WO2005012355A1 - Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática - Google Patents

Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática Download PDF

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María Mercedes RAMOS GONZÁLEZ
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    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Definitions

  • the invention consists in the production of bioactive egg products derived from egg white proteins. These give rise, after an enzymatic treatment, to peptides with inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme (TECA activity) in vitro and / or antihypertensive and / or antioxidant activity, which can be applied in the food and pharmaceutical industry.
  • TECA activity angiotensin converting enzyme
  • Bioactive peptides correspond to fragments that are inactive within the precursor protein, but which can be released by hydrolysis in vivo or in vitro and, in this way, exert different physiological functions in the body. Since its discovery, in 1979, peptides have been described food protein derivatives with different biological activities: antihypertensive, antithrombotic, opioid, antioxidant, immunomodulant, etc.
  • bioactive peptides those that exert antihypertensive activity through the regulation of the renin-angiotensin system (T. Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381).
  • the high incidence of coronary diseases in the population is notorious, and the treatment of hypertension is one of the most used strategies to reduce the risk of cardiovascular diseases.
  • the mechanism of action of these peptides has been explained by the inhibition of the angiotensin-converting enzyme (RCT), which catalyzes the formation of angiotensin IL an octapeptide with a potent vasoconstrictor activity and, in addition, inactivates bradykinin, which produces vasodilation.
  • RCT angiotensin-converting enzyme
  • TECA Different peptides with ACE inhibitory activity
  • WO01 / 85984 Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting produets and treatment of hypertension in mammals
  • caseins US6514941, Method of preparing a casein hydrolysate enriched in anti-hypertensive peptides
  • Another group of bioactive peptides of great importance is that of peptides with anti-oxidant activity.
  • Aging and various pathologies are related to the oxidation of cellular components, such as lipids, proteins or DNA, so the inclusion of antioxidants in the diet has a preventive character.
  • these compounds can prevent the oxidation of fats, avoiding the appearance of unpleasant flavors in food.
  • Yoshikawa Isolation and characterization of ovokmin, a bradykinin Bl agonist peptide derived from ovoalbumin, Peptides, 1995, 16: 785-790
  • ovokinin an isolated octapeptide of an ovalbumin hydrolyzate with pepsin (FRADHPFL)
  • FRADHPFL ovalbumin hydrolyzate with pepsin
  • Ovokinin had antihypertensive activity when administered orally to spontaneously hypertensive rats (SHR) at doses of 100 mg kg (H. Fujita, R. Sasaki and M.
  • Yoshikawa Potentiation of the antihypertensive activity of orally administerrd ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59: 2344-2345).
  • Yoshikawa A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SUR mesenteric artery, FEBS Letters, 1999, 452: 181-184), purified from a ovalbumin hydrolyzate with chymotrypsin, a hexapeptide corresponding to fragment 2-7 of ovokinin (RADHPF, ovokinin (2-7)) that exerted a potent vasodilator action in SHR at a dose of 10 mg / kg. Subsequently, ovokinin analogs (2-7) were synthesized in order to increase their antihypertensive activity.
  • ovokinin analogs (2-7) were synthesized in order to increase their antihypertensive activity.
  • RPFHPF and RPLKPW showed 10 and 100 times more activity than ovokinin (2-7) after oral administration to SHRs (minimum effective doses of 1 and 0J mg / kg), which was attributed to a higher Resistance to digestive tract proteases (N. Matoba, Y. Yamada, H. Usui, R. Nakagiri and M. Yoshikawa, Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65: 736-739 and Y. Yamada, N. Matoba, H. Usui and K.
  • bioactive peptides consumed as part of the diet are capable of producing metabolic or physiological effects, useful in health maintenance.
  • the production of bioactive peptides from egg white proteins would allow new uses to be found in the chicken egg, beyond its classic nutritional value, including the production of medicinal and nutraceutical bioproducts. This would contribute to the development of healthy, safe and high quality foods, contributing to the use and revaluation of egg products.
  • the present invention consists in the production of egg products containing bioactive peptides with JJECA activity in vitro and / or antihypertensive activity and / or antioxidant activity, by enzymatic hydrolysis of egg proteins.
  • Bioactive peptides are produced by hydrolysis of one or more proteins, peptides or fragments thereof, which contain the amino acid sequence of said bioactive peptides (preferably containing ovalbumin), using enzymes (preferably pepsin) and hydrolysis conditions that allow the breakdown of the protein chain in the right places for its release. They can also be obtained by chemical or enzymatic synthesis or by recombinant methods etc.
  • Such peptides can be consumed as such, or from crude hydrolysates, low molecular weight concentrates or other active subfractions obtained by size separation methods or chromatographic methods.
  • hydrolysates In addition to being part of food products, such hydrolysates, their fractions or peptides could also be part of pharmaceutical products. Thus, they could help in the treatment and prevention of diseases, particularly in the control of blood pressure.
  • the invention extends the applications of egg proteins, contributing to their utilization and revaluation.
  • the invention provides a method for producing bioactive peptides from egg white proteins.
  • Said bioactive peptides are those identified with the amino acid sequences shown in the SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. JO. No. 6, SEQ. ID. No. 7 and SEQ. ID. No. 8 (table 1), some of which have LECA activity in vitro and / or antihypertensive activity in vivo and / or anti oxidant activity.
  • the starting material of the present invention would be any suitable substrate comprising one or more proteins or peptides, of animal, vegetable origin or from micro-organisms, containing the amino acid sequence of the bioactive peptides of interest (SEQ. ID. No. .1, SEQ. ID No. 2, SEQ. D. No. 3, SEQ. ID. _.. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID No. 7 and SEQ ID No. 8, table 1), preferably ovalbumin or egg white. Since they all belong to the ovalbumin sequence, it is obvious that any preparation containing ovalbumin or ovalbumin peptides or fragments of any size, alone or mixed with other proteins, could be used.
  • Said starting material is dissolved or dispersed, at an appropriate concentration, in water or in a buffer solution, at a pH suitable for the action of the proteolytic enzyme.
  • Any proteolytic enzyme capable of breaking the protein present in the starting material and providing the peptides of interest may be employed, but preferably pepsin at pH 2-0-3.0.
  • Proteolytic microorganisms that carry out fermentation of the substrate could also be used.
  • the hydrolysis conditions pH, temperature, pressure, enzyme-substrate ratio, reaction interruption etc., are optimized in order to select the most active hydrolysates.
  • the bioactive peptides are obtained using pepsin at pH 2.0, in a 1/100 enzyme / substrate ratio, w / w and performing hydrolysis at 37 ° C and atmospheric pressure (0J MPa), for a period of time between 10 min and 24 hours, but preferably for less than 3 hours.
  • low molecular weight fractions can be obtained from hydrolysates by methods such as ultrafiltration, dialysis, electrodialysis with pore size membranes suitable, gel filtration chromatography, etc.
  • fractions of molecular weight less than 3000 Da of the hydrolysates are obtained by ultrafiltration through a hydrophilic membrane of 3000 Da. These fractions show greater ACEI and antihypertensive activity than the starting hydrolysates.
  • active subfractions can be isolated by hydrophobic interaction chromatography, ion exchange chromatography or, preferably reverse phase high efficiency chromatography.
  • the peptides shown in Table 1 and indicated with the SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 and SEQ. ID. No. 8 possess bioactive properties, fundamentally TECA and / or antihypertensive and / or antioxidant activity and are also the subject of the present invention.
  • the peptides identified with the SEQ sequences. ID. No. 2, SEQ. ID. °. 3, SEQ. ID. No. 5 and SEQ. ID. J °. 6 show potent EECA activity in vitro and SEQ sequences. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3 and SEQ. ID. No. 6 possess antihypertensive activity in rats spontaneously hypertensive (SHR), but not in normotensive rats Wistar-Kyoto (WKY) when administered orally.
  • SHR spontaneously hypertensive
  • WKY Wistar-Kyoto
  • at least the peptide identified as SEQ. ID. No. 6 has antioxidant activity against free radicals. It should be noted that these are natural peptides from which few side effects and good tolerance can be expected.
  • bioactive peptides identified in the hydrolysates can be obtained by chemical and / or enzymatic synthesis of peptides or by recombinant methods.
  • egg products complete hydrolysates, their low molecular weight fractions, or one or more of their constituent bioactive peptides (including their derivatives, pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof), could be used as therapeutic substances with ACEI activity and / or with antihypertensive activity and / or antioxidant activity.
  • Said egg products can be subjected to heat treatment, such as pasteurization, or undergo drying or lyophilization etc., to be used as functional food products, food additives or ingredients, or pharmaceutical products, for the treatment and / or prevention of hypertension.
  • heat treatment such as pasteurization, or undergo drying or lyophilization etc.
  • hydrolyzate, low molecular weight fraction, peptides, their derivatives or pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof, as well as their dosage for the treatment of any pathology will vary depending on numerous factors, such as age, severity of the pathology or dysfunction, route of administration and dose frequency.
  • These compounds could be presented in any form of administration, solid or liquid, and administered by any appropriate oral, respiratory, rectal or topical route, although they are particularly designed for solid or liquid administration by oral route.
  • the process of obtaining these egg products can be optimized, directing it to the production of the greatest possible amount of bioactive peptides or to control possible the appearance of bitterness, normally caused by a high concentration of hydrophobic peptides of intermediate or low molecular weight.
  • Angiotensin converting enzyme (ACEI) inhibitory activity is measured in vitro according to the DW Cushman and HS Cheung (Spectrophotometric assay and properties of the method) angiotensin-converting enzyme of rabbit lung, Biochemical Pharmacology, 1971, 20: 1637-1648), subsequently modified by YK Kim, S. Yoon, DY Yu., B. Lonnerdal and BH Chung (Novel angiotensm-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human O s i-casein expressed in Escherichia coli. Journal of Dairy Research 1 99, 66, 431-439).
  • the histidyl leucine hippyl substrate (BHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA) is dissolved in 0.1 M borate buffer with 0.3 M NaCl, pH 8.3, to obtain a final concentration of 5 mM.
  • To 100 ⁇ l of substrate are added 40 ⁇ l of each of the samples whose LECA activity is to be determined.
  • ECA enzyme (EC 3.4.15.1, Sigma), dissolved in 50% glycerol, and diluted at the time of the 1/10 test in double-distilled water is added.
  • the reaction is carried out at 37 ° C, for 30 minutes in a water bath.
  • the enzyme is inactivated by lowering the pH with 150 ⁇ l of 1N HC1.
  • the formed hippuric acid is extracted with 1000 ⁇ l of ethyl acetate. After vortexing for 20 seconds, it is centrifuged at 4000 rpm for 10 min and at room temperature. 750 ⁇ l of the organic phase is evaporated by heating at 95 ° C for 10 minutes. The hippuric acid residue is redissolved in 800 ⁇ l of double distilled water and, after stirring for 20 seconds, the absorbance at 228 nm is measured on a Dur-70 spectrophotometer from Beckman Instruments, Inc., Fullerton, USA. The following formula is used to calculate the percentage of ACEI:
  • White is used to correct background absorbance. This contains substrate, enzyme and 20 ⁇ l of double distilled water instead of sample, and the reaction is stopped at zero time.
  • the control assumes one hundred percent of the enzymatic action on the substrate in absence of inhibitors, and contains 20 ⁇ l of water instead of sample and incubates the same time as the sample.
  • IC 50 ⁇ M or ⁇ g / ml
  • concentration at which 50% of enzyme activity is inhibited The protein concentration is determined by the bicinconinic acid (BCA) assay (Pierce, Rockford, JL, USA) using bovine serum albumin as the standard.
  • BCA bicinconinic acid
  • the compound ABTS (Sigma), dissolved in water at a concentration of 7 mM, is put into 2.45 mM potassium persulfate contact in a 1: 2 ratio for 24 hours avoiding light
  • PBS saline phosphate buffer
  • pH 7.4
  • the antioxidant activity of the sample is expressed in relation to the antioxidant activity of Trolox (6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) (Sigma), a vitamin E analogue, using a TEAC value (antioxidant capacity equivalent to Trolox) at a certain time.
  • TEAC value antioxidant capacity equivalent to Trolox
  • Different ways of calculating the TEAC value have been developed. We use the method described by FWPC van Overlveld, GRMM Haenen, J. Rhemrev, JPW Vermeiden and A.
  • the value 0.2845 represents the decrease in absorbance caused by 1 mM of Trolox.
  • phase A binary gradient of water
  • phase B acetonitrile
  • the volume of injected sample is 200 ⁇ l. Before injection, the samples are passed through a 0.45 ⁇ m Millipore (Waters) filter. Analysis using tandem mass spectrometry (off-line) An Esquire 3000 ion trap unit is used (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany). The sample is injected into the electrospray nebulizer at a flow of 4 ⁇ l / min, using a syringe pump type 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA). The equipment uses nitrogen as a nebulizer and drying gas, and operates with a helium pressure of 5 x 10 ⁇ 3 bar.
  • Mass spectra are acquired in a range of 50-1500 m / z and at a speed of 13000 Da / second.
  • the interpretation of the MS spectra in tandem for the identification of the peptide sequences is carried out with the Biotools 2.1 program (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).
  • RP-HPLC-MS / MS An Esquire-LC device (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Germany) is used.
  • the HPLC equipment (1100 series) consists of a quaternary pump, an automatic injector, an eluent degassing system and a variable wavelength ultraviolet detector (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) coupled in line to a mass spectrometer of ionic trap Esquire 3000 (Bruker Daltonik).
  • the column is a Hi-Pore C18 column (250 x 4.6 mm di., 5 ⁇ m particle size) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).
  • Solvent A is a mixture of water and trifluoroacetic acid (1000: 0.37) and solvent B a mixture of acetonitrile and trifluoroacetic acid (1000: 0.27).
  • 50 ⁇ l of sample are injected at a concentration of 1-2 mg / ml.
  • a flow of 0.8 ml / minute is used, with a linear gradient from 0% to 30% of solvent B in A in 25 minutes.
  • the eluent is monitored at 214 nm, by mass spectrophotometry, under the same conditions as indicated in the previous section, except that the injection flow of the sample through the nebulizer is 60 ⁇ l / min.
  • a tail cuff device (Le5001, Letica) is used that provides a digital value of the SBP automatically and records and facilitates the heart rate of the Animals Several measurements are made, and the average of all of them is obtained to obtain a reliable value of the PAS Before placing the sleeve and the transducer in the tail of the rats, these are exposed to a temperature close to 30 ° C to facilitate dilation of the caudal artery In addition, to ensure the reliability of the measurement, the animals get used to the procedure 2 weeks before carrying out the test in question. The administration of the products to be tested is carried out by intragastric tube in a period of time between 9 and 10 am The SHR used for the study had PAS values between 230 and 280 mm Hg.
  • a negative control to establish the circadian variation of the SBP in probed rats
  • the SBP measurements obtained in rats that are administered by intragastric tube 1 ml of water are used.
  • the SBP measures obtained in rats that are administered by intragastric tube 50 mg / kg of Captopril (prototype drug TECA) are used. This dose of Captopril is administered to each rat in a volume of 1 ml.
  • Figure 1 represents the decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats, after administration by intragastric tube of 1 ml of water (o), 50 mg / kg of Captopril ( ⁇ ), 200 mg / kg of egg white (CH) (X), and different doses of egg white hydrolyzate (HCH): 100 mg / kg
  • FIG. 1 represents the mean ⁇ ESM for a minimum of 9 animals.
  • the abscissa axis represents the time, in hours, elapsed since the administration.
  • Figure 2 represents the decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats, after administration by intragastric tube of 1 ml of water (o), 50 mg / kg of Captopril (D) and different doses of fraction less than 3000 Da of egg white hydrolyzate (F ⁇ 3000 Da): 25 mg / kg (4), 50 mg / kg (A) and 100 mg / kg (").
  • SBP systolic blood pressure
  • Figure 3 A is a chromatogram obtained using reverse phase high efficiency liquid chromatography (RP-HPLC) on a preparative scale of the fraction less than 3000 Da produced by hydrolysis of egg white with pepsin for 3 h, in which 9 fractions (F1-F9) are selected, which were automatically collected.
  • the time in minutes is represented on the abscissa axis.
  • Figure 3 B represents the TECA capacity, expressed as the con Protein centering necessary to inhibit 50% of the enzyme (IC50), corresponding to each of the 9 fractions collected by RP-HPLC on a preparative scale.
  • Figure 4 represents the decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats, after administration by tube.
  • intragastric of 1 ml of water (o) 50 mg / kg of Captopril (D) and different doses of the YAEERYP ⁇ L peptide: 0.5 mg / kg (i), 1 mg / kg (A) and 2 mg / kg (u).
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 9 animals.
  • On the abscissa axis the time, in hours, transcribed from the administration is represented.
  • Figure 5 represents the decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats, after administration by intragastric tube of 1 ml of water (o), 50 mg / kg of Captopril ( ⁇ ) and different doses of the peptide RADHPFL: 0.5 mg / kg (4), 1 mg / kg (A) and 2 mg / kg (m).
  • SBP systolic blood pressure
  • ⁇ systolic blood pressure
  • Figure 6 represents the decrease in systolic blood pressure (SBP), obtained in spontaneously hypertensive rats, after administration by intragastric tube of 1 ml of water (X), 50 mg / kg of Captopril ( ⁇ ) and different doses of the peptide INF: 1 mg / kg ( ⁇ ), 2 mg / kg (A) and 4 mg / kg (u).
  • SBP systolic blood pressure
  • X 1 ml of water
  • ⁇ Captopril
  • ⁇ Captopril
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 9 animals.
  • the abscissa axis represents the time, in hours, elapsed since the administration.
  • Figure 7 represents the variation of systolic blood pressure (SBP), obtained in normotensive Wistar-Kyoto rats, after administration by intragastric tube of 1 ml of water (o), 50 mg / kg of Captopril (D), 200 mg / kg of CH (X), 400 mg / kg of HCH (•), 100 mg kg of the fraction less than 3000 Da of HCH (F ⁇ 3000 Da) ( ⁇ ), 2 mg / kg of the YAEERYPEJ peptide » 2 mg / kg of the RADHPFL peptide (A) and 4 mg / kg ⁇ VF peptide (B).
  • SBP systolic blood pressure
  • the abscissa axis represents the time, in hours, elapsed since the administration.
  • Example 1 Obtaining bioactive peptides, with ACEI and antihypertensive activity, from egg white hydrolyzed with pepsin at atmospheric pressure.
  • the hydrolyzate was obtained using as a clear substrate of chicken egg, from fresh eggs, separated from the yolk and lyophilized.
  • pepsin EC 3.4.23.1. Type A, 10000 U / mg protein
  • the substrate was dissolved in water at a concentration of 100 mg / ml and the pH was adjusted to 2.0 by adding 1N HC1.
  • Pepsin substrate enzyme ratio 1/100, w / w
  • Hydrolysis was performed at a temperature of 37 ° C for 24 hours, at atmospheric pressure (0.1 MPa).
  • Pepsin inactivation was achieved by raising the pH to 7.0 with 1N NaOH.
  • JECA activity was measured in aliquots collected after different hydrolysis times, 0, 30 minutes, 3, 5, 8 and 24 hours.
  • the fraction less than 3000 Da of the egg white hydrolyzate with pepsin for 3 hours was obtained by ultrafiltration through a hydrophilic membrane of 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA, USA), centrifuging at 1900 g for 40 minutes.
  • ACEI activity was measured in the retained (size fraction> 3000 Da) and in the permeate (size fraction ⁇ 3000 Da).
  • the IC 50 values were, respectively, 298.4 and 34.5 ⁇ g / ml. This shows that the permeate has approximately 10 times more JECA activity and that, therefore, the activity is mainly due to small peptides.
  • the antihypertensive activity of the egg white hydrolyzate with pepsin was tested for 3 hours and its fraction less than 3000 Da in spontaneously hypertensive rats (SHR) and in Wistar-Kyoto (WKY) normotensive rats.
  • SHR spontaneously hypertensive rats
  • WKY Wistar-Kyoto
  • Different concentrations of both lyophilized egg products were administered to the animals that, in the in the case of the hydrolyzate, they were between 100 and 400 mg / kg, and in the case of the fraction less than 3000 Da, between 25 and 100 mg / kg.
  • Figures 1 and 2 show, respectively, the decrease in SBP obtained in SHR at different times after administration of different doses of egg white hydrolyzate with pepsin for 3 hours, and after administration of different doses of the smaller fraction of 3000 Da of said hydrolyzate.
  • the results of these tests with non-hydrolyzed egg white (control) 200 mg / kg are shown in Figure 1. It can be seen that the PAS values corresponding to the control are similar to the PAS values of animals a Those who administer water.
  • These figures also include the decrease in SBP observed after the administration of Captopril. Captopril produces a pronounced decrease in SBP in SHR. The decrease in SBP is maximum 6 hours after drug administration.
  • the egg white hydrolyzate and the fraction less than 3000 Da cause significant dose-dependent decreases of SBP in animals.
  • the lowest PAS values after administering the egg white hydrolyzate and the fraction less than 3000 Da of this hydrolyzate, are also observed 6 hours after administration.
  • the SBP values observed 24 hours after the different administrations are similar to those that the animals had before them.
  • the fraction less than 3000 Da obtained after hydrolysis of egg white with pepsin for 3 hours was lyophilized and redissolved in water at a concentration of 50 mg / ml and It was fractionated by RP-HPLC on a semi-preparative scale.
  • FIG. 7 shows the changes of the PAS obtained in WKY ralas at different times, after the administration of the following compounds 400 mg / kg of the egg white hydrolyzate, 100 mg / kg of the Menoi fraction of 3000 Da of hydrolyzed, 2 mg / kg of the SEQ.LD.N 0 peptide. 6.2 mg / kg peptide SEQ.ID.N 0 . 3, and 4 mg / kg peptide SEQ.JJD.N 0 . 2.
  • the results obtained after administration of 50 mg / kg of Captopril are also included.
  • Example 4 Obtaining bioactive peptides from ovalbumin hydrolyzed with pepsin at atmospheric pressure The hydrolyzate was obtained using ovoalbumin substrate grade VI (99% purity) (Sigma). The substrate was dissolved in water at a concentration of 100 mg / ml and the pH was adjusted to 2.0 by adding 1N HC1. In this particular embodiment of the invention, pepsin (EC 3.4.23.1. Type A, 10000 U / mg protein), from pork stomach (Sigma) was added at an enzyme / substrate ratio 1/100, w / w. Hydrolysis was carried out at a temperature of 37 ° C for 3 hours, at atmospheric pressure (0.1 MPa). Pepsin inactivation was achieved by raising the pH to 7.0 with 1N NaOH.
  • pepsin EC 3.4.23.1. Type A, 10000 U / mg protein
  • Hydrolysis was carried out at a temperature of 37 ° C for 3 hours, at atmospheric pressure (0.1 MPa). Pepsin inactivation was achieved by raising the pH to 7.0
  • SEQ. ID. No. 2 SEQ. ID. No. 3 and SEQ. THE. No. 6 also show antihypertensive activity in rats (example 2), and SEQ. ID. No. 6 has antioxidant activity against free radicals (example 3).
  • Example 5 Obtaining bioactive peptides from ovalbumin hydrolyzed with pepsin under conditions of high hydrostatic pressure.
  • the hydrolyzate was obtained using ovoalbumin substrate grade VI (99% purity) (Sigma).
  • pepsin EC 3.4.23.1. Type A, 10000 U / mg protein
  • the substrate was dissolved in water at a concentration of 2 mg / ml and the pH was adjusted to 2.0 by adding 1N HC1.
  • Pepsin enzyme enzyme / substrate ratio 1/20, w / w was added.
  • the hydrolysis was carried out at a temperature of 37 ° C for 30 min, at different hydrostatic pressures (100, 200, 300 and 400 MPa).
  • Pepsin inactivation was achieved by raising the pH to 7.0 with 1N NaOH.
  • the treatments with high pressure were carried out in a discontinuous hydrostatic pressure equipment (900 HP Eurotherm Automation) with a capacity of 2350 ml, which reaches a pressure of 500 MPa.
  • the high-pressure chamber consists of a stainless steel cylinder, filled with the pressure-transmitting medium (water), into which the substrate and enzyme mixture is introduced, packed in an Eppendorf plastic tube without leaving an air chamber.
  • the equipment reaches the desired pressure at a speed of 2.5 MPa / second and, after treatment, drops to zero at the same speed.
  • the equipment is accompanied by an auxiliary bath that, through the circulation of water through an outer jacket that surrounds the cylinder, allows treatments at temperatures from -20 ° C to 95 ° C.
  • the process temperature is controlled by a thermocouple submerged in the pressure transmitting medium.
  • the hydrolysates thus obtained were analyzed by RP-HPLC-MS / MS. At least the sequences were found: SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 5 and SEQ. ID. No. 6 which, as indicated in example 2, have IC50 of less than 7 ⁇ M.
  • SEQ. ID. No. 3 and SEQ. ID. No. 6 also show antihypertensive activity in rats (example 2), and SEQ. ID. No.
  • Example 6 has antioxidant activity against free radicals (example 3). This example shows how the use of high hydrostatic pressures allows hydrolysates containing active peptides to be obtained more quickly than by hydrolysis at atmospheric pressure. It should be noted that the SEQ was not obtained under these conditions. ID. No. 2, which could have an impact on the industrial applicability of hydrolysates.

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Abstract

La invención consiste en la producción de ovoproductos conteniendo péptidos bioactivos a partir de clara de huevo sometida a un tratamiento enzimático. Dichos péptidos muestran actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva en ratas y/o actividad antioxidante. Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o sus péptidos constituyentes, podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o con actividad antioxidante, ya sea como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.

Description

TITULO
Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática
SECTOR DE LA TÉCNICA La invención consiste en la producción de ovoproductos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo. Éstas dan lugar, tras un tratamiento enzimático, a péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad TECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o antioxidante, que pueden aplicarse en la industria alimentaria y farmacéutica.
ESTADO DE LA TÉCNICA El papel del huevo en la nutrición humana es esencial ya que constituye un alimento nutritivo y saludable. El reciente desarrollo de nuevas técnicas biotecnológicas y de separación permite el fraccionamiento de distintos componentes del huevo para ser usados con nuevos propósitos alimenticios o no alimenticios y, de este modo, están apareciendo nuevas aplicaciones que contribuyen a aumentar su consumo. Así, distintas empresas dedicadas a la producción de proteínas aisladas a partir de fracciones del huevo, están interesadas en aumentar y diversificar los usos de algunos componentes, como la ovoalbúmina y la ovotransferrina. Este es el caso de las industrias dedicadas a la producción de lisozima, utilizada como agente antimicrobiano, que obtienen como subproductos otras fracciones nitrogenadas de bajo coste, destinadas generalmente a alimentación animal o para su uso como emulgentes y gelificantes en distintos alimentos. En los últimos años, los alimentos funcionales han irrumpido con fuerza en el sector alimentario, debido a la mayor concienciación de los consumidores de la relación existente entre la dieta y la salud. Dentro de los ingredientes funcionales, es decir, componentes que, incorporados al alimento, proporcionan al mismo actividades biológicas específicas que van más allá de la mera nutrición, ocupan un lugar destacado los péptidos bioactivos, por su diversidad y multifuncionalidad. Los péptidos bioactivos corresponden a fragmentos que se encuentran inactivos dentro de la proteína precursora, pero que pueden liberarse mediante hidrólisis in vivo o in vitro y, en esta forma, ejercer distintas funciones fisiológicas en el organismo. Desde su descubrimiento, en 1979, se han descrito péptidos derivados de proteínas alimentarias con diferentes actividades biológicas: antihipertensiva, antitrombótica, opiácea, antioxidante, inmunomodulante, etc. Entre los péptidos bioactivos, cabe destacar aquellos que ejercen actividad antihipertensiva mediante la regulación del sistema renina-angiotensina (T. Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381). Es notoria la elevada incidencia de enfermedades coronarias en la población, y el tratamiento de la hipertensión constituye una de las estrategias más utilizadas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. El mecanismo de acción de estos péptidos se ha explicado mediante la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), que cataliza la formación de angiotensina IL un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora y, además, inactiva la bradiquinina, que produce vasodilatación. Se han descubierto distintos péptidos con actividad inhibidora de la ECA (TECA), obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de proteínas de suero lácteo (WO01/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting produets and treatment of hypertension in mammals), caseínas (US6514941, Method of preparing a casein hydrolysate enriched in anti-hypertensive peptides), etc. Otro grupo de péptidos bioactivos de gran importancia es el de los péptidos con actividad anti oxidante. El envejecimiento y diversas patologías (alteraciones neurológicas, procesos cancerosos, cataratas, etc.) están relacionados con la oxidación de componentes celulares, como lípidos, proteínas o ADN, por lo que la inclusión de antioxidantes en la dieta tiene un carácter preventivo. Además, de su acción biológica, estos compuestos pueden prevenir la oxidación de las grasas, evitando la aparición de sabores desagradables en los alimentos. Algunas investigaciones han puesto de manifiesto la capacidad de distintas proteínas y de hidrolizados de las mismas para ejercer una acción antioxidante, bien actuando como secuestradores de radicales libres (K. Suetsuna, H. Ukeda y H. Ochi, Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein, Journal of Nutritional Bioche istry, 2000, 11:128-131) o inhibiendo enzimas relacionadas con la oxidación de las grasas (S. G. Rival, S. Fornaroli, C. G. Boeriu y H. J. Wichers, Caseins and casein hydrolysates. I. Lipoxygenase inhibitory properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 287-294). Debe destacarse que los estudios de la relación estructura-actividad de los péptidos PECA y antioxidantes han puesto de manifiesto una característica común a ambos: la importancia de ciertos aminoácidos hidrofóbicos en estas dos actividades biológicas (H. M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto y K. Nokihara, Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 49-53). Entre las estrategias más utilizadas para la obtención de péptidos activos para su uso alimentario, destacan la hidrólisis enzimática y los procesos fermentativos. Por otra parte, en los últimos años se han propuesto distintos tratamientos tecnológicos para la funcionalización de proteínas. El empleo de altas presiones hidrostáticas, como método físico de desnaturalización, tiene como resultado la modificación de los enlaces no covalentes responsables de la estructura de las proteínas, dando lugar a cambios conformacionales que conducen a un estado desplegado. Varios estudios han demostrado que la proteolisis se acelera y aparecen distintos productos de hidrólisis bajo condiciones de alta presión, en comparación con lo que ocurre a presión atmosférica F. Bonomi, A. Fiocchi, H. Fraki-er, A. Gaiaschi, S. Iametti, C. Poesi, P. Rasmussen, P. Restani y P. Rovere, Reduction of immunoreactivity of bovine β- lactoglobulin upon combined physical and proteolytic treatment, Journal of Dairy Research, 2003, 70: 51-59). Además, debe tenerse en cuenta que la mayoría de las enzimas mantienen su actividad hasta 400 MPa, inactivándose a presiones mayores. Sin embargo, en la bibliografía no se ha descrito la producción de péptidos bioactivos en condiciones de alta presión. A diferencia de otras proteínas alimentarias, existen muy pocos estudios relacionados con péptidos bioactivos derivados de las proteínas de huevo, aún siendo éstas una fuente de nitrógeno muy importante en la dieta. H. Fujita, K Yokoyama, y M. Yoshikawa (Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564-569) encontraron actividades TECA en hidrolizados de ovoalbúmina con pepsina y termolisina, con valores de ϊCso (concentración que inhibe el 50% de la actividad de la enzima) de 45.0 y 83.0 μg/ml respectivamente. Estos autores aislaron seis péptidos con actividad TECA a partir del hidrolizado con pepsina, con valores de IC50 de 0.4 a 15 μM, pero ninguno de ellos, excepto el dipéptido LW, mostró actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Se postuló que dichos péptidos serían sustratos de la ECA, pero no verdaderos inhibidores, por lo que mostrarían actividades IECA aparentes en el ensayo in vitro (H. Fujita y M. Yoshikawa, LKPNM: a prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein, Immunopharmacology, 1999, 44:123-127). Estas observaciones ponen de manifiesto que la determinación de la actividad TECA in vitro, si bien es un buen punto de partida de trabajo, no puede convertirse en el único criterio de selección, al no tener en consideración las transformaciones fisiológicas en el organismo que determinan la biodisponibilidad de los péptidos (digestión y paso a través de la barrera gastrointestinal para llegar a la sangre en forma activa). Se han descrito dos péptidos con actividad vasodilatadora, que provienen de la misma región de la ovoalbúmina hidrolizada con diferentes enzimas. H. Fujita, H. Usui, K. Kurahashi y M. Yoshikawa (Isolation and characterization of ovokmin, a bradykinin Bl agonist peptide derived from ovoalbumin, Peptides, 1995, 16: 785-790) encontraron que la ovokinina, un octapéptido aislado de un hidrolizado de ovoalbúmina con pepsina (FRADHPFL), mostraba actividad vasorelaj adora en arterias mesentéricas caninas, pero no poseía actividad TECA. La ovokinina poseía actividad antihipertensiva cuando se administraba oralmente a ratas espontáneamente hipertensas (SHR) a dosis de 100 mg kg (H. Fujita, R. Sasaki y M. Yoshikawa, Potentiation of the antihypertensive activity of orally administerrd ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59: 2344-2345). N. Matoba, H. Usui, H. Fujita y M. Yoshikawa (A novel anti- hipertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SUR mesenteric artery, FEBS Letters, 1999, 452:181-184), purificaron a partir de un hidrolizado de ovoalbúmina con quimotripsina, un hexapéptido correspondiente al fragmento 2-7 de la ovokinina (RADHPF, ovokinina (2-7)) que ejercía una potente acción vasodilatadora en SHR a dosis de 10 mg/kg. Posteriormente, se sintetizaron análogos de la ovokinina (2-7) con el objetivo de aumentar su actividad antihipertensiva. Entre ellos, RPFHPF y RPLKPW, mostraron, respectivamente 10 y 100 veces más actividad que la ovokinina (2-7) tras su administración oral a SHRs (dosis mínimas efectivas de 1 y 0J mg/kg), lo que se atribuyó a una mayor resistencia a las proteasas del tracto digestivo (N. Matoba, Y. Yamada, H. Usui, R. Nakagiri y M. Yoshikawa, Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65: 736-739 y Y. Yamada, N. Matoba, H. Usui y K. Onishi, Design of a highly potent anti-hypertensive peptide based on ovokinin (2- 7), Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66: 1213-1217). Debe destacarse que, de acuerdo con estos autores y a diferencia de la mayoría de los péptidos antihipertensores de origen alimentario, ni la ovokinina (2-7), ni sus derivados RPFHPF o RPLKPW poseerían actividad TECA. Se ha postulado que disminuirían la presión arterial a través de su interacción con receptores del tracto gastrointestinal o debido a efectos en el sistema nervioso central. Dada la alta calidad biológica de las proteínas del huevo, es de gran interés obtener, a partir de éstas, péptidos bioactivos que consumidos como parte de la dieta, además de ejercer sus funciones nutrí cionales básicas, sean capaces de producir efectos metabólicos o fisiológicos, útiles en el mantenimiento de la salud. La producción de péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la clara de huevo permitiría encontrar nuevos usos al huevo de gallina, más allá de su valor alimenticio clásico, incluyendo la producción de bioproductos medicinales y nutracéuticos. Esto contribuiría al desarrollo de alimentos saludables, seguros y de alta calidad, contribuyendo al aprovechamiento y revalorización de los ovoproductos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención La presente invención consiste en la producción de ovoproductos que contienen péptidos bioactivos con actividad JJECA in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante, mediante hidrólisis enzimática de proteínas de huevo. Los péptidos bioactivos se producen mediante la hidrólisis de una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos (preferentemente que contengan ovoalbúmina), empleando enzimas (preferentemente pepsina) y condiciones de hidrólisis que permitan la ruptura de la cadena proteica en los lugares adecuados para su liberación. También pueden obtenerse mediante síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes etc. Dichos péptidos pueden consumirse como tales, o a partir de los hidrolizados crudos, de concentrados de bajo peso molecular o de otras subfracciones activas obtenidas mediante métodos de separación por tamaño o métodos cromatográficos. Además de formar parte de productos alimenticios, tales hidrolizados, sus fracciones o los péptidos también podrían formar parte de productos farmacéuticos. Así, podrían auxiliar en el tratamiento y prevención de enfermedades, particularmente, en el control de la presión arterial. La invención amplía las aplicaciones de las proteínas del huevo, contribuyendo a su aprovechamiento y revalorización.
Descripción detallada de la invención La invención proporciona un método para producir péptidos bioactivos a partir de proteínas de clara de huevo. Dichos péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. JO. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8 (tabla 1), algunos de los cuales poseen actividad LECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad anti oxidante. El material de partida de la presente invención sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal o procedentes de microoganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. D. N°. 3, SEQ. ID. _ . . 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8, tabla 1), preferiblemente ovoalbúmina o clara de huevo. Dado que todos ellos pertenecen a la secuencia de la ovoalbúmina, resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga ovoalbúmina o péptidos o fragmentos de ovoalbúmina de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por ejemplo: ovoalbúmina pura, clara de huevo y huevo entero en sus diferentes formas de presentación, ovoprbductos destinados a hostelería y restauración, complementos dietéticos para deportistas ovoproductos para alimentación animal etc. Dicho material de partida se disuelve o dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica. Puede emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2-0-3.0. También podrían emplearse microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato. Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, presión, relación enzima- sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, se obtienen los péptidos bioactivos empleando pepsina a pH 2.0, en una relación enzima/sustrato 1/100, p/p y realizando la hidrólisis a 37°C y a presión atmosférica (0J MPa), durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 min y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 3 horas. El empleo de altas presiones hidrostáticas, hasta 400 MPa, acelera la hidrólisis del sustrato sin inhibir la enzima proteolítica y modifica el perfil de los péptidos obtenidos. A continuación, si se desea concentrar los péptidos bioactivos y dado que los péptidos con actividad TECA contienen de 3 a 6-7 aminoácidos, aproximadamente (A. Pihlanto-Leppálá, T. Rokka y H. Korhonen, Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins, International Dairy Journal, 1998, 8:325-331), se pueden obtener, a partir de los hidrolizados, fracciones de bajo peso molecular mediante métodos tales como ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis con membranas de tamaño de poro adecuado, cromatografía de filtración por gel, etc. En una realización particular, se obtienen las fracciones de peso molecular menor de 3000 Da de los hidrolizados mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofílica de 3000 Da. Dichas fracciones muestran mayor actividad IECA y antihipertensiva que los hidrolizados de partida. A partir de las fracciones de bajo peso molecular de los hidrolizados pueden aislarse subfracciones activas mediante cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico o, preferiblemente cromatografía de alta eficacia en fase inversa. Además de los hidrolizado completos y sus fracciones, los péptidos mostrados en la tabla 1 y señalados con las SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8, poseen propiedades bioactivas, fundamentalmente actividad TECA y/o antihipertensiva y/o antioxidante y son también objeto de la presente invención. En concreto, los péptidos identificados con las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. °. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. J °. 6 muestran una potente actividad EECA in vitro y las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6 poseen actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), pero no así en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY) cuando se administran por via oral. Por otra parte, al menos el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 6, posee actividad antioxidante frente a radicales libres. Debe destacarse que se trata de péptidos naturales de los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena tolerancia. Asimismo, los péptidos bioactivos identificados en los hidrolizados (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8) pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por métodos recombinantes.
Tabla 1. Secuencias de los péptidos bioactivos identificados YQIGL SEQ. ID. N°. 1 IVF SEQ. ID. N°. 2 RADHPFL SEQ. ID. N°. 3 FSL SEQ. ID. N°. 4 FRADHPFL* SEQ. ID. N°. 5 YAEERYPIL SEQ. JX>. N°. 6 RDTLNQ SEQ. ID. N°. 7 SALAM SEQ. ID. N°. 8
* Secuencia previamente identificada como ovokinina (H. Fujita; H. Usui; K.
Kurahashi y M. Yoshikawa, Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin Bl agonist peptide derived from ovoalbumin, Peptides, 1995, 16: 785-790). Debe destacarse que estos autores comprobaron su actividad vasodilatadora en arterias mesentéricas caninas, pero afirman que no posee actividad TECA.
No se había descrito previamente la obtención de péptidos bioactivos a partir de hidrolizados de clara de huevo con pepsina, aunque ya se había puesto de manifiesto la actividad JECA in vitro de hidrolizados de ovoalbúmina (H. Fujita, K Yokoyama, y M. Yoshikawa, Classification and antihypertensive activity of antiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564-569). La clara de huevo resulta un sustrato proteico barato y fácilmente asequible para producir péptidos bioactivos. Por otra parte, tampoco se había demostrado la actividad antihipertensiva in vivo de los hidrolizados de ovoalbúmina. Como ya se ha explicado, debe destacarse que con frecuencia, muchos péptidos que se muestran como potentes inhibidores de la ECA in vitro pierd en toda o parte de su actividad cuando son ensayados in vivo, o incluso, péptidos que in vitro no presentan gran actividad como inhibidores de la ECA la adquieran in vivo debido a la actuación de enzimas digestivas (M. Maeno, N. Yamamoto y T. Takano, Identification of an anti- hypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helvéticas CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316-1321). Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o uno o más de sus péptidos bioactivos constituyentes (incluyendo sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas), podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Dichos ovoproductos pueden ser sometidos a un tratamiento térmico, como la pasteurización, o bien someterse a secado o liofilización etc., para emplearse como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas, principalmente en seres humanos, aunque también en animales. La cantidad de hidrolizado, fracción de bajo peso molecular, péptidos, sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas, así como su dosificación para el tratamiento de alguna patología variará dependiendo de numerosos factores, como la edad, severidad de la patología o disfunción, vía de administración y frecuencia de la dosis. Estos compuestos podrían presentarse en cualquier forma de administración, sólido ó líquido, y administrarse por cualquier vía apropiada oral, respiratoria, rectal o tópica, aunque particularmente están diseñados para una administración sólida o líquida por vía oral. En general, el proceso de obtención de estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular y sus péptidos constituyentes, se podrá optimizar, dirigiéndolo a la producción de la mayor cantidad posible de péptidos bioactivos o para controlar en lo posible la aparición de amargor, originado normalmente por una elevada concentración de péptidos hidrófobos de peso molecular intermedio o bajo. Procedimientos analíticos Medida de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) La actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) se mide in vitro de acuerdo con el método de D. W. Cushman y H. S. Cheung (Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung, Biochemical Pharmacology, 1971, 20:1637-1648), modificado posteriormente por Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu., B. Lonnerdal y B. H. Chung (Novel angiotensm-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human Osi-casein expressed in Escherichia coli. Journal of Dairy Research 1 99, 66, 431-439). El sustrato hipuril histidil leucina (BHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA) se disuelve en tampón borato 0.1 M con NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración final 5 mM. A 100 μl de sustrato se le añaden 40 μl de cada una de las muestras cuya actividad LECA se quiere determinar. Se adiciona la enzima ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol al 50%, y diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua bidestilada. La reacción se lleva a cabo a 37°C, durante 30 minutos en un baño de agua. La enzima se inactiva descendiendo el pH con 150 μl de HC1 1N. El ácido hipúrico formado se extrae con 1000 μl de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20 segundos, se centrifuga a 4000 rpm durante 10 min y a temperatura ambiente. Se toman 750 μl de la fase orgánica que se evapora por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. El residuo de ácido hipúrico se redisuelve en 800 μl de agua bidestilada y, tras agitar durante 20 segundos, se mide la absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro Dur-70 de Beckman Instruments, Inc., Fullerton, EEUU. Para calcular el porcentaje de IECA se emplea la fórmula siguiente:
Acontrol-Amuestra % IECA= * 100 Acontrol-Ablanco
El blanco se utiliza para corregir la absorbancia de fondo. Este contiene sustrato, enzima y 20 μl de agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo cero. El control supone el cien por cien de la acción enzimática sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene 20 μl de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la muestra. Los resultados se presentan como el IC50 (μM o μg/ml) o concentración a la que se inhibe el 50% de la actividad de la enzima. La concentración de proteína se determina mediante el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, JL, EEUU) empleando como patrón seroalbúmina bovina.
Medida de la actividad antioxidante Para la medida de la actividad antioxidante, se utiliza el método desarrollado por R Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang y C. Rice-Evans (Antioxidant activity applying an improved ABTS radical catión decolorization assay, Free Radical Biological Medicine, 1999, 26: 1231-1237). El método se basa en la desaparición del radical ABTS*+ (ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) debido a la acción reductora de diferentes muestras con actividad antioxidante. El radical ABTS*4" presenta un máximo de absorbancia a 734 nm. La actividad antioxidante se detecta por la disminución en el tiempo de la absorbancia de 734 nm. Para generar el radical ABTS"+, el compuesto ABTS (Sigma), disuelto en agua a una concentración 7 mM, se pone en contacto con persulfato potásico 2.45 mM en una relación 1:2 durante 24 horas evitando la luz. Después de 24 horas, la absorbancia a 734 nm se ajusta a un valor de 0.70 ±0.02 con tampón fosfato salino (PBS) 5 mM, 138 mM de NaCl, pH =7.4. En un experimento típico, 1 mi de esta solución se añade a 10 μl de la muestra (1.5 mM), disuelta en tampón fosfato sódico 0,02 M, pH= 6,5. El experimento se realiza por triplicado, incubando cada muestra con el radical ABTS*+ durante 10 minutos a 37 °C, haciendo lecturas de la absorbancia a 734 nm en el minuto 1, 6 y 10. Como blanco se utiliza tampón fosfato sódico 0.02 M, pH= 6.5 y al mismo tiempo que se realiza la incubación de las muestras, se incuba el radical ABTS*+ sin agente antioxidante (control). La actividad antioxidante de cada muestra se calcula con respecto a la absorbancia a 734 nm que presenta el control. La actividad antioxidante de la muestra se expresa en relación a la actividad antioxidante del Trolox (ácido 6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico) (Sigma), análogo de la vitamina E, mediante un valor TEAC (capacidad antioxidante equivalente al Trolox) a un determinado tiempo. Se han desarrollado diferentes maneras de calcular el valor TEAC. Utilizamos el método descrito por F.W.P.C. van Overlveld, G.R.M.M. Haenen, J. Rhemrev, J.P.W. Vermeiden y A. Bast (Tyrosine as important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma, Chemical and Biological Interactions, 2000, 127: 151-161), que es válido para calcular el valor TEAC de un compuesto puro, el cual provoca una disminución de la absorbancia que aumenta linealmente al aumentar la concentración. En este caso solo haría falta calcular una concentración determinada de un compuesto para poder calcular su valor TEAC. Variación de la Abs73 nm l-CΑ-'-'Compuesto 0.28045 x [Concentración de compuesto]
El valor 0.2845 representa la disminución de la absorbancia que provoca 1 mM de Trolox.
Aislamiento de fracciones peptídicas mediante cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semi-preparativa Se utiliza un equipo formado por dos bombas programables modelo Waters Delta 600, un detector de diodos alineados modelo 966, un inyector automático modelo
717 plus, y un colector de fracciones automático (Waters Corp., Mildford, MA, EEUU)
Se usa una columna C18 Prep NovaPack® HR, 7.8 x 300 mm y 6 μm de tamaño de poro
(Waters), con un cartucho Cι8 (Waters) como guardacolumna. Los análisis se realizan a
30°C y la detección a 214 y 280 nm. La adquisición de los datos se lleva a cabo con el Software Millennium versión 3.2 (Waters). Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de agua (fase A) y acetonitrilo (fase B) con 0J % de TFA en cada uno de ellos y un flujo de 4 ml/min. El gradiente de fase B es del 2% al 10% en 15 min, del
10% al 20% durante 35 min, del 20% al 30% durante 20 min, se lava la columna con
70% de B y finalmente se acondiciona en las condiciones iniciales durante 15 min. El volumen de muestra inyectado es de 200 μl, Antes de la inyección, las muestras se pasan por un filtro Millipore (Waters) de 0.45 μm. Análisis mediante espectrometría de masas en tándem (off-line) Se emplea un equipo de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). La muestra se inyecta en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4 μl/min, utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado, y opera con una presión de helio de 5 x 10~3 bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tándem para la identificación de las secuencias peptídicas se realiza con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).
Análisis mediante RP-HPLC acoplado on-line a espectrometría de masas en t ndem (RP-HPLC-MS/MS) Se emplea un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie 1100) está formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna es una columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm di., 5 μm de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0.37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50 μl de muestra, a una concentración de 1-2 mg/ml. Se emplea un flujo de 0.8 ml/minuto, con un gradiente lineal de 0% al 30% del disolvente B en A en 25 minutos. El eluyente se monitoriza a 214 nm, mediante espectrofotometría de masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en el apartado anterior, salvo que el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador es de 60 μl/min.
Estudio de la actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas Se estudia el efecto de varios de los péptidos identificados y de algunos productos que los contienen (por ejemplo el hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas y la fracción del mismo menor de 3000 Da) sobre la presión arterial de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y de ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las SHR. Este estudio se realiza con SHR (10) y WKY de 17-24 semanas de edad y peso comprendido entre 300 y 350 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A. Las ratas se almacenan e jaulas de cinco en cinco y se mantienen a una temperatura estable de 25°C con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición. Para realizar las medidas de presión arterial sistólica (PAS) se utiliza un equipo de "tail cuff (método del manguito en la cola) (Le5001, Letica) que proporciona un valor digital de la PAS automáticamente y registra y facilita la frecuencia cardiaca de los animales. Se realizan varias medidas, y se obtiene la media de todas ellas para conseguir un valor fiable de la PAS. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, éstas se exponen a una temperatura próxima a los 30°C para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbran al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión. La administración de los productos a ensayar se realiza mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana. Las SHR utilizadas para el estudio tenían valores de PAS comprendidos entre 230 y 280 mm Hg. Las WKY utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS comprendidos entre 160 y 200 mm Hg. Se toman medidas de la PAS de los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta las 8 horas post-administración de los productos a ensayar; adicionalmente se toma una medida de la PAS 24 horas después de la administración de dichos productos. Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS en ratas sondadas) se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 1 mi de agua. Como control positivo, se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 50 mg/kg de Captopril (fármaco TECA prototipo). Esta dosis de Captopril se administra a cada rata en un volumen de 1 mi. Para establecer el efecto de la clara de huevo no hidrolizada sobre la presión arterial de los animales, se llevan a cabo ensayos semejantes a los descritos anteriormente, en los que los animales se tratan por el mismo procedimiento con 200 mg/kg de clara de huevo previamente liofilizada (testigo). Los resultados obtenidos se agrupan y se obtiene la media ± el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 9 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados se comparan siempre con los datos que se consideran control negativo. Para compararlos y obtener la significación estadística se utiliza el test de la "t" de "Student" para datos no apareados y se considera significativa la diferencia para valores de p<0.05.
Breve descripción del contenido de las figuras La figura 1 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (π), 200 mg/kg de clara de huevo (CH) (X), y diferentes dosis del hidrolizado de clara de huevo (HCH): 100 mg/kg
( ), 150 mg/kg (A), 200 mg/kg (m), y 400 mg kg (Δ). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración. La figura 2 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (D) y diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo (F<3000 Da): 25 mg/kg (4), 50 mg/kg (A) y 100 mg/kg (" ). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración. La figura 3 A es un cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala preparativa de la fracción menor de 3000 Da producida mediante hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 h, en el que se seleccionan 9 fracciones (F1-F9), que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos. La figura 3 B representa la capacidad TECA, expresada como la concentración proteica necesaria para inhibir el 50 % de la enzima (IC50), correspondiente a cada una de las 9 fracciones recogidas mediante el RP-HPLC a escala preparativa. La figura 4 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua ( o), 50 mg/kg de Captopril (D) y diferentes dosis del péptido YAEERYPΓL: 0.5 mg/kg (i), 1 mg/kg (A) y 2 mg/kg (u). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcunido desde la administración. La figura 5 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (π) y diferentes dosis del péptido RADHPFL: 0.5 mg/kg (4), 1 mg/kg (A) y 2 mg/kg (m). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración. La figura 6 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua (X), 50 mg/kg de Captopril (π) y diferentes dosis del péptido INF: 1 mg/kg (Φ), 2 mg/kg (A) y 4 mg/kg (u). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración. La figura 7 representa la variación de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas Wistar-Kyoto normotensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 mi de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (D), 200 mg/kg de CH (X), 400 mg/kg de HCH (•), 100 mg kg de la fracción menor de 3000 Da de HCH (F<3000 Da) (Δ), 2 mg/kg del péptido YAEERYPEJ», 2 mg/kg del péptido RADHPFL (A ) y 4 mg/kg péptido ΓVF(B). Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales.
En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos ilustran la invención, aunque no deben considerarse como limitativos del alcance de la misma,
Ejemplo 1. Obtención de péptidos bioactivos, con actividad IECA y antihipertensiva, a partir de clara de huevo hidrolizada con pepsina a presión atmosférica El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato clara de huevo de gallina, procedente de huevos frescos, separada de la yema y liofilizada. Como enzima, se utilizó pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 100 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HC1 1N. Se añadió pepsina (relación enzima sustrato 1/100, p/p). La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37 °C durante 24 horas, a presión atmosférica (0.1 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1N. Se midió la actividad JECA en alícuotas recogidas tras diferentes tiempos de hidrólisis, 0, 30 minutos, 3, 5, 8 y 24 horas. Los resultados mostraron que la clara de huevo sin hidrolizar no posee actividad IECA (IC50 > 750 μg/ml), pero inhibe a la ECA activamente tras distintos tiempos de hidrólisis con pepsina, alcanzándose una importante inhibición tras 3 horas de hidrólisis (ICso = 200.9 ± 1.5 μg/ml; 55.3 ± 2.1 μg/ml; 72.2 ± 2.3 μg/ml; 43.07 ± 1.4 μg/ml; 40.2 ± 0.9 μg/ml; a los 30 min, 3, 5, 8 y 24 horas, respectivamente). La fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas se obtuvo mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofílica de 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA, EEUU), centrifugando a 1900 g durante 40 minutos. Se midió la actividad IECA en el retenido (fracción de tamaño >3000 Da) y en el permeado (fracción de tamaño <3000 Da). Los valores de IC50 fueron, respectivamente de 298.4 y 34.5 μg/ml. Esto pone de manifiesto que el permeado posee aproximadamente 10 veces más actividad JECA y que, por tanto, la actividad se debe fundamentalmente a péptidos de pequeño tamaño. Se ensayó la actividad antihipertensiva del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas y su fracción menor de 3000 Da en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY). Se administraron distintas concentraciones de ambos ovoproductos liofilizados a los animales que, en el caso del hidrolizado, estaban comprendidas entre 100 y 400 mg/kg, y en el caso de la fracción menor de 3000 Da, entre 25 y 100 mg/kg. Las Figuras 1 y 2 muestran, respectivamente, la disminución de la PAS obtenida en SHR en distintos momentos tras la administración de diferentes dosis del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas, y tras la administración de diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da de dicho hidrolizado. Los resultados de estos ensayos con clara de huevo no hidrolizada (testigo) (200 mg/kg) se representan en la figura 1. En ella puede observarse que los valores de PAS correspondientes al testigo son semejantes a los valores de PAS de los animales a los que se administra agua. En estas figuras se incluye, además, la disminución de la PAS observada tras la administración de Captopril. El Captopril produce una pronunciada disminución de la PAS en las SHR. La disminución de la PAS es máxima 6 horas después de la administración del fármaco. El hidrolizado de clara de huevo y la fracción menor de 3000 Da ocasionan significativas disminuciones dosis-dependientes de la PAS en los animales. Los menores valores de la PAS después de administrar el hidrolizado de clara de huevo y la fracción menor de 3000 Da de este hidrolizado, se observan también 6 horas después de su administración. Los valores de la PAS observados 24 horas después de las distintas administraciones son semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas. Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad PECA y/o antihipertensiva, la fracción menor de 3000 Da obtenida tras la hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 horas se liofilizó y redisolvió en agua a una concentración de 50 mg/ml y se fraccionó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa. Tal y como se muestra en la Figura 3 A, se recogieron 9 fracciones (tras, aproximadamente, 10-12 análisis), que se congelaron, liofilizaron y se mantuvieron a -20 °C hasta su utilización. Cada fracción se redisolvió en agua milli-Q y se midió la actividad IECA. Como se muestra en la Figura 3 B, las subfracciones más activas fueron la 6, 7 y 8, que se analizaron por espectrometría de masas en tándem para determinar sus péptidos constituyentes. Con ese fin, las subfracciones peptídicas 6, 7 y 8, recogidas mediante RP-HPLC preparativo, se liofilizaron y se disolvieron a una concentración de 5-10 μg/ml en una mezcla de acetonitrilo al 50 % en agua conteniendo 0.3 % de ácido fórmico. Los péptidos identificados se muestran en la tabla 2. Debe destacarse que todos los péptidos procedían de la ovoalbúmina. Tabla 2. Péptidos identificados en las subfracciones 6, 7 y 8 de la fracción . menor de
3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante tres horas Masa Masa
Fracción. 11°. Proteína Posición Aminoácidos Secuencia n° experimental teórica 6 592.3 592.32 üvoalbúrπina 212-210 YQIGL SEQ. ΪD. ¥. . i 6 377.2 377.23 Ovσalbúrnina 178-180 l'V'F SEQ. ΪD. N°. 2 6 854.4 854.44 Ovoalbú-nina 359-365 RADHPFL SEQ. ΪD. N°. 3 6 365.2 365.20 Gvoa ina 99-101 FSL SEQ. ΪD. N°. 4 7 721.3 721.37 Ovoalbúmina 256-26 i ESÜNF 7 1001.4 1001.51 Ovoalbúmina 358-365 FRADHPFL SEQ. ID. N°. 5 7 1152.3 1152.58 Ovoalbúmina 106-1 14 YAEERYPΠ. SEQ. ID. N° 6 8 757.2 757.41 Ovoalbúmina 84-89 RDILNQ SEQ. ID. N°. 7 8 1040.2 1040.58 Ovoalbúmina 243-252 V LPDEVSGL 8 491.1 491.24 Ovoalfaúmina 36-40 SALAM SEQ. ΪD. W. 8 8 487.1 487.26 Ovoalbú ina 144-147 EI.IN 8 1164.2 i ] 04.59 Ovoalbúniina 125-134 Y'RGGLEPÍNF
EjeoipI© 2. Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad TECA y antifaipertensiva Se sintetizaron químicamente todos los péptidos identificados, mencionados en la Tabla 2 del ejemplo 3, mediante el método Fmoc en fase sólida con un sinteíizador modelo 43 JA de Applied Biosystems Inc. (Überlingen. Alemania). La pureza de los péptidos sintéticos se verificó mediante RP-H.PI.C~MS MS. Se midió la actividad ÍECÁ de los péptidos sintéticos. La actividad encontrada se muestra en la tabla 3. Destacan por su actividad 8 péptidos con ICJO inferiores a 450 μM y, sobre todo, las secuencias: SEQ. LO. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6, con IC50 inferiores a 34 μM.
Tabla 3. Actividad BECA de los péptidos identificados en las subfracciones 6, 7 y 8 de la fracción menor de 3000 Da hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante tres horas Secuencia n° Aminoácidos IC 50 (μM) SEQ ÍD N° 1 VQIGL ¡ 73 8 SLQ K° 2 JVF 33 9 SEQ ID ° 3 RΛDHPFJ 6 2 SEQ ID N° 4 FSL 172 9 fcSUNJ" > 1000 SEQ ID N° 5 RADJIPFL 3 2 SEQ ID N°. 6 YAEF.RYPIL 4 7 SEQ ÍD. N° 7 RDILNQ 435 7 VLLPDEVSGL > 1000 SLQ m. S° 8 SAIAM 229 1 F.LIN > 1000 YRGGLEPTNF > 1000 Se ensayó la actividad antihipeitensiva de los péptidos SEQ lü 3NP 2, SLQ ID
N° 3 v SEQ. ID N° 6, para lo cual se administraron diferentes dosis de los mismos a SHR y a WKY, siendo la dosis máxima utilizada siempre equivalente en unidades de actividad SECA a la dosis 50 mg/kg de la fi acción menoi de 3000 Da del hidrohzado de claia de huevo Los popados se disolvieron en agua destilada y la dosis correspondiente se administró a cada rata en un volumen de J mi Las. Figiuas 4, 5 y 6 muestran las disminuciones de la PAS obtenidas en SHR en distintos momentos, tras la administración de distintas dosis de los péptidos SEQ ID N° 6, SBQ JD N° 3 y SEQ ÍD N° 2 Se puede observar que la administración de estos péptidos ocasiona una disminución dosis-dependiente significativa de la PAS en estos animales La disminución de Ja PΛS es máxima 6 horas después de la administración de estos pépüdυs. y la disminución máxima obtenida es además similar con los diferentes péptidos La Figura 7 muestra, los cambios de la PAS obtenidos en ralas WKY en distintos momentos, tras la administración de los siguientes compuestos 400 mg/kg del hidrolizado de clara de huevo, 100 mg/kg de ia fracción menoi de 3000 Da del hidrolizado, 2 mg/kg del péptido SEQ.LD.N0. 6, 2 mg/kg del péptido SEQ.ID.N0. 3, y 4 mg/kg del péptido SEQ.JJD.N0. 2. También se incluyen los resultados obtenidos tras la administración de 50 mg/kg de Captopril, Puede apreciarse, que ninguno de estos compuestos modifica la PAS de las ratas WKY cuando se administra la dosis más alta utilizada. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables de los productos ensayados sobre la presión arterial de sujetos normotensos. Los resultados presentados demuestran que los péptidos identificados por las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6, tienen un claro y pronunciado efecto antihipertensivo, que tras su administración aguda sigue un curso temporal semejante al efecto antihipertensivo que se aprecia cuando se administra el hidrolizado de clara de huevo o la fracción menor de 3000 Da de dicho hidrolizado.
Ejemplo 3. Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad antioxidante Se midió la actividad anti oxidante de uno de los péptidos identificados, concretamente la secuencia SEQ. ID. N°. 6, mencionada en el ejemplo 1. La actividad encontrada se muestra a continuación: TEACγAEERYPIL (l minuto) = 0.8 TEACYAEERYPI (6 minutos) = 1.2 TEACYAEERYPIL (l O minutos) == 1.3
Los resultados muestran, por tanto, que 1 mg de YAEERYPJL (SEQ. ID. N°. 6) presenta 1.3 veces más actividad antioxidante que 1 mg de Trolox.
Ejemplo 4. Obtención de péptidos bioactivos a partir de ovoalbúmina hidrolizada con pepsina a presión atmosférica El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato ovoalbúmina grado VI (99% de pureza) (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 100 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HC1 1N. En ésta realización particular de la invención se añadió pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma) a una relación enzima/sustrato 1/100, p/p. La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37 °C durante 3 horas, a presión atmosférica (0.1 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1N. La medida de la actividad JECA demostró que la ovoalbúmina sin hidrolizar no posee actividad JECA (IC50 > 750 μg/ml), pero inhibe a la enzima tras 3 horas de hidrólisis con pepsina (IC50 = 129.0 ± 0.6 μg/ml). El hidrolizado así obtenido se analizó mediante RP-HPLC-MS/MS. Se encontraron, al menos, las secuencias: SEQ. JO. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ.
ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8. Entre ellas, las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3,
SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. JD. N°. 6 poseen IC50 inferiores a 34 μM (ejemplo 2). Las SEQ.
ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. LO. N°. 6 presentan, además actividad antihipertensiva en ratas (ejemplo 2), y la SEQ. ID. N°. 6 posee actividad antioxidante frente a radicales libres (ejemplo 3).
Ejemplo 5. Obtención de péptidos bioactivos a partir de ovoalbúmina hidrolizada con pepsina bajo condiciones de alta presión hidrostática El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato ovoalbúmina grado VI (99% de pureza) (Sigma). Como enzima, se utilizó pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 2 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HC1 1N. Se añadió pepsina (relación enzima/sustrato 1/20, p/p). La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37 °C durante 30 min, a distintas presiones hidrostáticas (100, 200, 300 y 400 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1N. Los tratamientos con alta presión se realizaron en un equipo discontinuo de presión hidrostática (900 HP Eurotherm Automation) con capacidad para 2350 mi, que alcanza una presión de 500 MPa. La cámara de alta presión está constituida por un cilindro de acero inoxidable, llena del medio transmisor de la presión (agua), en cuyo interior se introduce la mezcla de sustrato y enzima, envasada en un tubo de plástico Eppendorf sin dejar cámara de aire. El equipo alcanza la presión deseada a una velocidad de 2.5 MPa/segundo y, tras el tratamiento, desciende a cero a la misma velocidad. El equipo va a acompañado de un baño auxiliar que, mediante la circulación de agua a través de una camisa exterior que rodea al cilindro, permite realizar tratamientos a temperaturas desde -20°C hasta 95°C. La temperatura del proceso se controla mediante un termopar sumergido en el medio transmisor de la presión. Los hidrolizados así obtenidos se analizaron mediante RP-HPLC-MS/MS. Se encontraron, al menos, las secuencias: SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6 que, como se indicó en el ejemplo 2, poseen IC50 inferiores a 7 μM. Las SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6 presentan, además actividad antihipertensiva en ratas (ejemplo 2), y la SEQ. ID. N°. 6 posee actividad antioxidante frente a radicales libres (ejemplo 3). Este ejemplo muestra como el empleo de altas presiones hidrostáticas permite obtener hidrolizados conteniendo péptidos activos más rápidamente que efectuando las hidrólisis a presión atmosférica. Cabe destacar que no se obtuvo, bajo estas condiciones, la SEQ. ID. N°. 2, lo que podría tener incidencia en la aplicabilidad industrial de los hidrolizados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo caracterizado por a. poseer actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante. b. tener un peso molecular comprendido entre 365,2 y 1152,58 c. ser péptido identificado con las secuencias de aminoácidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°.
2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. DD. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8 2. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivindicación 1 caracterizado por obtenerse mediante un procedimiento de síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes.
3. Procedimiento para producir productos bioactivos según la reivindicación 1 y 2 caracterizado por a, obtenerse por hidrólisis del material de partida que sería cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal o procedentes de rnicrooganismos, preferiblemente ovoalbúmina o clara de huevo que cuya secuencia de aminoácidos comprendiese la secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en la reivindicación 1, b. disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica, c. emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2-0-3.0; o microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato, y d. el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 min y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 3 horas.
4. Procedimiento para producir productos bioactivos según la reivindicación 3 caracterizado por emplear altas presiones hidrostáticas entre 100 y 1000 MPa, preferentemente 400 MPa, para acelerar la hidrólisis del sustrato sin inhibir la enzima proteolítica y/o modificar el perfil de los péptidos obtenidos
5. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis erizimática de proteínas de la clara de huevo caracterizado porque para su obtención se emplean los procedimientos indicados en la reivindicaciones 3 y 4,
6. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivindicación 5 caracterizado porque el material de partida es entre otros, ovoalbúmina pura, clara de huevo y huevo entero en sus diferentes formas de presentación, u ovoproductos destinados a hostelería y restauración, complementos dietéticos para deportistas ovoproductos para alimentación animal.
7. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivmdicación 6 caracterizado porque se trata del hidrolizado enzimático, cualquiera de sus f acciones, o una purificación de los mismos que contenga al menos alguno de los péptidos indicados en la reivindicación 1
8. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo caracterizados por ser derivados o sales farmacéuticamente aceptables o sus mezclas de cualquiera de los productos bioactivos indicados en las reivindicaciones 1,2 5,6 y 7.
9. Composición farmacéutica caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad TECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1,2 5,6 y 7.
10. Aditivo, ingrediente o suplemento alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1,2 5,6 y 7.
11. Producto alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1,2 5,6 y 7.
12. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 9 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.
13. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario funcional según la reivindicación 9 en la elaboración de un producto alimentario funcional favorable para reducir la hipertensión.
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