WO2002026243A1 - Composition permettant de reduire les graisses neutres dans le sang - Google Patents

Composition permettant de reduire les graisses neutres dans le sang Download PDF

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reducing
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Mitsutaka Kohno
Motohiko Hirotsuka
Toshiaki Aoyama
Kiyoharu Takamatsu
Yukio Hashimoto
Makoto Kito
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Fuji Oil Company, Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for reducing neutral fat in blood.
  • Soybean protein is not only excellent in nutritional properties among vegetable proteins, but also has various physiologically active effects in recent years, and is a food material that has attracted attention as a physiologically functional agent.
  • soy protein to lower triglyceride in blood has already been confirmed, including the effect of soy protein in lowering body fat percentage, and that the mechanism is to suppress the activity of fatty acid synthase in the liver. And Iriya et al. (Nutr., 126, 380, 1996).
  • the effects of whole soybean globulin, 7S globulin, and 11S globulin on blood and hepatic lipids have been studied.These effects are higher than that of casein, an animal protein, in blood cholesterol and medium. It is generally superior in its ability to reduce sexual fat (Okita et al., J. Nutr., 27, 379, 1981).
  • soy protein including 7S globulin, forms a complex with phytic acid and affects the digestibility of soy protein (Rita et al., J. Food Sci., 52, 325, 1987).
  • soybean-derived proteins also include proteins with high affinity for polar lipids that constitute cell membranes and other membranes such as protein bodies and oil bodies.
  • Body Associated Proteins Body Associated Proteins.
  • Lipid-associated protein is a generic name for a group of proteins mainly composed of membrane proteins.In particular, proteins that mainly show 34 kDa, 24 kDa, and 18 kDa in the estimated molecular weight by SDS-polyacrylamide electrophoresis are included.
  • Ethanol A fraction containing about 10 to 12% by weight of polar lipids that can be extracted with a polar solvent of 2: 1 polar solvent. Approximately 35% of industrially produced isolated soybean protein (BBB, 62 (5), 935-940 (1998)). In addition, lipid-associated proteins have a poor flavor and high allergenicity.
  • the present invention provides a food product by separating a fraction of soybean protein having a blood triglyceride-reducing ability, and subjecting the fraction to a treatment S that further enhances its effect. Or to provide as pharmaceuticals. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found the following as a result of intensive studies.
  • HDLC is a so-called good cholesterol that recovers excess cholesterol, and its improving effect, combined with the effect of lowering total cholesterol, greatly reduces the atherosclerosis index.
  • Atherosclerosis index (total cholesterol minus HD L cholesterol) D L cholesterol
  • soybean protein by treating soybean protein with phytic acid-degrading enzyme, low-phytin 7S globulin in which phytic acid is decomposed and removed is fractionated.
  • phytic acid-degrading enzyme by treating soybean protein with phytic acid-degrading enzyme, low-phytin 7S globulin in which phytic acid is decomposed and removed is fractionated.
  • lipid-associated proteins rich in membrane proteins mixed in soybean proteins the efficacy of the active ingredient 7S globulin can be further enhanced.
  • the present invention provides a composition for reducing triglyceride in blood, comprising a low phytic acid soy protein rich in 7S globulin as an active ingredient.
  • a fraction rich in 7S glopurine which is a major component of soy protein, is fractionated.
  • Soy protein rich in 7S glopurin which is fractionated with a protein purity (SPE standard described below) of 50% or more, is lipid-associated.
  • Polar lipids extracted with black-mouth form / methanol, which is an indicator of protein, are reduced to 1 Z 3 or less, and the phytic acid content, which is about 2% per protein in commercial soy protein products, is reduced to 0% per protein.
  • An object of the present invention is to provide a composition for reducing blood triglyceride containing low phytic acid and high purity 7S globulin decomposed and removed to 2% or less as an active ingredient.
  • a composition for reducing blood triglyceride containing low phytic acid and high purity 7S globulin decomposed and removed to 2% or less as an active ingredient.
  • phytic acid degrading enzyme is allowed to act in the soybean protein production process, thereby facilitating the fractionation of 7S glopurine, and reducing phytic acid to 0.2% or less per protein and lipid-associated protein.
  • composition for reducing triglyceride in blood comprising as an active ingredient a high-purity, low-phytate 7S glopurine, which is decomposed and removed to 10% or less.
  • the preparation was performed without adding a reducing agent.
  • a manufactured composition for reducing blood neutral fat is provided.
  • 7S glopurine is generally a globulin that is a generic term for soluble globular proteins and has a molecular weight ultracentrifugation sedimentation coefficient equivalent to 7S.
  • Globulin has 2S, 7S, 11S, and 15S in terms of molecular weight distribution, and it is known that 7S and 11S are contained in large amounts in stored proteins of legumes such as soybean. ing. Note that soybean 7S globulin is substantially equivalent to i3-conglycinin in immunological nomenclature.
  • a fraction having a high content of 7S glopurine fractionated from soybean protein is used as a main component.
  • To fractionate 7S globulin from soy protein first remove 11S globulin.
  • Shibasaki method Thihn, VH, and Shibasaki, K., J. Agric. Food Chem., 24, 117, 1976
  • CIF cold-insoluble fraction
  • WJ Wolf et al.
  • Sly cold-insoluble fraction
  • 7S globulin is fractionated by a conventional method for preparing isolated soybean protein.
  • 7S glopurine with a purity that can be sufficiently used without using a reducing agent, and to use it as a neutral fat reducing agent.
  • a wider range of applications can be expected if no reducing agent is included.
  • a soy protein enriched in 7S globulin fractionated at a protein purity (based on SPE) of 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 85% or more is obtained. .
  • an enzyme or an enzymatic agent having a phytic acid-decomposing activity such as phytase-phosphorase, is allowed to act on the obtained 7S glopurin-rich fraction to decompose and remove phytic acid.
  • the low-phytin 7S globulin inherently decomposing and removing phytic acid to 0.2% or less, preferably 0.1% or less, more preferably 0.05% or less per protein originally has Increases the ability to reduce triglycerides in the blood.
  • soybean protein is directly reacted with an enzyme having phytic acid-decomposing activity, such as phytolytic enzyme, or an enzyme agent. It is also possible to remove 11S globulin at the same time.
  • the ability of hypophytinized 7S globulin to reduce triglyceride in blood can be further enhanced.
  • composition of the present invention can be made into a composition for oral administration using the obtained fraction or soybean protein as an active ingredient, for example, in the form of powder, dragee, granule, etc. according to a known method.
  • the composition can be a composition, and other excipients and additives can be appropriately added.
  • the fraction and soybean protein used as the active ingredient of the present invention are safe and can be used for food, and the amount to be incorporated into the composition and the amount of intake are particularly limited. It can be taken as is or added to food as a dietary treatment.
  • the preferred intake is in the range of 50-500 mg, preferably 100-30 Omg, of low phytate soy protein enriched in 7S globulin per kg of body weight.
  • the main analysis methods used in the present invention are as follows.
  • Chromate oil A mixture of formaldehyde and methanol (volume ratio, 2: 1) was added approximately 50 times to the dry matter of the sample, and the weight ratio of the solids extracted under reflux was measured as the chroma oil.
  • SPE standard The electrophoresis pattern obtained by the above-mentioned SDS-polyacrylamide electrophoresis was measured at every densitome, and the area ratio of the corresponding fraction to the whole was defined as the purity (SPE standard).
  • 7S globulin content refers to the total amount of the ⁇ ,) 3 subunits
  • 11S globulin content refers to the total amount of acidic polypeptide (A) and basic polypeptide (B).
  • the low phytin 7S globulin obtained in this manner was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then the stained protein was analyzed. Measurement of the band staining showed a purity of 95%.
  • the phytic acid content was 0.05% per protein, and it was confirmed that phytic acid was almost completely decomposed and removed.
  • the product had a chromata oil content of 0.5%, which was significantly lower than that of Production Example 1.
  • the total of sulfur-containing amino acids of cystine and methionine was high-purity 7S with much less impurities compared to purified 7S, which is 12 mg g protein and originally 5 mgZ protein.
  • Example 1 (Test for confirming the effect of reducing triglyceride in blood by rats)
  • a confirmation test of the blood neutral fat reducing effect was performed using a rat.
  • the test feed contains the soybean protein obtained in Production Example 2 above and casein (vitamin-free casein, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) as a dietary protein in a ratio of 20%, respectively, for comparison. 5% and 0.125% of sodium cholate were added, and the mixture ratio of sucrose and corn starch was set to 1: 2.
  • the specific composition is shown in Table 1 below.
  • Table 2 Changes in body weight in the test group of 5-week-old rats Unit: g Test group Caseinino Low phytin 7S-D'furin (7S-PH) At the start of the test
  • the rats were fasted for 7 hours from the morning of the 11th day (AM 8:00), laparotomy was performed under Nembutal anesthesia, and blood was collected from the abdominal aorta using a heparinized syringe. Plasma was separated from the blood by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes, 5 minutes), and neutral fat and cholesterol were measured. The mean value and standard error were calculated for each group, and the significance test was performed by Duncan's multiple range test. The results are shown in Tables 4 and 5 below. The neutral fat reduction rate and cholesterol reduction rate in the table are shown by the ratio () of the difference between the casein and test groups to the casein group in each item.
  • low-phytin 7S globulin exhibited a significant cholesterol and triglyceride-reducing effect in both the growth phase (5 weeks of age) and the maturation phase (20 weeks of age).
  • Comparative Example 1 (Test for confirming the effect of reducing blood triglyceride by rat) In the same manner as in Example 1, a test was performed to confirm the effect of reducing the triglyceride in blood by rat. A test feed having the same composition as in Example 1 was used. However, 7S globulin (7S) obtained in Production Example 1 was used as soy protein.
  • the experimental animals were 5 week-old male Wistar rats (body weight: about 90 to 110 g) purchased from SLC in Japan and pre-fed for 1 week on a commercial solid feed (Orien CRF-1). The animals were divided into three groups of six animals per group so that the body weights of the food groups were equal, and they were reared on the test food for 3 weeks. Rats were housed individually in individual cages and kept at a temperature of 23 ⁇ 1 and a humidity of 55 ⁇ 5% under a 12-hour light / dark cycle (lighting from 7:00 to 7:00 PM). Water and feed were available ad libitum during the rearing period. The test period was 21 days, and the weight gain 1 during that period was measured. The results are shown in Table 6 below. No significant difference was observed in the increase in body weight between the tests.
  • Table 6 Changes in body weight of each test group Unit: g Test group Casein 7S globulin (7S) At the start of test 1 51.0 ⁇ 1.3 15 1.1 ⁇ 0.9 After completion of test 243.8 ⁇ 1.6 240.8 ⁇ 5.5 Weight gain Volume 92.7 Sat 1.5 89.7 ⁇ 6.0
  • Table 7 Changes in triglyceride level in blood of each test group Unit: g Test group Casein 7S globulin (7S) Triglyceride concentration 90.4 2.2 22.7 Sat 6.6 Triglyceride lowering rate 35.6
  • 7S globulin of Comparative Example 1 Compared to the cholesterol and triglyceride-reducing effects of casein on low phytin 7S globulin used in Example 1, 7S globulin of Comparative Example 1 has a weaker reduction effect, and low phytin 7S globulin is higher than 7S globulin. It became clear that it had a blood lipid improving effect.
  • Table 10 shows the atherosclerosis index calculated by HDLC and the above data.
  • HDLC was found to be improved in the group where phytic acid was removed.
  • high-purity low-phytin 7S globulin which removes phytic acid and removes lipid-associated proteins, It also showed a significant serum lipid-improving effect, especially an atherosclerosis index-reducing effect.
  • the concentration of triglyceride in blood can be efficiently reduced and the safety is extremely high. Therefore, the composition of the present invention is a prophylactic or therapeutic agent for reducing the concentration of triglyceride in blood. Not only is it useful as a food, but it can also be used as a food or drink for that purpose.

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Description

明 細 血中中性脂肪低減用組成物 技術分野
本発明は、 血中の中性脂肪低減用組成物に関する。 背景技術
大豆蛋白質は植物性蛋白質の中で栄養性が優れているだけでなく、 近年では様々な生理活性効果が見い出され、 生理機能剤としても注 目される食品素材である。
大豆蛋白質の持つ血中の中性脂肪低下能は、 大豆蛋白質が体脂肪 率を下げる効果などから既に確認されており、 そのメカニズムは肝 臓での脂肪酸合成酵素の活性を抑えるためであることを、 入谷ら ( Nutr., 126, 380, 1996)が明らかにしている。 さらに、 全大豆グロブ リン、 7Sグロブリン、 11Sグロブリンの各々について、 血中及び肝 臓脂質に与える影響が検討されており、 それらは動物性蛋白質であ るカゼィンに比べて、 血中のコレステロールや中性脂肪を低減する 能力において総じて優れている (沖田らの J.Nutr.,27, 379,1981)。
また、 育種による 11Sグロプリン欠損大豆、 すなわち 7Sグロブ リンに富んだ種子についての報告があり (Breeding Science ,46, 11, 1996) 、 それを応用した報告 (Breeding Science ,50, 101,2000) や特許 (US 6, 171,640 B1)も出されている。
しかしながら、 7Sグロブリンを含め大豆蛋白質はフィチン酸との 複合体を形成し、 大豆蛋白質の消化性に影響していることが知られ ている(リタ一ら、 J.Food Sci.,52, 325,1987)。 さらに大豆由来の蛋白には、 細胞膜をはじめプロティンボディ 一 ·オイルボディー等の膜を構成する極性脂質との親和力の高い蛋 白も存在しており、 佐本らにより 「脂質会合蛋白質」 (Oil-Body Associated Proteins) と名付けられている。 脂質会合蛋白質は膜蛋 白質を主体とする蛋白群の総称で、特に SDS-ポリアクリルアミド電 気泳動による推定分子量において主に 3 4 kDa、 2 4 kDa、 1 8 kDaを示す蛋白質を含み、 クロ口ホルム:エタノール = 2 : 1の極 性溶媒により抽出きれる極性脂質を 1 0〜 1 2重量%程度の極性脂 質を含有する画分であり、 工業的に生産される分離大豆蛋白の約 35%をも占めていることが佐本らにより報告されている (B.B.B.,62(5), 935-940(1998))。 また、脂質会合蛋白質は風味が悪 く、 高いアレルゲン性を有している。
しかし、 大豆蛋白質の蛋白質組成の検定によく用いられる SDS- ポリアクリルアミド電気泳動法では、 脂質会合蛋白質は染色性に乏 しいため、 実際の存在量よりもはるかに低く見積もられるか、 全く 考慮されない場合が多い。 つまり従来の分画法は 7Sと 11Sのみに 注目しており、 各画分に混在する脂質会合蛋白質については考慮さ れていない。 しかし、 生理学的見地より、 純度の高い 7Sや 11Sを 得るには、 この脂質会合蛋白質の挙動を考慮する必要がある。
大豆蛋白質から 7S グロブリンを効率よく調製し、 かつ複合体と して結合して るフィチン酸を分解、 除去すると同時に脂質会合蛋 白質の混在を抑え、 純度を高めることは、 血中の中性脂肪低減剤と して、 安全性のきわめて高い医薬品素材としてだけでなく、 食品用 素材として利用する上で重要な因子である。
本発明は、 大豆蛋白質中の血中の中性脂肪低下能を有している画 分を分 jして、 さらにその効果を高める処 Sを施すことで、 食品あ るいは医薬品として提供することを課題とする。 発明の開示
本発明者らは、 鋭意検討の結果、 次のことを見出した。
( 1 )脱脂大豆より、大豆蛋白質成分の一般的な分画法である夕ン · シバサキらによる方法によって 11Sグロプリンを除去した後、 そこ から 7S グロブリンを分画する場合、 還元剤を使用せずとも 5 0 % 以上の純度にまで分画出来る。
( 2 )上記 7Sグロプリンおよび 7Sグロブリンに結合したフィチン 酸を分解、 除去した 7Sグロブリン ( 「低フィチン 7Sグロブリン」 という、 以下同様。 ) を、 カゼインを比較対照としたラットを用い た 2 1日間の動物実験により、 血中の中性脂肪低減能はカゼインに 比べ、 7Sグロブリンおよび低フィチン 7Sグロブリンで優れており、 特に低フィチン 7Sグロプリンが高い中性脂肪低減能を有していた。
( 3 ) また、 この中性脂肪低減能の発現に伴い、 血中のコレステロ 一ル値も低下する。 このコレステロール低下能は、 7Sグロブリンに も低フィチン 7Sグロブリンにも、 同様に見られるが、 HDL-コレス テロール (HDLC)は低フィチン 7Sグロプリンの方が向上すること。
HDLCは余分のコレステロールを回収するいわゆる善玉コレステ ロールであって、 これの向上効果は総コレステロール低下効果とあ いまって動脈硬化指数を大きく低下させる。
動脈硬化指数 = (総コレステロール一 HD Lコレステロール) D Lコレステロール
( 4 ) さらに、 大豆蛋白質をフィチン酸分解酵素で処理することに より、 フィチン酸が分解、 除去された低フィチン 7S グロブリンが 分画される。 ( 5 ) 加えて、 大豆蛋白質に混在する膜蛋白質に富む脂質会合蛋白 質を除去することにより、 有効成分である 7S グロブリンの効力を より強化することができる。
かくして、 血中の中性脂肪低減能を有するとされる 7S グロプリ ンからフィチン酸を分解、 除去し、 さらに脂質会合蛋白質を除去し て純度を上げることで、 その効果が著しく向上することが判明し、 その分、 投与量は少量で済むことが期待できることを見出し、 本発 明を完成するに至った。
本発明は、 7Sグロブリンに富む低フィチン酸大豆蛋白を有効成分 とする血中中性脂肪低減用組成物を提供するものである。 また、 大 豆蛋白質の主要構成成分である 7Sグロプリンに富む画分を分画し、 蛋白質純度 (後述 SPE基準)として 5 0 %以上で分画された 7Sグロ プリンに富む大豆蛋白で、 脂質会合蛋白質の指標であるクロ口ホル ム ·メタノールで抽出される極性脂質を 1 Z 3以下に低減し、 さら に、 市販の大豆蛋白製品では蛋白当たり約 2 %であるフィチン酸含 量を蛋白当たり 0 . 2 %以下まで分解、 除去した低フィチン酸高純 度 7S グロブリンを有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物を提 供するものである。 つまり、 膜蛋白質に富む脂質会合蛋白質の混在 を極力おさえ, フィチン酸を分解 ·除去する分画手段を講じること により、 より効力のつよい血中中性脂肪低減用組成物を提供するも のである。 一方、 分画の手段として、 大豆蛋白質製造工程において フィチン酸分解酵素を作用させることで、 7Sグロプリンの分画を容 易にし、 かつ、 フィチン酸を蛋白当たり 0 . 2 %以下、 脂質会合蛋 白質を 1 0 %以下にまで分解、 除去した高純度な低フィチン酸 7S グロプリンを有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物を提供する ものである。 また、 上記製造工程において還元剤を添加しないで調 製された血中中性脂肪低減用組成物を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、 7Sグロプリンとは、 一般に可溶性の球状蛋白質 の総称であるグロブリンの中、 分子量の超遠心沈降係数が 7S に相 当するものを言う。グロブリンにはその分子量分布で 2 S、7S、11S、 1 5 Sが存在し、 そのうち、 7Sと 11Sが大豆の様な豆科植物の貯 蔵蛋白質には多量に含まれていることが知られている。 なお、 大豆 の 7S グロブリンは免疫学的命名法にいう i3—コングリシニンに実 質的に相当する。
本発明においては、 大豆蛋白質から分画した 7S グロプリンの含 量の高い画分を主成分として用いる。 大豆蛋白質から 7S グロプリ ンを分画するには、 まず、 11S グロブリンを除去する。 その除去に は、 現在各グロプリン成分の分画方法として広く用いられいる夕 ン · シバサキの方法 (Thahn,V.H., and Shibasaki , K . , J.Agric.Food Chem. , 24, 117,1976) はもちろん、 その他いわゆ るクリオプレシピテーシヨン (Briggs,D.R., and Mann,R.L., Cereal Chem, 27, 243,1950) による冷却不溶区分 (Cold-insoluble fraction CIF と呼ばれる) や、 ウルフらによる (Wolf,W.J., and Sly.D.A., Cereal Chem, 44, 653,1967) 0 . 1 N塩化カルシウム添加による 分画法いずれの分画法によっても良い。 また、 後述の製造例 2で示 すような方法で、 11Sおよび脂質会合蛋白質を除いたものを用いて もよい。
上記いずれかの方法により 11Sグロブリンを除去した後、 7Sグ ロブリンを通常の分離大豆蛋白質の調製方法によって分画する。 た だし、 この際、 還元剤は用いずとも十分使用に耐えうる純度の 7S グロプリンが分画でき、 さらに中性脂肪低減剤として使用する場合 も、 還元剤を含まない方がより広い範囲の用途が期待できる。 蛋白 質純度 (SPE基準) として 5 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 更 に好ましくは 8 0 %以上、 特に好ましくは 8 5 %以上で分画された 7Sグロブリンに富む大豆蛋白が得られる。 さらに得られた 7Sグロ プリンに富む画分に、 フィチン酸分解活性を有するフイタ一ゼゃホ スファ夕一ゼのような酵素または酵素剤を作用させ、 フィチン酸を 分解、 除去する。 この様にしてフィチン酸を蛋白当たり 0 . 2 %以 下、 好ましくは、 0 . 1 %以下、 より好ましくは 0 . 0 5 %以下ま で分解、 除去した低フィチン 7S グロブリンが本来有している血中 の中性脂肪低減能を高める。
このフィチン酸が分解、 除去された低フィチン 7S グロブリンを 分画する方法として、 大豆蛋白質に直接フィチン酸分解活性を有す るフィ夕一ゼゃホスファターゼのような酵素または、 酵素剤を作用 させることで、 11Sグロブリンの除去とを同時に行うことも可能で ある。
さらに脂質会合蛋白質を除去することにより、 低フィチン化 7S グロブリンの血中中性脂肪低減能をさらに高めることができる。 そ の方法として、脂質会合蛋白質が不溶化しやすい微酸性領域 (pH 3 . 8〜6 . 8 ) で加温 (30-75で)を行い、 p H 5 . 6から 6 . 8におけ る沈殿画分として除去することができる。
本発明の組成物は、 得られた画分や大豆蛋白を有効成分として経 口投与用の組成物とすることができ、 例えば、 公知の方法に従って 粉末状、糖衣錠、顆粒状等の剤形の組成物とすることができ、適宜、 他の陚形剤、 添加剤を添加することができる。
本発明の有効成分として用いる画分や大豆蛋白は食用として使用 できる安全なものであり、 組成物への配合量、 摂取量は特に限定す るものではなく、 そのまま摂取しても、 また、 食餌療法として食品 に添加してもよい。 好ましい摂取量は、 体重 l kgあたり、 7Sグロ ブリンに富む低フィチン酸大豆蛋白の量として 50〜500mg、 好ましくは 1 00〜30 Omgの範囲にある。
実施例
以下に、 本発明の有効性を実施例と共に示すが、 これらの例示に よって本発明の技術思想が限定されるものではない。
本発明に用いた主な分析方法は以下の通りである。
*粗蛋白質;ケールダール法に基づき窒素含量を求め、 係数 6. 2 5をかけて粗蛋白質に換算した。
*SDS-ポリアクリルアミド電気泳動; Laemmli (Nature, 227, 680 (197 0) ) の方法に基づきゲル濃度 1 0— 20%のグラ ディェントゲルで分析した。 アプライ量は 10/igとした。
*フィチン酸; Alii Mohamed の万法 (Cereal Chemistry 63, 475-478.1986) に準拠して測定した。
*クロメタ油分;試料乾物に対してクロ口ホルム ·メタノールの混 合液 (容量比、 2 : 1) を約 50倍加え、 還流抽出される固形分の 重量比をクロメ夕油分として測定した。
*純度 (SPE基準) ;上記の SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で 得られた泳動パターンをデンシトメ一夕一で測定し、 その全体に対 する該当画分の面積比率を純度 (SPE基準) とした。 ここに 7Sグ ロブリン含量はひ、 α ' 、 )3サブユニットの総量を指し、 11S グロ ブリン含量は酸性ポリぺプチド (A)と塩基性ポリベプチド (B)の総量 を指す。
*補正純度;上記で得られた純度 (SPE基準) から、 混在する脂質 会合蛋白質の量も考慮した補正純度を以下のように算出した。 すな わち試料の純度(SPE基準) のィ直を A%として、 当該試料中には 7S グロブリンおよび 11Sグロブリン以外にクロメタ油分の少なくとも 10重量倍に相当する脂質会合蛋白質も存在するので、 7Sグロプリ ン及び 11Sグロブリンに脂質会合蛋白質の量を含めた合計蛋白に対 する純度として算出する。
補正純度 (%)=(100(%)—クロメ夕油分 (%) * 10) * A(%)/100
* 中性脂質、 総コレステロール、 HDLコレステロール (HDL C) ; フジフィルム社製ドライケム 5500装置にて、 固相法で測 定。
以下に本発明の好ましい態様を記載する。
製造例 1 (7Sグロブリン = 「7S」 及び低フィチン 7Sグロブリン- 「7S-PH」の調製)
脱脂大豆に 1 : 10の重量割合で水を加え、 随時 pHを 7. 0に 調整しながら 1時間撹拌後遠心分離( 4, 000 r. p. m. , 2 0でで 10分間) し上澄液を得た。 得られた上澄液を pH 6. 4に 調整して、 4でにてー晚放置して、 遠心分離( 4, 000 r. p. m. , 4 で 10分間) して沈殿を除去した。 得られた上澄液を、 pH 4. 5に調整し、 遠心分離( 4, O O O r. p. m. , 4 :で 1 0分間)して得られた沈殿物を回収して 7Sグロブリンカードとした。 この 7Sグロブリンカードに 4倍量の水を加え、 pH 6. 0に調整 後、 フイターゼ(ノポ社製 rPYTASE NOVO L」 )を蛋白当たり 0. 2%添加後、 40でで 1時間反応させた。 この反応液を pH 5. 0 に調整後、遠心分離( 4, 000 r. p. m. , 20でで 10分間) し てホエー画分を除き、 低フィチン 7Sグロブリンカードを得た。 7S グロブリンカード、 低フィチン 7S グロブリンカードはともに加水 後、 pH 7. 0に中和し、 140 15秒間殺菌を行った後、 直ちに噴 霧乾墚して 7Sグロプリンおよび低フィチン 7Sグロプリンを得た。 このようにして得られた各 7S グロブリンを S D S—ポリアクリル アミドゲル電気泳動に供し、 その後染色された蛋白質のバンドの染 色度の測定から、 純度として 8 0 %であることが示された。 また両 者のフィチン酸含量は蛋白当たり各々 1 . 8 %と 0 . 0 5 %であり、 フイターゼ処理によりフィチン酸がほぼ完全に分解、 除去されてい ることを確認した。 また本品のクロメタ油分含量は 2 . 8 %であつ た。 一方、 シスチンとメチォニンの含硫アミノ酸の合計は 2 5 mg /%蛋白質で、 本来 5 mgZg蛋白質である精製 7Sに比べて高い値 を示し、 まだ不純物の多いことが示唆された。
製造例 2 (高純度低フィチン 7Sグロプリン:「7S-PH-LP」の調製) 低変性脱脂大豆 1重量部に、 10重量部の 40での抽出水を加え、 塩酸にて pH5.3に調整した。この溶液に蛋白重量あたり 8unit相当 のフィ夕一ゼ(ノボ社製「PYTASE NOVO L」 ) を加え、 40でにて 蛋白の抽出と酵素反応を併せた 30分間の処理を行い、酵素処理した 抽出スラリーを得た。 この酵素処理抽出スラリーを 25で付近まで冷 却し、塩酸にて pH6.1に調整し、 バッチ式遠心分離機(3,000G) で 遠心分離した。 このとき可溶性画分と不溶性画分は明確な分離をし た。 なお、 この遠心分離時の溶液温度は 25 付近であった。 次に、 可溶性画分を塩酸にて pH4.9に調整後、遠心分離して沈澱カード得 た。 沈澱カードは 1 0倍量の水で水洗後、 加水 (4倍重量) し、 苛 性ソーダで中和し、 140 15秒間殺菌を行ったのち直ちに噴霧乾燥 してフィ夕ーゼ処理した 7S グロブリンに富んだ分画大豆蛋白を得 た(「7S-PH-LP」)0
このようにして得られた低フィチン 7S グロブリンを S D S—ポ リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、 その後染色された蛋白質の バンドの染色度の測定から、 純度として 9 5 %であることがしめさ れた。 またフィチン酸含量が蛋白当たり 0 . 0 5 %であり、 フイチ ン酸がほぼ完全に分解、 除去されていることを確認した。 一方、 本 品のクロメタ油分含量は 0 . 5 %であり製造例 1に比較して大きく 低下していることが確認された。 さらにシスチンとメチォニンの含 硫アミノ酸の合計は 1 2 mg g蛋白質で本来 5 mgZ蛋白質である 精製 7Sに比べてかなり不純物の少ない高純度の 7Sであることが示 唆された。
実施例 1 (ラットによる血中中性脂肪低減効果確認試験)
ラッ卜を用いて血中中性脂肪低減効果の確認試験を行った。 試験 飼料としては、 上記製造例 2で得られた大豆蛋白と、 さらに比較対 照としてカゼィン(ビタミンフリーカゼィン、オリェンタル酵母 (株) 製) をそれぞれ食餌蛋白質として 2 0 %含み、 コレステロールお. 5 %とコール酸ナトリウム 0 . 1 2 5 %を添加し、 さらにシュクロ ースとコーンスターチの混合比率を 1 : 2としたものを用いた。 具 体的配合を下記表 1に示す。
表 1 各試験群の飼料組成 成分 組成 (%) 蛋白質 粗蛋白質として 2 0 %となるよう
Q!—コ-ンスターチにて調整
シュクロ-ス 2 0 . 0
コーン油 5 . 0
ビタミンミックス 1 . 0
ミネラルミックス 3 . 5 セル口-ス粉末 5. 0
酒石酸水素コリン 0. 2
コレステロ-ル 0. 5
コ-ル酸ナトリウム 0. 125
一コーンスターチ 全体が 100となる様調! 実験動物は 5週齢 (成長期) および 20週齢 (成熟期〉 のゥイス 夕一系雄ラット (体重 100〜120 g、 330〜360 g程度の もの) を日本 SLCより購入し、 市販固形飼料 (オリエンタル CR F— 1) で 1週間予備飼育した後、 各試験飼料群の体重が揃うよう に 1群 6匹で計 2群に分け、 試験飼料で 10日間飼育した。 飼育は ラットを個別ケージに 1匹ずつ入れ、 温度 23 ± IX:、 湿度 55土 5%で 12時間明暗サイクル (AM 7 : 00から PM7 : 00まで 照明)の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。 試験期間は 10日間とし、 その期問の体重の増減を測定した。 そ の結果を下記表 2および表 3に示す。 なお、 各試験間の体重の増加 量に有意差は認められなかった。
表 2 5週齢ラットの試験群の体重の推移 単位; g 試験群 カゼィニノ 低フィチン 7Sク' Dフ'リン (7S-PH) 試験開始時 153.3 ± 1. 3 53.3± 1. 3
試験終了後 201.7土 1. 3 92.0 ± 1. 5
体重増加量 48.4± 1. 3 38.7 ± 1. 6 表 3 20週齢ラットの試験群の体重の推移 単位; g 試験群 カゼイン 低フィチン 7Sク' Dフ'リン (7S-PH) 試験開始時 357.2 ±2. 7 356.4土 5. 8 試験終了後 358.7 ± 3. 7 352.0土 10. 3 体重増加量 0.3 ±2. 1 4.4土 4. 6
10日問の試験食終了後、 1 1日目の朝 (AM 8 : 00) より 7 時間絶食し、 ネンブタール麻酔下で開腹後、 へパリン処理した注射 器で腹部大動脈より採血した。 血液から遠心分離( 3、 000 r . p. m. , 5 で 15分間)にて血漿を分離し、 中性脂肪およびコレ ステロールを測定した。 測定値については群毎に平均値と標準誤差 出し、 意 の検定は Duncan's multiple range testによって 行った。 その結果を以下の表 4および表 5に示す。 なお表中の中性 脂肪低下率およびコレステ D-ル低下率は各項目のカゼィン区とテスト区 の差のカゼイン区に対する比率 ( ) で示した。
表 4 5週齢ラットの試験群の血中中性脂肪量の推移 試験群 カゼイン 低フィチン 7Sク' Π7*リン (7S-PH) 中性脂肪濃度 76.2土 10. 9 89. ± 5. 7 中性脂肪低下率 49 6
総コレステ ル濃度 44.1土 6. 0 93. 5': 2. 9 コレステ Π-ル低下率 35 単位; (濃度) mg/dl、 (率) % 表 5 20週齢ラットの試験群の血中中性脂肪量の推移 試験群 カゼイン 低フィチン 7Sク' Dフ'リン (7S-PH) 中性脂肪濃度 261.2±22. 5 108. 6±2 1. 6 中性脂肪低下率 一 58. 4
総コレステロ-ル濃度 1 32.5± 3. 5 92. 8土 14. 5 コレステ U-ル低下率 一 30. 0 単位; (濃度) mg/dl、 (率) %
以上のように、 低フィチン 7S グロブリンは成長期 (5週齢) お よび成熟期 (20週齢) のいずれにおいても顕著なコレステロール および血中中性脂肪の低減効果を示した。
比較実施例 1 (ラットによる血中中性脂肪低減効果確認試験) 実施例 1と同様に、 ラットによる血中中性脂肪低減効果の確認試 験を行った。 試験飼料として、 実施例 1と同様の組成のものを使用 した。 ただし、 大豆蛋白としては、 製造例 1で得た 7S グロブリン (7S) を使用した。
実験動物は 5週齢のウィスター系雄ラット (体重 90〜1 10 g 程度のもの) を日本 SLCより購入し、 市販固形飼料 (オリエン夕 ル C R F— 1 ) で 1週間予備飼育した後、 各試験飼料群の体重が揃 うように 1群 6匹で計 3群に分け、 試験飼料で 3週間飼育した。 飼 育はラットを個別ケージに 1匹ずつ入れ、 温度 23± 1 、 湿度 5 5± 5%で 12時間明暗サイクル (AM 7 : 00から PM7 : 00 まで照明) の下で行った。 飼育期間中は水および飼料を自由摂取さ せた。 試験期間は 21日間とし、 その期間の体重の増 ¾1を測定した。 結 果を下記表 6に示す。 なお、 各試験間の体重の増加量に有意差は認 められながった。
表 6 各試験群の体重の推移 単位; g 試験群 カゼイン 7Sグロブリン (7S) 試験開始時 1 51.0± 1. 3 15 1.1 ± 0. 9 試験終了後 243.8 ± 1. 6 240.8 ± 5. 5 体重増加量 92.7土 1. 5 89.7 ± 6. 0
2 1日間の試験食終了後、 22日目の朝 (AM 8 : 00) より 6 時間絶食し、 ネンブタール麻酔下で開腹後、 へパリン処理した注射 器で腹部大動脈より採血した。 血液から遠心分離( 3、 000 r. p. m. , 5でで 10分間) にて血漿を分離し、 中性脂肪およびコ レステロールを測定した。 測定値については群毎に平均値と標準偏 差を算出し、 有意差の検定は Duncan's multiple range testによつ て行った。 その結果を以下の表 7に示す。 各低下率の求め方は実施 例 1の表 4, 5と同じである。
表 7 各試験群の血中中性脂肪量の推移 単位; g 試験群 カゼイン 7Sグロブリン (7S) 中性脂肪濃度 90.4 2. 2 22. 7土 6. 6 中性脂肪低下率 35. 6
総]レステ D-ル濃度 8.7 ±4. 5 09. 9士 5. 8 コレス ϊπ-ル低下率 7. 4 単位; (濃度) mg/dl、 (率) %
実施例 1で用いた低フィチン 7S グロブリンのカゼインに対する コレステロールおよび中性脂肪低減効果に比較し、 比較実施例 1の 7Sグロブリンは低減効果が弱く、 低フィチン 7S グロブリンが 7S グロブリンに比較して、 高い血中脂質改善効果を有していることが 明らかとなった。
実施例 2
製造例 2で調製した精製度の高い低フィチン 7S グロブリン (7S-PH-LP) を用いて、 その血中中性脂肪低減効果を調べた。 対 照として、 実施例 1と同様のカゼイン、 7Sグロブリン (7S) 、 低フ ィチン 7Sグロブリン(7S-PH)、および市販の分離大豆蛋白質(SPI) を用いた。 各蛋白質試^の組成は表 8に示した。
表 8 単位:%
SPI 7S 7SPH 7S-PH-LP 粗蛋白質 86. 2 88. 0 90. 5 92. 3 純度 (SPE基準) 一 80. 0 82. 2 95. 7 クロメタ油分 3. 2 2. 8 2. 8 0- 5 フィチン酸 1. 8 1. 8 0. 05 0. 05 補正純度 一 57. 6 59. 2 90. 9 動物実験は実施例 1と同様の 5週齢のラットを用い、 実施例 1と 同条件で体重を測定しながら 2週間飼育した。 試験食終了後実施例 1と同様な方法で採血し、 中性脂肪、 コレステロールを測定した。 その結果の、 体重の推移を表 9に、 中性脂肪、 コレステロール、
HDLCおよび以上のデ一夕により算出した動脈硬化指数を表 1 0 示す。
表 9 単 1 ; g
QpT θ
ノ J . 1 ノ ί θ 7 Q-PW / Q- Jr trJl.T Lt Pr
1 Q Q Π 1 Q C Q
丄 ΰί5. # 丄 dO. O 丄 ίί .σ 試験終了時 210.2 212.9 206.9 179.6 206.5 体重増加量 71.7 74.3 71.1 44.0 68.8 表 1 0 単位 ; mg/dl カゼイン SPI 7S 7S-PH 7S-PH-LP 中性脂肪濃度 178.3 120.0 105.0 92.7 91.0 総コレステ D-ル濃度 125.6 88.3 88.3 90.8 87.3
HDLC 37.1 36.8 34.2 43.5 44.0 動脈硬化指数 2.39 1.40 1.58 1.09 0.98 以上の結果より、 中性脂肪及びコレステロール低減効果はほぽ カゼィンくく SPI=7S<7S-PHく 7S-PH-LP
の順でみとめられ、 また、 HDLCはフィチン酸を除去した群で向上 することが認められた。 すなわちフィチン酸を除去し、 さらに脂質 会合蛋白質をも除いた高純度の低フィチン 7S グロブリンにもっと も顕著な血清脂質改善効果、 特に動脈硬化指数低減効果のあること が示された。 産業上の利用可能性
本発明により、 血中中性脂肪濃度を効率的に低減せしめることが でき、 しかも安全性がきわめて高いので、 本発明の組成物は血中中 性脂肪の濃度低減のための予防ないし、 治療剤として有用であるだ けでなく、 そのための飲食品として供することが出来る。

Claims

請求の範囲
(1) 7Sグロプリンに富む低フィチン酸大豆蛋白を有効成分とす る血中中性脂肪低減用組成物。
(2) 蛋白当たり 7S グロブリンを 50%以上含有した請求項 1 p β載の血中中性脂肪低減用組成物。
(3) フィチン酸含量が、 蛋白当たり 0. 2%以下である請求項 1または 2記載の血中中性脂肪低減用組成物。
(4) 蛋白質中の脂質会合蛋白質が 10%以下である請求項 1ま たは 2記載の血中中性脂肪低減用組成物。
(5) 蛋白中のクロ口ホルム:メタノール =2 : 1の溶媒に溶解 する画分が 1 %以下である請求項 1または 2記載の血中中性脂肪低 減用組成物
( 6 ) 大豆蛋白質にフィチン酸分解酵素を作用させて得られたも のである請求項 1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
(7) 7Sグロブリンが蛋白質の 50 %以上含む大豆種子より調製 した請求項 1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
(8) その製造工程において還元剤を添加しないで調製された請 求項 1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
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