CN101428137A - 血中中性脂肪减少组合物 - Google Patents

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Abstract

一种用于安全和有效地减少血液中中性脂肪的组合物，该组合物包含作为活性成分的大豆蛋白，该大豆蛋白包含占蛋白至少50％从大豆蛋白分级出来的7S球蛋白并具有占蛋白0.2％或更低的肌醇六磷酸含量。组合物的效果通过去除与脂相关的蛋白和减少可溶于氯仿/甲醇中的油类物质而进一步提高。

Description

血中中性脂肪减少组合物
本申请是分案申请，其母案是申请日为2001年9月28日、申请号为01819556.3、发明名称为“血中中性脂肪减少组合物”的申请.
技术领域
本发明涉及中性血脂减少组合物.
背景技术
植物蛋白当中，大豆蛋白不仅具有卓越的营养性能而且最近还发现具有各种各样生理学功效，并作为生理学功能剂正成为一种令人瞩目的食品材料.
大豆蛋白的中性血脂减少效应现已公认基于大豆蛋白对体内脂肪的减少效应，其机理据Iritani等人报告(《J.Nutr.(营养学杂志)》，126，380，1996)是对肝脏中脂肪酸合成酶活性的抑制作用。另外，曾研究了完整大豆球蛋白，7S球蛋白和11S球蛋白中每一种，对于血液中和肝脏中脂肪的作用，一般均报道在减少血液胆固醇或中性脂肪的能力上比作为动物蛋白的酪蛋白更优异(Okita等人，《J.Nutr.(营养学杂志)》，27，379，1981)。
还报道过11S球蛋白-缺少的大豆，即富含7S球蛋白的种子，可通过繁殖获得(Breeding Science《繁殖科学》，46，11，1996)，还报道过其应用(《繁殖科学》Breeding Science，50，101，2000)及其专利(US 6,171,640B1)。
然而，大豆蛋白，包括7S球蛋白，已知与肌醇六磷酸生成配合物并从而对大豆蛋白的消化产生不利影响(M.A.Ritter等人，J.Food Sci.《食品科学杂志》，52，325，1987).
作为大豆衍生的蛋白，对作为细胞质膜成分以及作为蛋白体或油体膜的极性脂具有高亲和力的蛋白，已由Samoto等人鉴定并命名为“油体缔合蛋白”.油体缔合蛋白是一类蛋白的统称，主要由膜蛋白，尤其是分子量按SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定为34kDa、24kDa和18kDa，并作为含约10～12wt％可用2:1氯仿:乙醇极性溶剂混合物萃取的极性脂的级分存在的那些，且据Samoto等人报道以占工业生产的分级大豆蛋白高达约35％的数量产出(B.B.B.，62(5)，935-940(1998))。油体缔合蛋白味道很差且具有高变应原性.
然而，鉴于油体缔合蛋白在常用来确定大豆蛋白组成的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中仅略微染色，故其估计含量变得远比其实际含量小或甚至可忽略不计.于是，传统的分级处理仅着眼于7S和11S上，而对油体缔合蛋白这种污染每一个级分的成分却不予理会.但是，从生理学观点来看，为了制取较高纯度的7S和11S必须考虑到这些油体缔合蛋白的性能.
为有效地从大豆蛋白中制备7S球蛋白，同时在配合物分解中切断肌醇六磷酸的配合物键合并抑制油体缔合蛋白的污染作用从而提高纯度，不仅对于用作旨在减少中性血脂的极其安全药物材料而且对于用作食品材料都是非常重要的.
发明目的
本发明的目的是从大豆蛋白中制取一种具有中性血脂减少能力的级分并处理该级分以提高其能力，从而以食品或医药形式提供用.
发明概述
我们做了深入研究并获得以下发现.
(1)当采用作为分级大豆蛋白的标准程序的Thahn和Shibasaki方法从脱脂大豆中除掉11S球蛋白，随后从中分级出7S球蛋白时，不采用任何还原剂(reducing agent)就可能实现高达50％或更高纯度的分级.
(2)当上面描述的7S球蛋白和切断肌醇六磷酸与7S球蛋白的键合以后获得的7S球蛋白(以下称肌醇六磷酸减少的7S球蛋白)接受在鼠体内以酪蛋白作为对照样的21日研究时，7S球蛋白和肌醇六磷酸减少的7S球蛋白表现出比酪蛋白更优异的中性血脂减少能力，其中肌醇六磷酸减少的7S球蛋白表现出特别高的中性脂肪减少效果.
(3)响应该中性脂肪减少效应的开始，血液胆固醇水平下降.虽然7S球蛋白和减少的肌醇六磷酸减少的7S球蛋白都显示出此种胆固醇降低的能力，但HDL-胆固醇(HDLC)水平则毋宁说是由于肌醇六磷酸减少的7S球蛋白的作用而改善的.
HDLC是所谓回收多余胆固醇的好胆固醇，而HDLC水平的改善，当与总胆固醇降低效应相结合时，将导致动脉硬化指数大幅降低.
动脉硬化指数＝(总胆固醇-HDL胆固醇)/HDL胆固醇。
(4)通过以肌醇六磷酸分解酶进一步处理大豆蛋白，可分级出一种已经裂解(cleave)去肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸钙镁7S球蛋白.
(5)通过进一步去除污染大豆蛋白的富含膜蛋白的油体缔合蛋白，7S球蛋白作为活性成分的功效可进一步提高.
结果发现，通过从被认为具有中性血脂减少作用的7S球蛋白上裂解掉肌醇六磷酸和通过去除油体缔合蛋白以提高纯度，可达到更高的功效并相应地减少剂量，从而确立本发明.
本发明提供一种中性血脂减少组合物，其活性成分是一种富7S球蛋白的肌醇六磷酸减少的大豆蛋白.还提供一种中性血脂减少组合物，其活性成分是肌醇六磷酸减少的高纯度7S球蛋白，该蛋白是一种通过提纯含大量作为大豆蛋白主要成分的7S球蛋白的级分至高达50％或更高的蛋白纯度(以下面所描述的SPE为基准)而获得的富7S球蛋白的大豆蛋白，其中氯仿：甲醇-可萃取极性脂，作为油体缔合蛋白的指数，已降低到1/3或更低，且其中肌醇六磷酸这种在市售大豆蛋白产品中占蛋白约2％含量的成分已通过将肌醇六磷酸裂解掉而降低到占蛋白的0.2％或更低的水平.于是，借助一种涉及尽可能抑制富膜蛋白的油体缔合蛋白的污染以及肌醇六磷酸裂解的分级处理，可提供一种功效进一步提高的中性血脂减少组合物。另一方面，通过在大豆蛋白制造过程中使用一种肌醇六磷酸分解酶，7S球蛋白的分级得到进一步促进，从而提供一种含作为活性成分的高纯度、肌醇六磷酸减少的7S球蛋白的中性血脂减少组合物，因为肌醇六磷酸已减少到占蛋白0.2％或更低，并且油体缔合蛋白降低到了10％或更低.还提供一种中性血脂减少组合物，在其如上所述的制造过程中不需要使用任何还原剂.
优选实施方案详述
本发明涉及以下实施方案：
实施方案1.一种中性血脂减少组合物，它包含肌醇六磷酸减少的大豆蛋白作为其活性成分，其包含占蛋白50％或更多的7S球蛋白，以及其肌醇六磷酸含量占蛋白的0.2％或更低.
实施方案2.实施方案1的中性血脂减少组合物，其包含占蛋白80％或更多的7S球蛋白.
实施方案3.实施方案1的中性血脂减少组合物，它包含占蛋白10％或更少的油体缔合蛋白.
实施方案4.实施方案1的中性血脂减少组合物，它包含占蛋白1％或更少的2∶1的氯仿：甲醇可溶性级分.
实施方案5.实施方案1的中性血脂减少组合物，它是通过使大豆蛋白与肌醇六磷酸分解酶起反应而获得的.
实施方案6.实施方案1的中性血脂减少组合物，它是由含占蛋白50％或更多的7S球蛋白的大豆制备的.
实施方案7.实施方案1的中性血脂减少组合物，它是在制造过程中不采用任何还原剂而制成的.
在本发明中，7S球蛋白是指一种球蛋白，在众多被统称为球蛋白的可溶性球状蛋白当中，其超离心沉积系数是7S.按分子量分布划分，球蛋白划分为2S、7S、11S和15S，这当中7S和11S据知在诸如大豆之类的豆类植物储存蛋白中含量丰富.大豆的7S球蛋白与免疫学术语β-conglyc inin实质上是相同的.
在本发明中，从大豆蛋白获得的富7S球蛋白级分用作主要成分.从大豆蛋白分级出7S球蛋白的第一步涉及去除11S球蛋白.该去除可采用已知方法来实现，包括：目前被广泛用来获得每种球蛋白级分的Thahn和Shibasaki的方法(Thahn，V.H.，和Shibasaki，K.，(J.Agric.Food Chem.)《农业食品化学杂志》，24，117，1976)，以及利用低温沉淀的冷不溶性分级(CIF)方法(Briggs，D.R.，和Mann，R.L.，(Cereal Chem)《谷物化学》，27，243，1950)和Wolf等人提出的加入0.1N氯化钙的分级方法(Wolf，W.J.，和Sly，D.A.，(CerealChem)《谷物化学》，44，653，1967).按下面生产实施例2中所描述的方法去除11S和油体缔合蛋白以后制成的级分也可使用.???
通过以上所述的任何一种方法去除11S球蛋白以后，7S球蛋白按制备离析的大豆蛋白的普通方法分级出来.在这样的程序中，纯度足以为应用所接受的7S球蛋白可以在没有还原剂存在下获得，而这种不存在还原剂也有利于当作中性脂肪还原剂使用的较宽领域使用.可获得一种富7S球蛋白大豆蛋白，其蛋白纯度(以SPB为基准)是50％或更高，优选60％或更高，更优选80％或更高，尤其是85％或更高。如此获得的富7S球蛋白进一步接受具有肌醇六磷酸分解活性的酶，例如肌醇六磷酸酶或磷酸酶或其制剂的处理，从而裂解掉肌醇六磷酸.结果，通过将肌醇六磷酸裂解到占蛋白的0.2％或更低，优选0.1％或更低，更优选0.05％或更低水平所获得的、由肌醇六磷酸减少的7S球蛋白天然具备的中性血脂减少能力将得到提高.
通过按如上所述裂解掉肌醇六磷酸所获得的肌醇六磷酸减少的7S球蛋白的分级方法可与11S球蛋白的去除同时地完成，即，以诸如肌醇六磷酸酶和磷酸酶及其制剂之类具有肌醇六磷酸分解活性的酶直接处理大豆蛋白.
进而，通过去除油体缔合蛋白，该肌醇六磷酸减少的7S球蛋白的中性血脂减少能力可得到进一步提高.为此目的，油体缔合蛋白可在弱酸性pH(pH3.8～6.8)——此时它们将趋于不溶解——经过加热(30～75℃)之后，在pH5.6～6.8进行沉淀而被去除.
本发明组合物可配制成口服组合物，其活性成分为按如上所述获得的级分或大豆蛋白，并可按已知方法配制成各种各样剂量形式如粉末、糖衣片剂和丸剂，任选地配以其他赋形剂和添加剂.
本发明用作活性成分的级分或大豆蛋白是一种可安全食用的材料，其在组合物中的加入量或摄入量不受特定限制，并且可以原封地摄入，或者可结合到食品中作为一种饮食疗法.每千克体重的优选摄入量介于50～500mg，优选100～300mg，按富7S球蛋白的肌醇六磷酸减少的大豆蛋白计.
实施例
本发明的用途将在下面的实施例中进一步讨论，但这些实施例不应限制本发明法技术宗旨.
现就本发明采用的主要分析方法描述如下.
*粗蛋白：根据Kjeldahl方法，测定氮含量并乘以系数6.25换算为粗蛋白.
*SDS-聚丙烯酰胺电泳：根据Laemmli的方法(Nature《自然》，227，680(1970))，分析在10％～20％的梯度凝胶浓度下进行.施加的样品量为10μg.
*肌醇六磷酸：采用AliiMohamed的方法(Cereal Chemistry《谷物化学》，63，475～478，1986).
*氯仿甲醇-可萃取油分数：干燥样品与约50倍体积氯仿与甲醇(2:1，体积比)混合，然后确定被回流萃取出的固体的重量比，即作为氯仿·甲醇-可萃取油分数.
*纯度(SPE标准)：在上面描述的SDS-聚丙烯酰胺电泳中获得的谱带图案，采用光密度计测出，于是，对应带在总面积中所占面积百分数即代表纯度(根据SPB)。本文提到的7S球蛋白含量是指α，α’和β亚单元的总量，而11S球蛋白含量是指酸性多肽(A)与碱性多肽(B)的总量。
*校正纯度：基于上面获得的纯度(根据SPE)并考虑任何夹杂的油体缔合蛋白，校正纯度按如下所述计算.譬如，样品纯度(根据SPE)用A％代表，然后计算以包括7S球蛋白、11S球蛋白和油体缔合蛋白在内的总蛋白为基准的数值，因为除了7S球蛋白和11S球蛋白之外，样品还包含至少十倍于氯仿·甲醇-可萃取油部分数量的油体缔合蛋白。
校正纯度(％)＝(100(％)-氯仿·甲醇-可萃取油部分(％)*10)*A(％)/100
*中性脂肪、总胆固醇、HLD胆固醇(HDLC)：在固相法中采用富士胶片公司制造的DRYCHEM型号5500.
下面描述本发明优选的实施方案.
生产实例1(7S球蛋白＝“7S”和肌醇六磷酸减少的7S球蛋白＝“7S-PH”的制备)
脱脂大豆与水按1:10的重量比合并且在搅拌下在1h内调节到pH7.0，然后离心分离(4000rpm，20℃，10min)以除掉沉淀.获得的上层清液调节到pH6.4，在4℃静置过夜，离心分离(4000rpm，4℃，10min)以除掉沉淀。获得的上层清液调节到pH4.5并离心分离(4000rpm，4℃，10min)，并回收形成的沉淀即作为7S球蛋白凝乳(curd).
该7S球蛋白凝乳与4倍体积水合并，调节到pH6.0，按以蛋白为基准0.2％补加肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)，然后在40℃反应1h.反应混合物调节到pH5.0，离心分离(4000rpm，20℃，10min)以除掉乳浆部分，从而获得低肌醇六磷酸7S球蛋白凝乳.7S球蛋白凝乳和低肌醇六磷酸7S球蛋白凝乳都进行水化，然后中和到pH7.0，在140℃灭菌15s，继而快速喷雾干燥以获得7S球蛋白和肌醇六磷酸减少的7S球蛋白。如此获得的7S球蛋白和肌醇六磷酸减少的7S球蛋白各自经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，染色蛋白带的色强度揭示，纯度为80％.肌醇六磷酸在两种样品中的含量分别为1.8％和0.05％，表明，肌醇六磷酸处理导致肌醇六磷酸几乎完全裂解.该样品的氯仿·甲醇-可萃取油分数是2.8％.另一方面，含硫氨基酸胱氨酸和蛋氨酸的总含量是25mg/g蛋白，高于提纯的7S天然具有的5mg/g蛋白，表明，仍然残留着相当数量杂质.
生产实例2(高纯度、肌醇六磷酸减少的7S球蛋白：“7S-PH-LP”的制备)
1重量份低改性脱脂大豆在40℃与10重量份萃取水合并，用盐酸调节到pH5.3.该溶液中补加按蛋白计8单位肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)并同时地进行30min在40℃下的蛋白萃取和酶反应，以获得酶处理的淤浆萃取物.该酶处理的淤浆萃取物冷却至约25℃，用盐酸调节到pH6.1，并采用间歇式离心机离心分离(3000G).随后，立即观察到可溶性部分与不溶性部分之间明显的分离.该离心机的溶液温度是为约25℃.随后，可溶性部分用盐酸调节到pH4.9，再离心分离获得沉淀凝乳.该沉淀凝乳以10倍体积水洗涤，水化(至4倍重量)，用氢氧化钠中和，在140℃灭菌15s，然后快速喷雾干燥以获得肌醇六磷酸酶-处理的富7S球蛋白分级的大豆蛋白(“7S-PH-LP”).
如此获得的肌醇六磷酸减少的7S球蛋白接受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，染色蛋白带的色强度揭示，纯度为95％.肌醇六磷酸含量占到蛋白的0.05％，表明，肌醇六磷酸几乎完全裂解.另一方面，该样品的氯仿·甲醇-可萃取油分数是0.5％，这大大低于采用生产实例1获得的.含硫氨基酸胱氨酸和蛋氨酸的总含量是12mg/g蛋白，表明获得了一种高纯度7S，其含杂，考虑到一般提纯的7S所天然具有的5mg/g蛋白的数值，有了明显降低.
实例1(中性血脂减少效应在小鼠体内的证实)
中性血脂减少效应在小鼠体内做了验证.这里采用的每种饲料包含，作为食用蛋白，在上面描述的生产实例2中制取的大豆蛋白或作为对比例的酪蛋白(不含维生素的酪蛋白，ORIENTAL YEAST)，浓度20％，连同0.5％胆固醇和0.125％胆酸钠和蔗糖与玉米淀粉的1:2混合物.典型配方示于下表1.
表1每个处理组的饲料配方
Figure A200810160920D00101
实验动物为5周龄(生长期)和20周龄(成熟期)雄性Wistar小鼠(体重介于100～120g，和330～360g)，由NIPPON SLC购得，最初接受市售固体饲料(ORIENTAL YEAST，CRF-1)的饲喂达1周，然后总共分成两个处理组，每个组由6个动物组成，组与组之间没有体重偏差，然后动物以试验饲料喂养10日.每只小鼠关在单独笼子中，处于23±1℃的温度和55％±5％的湿度12小时光照时间(早7:00～晚7:00)之下.喂养期间，让动物随意(adlibitum)接受水和饲料.
处理时间为10日，其间监视体重.结果载于下表2和3.在这两组之间未观察到明显增重差异.
表2
5周龄小鼠处理组的体重变化，单位：g
Figure A200810160920D00102
表3
20周龄小鼠处理组的体重变化，单位：g
Figure A200810160920D00111
10天处理时间以后，每只小鼠从第11日的早晨(上午8:00)起被绑住7h，然后在以戊巴比妥钠麻醉之下接受剖腹手术，然后通过肝素化的针筒从腹大动脉抽取血液.该血液随后离心分离(3000rpm，5℃，15min)以分离血浆，并化验其中的中性脂肪和胆固醇。计算每组数据中的平均值和标准偏差，并采用Duncan多区间试验来分析统计学显著性。结果示于表4和5中.在表格中，中性脂肪减少百分数和胆固醇减少百分数是酪蛋白组与处理组之间各自数据之差相对于酪蛋白组数据的比值(％)。
表4
5周龄小鼠处理组中中性血脂的变化
Figure A200810160920D00112
单位：(水平)mg/dl，(比值)％
表5
20周龄小鼠处理组中中性血脂的变化
Figure A200810160920D00113
Figure A200810160920D00121
单位：(水平)mg/dl，(比值)％
从上面所示数据清楚地看出，肌醇六磷酸减少的7S球蛋白在生长期(5周龄)和成熟期(20周龄)组中都表现出胆固醇和中性血脂显著减少的效果.
对比例1(中性血脂减少在小鼠上的验证)
类似于实例1，在小鼠体内验证中性血脂减少效应.处理的饲料组成类似于实例1，不同的是采用生产实例1中获得的7S球蛋白(7S)作为大豆蛋白.
实验动物为5周龄雄性Wistar小鼠(体重介于90～110g)，由NIPPON SLC购得，最初接受市售固体饲料(ORIENTAL YEAST，CRF-1)的饲喂达1周，然后总共分成两个处理组，每个组由6个动物组成，组与组之间没有体重偏差，然后动物以试验饲料喂养3周.每只小鼠关在单独笼子中，处于(23±1)℃的温度和55％±5％的湿度在12小时光照时间(早7:00～晚7:00)之下.喂养期间，让动物随意接受水和饲料。
处理时间为21日，其间监视体重.结果载于下表6.在这两组之间未观察到明显增重差异.
表6
处理组的体重变化，单位：g
21天处理时间以后，每只小鼠从第22日的早晨(上午8:00)起被绑住6h，然后在以戊巴比妥钠麻醉之下接受剖腹手术，然后通过肝素化的针筒从腹大动脉抽取血液.该血液随后离心分离(3000rpm，5℃，10min)以分离血浆，并化验其中的中性脂肪和胆固醇.计算每组数据中的平均值和标准偏差，并采用Duncan多区间试验来分析统计学显著性.结果示于表7中。每项减少百分数都是采用类似于实例1中表4和5所用方法确定的.
表7
处理组中中性血脂的变化单位：g
Figure A200810160920D00131
单位：(水平)mg/dl，(比值)％
当与实例1中采用的肌醇六磷酸减少的7S球蛋白的胆固醇和中性脂肪相对于酪蛋白的减少效果进行比较时，对比例1中的7S球蛋白减少效果较低，表明，肌醇六磷酸减少的7S球蛋白比7S球蛋白具有更高的血脂改进效果.
实例2
考察了在生产实例2中制备的高纯度、肌醇六磷酸减少的7S球蛋白(7S-PH-LP)的中性血脂减少效果.作为对照例，采用在实例1中采用的酪蛋白、7S球蛋白(7S)、肌醇六磷酸减少的7S球蛋白(7S-PH)和市售分离大豆蛋白(SPI).每种蛋白的组成示于表8.
表8单位：％
Figure A200810160920D00132
类似于实例1的5周龄小鼠作为实验动物，喂养2周，其间在类似于实例1的条件下监视体重.处理期过后，类似于实例1采集血液，并化验中性脂肪和胆固醇.
结果包括表9所示的体重变化和表10所示中性脂肪、胆固醇、HDLC和由它们算出的动脉硬化指数.
表9单位：g
表10单位：mg/dl
Figure A200810160920D00142
根据上面所述结果，中性脂肪和胆固醇减少效应按以下顺序递增，酪蛋白<<SPI＝7S<7S-PH<7S-PH-LP，且HDLC在无肌醇六磷酸组中表现出改善.因此，通过去除肌醇六磷酸、又通过去除油体缔合蛋白获得的高纯度、肌醇六磷酸减少的7S球蛋白显示出最明显的血清脂改善效果，尤其是动脉硬化指数降低效果.
本发明使有效降低中性血脂水平成为可能，本发明组合物，由于具有高度安全性，故不仅作为预防或治疗药剂用于减少中性血脂水平十分有用，而且能作为食品用于该目的.

Claims (7)

1.一种中性血脂减少组合物，它包含肌醇六磷酸减少的大豆蛋白作为其活性成分，其包含占蛋白50％或更多的7S球蛋白，以及其肌醇六磷酸含量占蛋白的0.2％或更低.
2.权利要求1的中性血脂减少组合物，其包含占蛋白80％或更多的7S球蛋白.
3.权利要求1的中性血脂减少组合物，它包含占蛋白10％或更少的油体缔合蛋白.
4.权利要求1的中性血脂减少组合物，它包含占蛋白1％或更少的2∶1的氯仿：甲醇可溶性级分.
5.权利要求1的中性血脂减少组合物，它是通过使大豆蛋白与肌醇六磷酸分解酶起反应而获得的.
6.权利要求1的中性血脂减少组合物，它是由含占蛋白50％或更多的7S球蛋白的大豆制备的。
7.权利要求1的中性血脂减少组合物，它是在制造过程中不采用任何还原剂而制成的.
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