BR9816237B1 - farinha de soja com altos teores de beta-conglicinina e ingrediente de alimentação animal. - Google Patents

farinha de soja com altos teores de beta-conglicinina e ingrediente de alimentação animal. Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FARINHA DE SOJA COM ALTOS TEORES DE BETA-CONGLICININA E INGREDIENTE DE ALIMENTAÇÃO ANIMAL".
Pedido dividido do Pl 9808477-1 de 03.04.1998. Antecedentes da Invenção
A presente invenção refere-se a um isolado de proteína com alto teor de beta-conglicinina, uma carne, um queijo, uma bebida nutritiva e a métodos para produção de queijos, bebidas e substitutos de carne.
Glicinina e beta-conglicinina representam aproximadamente 70% das proteínas nos feijões-soja. Tem sido postulado que as propriedades fun- cionais dos ingredientes da proteína de soja em sistemas alimentícios po- dem ser melhoradas modificando-se a razão entre essas proteínas. Tentati- vas anteriores foram feitas para aumentar a razão de glicinina para beta- conglicinina para melhorar o rendimento e qualidade de géis de feijão-soja tipo tofu e para melhorar o teor de súlfur aminoácidos para propósitos nutri- cionais [Kitamura, K. Trends Food Science & Technology 4:64-67, (1993), Murphy1P. e outros, Food Technology 51:86-88, 110 (1997)].
Proteínas dietéticas são necessárias para substituir as perdas metabólicas de proteínas de tecidos e órgãos, para formar e depositar prote- ínas em novos tecidos e para reabastecer as perdas nos tecidos como con- seqüência de condições patológicas. Essas necessidades são atendidas por aminoácidos indispensáveis (essenciais) e aminoácidos dispensáveis que constituem a proteína dietética. É principalmente neste contexto que o valor nutritivo das proteínas dietéticas é definido como a habilidade de atender às necessidades diárias de aminoácidos essenciais. (Steinke, F. e outros, No- vos Alimentos Protéicos na Saúde Humana: Prevenção Nutricional e Terapi- a, CRC Press, 1992). Proteínas de alta qualidade contêm todos os aminoá- cidos essenciais em níveis maiores do que os níveis de referência e são al- tamente digeríveis logo que os aminoácidos estejam disponíveis. Neste con- texto, clara de ovo e proteínas de leite são os padrões com os quais outras proteínas são avaliadas e as proteínas de plantas são consideradas ter valor nutritivo inferior. Os aminoácidos essenciais cujas concentrações na proteína encontram-se abaixo do nível de uma proteína de referência são designados como aminoácidos limitados, como por exemplo, a soma de cisteína e meti- onina são limitados nos feijões-soja.
Glicinina contém de 3 a 4 vezes mais cisteína e metionina por unidade de proteína do que a beta-conglicinina (Fukushima D., Food Ver. Int.7:323-351, 1991). Desse modo, espera-se que um aumento no teor de glici- nina e uma redução no teor de beta-conglicinina resulte numa melhor quali- dade da proteína (Kitamura, K. Trends Food Science & Technology 4:64-67,1993; Kitamura , K., JARQ 29:1-8, 1995). Isto é consistente com a verifica- ção de que o valor médio dos teores de aminoácido contendo enxofre nos grãos de quatro linhas representativas de que tinham baixos teores de beta- conglicinina foi de cerca de 20% mais alto do que os das quatro variedades comuns(Ogawa, T. Japan. J. Breed. 39:137-147, 1989). Uma correlação po- sitiva foi também descrita, dentre os feijões-soja silvestres, entre a razão glicinina:beta-conglicinina (1,7 - 4,9) e a concentração de metionina ou ciste- ína na proteína total (Kwanyuen e outros, JAOCS 74:983-987, 1997). Não existem descrições da composição de aminoácidos de linhas com altos teo- res de beta-conglicinina (razão glicinina:beta-conglicinina menor do que 0,25).
Em adição à habilidade das proteínas de atenderem às necessi- dades diárias de aminoácidos do corpo, as proteínas dietéticas podem tam- bém contribuir com peptídeos bioativos e espécies de aminoácidos que po- dem reduzir os fatores de risco de doenças cardiovasculares, câncer e oste- oporose. Esses fatores composicionais deveriam também ser considerados na determinação da qualidade da proteína, especialmente em países como os Estados Unidos onde as pessoas consomem na média um grande exces- so de proteínas dietéticas. Pesquisadores (Sugano e outros, PTC Ns WO 89/01495; Sugano, M.J. Nutr. 120:977-985, 1990; Sugano M. & Kobak, K.Annu. NY Acad. Sei. 676:215-222, 1993; Wang, M. J Nutr. Sei. Vitaminol. 41:187-195, 1995) identificaram uma fração resistente à pepsina de proteína de feijão-soja (peso molecular de 5.000-10.000) que representa cerca de 15% da proteína na proteína de soja isolada. Seres humanos alimentados com 24 g ou 48 g por dia da fração resistente à pepsina apresentaram Co- IesteroI-LDL mais baixo e mais excreção fecal neutra e esteróide ácida do que aqueles alimentados com dietas com proteína de soja isolada ou caseí- na. As proteínas de soja que contribuem para essa fração resistente à pep- sina não foram identificadas. Beta-conglicinina purificada é mais resistente à pepsina do que a glicinina purificada (Astwood, J. & Fuchs, R. Em Monogra- fias em Alergia, Sexto Simpósio Internacional em Problemas Clínicos e Imu- nológicos de Alergia à Alimentos, editores Ortolani, C. e Wuthrich, B., Basel, Karger, 1996) assim é descrito que a beta-conglicinina pode ser a contribuin- te primária para a função bioativa. Esta possibilidade não foi demonstrada ainda no estudo de alimentação ou com proteína feita a partir de feijões-soja tendo composições de proteínas alteradas.
As subunidades alfa e alfa-principal da beta-conglicinina intera- gem especificamente com os componentes da membrana de células do fí- gado de seres humanos e animais em experimentos com cultura de tecidos. As subunidades de beta-conglicinina são então incorporadas, degradadas e aumentam a máxima ligação de LDL aos receptores de alta afinidade. Pro- põe-se que tal mecanismo poderia ser responsável pelas propriedades de abaixamento do colesterol dos isolados de proteína de soja. Entretanto, não é claro se significativas quantidades de proteínas de soja dietéticas podem se mover para o fígado 'in vivo'. Lavarti e outros (J. Nutr. 122:1971-1978, 1992) descreveu num estudo no qual ratos hipercolesterolêmicos foram ali- mentados com glicinina ou beta-conglicinina por duas semanas. Ambos os grupos mostraram uma redução de 1/3 no colesterol total no soro. Não exis- tem estudos que determinem os efeitos dos isolados de proteína de soja de feijões - soja com proteínas de soja modificadas sobre as propriedades de abaixamento do colesterol do isolado de proteína de soja.
Raciocina-se, a partir de estudos em macacos Rhesus usando- se isolado de proteína de soja extraído com álcool (que remove as isoflavo- nas) e não extraído com álcool, que as isoflavonas de feijão-soja são os principais componentes dos isolados de proteína de soja responsáveis pelos efeitos de abaixamento do colesterol (Anthony, M.S., J. Nutr. 126: 43-50, .1996). Entretanto, submetendo-se a proteína de soja à extração com álcool não apresentou qualquer efeito nos seus efeitos abaixadores de lipídeos em outros estudos usando-se Hamsteres (Balmir e outros, J. Nutr. 126:3046-3053, 1996) ou ratos (Topping e outros, Nutr. Res. 22:513-.520, 1980). Os processos de extração com álcool podem extrair algumas proteínas e podem desnaturar e agregar as estruturas singulares das proteínas de soja, afetan- do provavelmente como atuam no trato gastrointestinal. Por exemplo, Suga- no e outros, J. Nutr. 120:977-985, 1990 observaram que a extração com me- tanol eliminou completamente a habilidade de peptídeos de proteína de soja de alto peso molecular se ligar excretar esteróides. Alimentar isoflavonas isoladas de soja (genisteína e daidezeína) não apresentaram efeito sobre os lipídeos do soro ou lipoproteínas em humanos (Coquhoun e outros, Atheros- clerosis, 109:75, 1994).
A confusão acerca dos papéis relativos dos vários constituintes do isolado de proteína de soja nos efeitos de abaixamento do colesterol ob- servados, são difíceis de resolver usando-se tecnologias de processo para criar amostras com composição alterada. Uma melhor abordagem é modifi- car especificamente os componentes de interesse nos feijões-soja.
Um indicador chave emergente para o risco de doença cardíaca, são os altos níveis de homocisteína. A metionina dietética é um precursor para a homocisteína, de modo que um alto consumo de metionina pode au- mentar potencialmente o risco de doença cardíaca, especilamente se é con- sumido também baixos níveis de ácido fólico e vitamina B6 (McCully, K.S. The Homocysteine Revolution, Keats Publishing, Inc. New Canaan, Connec- ticut, 1997). Outra rota que abaixa a citotoxicidade endotélica da homocisteí- na é a reação entre oxido nítrico (NO) e homocisteína 'in vivo1 para formar a S-nitroso-homocisteína não-tóxica. A rota pode ser melhorada pelo aumento dos níveis de arginina dietética porque a arginina é convertida pela óxido nítrico sintase à NO. Portanto, uma proteína dietética ideal para manter ní- veis saudáveis de homocisteína, como descritos nesta invenção, deveria ter alto teor de arginina e baixo teor de metionina (e cisteína) como encontrado beta-conglicinina. Entretanto, antes desta descrição, o uso de um isolado de proteína de soja rico em beta-conglicinina projetado para este propósito não foi considerado.
Novos ingredientes de proteínas podem contribuir positivamente para o sabor, textura e aparência de alimentos para ganharem aceitação. Esses atributos de qualidade são determinados pela estrutura das proteínas e como ela muda na presença de outros componentes do alimento (por e- xemplo, íons cálcio, outras proteínas) e condições de processamento (por exemplo, temperatura, pH). É usualmente proposto se aumentar o teor de glicinina dos feijões - soja para melhorar a funcionalidade como alimento dos ingredientes da proteína de soja. Tentativas anteriores para melhorar o ren- dimento e qualidade de géis de feijão-soja tipo tofu têm sido feitas no sentido de aumentar certas glicininas ou a razão de glicinina para beta-conglicinina (Wang1C-C e Chang, S.J. Agric. Food Chem. 43:3029-3034, 1995; Yagasaki, K. e outros, Breeding Sei. 46:11-15, 1996; Murphy, P. e outros, Food Tech- nology 51:86-88, 110, 1997). Existe pouca informação sobre as propriedades da glicinina e da beta-conglicinina em outros sistemas alimentícios modelos , especialmente sob condições típicas de outros sistemas alimentícios (por exemplo, pH baixo, alto teor de sal, gordura, formação de gel à temperaturas abaixo de 72°C). As propriedades de formação de espumas da glicinina são superiores às da beta-conglicinina num pH de 7,0 e sem sal (Yu, M.A. J. A- gric. Food Chem. 39:1563-1567, 1991). Glicinina parcialmente hidrolizada forma géis induzidos por calor que são mais similares a coalho de queijo do que a beta-conglicinina parcialmente hidrolizada em pH neutro. (Kamata e outros, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 36:557-567, 1989) . A glicinina foma gel na temperatura de ebulição com módulo de elasticidade mais alto do que o isolado de proteína de soja. (Van Kleff, Bioplymers 25:31-59, 1986). Algumas comparações foram feitas entre a glicinina e a beta-conglicinina num pH de 7,5-8,0. (Shimada, K. e Matsushita, S., Agric. Biol. Chem., 44:637-641, 1980; Utsumi, S. and Kinsella, J. Food Sei. 50:1278-1282, 1985; Nakamura e outros, Agric. Biol. Chem. 50:2429-2435, 1986). Embora a beta- conglicinina foi observada ter melhores propriedades emulsificantes compa- radas à glicina, ela não apresentava melhores propriedades emulsificantes comparadas com os controles de isolados de proteína de soja integral (Aoki e outros, J. Food Sei, 45-534-546, 1980; Yao e outros, JAOCS 67:974-979, .1990). As propriedades de congelamento-descongelamento dos isolados de proteína de soja ricas em beta-conglicinina e da glicinina não foram descri- tos.
Germeplasma de feijão-soja que tem falta de glicinina, varieda- des de linha de parentela B2W(2), B2G(2) e B2G(1) foram recebidas do Dr. Norihiko Kaizuma, Presidente da Universidade de Tohoku, Marioka, Japão, (7/10/96). A mutação dessas linhas de feijões-soja foi induzida através do uso de irradiação gama (Odanaka, HeN. Kiazuma, Japan J. Breed. 39 (Suppl.) 430-431, 1989; Kiazuma e outros, Japan J. breed. 40 (Supl. 1) 504- .505, 1990). Essas linhas têm falta de subunidades do grupo I consistindo de A1aB2, A1b1b e A2B1a . A síntese dos polipeptídeos em falta mostrou-se estar controlada por um único alelo recessivo. Não foi observado efeito dele- tério sobre os aspectos fisiológicos tais como o desenvolvimento e germina- ção dos grãos.
As propriedades dos isolados de alto teor de beta-conglicinina no pH 7,0 foram discutidas em Nagano, T. J. Agric. Food Chem. 44:3484- .3488. As propriedades de formação de gel a 85°C e propriedades de forma- ção de espumas de frações de beta-conglicinina enzimáticamente hidroliza- das foram discutidas em Lehnhardt, W.F. e Orthoefer, F.T., Patente Européia Nº 0072617, 1982.
Os rendimentos de proteína e outros constituintes do feijão-soja necessitam ser considerados no projeto de uma variedade comercialmente viável. Correlações positivas foram encontradas entre o teor total de proteína dos feijões-soja e a razão glicinina:beta-conglicinina, de modo que os fei- jões-soja que são mais ricos em glicinina tivessem um teor de proteína mais alto (Shui-Ho Cheng, 1984 Tese de Ph.D., Univ. of IL). Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a uma farinha de soja produzida a partir de feijões-soja com altos teores de BC que é rica nos aminoácidos Iisi- na, metionina, cisteína e arginina. A invenção refere-se ainda a um ingredi- ente de alimentação produzido através do uso de uma farinha feita a partir de feijões-soja com altos teores de BC, que é rica nos aminoácidos lisina, metionina, cisteína e arginina.
A invenção provê novos BC-SPrs altos tendo níveis mais altos de aminoácidos essenciais e métodos para prepará-los. A presente invenção refere-se ainda a métodos aperfeiçoados para o processamento de alimen- tos e a produção de produtos alimentícios. Em geral, o BC-SPI da presente invenção contém um isolado tendo um teor de BC maior do que 40% da pro- teína e tendo menos de 10% da proteína como glicinina. O BC-SPI tem uma soma de de cisteína e metionina no isolado maior do que 24 mg/ g de prote- ína. O método de produção do BC-SPI da presente invenção consiste da remoção da casca do grão dos feijões-soja e a condicíonamnto dos grãos para a produção de flóculos. Os grãos condicionadas são feitas em flóculos e é extraído o óleo. Os flóculos de grão de feijão-soja são então preferenci- almente triturados e é adicionado um solvente para ajustar o pH numa faixa de cerca de 8,5 á cerca de 10 para dissolver a proteína. É produzido um ex- trato pela remoção da fibra por centrifugação. O extrato é neutralizado e os açúcares e outros solutos de baixo peso molecular são removidos. O produ- to resultante é uma pasta fluida que é seca. A presente invenção inclui tam- bém métodos para usar o BC-SPI como produtos alimentícios diferentes. Descrição da Invenção
Para proporcionar uma compreensão dos diversos termos usa- dos no relatório e nas reivindicações, são fornecidas as seguintes definições: Feijões-soja de alto teor de beta-conqlicinina: Como usado nesta invenção, feijões-soja ricos em altos teores de beta-conglicinina (BC) refere- se aos grãos de feijão-soja que têm um teor de BC maior do que 40% e ten- do um teor de glicinina de menos de 10% do peso da proteína seca usando- se os métodos definidos no Exemplo 1.
Isolado de proteína de soja (SPI): Como usado nesta invenção, isolado de proteína de soja é um pó seco por atomização feito a partir de feijões-soja contendo não menos do que 90% de proteína numa base isenta de umidade. Isolado de proteína de soia de alto teor de beta-conalicinina: Como usado nesta invenção, isolado de proteína de soja de alto teor de be- ta-conglicinina (BC-SPI) refere-se à um pó seco por atomização que é obtido a partir de grãos de feijão-soja de alto teor de BC. A quantidade de BC no BC-SPI é maior do que 40% do peso de proteína seca no isolado e a quanti- dade de glicinina no BC-SPI é menor do que 10% do peso da proteína seca no isolado usando-se os métodos do Exemplo 1.
Válvula L Hunter: Como usado nesta invenção, o termo "Válvula L Hunter" é a medida da brancura através de um colorímetro.
Válvula B Hunter: Como usado nesta invenção, o termo "Válvula B Hunter" é a medida do amarelidão através de um colorímetro.
índice de Solubilidade de Nitrogênio (NSI):Como usado nesta invenção, o termo "índice de Solubilidade de Nitrogênio (NSI)" é a medida da solubilidade da proteína usando-se o método Ba11-65 dos Métodos Oficiais e tentativos da AOCS, 1989, A- Edição.
Parcialmente Hidrolizado: Como usado nesta invenção, o termo "Parcialmente Hidrolizado" significa os produtos de hidrólise da BC.
Carnes Emulsificadas: Como usado nesta invenção, o termo "Carne Emulsificada" significa carnes contendo soja tendo uma textura tenra, tais como salsichas frankfurters e bolonha.
Barra Alimentícia Nutritiva: Como usado nesta invenção, o termo "Barra Alimentícia Nutritiva" significa uma barra alimentícia projetada para promover a saúde.
Sensação na Boca: Como usado nesta invenção, o termo "Sen- sação na Boca" significa como a substância é sentida numa boca humana.
A presente invenção descreve os benefícios fisiológicos assim como a funcionalidade do alimento do BC-SPI. O BC-SPI da presente inven- ção tem níveis de aminoácidos essenciais mais altos do que os esperados. O alto BC-SPI da presente invenção tem melhores propriedades para o pro- cessamento do alimento e para os produtos. Determinação do valor de proteínas em alimentos contendo gordura
Produtos contendo gordura tais como salsichas frankfurters , queijo processado, molhos de saladas, molhos, e bebidas nutritivas depen- dem de emulsificantes para ajudar a formar gotículas muito pequenas de gordura durante os processos de homogeneização e a seguir estabilizar as gotículas contra coalescência (fusão das gotículas) e formação de creme (flutuação para o topo) durante a armazenagem. Proteínas que são especi- almente bons emulsificantes têm estruturas altamente flexíveis que permitem alta afinidade e adsorção das proteínas nas interfaces óleo-água , seguido da habilidade de formarem filmes mecânicamente fortes e viscoelásticos e altamente hidratados sobre as superfícies das gotículas via interações prote- ína-proteína. Eni alguns produtos, a agregação controlada das gotículas de gordura estabilizadas por proteínas seguida de aquecimento ou hidrólise enzimática das proteínas, é importante para a formação de estruturas de gel que seguram água e proporcionam textura aos alimentos. Proteínas animais tais como caseínas no leite, lipoproteínas na gema de ovo, miosinas na car- ne e proteínas de albumina na clara de ovo são bons agentes emulsificantes que têm ambas as propriedades de estabilização e formação de gel (Bringe, N., em "Food Proteins and Lipids", Damodoran, S., ed., Plenum Press, NY, págs. 161-181, 1997). A oportunidade da presente invenção é de substituir proteínas animais por ingredientes de proteína de soja mais econômicos e saudáveis.
O potencial de novas fontes de proteínas para substituir proteí- nas animais como emulsificantes de alimentos pode ser determinada pela medição do diâmetro das gotículas de gordura estabilizadas por proteínas que são formadas sob condições que quebram as partículas de gordura em pequenas gotículas. Um bom emulsificante de proteína se adsorve rapida- mente às novas superfícies óleo-água e estabiliza as gotículas quanto a coa- lescência, resultando em emulsões tendo os diâmetros de partícula os mais baixos possíveis. Proteínas com emulsificação insatisfatória não cobre todas as novas superfícies óleo-água e têm estruturas insatisfatóriamente hidrata- das que não repelem (prevenção de agregação) outras gotículas cobertas com proteína. Os emulsificantes de proteínas insatisfatórios causam a for- mação de partículas maiores via agregação gotícula-gotícula e as partículas grandes aumentam de espaço com o tempo deixando uma camada de soro no fundo das suspensões. Grandes agregados de partículas são também detectados na boca como texturas gredosas ou arenosas. Partículas peque- nas não são detectadas na boca como partículas individuais e criam uma textura lisa ou cremosa (Bringe, N. e Clark,. D. em "Science for the Food In- dustry of the 21th Century", Yalpany, M.,Ed. ATL Press, págs. 51-68, 1993). Para determinar o potencial dos novos ingredientes de proteínas de substitu- ir outros ingredientes, pode-se preparar emulsões com os ingredientes sob várias condições relevantes para diferentes alimentos e determinar os tama- nhos das gotículas formadas e a quantidade de soro criada após a estoca- gem (Bringe, N. e outros, J. Food Sei. 61:1-6, 1996). Propriedades Funcionais Benéficas da BC purificada
Antes dos feijões-soja com alto BC serem disponíveis para tes- tes, as propriedades de BC purificadas foram comparadas com as da glicini- na e isolados comerciais em emulsões alimentícias modelo. Na presente invenção verificou-se que a BC formava partículas de emulsão menores do que o controle e os ingredientes da proteína de soja comercial quando foram preparadas as emulsões na presença de íon sódio ( ou potássio) ou íon cál- cio em níveis similares aqueles encontrados em alimentos tais como bebidas nutritivas como mostrado no Exemplo 2. As boas propriedades emulsifican- tes da BC são importantes para manter as emulsões de bebidas livres de separação (formação de creme).
Aspectos adicionais da invenção incluem as verificações de que a BC portou-se melhor que o controle e os ingredientes de proteína de soja comerciais quando as emulsões estabilizadas por proteínas foram tratadas por calor ou quando as emulsões foram congeladas e descongeladas como descrito no Exemplo 2. Esta propriedade é valiosa em aplicações tais como sobremesas congeladas branqueador de café congelado líquido onde as texturas homogêneas lisas e aparências dos produtos dependem da estabi- lidade das proteínas contra a agregação das proteínas induzida pelo conge- lamento-descongelamento.
Outra forma de realização da invenção é que o gel induzido por calor ou propriedades de formação de viscosidade das emulsões estabiliza- das de BC foram ótimos próxima a pH 5,6 e significativamente maior do que as do controle e outros ingredientes de proteína de soja na presença de sal como descrito no Exemplo 2, Tabela 3. A preparação de géis de alimentos a partir de emulsões estabilizadas por BC na faixa de pH de 5,4 à 5,8 e baixas concentrações de sal (0,2-0,6% de NaCI ou KCI) pode agora ser concebida e projetadas sob esta invenção. A propriedade gelificante encontra-se na regi- ão de pH de carnes emulsificadas onde os ingredientes da proteína de soja são usados como agentes de gelificação. A limitação da verificação para aplicações em carne foi de que sistemas com carne não são aquecidos aci- ma de 710C e contêm pelo menos 3,5% de NaCI na fase água. Essas condi- ções são incluídas no exemplo abaixo. BC-SPI
Para tirar vantagem das propriedades da BC nas aplicações a- cima, foi desenvolvido nesta invenção um meio econômico da preparar SPI que seja rico em BC e tenha falta de glicinina. O uso de feijões-soja de alto teor de BC que contenha menos de 10% de glicinina e mais de 40% de BC, permite a preparação de BC-SPI sem as ineficiencias de remoção de glicini- na durante o processamento. Os BC-SPIs da presente invenção continham .50% de BC, comparados com 25% no SPI comercial conforme medido pelos métodos de eletroforese de gel SDS-PAGE definidos no Exemplo 1. O BC- SPI da presente invenção continha também aproximadamente 7% de glicini- na comparado com 51% no SPI comercial. Solubilidade e Cor do SPI comercial
Feijões-soja de alto teor de BC foram colhidos perto da área de St. Louis em Illinois no outono de 1997. Os grãos foram processados à BC- SPI usando-se precipitação ácida e uma combinação de métodos de ultrafil- tração e diafiltração (Lawhon, J. Patente U.S. No. 4.420.425, 1983; Koseo- glu, S. e Lusas, E. em "Proccedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs" por exemplo, Ap- plewhite, T., Amer. Oil Chem. Soc., Chamaign, IL, págs. 528-547, 1989) co- mo descrito no Exemplo 3. Grãos com baixos teores de BC (BC representa .11% da proteína) foram também processados a isolados de proteína de soja para comparação em estudos de alimentação de animais. Em uma forma de realização da invenção, a solubilidade e cor do BC-SPI feito por ultrafiltração e diafiltração foram substancialmente melhores do que as do isolado comer- cial e o BC-SPI feito por precipitação ácida como discutido no Exemplo 4. Esta verificação é valiosa para aplicações de misturas de bebidas secas on- de somente mistura com baixo cisalhamento é usada para dispersar o pó e onde a cor branca das bebidas lácteas é desejada. Agregados insolúveis maiores do que 10 mícrons são detectados pelo consumidor como uma re- preensível sensação arenosa na boca. Uma porção muito menor do volume da partícula no BC-SPI hidratado feita por ultrafiltração e diafiltração veio de partículas maiores do que 10 mícrons como descrito no Exemplo 3. Estabilidade do modelo de bebida de BC-SPI próximo do pH 6.7.
As propriedades dos BC-SPIs foram comparadas com as do iso- lados de proteína de soja comercial e caseinato de sódio num sistema de bebida modelo, pH 6,7. Os BC-SPIs desempenharam tão bem ou melhor do que os isolados comerciais dependendo das condições de pH por exemplo, como mostrado no Exemplo 5. Foi verificado que o BC tinha grande estabili- dade contra a agregação induzida por íon cálcio do que o SPI comercial, mas não no mesmo grau da estabilidade ao cálcio verificada para a BC puri- ficada como mostrado no Exemplo 2. Esta invenção inclui também a verifi- cação de que os BC-SPIs da presente invenção têm um grau de estabilidade de congelamento-descongelamento mais alto que foi melhor do que aquele do SPI comercial integral ou parcialmente hidrolizado como discutido no E- xemplo 5. A estabilidade de congelamento-descongelamento dos BC-SPIs é perdida quando íons cálcio livres são incluídos na formação. Portanto, um aspecto da invenção é o desenvolvimento de alimentos contendo poucos íons cálcio livres , e usando-se BC-SPIs para alcançar boa estabilidade de congelamento-descongelamento.
Propriedades de Espessamento do BC-SPI no pH 5.8. um modelo de carne emulsificada
Isolados de proteína de soja comercial são tipicamente tratados por calor à ou acima de 90°C por até 20 segundos durante a produção para desnaturar as proteínas e formar complexos entre as subuniadades básicas de glicinina e subunidades de beta-conglicinina. Isto facilita a gelificação dos isolados de proteína de soja em produtos alimentícios, especilamente à tem- peraturas abaixo da temperatura de desnaturação das proteínas. Para testar a aplicação do BC-SPI quanto as propriedades gelificantes na s condições de pH, sal e temperaturas de carnes emulsificadas, comparou-se as proprie- dades gelificantes de BC-SPI que foi preaquecido-tratado (90°C) com as propriedades gelificantes de isolado comercial e clara de ovo. Uma verifica- ção inesperada da presente invenção foi de que as viscosidades das emul- sões preparadas com BC-SPIs foram 1,7-3,0 vezes maiores do que aquelas preparadas com o isolado de proteína de soja comercial como mostrado no Exemplo 6. Além disso, as estruturas que sustentam água formadas por inte- rações proteínas-proteínas entre as superfícies das gotículas de gordura revestidas com proteínas foram mais facilmente desdobradas nas emulsões estabilizadas por BC-SPI do que aquelas estabilizadas por isolado comerci- al, conforme medido pelo maior redução na viscosidade com aumento no tempo de cisalhamento como discutido no Exemplo 6. Quando este desdo- bramento ocorre na boca é percebido como uma textura mais desejável, por exemplo, mais liso e menos duro. Portanto, as propriedades gelificantes (ou união de gordura e água) de isolado de proteína de soja sob as condições de sistemas de carne emulsificados podem ser otimizadas através do uso de BC-SPI.
Composição de aminoácido de feiiões-soia com BC e BC-SPI
Feijões-soja com alto teor de BC desta invenção apresentavam teor protéico e teores dos aminoácidos metionina, cisteína, Iisina e arginina surpreendentemente altos como indicado no Exemplo 6. Esses aminoácidos são normalmente limitados nos feijões-soja e farinhas de feijão-soja , espe- cialmente para o consumo de animais e seres humanos na infância (DeLu- mer, B. e outros, Food Technol. 51:67-70, 1997). Portanto, um aspecto da presente invenção inclui o uso de feijões-soja de alto teor de BC para fazer uma farinha de feijão-soja (com gordura ou sem gorgura) que é rica em ami- noácidos essenciais para uso em alimentos de animais, limitando a quanti- dade de aminoácidos sintéticos que são necessários para fortificar as rações alimentícias.
Os isolados de proteína de soja ricos em beta-conglicinina feitos pelos processos descritos no Exemplo 3, foram ambos similares na compo- sição de aminoácido essencial àquelas dos isolados de proteína de soja co- merciais ou ricos em súlfur aminoácidos como mostrado no Exemplo 8. As- sim os usos do SP-SPI para várias texturas de alimentos e benefícios fisio- lógicos não são necessáriamente limitados por um desbalanceamento de aminoácidos essenciais. A explicação provável é que os feijões-soja com alto teor de BC foram também enriquecidos em poucas proteínas de soja como parte da compensação para a perda de glicinina e essas proteínas são retidas no isolado de proteína de soja. Propriedades redutoras de colesterol dos BC-SPIs
Feijões-soja com falta de unidades alfa e alfa-principais de BC e feijões-soja ricos em BC foram usados para fazer isolados de proteína de soja. Esses BC-SPIs e isolados de controle feitos a partir de feijões-soja normais estão sendo testados quanto à propriedades redutoras de colesterol usando-se hamsters e métodos publicados (Terpstra, A. e outros, J. Nutr.121:944-947, 1991; Potter, S., e outros, J. Nutr. 126:2007-2011, 1996; Bal- mir, F. e outros, J. Nutr. 126:3046-3053, 1996). De acordo com a invenção, o BC produzido tem vários efeitos benéficos. Em particular, o BC tem benefí- cios de redução de colesterol específicos relacionados com as propriedades redutoras de colesterol dos ingredientes de proteína de soja e alimentos. Esses benefícios são relacionados com os teores de BC não os teores de proteína de soja totais.
BC-SPI com baixo teor de cisteína para aplicações em queijo processado
Nas aplicações em queijos da presente invenção, os BC-SPIs tratados por protease funcionam de maneira mais similar à proteínas de ca- seína do que os SPIs comerciais. Existem diversas diferenças entre a estru- tura das proteínas de caseína e proteínas de soja. Uma diferença chave é que as proteínas primárias (alfa -s1- e beta-caseínas) têm falta de cisteína, enquanto que as cinco subunidades de feijão-soja glicinina continham cada uma 0-6 cisteínas e as subunidades de beta-conglicinina continham 0 ou 1 cisteína (Utsumi e outros, em Food Proteins and Their Applications. Eds. Damodaran, S. e Paraf1 A . , Mareei Dekker1 Inc., 1997). A beta-conglicinina é mais similar à caseínas neste respeito do que a glicinina, assim poucos defeitos causados por grupos súlfur são prováveis no queijo com falta de glicinina (por exemplo, sabores oriundos de enxofre, agregados de proteínas ligados por dissulfeto que retêm água e criam uma textura farinácea).
Outra diferença chave entre proteínas de caseína e proteína de soja é que as dé caseína são fosforiladas. Os grupos fosfatos das proteínas de caseína servem à dois papéis. O primeiro papel é tornar as proteínas de caseína insolúveis na presença de cálcio seguido de adição de enzima qui- mozina que cliva especificamente a kappa-caseína. O segundo papel é o de ressolubilizar ou hidratar as caseínas seguido de acidificação por culturas bacterianas e remoção de água (soro de leite). Num pH mais baixo, o cálcio é liberado das fosfoproteínas e os grupos fosfato hidratados limitam a intera- ção proteína-proteína. Em queijo processado, o pH não tem que ser abaixa- do no que tange à solubilização das caseínas, por que são adicionados vá- rios sais de fosfato que quelam os íons cálcio. A natureza limitada das inte- rações caseína-caseína num pH de 5,1-6,0 e nas temperaturas de prepara- ção de alimentos, reduzem a ligação à água e daí a viscosidade da emulsão óleo-água estabilizada por proteína, e permite às caseínas fluírem como de- monstrado pelas propriedades de fusão e esticamento do queijo quando a- quecido. As caseínas solubilizadas servem também a um papel crítico como agentes emulsificantes em queijos processados, o que impede a separação da gordura durante o cozimento.
A beta-conglicinina é uma glicoproteína que contém carboidratos covalentemente ligados. Esses carboidratos que permanecem hidratados no pH do queijo, limitam as interações proteína-proteína entre as proteínas de BC. Um outro modo de melhorar a solubilidade das proteínas de BC no pH de queijo é hidrolizar parcialmente a BC. Modificação do SPI normal melho- rou a propriedade de fusão de análogos de queijo (Kim, S. e outros, JAOCS 69:755-759). Um melhoramento adicional é feito usando-se hidrolisados ri- cos em GC ou glicinina. Na presente invenção a hidrólise parcial da BC é singularmente valiosa por que as proteínas de BC são especialmente susce- tíveis de serem clivadas ao meio para formar fragmentos de 30kDa (Kawai e outros, Biosci. Biotech. Biochem. 61:794-799, 1997). Um aspecto da inven- ção é a verificação de o BC-SPI parcialmente hidrolisado funciona bem em análogos de queijo processado como discutido no Exemplo 9.
As propriedades de manufatura de queijo processado da BC são melhoradas pela hidrólise parcial da BC usando-se uma enzima como a Ala- calase (Novo Nordisk) como mostrado no Exemplo 9. A remoção de proteí- nas ricas em cisteína do BC-SPI irá também melhorar as propriedades da BC hidrolizada no queijo processado.
Proteína com baixa metionina e alta arainina para homocisteína
Metionina derivada de proteínas dietéticas serve como uma das principais fontes para a biossíntese de súlfur aminoácidos incluindo homocis- teína. Homocisteína é um fator de risco chave de doenças cardiovasculares. O consumo prolongado de dieta com baixo teor de metionina irá, portanto, reduzir ou pelo menos manter o nível de homocisteína no plasma .
Arginina, por outro lado, é o substrato natural para a óxido nítrico sintase, que converte arginina à citrulina e e óxido nítrico (NO). A citotoxici- dade endotélica da homocisteína é modulada pela presença de NO; NO e homocisteína reagem sob condições fisiológicas pára formar a S-nitroso- homocisteína não-tóxica. Além disso, NO é um importante mediador vascu- lar, liberado continuamente pelas células endotélicas no estado basal. No modelo do coelho hipercolesterolêmico, uma suplementação dietética com L- arginina reduz a formação de ateroma, melhora a dilatação endotélio depen- dente, diminui a agregação de plaquetas e a aderência de monócito ao en- dotélio aórtico. Mostrou-se também que a suplementação com L-arginina inibe a gregação de plaquetas em adultos jovens saudáveis via a rota do óxido nítrico. Em seres humanos hipercolesterolêmicos, a suplementação com L-arginina mostrou melhorar a vasorelaxação endotélio dependente. Além disso, o óxido nítrico, que é conhecido servir como uma retroalimenta- ção negativa para a VEFG, tem um benefício adicional de prevenir a angio- gênese e metástase. Desse modo, os benefícios à saúde conhecidos de li- beração contínua de baixos níveis de oxido nítrico na presente invenção é usada uma proteína de soja contendo alto teor de arginina e baixo teor de metionina como uma abordagem natural para desentoxicar homocisteína e representa uma alternativa viável e atrativa para as terapias atuais de uso de suplementos vitamínicos. A preparação deste aspecto da invenção é discuti- da no Exemplo 10.
Ingrediente de proteína com aminoácidos de baixo teor de enxofre para re- dução dos riscos de câncer e osteoporose.
A metionina representa um papel metabólico crítico no desen- volvimento de tumores por promover essencialmente a síntese de proteínas e proliferação de células. Desse modo, o teor mais baixo de metionina nas proteínas de soja comparadas com o das proteínas animais como a caseína, contribui para a inibição da tumorogênese através das proteínas com baixo teor de metionina como o isolado de proteína de soja comercial (Hawryle- wicz, E. e Huang, H., em "Dietary Proteins, How They Alliviate Disease and Promote Better Health", Liepa, G., editor, American Oil Chem. Soc.., Cham- paign, IL.pags. 123-150, 1992). O uso de BC-SPI contendo um teor de meti- onina ainda mais baixo, em aplicações de alimentos com alto teor de proteí- na irá melhorar ainda mais a segurança no consumo de alimentos com alto teor de proteínas.
A composição das proteínas na nossa dieta influencia também na saúde dos ossos influenciando na nossa retenção de cálcio dietético. Alta excreção de cálcio na urina para indivíduos numa dieta com alto teor de pro- teína animal, é relacionada com teores mais altos de aminoácidos contendo enxofre (Breslau, N. e outros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 66:140-146, 1988) e está relacionada com a incidência mais alta de fraturas na costela em mu- lheres com ingestão mais alta de proteína animal (Abelow, B. e outros,, Cla- cif, Tissue Int. 50:14-18, 1992). Um dos mecanismos envolvidos é o seguin- te: o enxofre é oxidado à sulfato in vivo, o que gera uma carga ácida fixa que é tamponada pelos ossos, resultando na dissolução dos ossos. O baixo teor de aminoácidos de enxofre do BC-SPI com baixo teor de metionina é benéfi- co na prevenção da osteoporose, câncer e doenças do coração. Aplicações em alimentos funcionais
Os benefícios fisiológicos acima da beta-conglicinina para apli- cações em alimentos funcionais tem sido reconhecido por desenvolvedores de produtos alimentícios. Usando-se as novas variedades de feijões-soja da presente invenção, tornou-se possível agora fazer-se BC-SPIs que são usa- dos para fazer bebidas e análogos de queijo com melhor textura, sabor, cor e qualidade nutritiva. Modificações adicionais
A presente invenção inclui modificações adicionais dos feijões- soja ricos em beta-conglicinina e proteínas de beta-conglicinina que aumen- tam ainda mais a eficiência de produção do isolado e a utilidade do BC-SPI. Exemplos incluem os seguintes: 1) Redução da quantidade de proteínas não estocadas no feijão-soja para aumentar os rendimentos de beta-conglicinina; 2) adição de uma única característica nula de dupla ou tripla-lipoxigenase para reduzir o desenvolvimento de sabor fora dos padrões durante a manu- fatura do BC-SPI como discutido no exemplo 11; 3) redução no teor de ácido linoléico e linolênico no feijão-soja, por exempli, pelo aumento do ácido oléi- co e/ou esteárico, para reduzir o desenvolvimento do sabor fora dos padrões durante a manufatura do BC-SPI; 4) modificação das quantidades de subu- nidades alfa, alfa' e beta da beta-conglicinina para obtenção de vários bene- fícios (por exemplo, redução da alergenicidade, melhora da solubilidade) pelo uso de tecnologia antisense ou as composições das subunidades atra- vés da mutagênese de sítio-específico; 5) hidrólise enzimática parcial do iso- lado rico em beta-conglicinina para melhorar a solubilidade da proteína, as propriedades do análogo de queijo, propriedades de gelificação e formação de espumas; e 6) fosforilação enzimática ou deamidação das proteínas de beta-conglicinina para melhorar a solubilidade e propriedades funcionais cor- relatas.
Procedimentos e métodos adicionais são bem conhecidos na técnica. Procedimentos adequados , materiais e métodos podem ser encon- trados em Fox, Ρ.F., Cheese: Chemistry, Physics and Mycrobiology1 Vol.2, Major Cheese Groups, pags. 339-383 (1987); Kolar, C.W. e outros, J.Amer. Oil Chem. Soe. 56:389-381, (1979); Fukushima, D. Food Ver. Int. 7:323-351, (1991); Hoogenkamp, H.W., Vegetable Protein Technology Value in Meat, Poultry & Vegetarian Foods, (1992); Mead, G.C. 1989, Processing of Poultry, Elsevier Appl. Sci., NY; Forrest, J.c. e outros, 1975, Principies of Meat Sci- ence, W.H. Freéman Co., San Francisco; e Wilson, L. A. Amer. Oil Chem. Soc., (1995), todos incorporados como referência nesta invenção.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são fornecidos para melhor ilustrar a pre- sente invenção e não se pretende que os mesmos sejam Iimitantes da in- venção além dos limites descritos nas reivindicações anexas. Exemplo 1
Eletroforese de gel SDS-PAGE de feiiões-soia e isolado de proteína de soia
1) Foram pesados 5 mg de amostra com teor protéico conhecido determinado pelo método Kjeldahl (proteína = nitrogênio χ 6,25) e colocados em um tudo microcentrífugo de 650 microlitros.
2) Foram adicionados 500 microlitros de solução de solubiliza- ção da amostra de SDS (contendo 10% de glicerol, 2,3% de SDS, Tris 0,0626 M1 pH 6,8, 5% de 2-mercaptoetanol, 0,05% de Azul de Bromofenol).
3) Os tubos foram selados e no caso das amostras de SPI colo- cadas em agitador por 20 minutos. Colocadas em banho de água ferente por 10 minutos.
4) As amostras foram resfriadas à temperatura ambiente.
5) As amostras foram centrifugadas em microcentrífugas ( ~ 14.000 χ g) por 10 minutos.
6) O sobrenadante foi recuperado
7) Forma carregados 5-8 microlitros (20-30 microgramas de pro- teína).
As condições da corrida e coloração:
1) Todos géis foram moldados por analista com 10-20% de acri- Iamida total (T) e 2,67% de géis de Laemelli que tinham uma espessura de .0,75 mm. Os géis foram moldados e processados usando-se o sistema Bio- Rad Protean Il xi que criam géis com aproximadamente 16 cm χ 16 cm.
.2) Os géis em montes foram moldados com 15 poços, e as a- mostras não foram fundidas nas pistas externas. Padrões de peso Bio-Rad Broad Molecular foram carregados em cada lado do gel para ser usado na determinação do peso molecular aparente.
.3) Os géis foram fundidos usando-se voltagem constante (60- 100 volts de um dia para o outro) ou corrente constante (15-30 mA/gel por 6-8 horas).
.4) Os géis foram fixados em ácido tricloroacético à 12, 5% por pelo menos 1 hora à temperatura ambiente.
.5) Os géis foram removidos do TCA e enxaguados por curto pe- ríodo em água deionizada. Foram colocados em Solução Coomassie A co- Ioidal ( 11% de sulfato de amônio/ 2% de ácido fosfórico) por 1 hora à tem- peratura ambiente, e então colocados em solução de coloração composta de .160 ml de solução A , 40 ml de metanol e 4,6 ml de solução B 91 g de Coo- massie G250 em 20 ml de água deionizada).
.6) Os géis foram coloridos à temperatura ambiente nesta solu- ção por pelo menos 16 horas (>24 é o melhor), a seguir foram enxaguadas com água deionizada e colocados ácido acético à 7% para remover por la- vagem os traços de coloração de fundo que ainda existia. Neste ponto os géis estavam prontos para representação de imagem ou fotografia.
Imagens Digitais de géis coloridos por Coomassie foram geradas usando-se uma câmara seqüencial com dispositivo de carga acoplada (CCD) Kodak Videk Mega-plus e um software de varredura incluído com um sistema de análise Biolmage Visage 2000 lmage. A câmara seqüencial CCD gerou imagens digitais que são 1024 χ 1024 pixels, com 250 valores digitais representando uma faixa de densidade ótica. Durante o processo de aquisi- ção de imagem, o sistema foi calibrado no que concerne ao tamanho do pi- xel e dos valores digitais. Os géis sofreram uma varredura usando-se a luz transmitida, uma lente de 17 mm, 2 filtros de densidade neutros, e um filtro amarelo para intensificar o contraste da coloração Coomassie. As análises das imagens digitais foram realizadas usando-se o software de análise Biolmage Whole Band. Com este aplicativo (software) o analista forneceu fronteiras de pistas, e o software identificava as pistas e gerava então suas fronteiras numa base automática. O analista tinha a ca- pacidade de remover fronteiras de banda que falharam na representação da banda, e a capacidade de assistir na determinação do posicionamento da fronteira indicando os eixos principais da banda. Este método controla as predisposições do analista através da aplicação dos mesmos algoritmos ao processo de determinação das fronteiras. Foi também possível ao analista definir manualmente (desenhar) a fronteira da banda, mas esta abordagem foi usada apenas onde todas as outras abordagens falharam (tipicamente de menos de 2% das bandas). O software de banda total quantificou as bandas individuais somando os valores digitais para cada pixel dentro da fronteira da banda , gerando um valor conhecido com densiadae ótica integrada ou IOD. Padrões de pesos moleculares comerciais (Bio-Rad Broad Molecular Weight Standards Catog #161-0317) aplicados nas pistas individuais do mesmo gel são usados para determinar o peso molecular aparente das banadas nas amostras. Bandas individuais podem ser nomeadas pelo analista para ajudar nas suas identificações na lista de bandas.
Os resultados da análise de imagens foram apresentados na forma de tabulação como uma "lista de bandas". A lista de bandas contêm dados agrupados por pistas incluindo o número da banda (numerado do topo da pista para o fundo), número da banda, IOD da banda, IOD % (% de mate- rial quantificado na pista representado por esta banda) e peso molecular. Cópias da tela do computador foram impressas como "despejos de memória da tela". Despejos de memória da tela foram gerados mostrando a imagem do gel digital sem anotação no lugar, com centros de bandas quantificads indicadas por um linha pontilhada, e com completa anotação mostrando as fronteiras, os nomes da pista, os centros da banda , as fronteiras da banda e os padrões de peso molecular. Exemplo 2
Isolados de proteína de soja comerciais, Supro 760 (SPI Comer- ciai A) e Supro 940 (SPI Comercial Β), foram obtidos de Protein Technologies International, St Louis, Missouri. Concentrado de proteína de soja comercial, Promine DS (SPC comercial) foi obtida Central Soya Company, Inc., Fort Wayne, Indiana. Isolado de proteína integral (SPI de Lab.) foi preparado de acordo com o método de Boatright, W.L. e outros,, J. Amer. Oil Chem. Soe. 72:1439-1444, (1995), com exceção de que foi usado petróleo para extrair a gordura. Emulsões contendo proteínas (1% de proteína), óleo de amendoim (10%), sacarose (5% na fase aquosa), NaCI (70 mM, 0,4% na fase aquosa) e CaCI2 onde indicado (4 mM) foram preparados por sonicação ( 160 watts, 60 seg.) e foram determinadas medições do diâmetro de partícula médio usando- se um instrumento de difração de luz à laser Malvern mastersizer. Um reôme- tro Bohlin VOR foi usado para determinar a viscosidade das amostras tratadas com calor (14,6 1/seg. de taxa de cisalhamento, 5 minutos, 5°C). As emulsões foram congeladas (4 dias, - 14°C) e descongeladas ou tratadas com calor (20 ml em frasco de vidro submerso num banho de água à 90°C por 60 minutos).
Os diâmetros das partículas pequenas das emulsões tratadas por calor ou congeladas-descongeladas, preparadas com caseinato de sódio e beta-conglicinina demonstraram o potencial da beta-conglicinina de substi- tuir o caseinato de sódio em aplicações de emulsões próximos de pH 6,7, tais como bebidas nutritivas e cremes de café como mostrado na Tabela 1. Tabela 1
Diâmetros de partículas médios de emulsões estabilizadas por beta- conglicinina purificada, isolado de proteína de soia de laboratório e ingredi- entes de proteína comercial
Proteína 0.4% de NaCI CaCIp 4 mM
Ph 6.0-6.1 PH 6.6-6.8 PH 6,0-6.1 PH 6.6-6.8 Caseinato de sódio 1,0 - 1,1 1,1 Beta-conglicinina 1,2 1,2 9,8 3,4 SPI de Laboratório 14,2 2,2 36,3 14,1 SPI Comercial A 30,0 1,6 69,1 61,9 SPI Comercial B 82,7 56,0 89,2 81,8 SPC Comercial 46,6 44,6 49,7 60,4 Tabela 2
Diâmetros de partículas médios de emulsões tratadas por calor ou congela- das-desconqeladas estabilizadas por beta-conqlicinina purificada, isolado de proteína de soia de laboratório e ingredientes de proteína comercial. 0.4% de NaCL e sacarose à 5%
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 3
Viscosidade de emulsões tratadas por calor estabilizadas por beta- conqlicinina purificada, isolados de proteína de soia de laboratório . isolado de proteína de soia comercial. 0,4% de NaCI e 5% de sacarose.
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Exemplo 3
Preparação em planta piloto de isolados de proteína de soia com alto teor de beta-conqlicinina
Remoção de gordura de feiiões-soia
1) Ajustar a umidade dos feijões-soja para cerca de 10% e tem- perar à temperatura ambiente.
2) Rachar os feijões-soja usando um moinho . 3) Debulhar os feijões-soja rachados usando um aspirador Kice.
4) Condicionar os feijões-soja triturados e debulhados à 50-60°C usando um fogão.
5) Flocular com os feijões-soja condicionados usando um moi- nho de floculação.
6) Extrair os flocos de feijão-soja com hexano.
7) Dessolventizar a refeição de feijão-soja desegordurada numa capela de laboratório por três dias.
B. Precipitação ácida
1. Água foi adicionada a um tanque com jaqueta de 200 litros e ajustada para 27-35°C e pH 8,5-9,0 usando-se NaOH a 20%. Flocos de fei- jão-soja desengordurados foram adicionados e misturados com um agitador equipado com duas hélices e um misturador de três estágios em linha moto- rizado que foi equipado com rotores fino, médio e grosso. O misturador em linha motorizado com uma circulação de malha fechada foi usado do princí- pio ao fim do processo de extração para reduzir o tamanho da partícula dos flocos e melhorar a extração de proteínas. A razão de água para farinha de soja foi de 10/1 (p/p). O pH da pasta fluida foi reajustado para pH 8,5-9,0 no caso do pH da pasta fluida ser menor do que 8,5.
2. A proteína de soja solubilizada foi recuperada da pasta fluida da extração por centrifugação (25-35°C), primeiro com um decantador para remover a maioria dos sólidos gastos, seguido de clarificação do líquido con- tendo proteína numa centrífuga de disco separador de lama numa vazão de alimentação de 250-500 Kg/h.
3. O pH da solução de proteína calrificada foi ajustado para 6,8- 7,0 usando-se ácido clorídrico a 6%. A solução de proteína foi pasteurizada numa condição de baixo calor (por exemplo, 72°C por 15 minutos) ou numa condição de alto calor ( por exemplo, 90°C, por 20 segundos) dependendo da aplicação, usando-se um trocador de calor de placas e resfriada para 25- 35°C.
4. A solução pasteurizada de proteína foi ajustada para pH 4,5 +/- 0,1 pela adição de ácido clorídrico (a 12%) e deixada reagir por 30 minu- tos a 30-35°C.
.5. A proteína precipitada foi recuperada usando-se uma centrífu- ga de disco separador numa vazão de alimentação de 200-400 Kg/h num intervalo de separação de lama de 3 minutos.
.6. O coágulo da proteína foi lavado por 10-30 minutos, duas ve- zes usando-se água acidificada ( pH 4,5 +/- 0,1 , 30-35°C). A razão de água de lavagem para sólidos úmidos empacotados foi de 5:1 (p/p). Quaisquer blocos no coágulo foram quebrados usando-se um mixer em linha motoriza- do. Os blocos no coágulo foram recuperados usando-se uma centrífuga de disco separador de lama nuam vazão de alimentação de 350-450 Kg/h após cada lavagem.
.7. O bloco lavado foi misturado com hidróxido de sódio diluído (à .0,5%) para neutralizar ( pH 7,0-7,2), diluído com água à 12-15% de sólidos (preferencialmente à 15%) e reajustado para pH 7,0-7,2. Um misturador em linha motorizado homogeiniza a pasta fluida antes da secagem por atomização (spray-drying). A solução de proteína foi estocada a 4 graus C ou tão fria quan- to possível antes da secagem por atomização usando-se um trocador de calor.
.8. A solução de proteína neutralizada e homogeneizada foi ajus- tada para 45-55°C e foi seca por secagem por atomização usando uma tem- peratura de entrada de ar de 180-185°C, e uma temperatura de saída de ar de 85-90°C.
C. Ultrafiltracão e diafiltracão
.1. Proteína pasteurizada foi preparada e obtida a solução da e- tapa A3 acima.
.2. A solução de proteína foi passada sobre uma membrana de ultrafiltração (por exemplo, fibra oca) com um corte de peso molecular de .100.000 Daltons. O volume original da solução de proteína foi mantido num recipiente de alimentação durante a ultrafiltração e diafiltração adicionando- se água para compensar o permeado removido.
.3. A solução resultante foi reciclada ao recipiente de alimentação.
.4. Uma vez que o permeado era de 1,3 à 1,5 vezes o volume de alimentação original, a adição de água ao recipiente de alimentação foi des- continuada e o permeado foi coletado (por exemplo, 90°C-120°C por 20 se- gundos).
5. O volume do recipiente de alimentação foi reduzido pela ultra- filtração até que um teor de sólidos de cerca de 15% fosse alcançado e ajus- tado para pH 6,8-7,0 pela adição de NaOH a 8% ou HCI a 6%.
6. O resultante foi seco por atomização usando-se uma tempera- tura de entrada do ar de 180-185°C e uma temperatura de saída do ar de -85-90°C.
Exemplo 4
Tabela 4. índice de solubilidade do Nitrogênio e cor do BC-SPI feito por ultra- filtracão e diafiltracão comparados com isolados comerciais
Isolados de BC-SPI e isolado com baixo teor de BC (para estudo de alimentação de animais) foram feitos pelos métodos de precipitação ácida e ultrafiltração em POS Pilot Plant Corp., Saskatoon, SK, Canada de acordo com os métodos do Exemplo 3.
As composições e propriedades físicas dos isolados compara- dos estão apresentados na tabela abaixo. Existe duas vezes mais BC no BC-SPI comparado com o SPI Comercial A, usando-se métodos de eletrofo- rese do Exemplo 1. O principal componente da glicinina dos BC-SPIs é a subunidade A3 (3,6% das proteínas no feijão-soja). O SPI com baixo teor de BC têm falta de unidades alfa e alfa' de beta-conglicinina. Uma vez que o SPI com baixo teor de BC e os (altos) BC-SPIs têm composições de amino- ácidos como indicado no Exemplo 8 e teor de isofalvona similares, quaisquer diferenças que se vê nas propriedades de abaixamento do colesterol dos isolados refletem diferentes qualidades da proteína de soja.
<table>table see original document page 27</column></row><table> Ρ.Η. = parcialmente hidrolizado
*P.Vol>10 m. - volume da partícula para partículas maiores do que 10 mí- crons
** Diâmetro médio da partícula
Tabela 4. Composição química de SPIs
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Tabela 5. Teor de isoflavonas nos SPIs. Os valores de isoflavonas listados são a soma dos isômeros individuais de cada isoflavona , genisteína, daidze- ína, e gliciteína, normalizados para suas diferenças em pesos moleculares para dar as concentrações de isoflavonas totais
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Exemplo 5
Propriedades dos BC-SPIs comparados com SPIs comerciais e caseinato de sódio num sistema de bebida modelo
Materiais: SPI Comercial (SPI Comercial A) e isolado de proteína de soja parcialmente hidrolizado (SPI Comercial C) foram obtidos de Protein Technologies, St. Louis, Missouri.
Formação da emulsão: Proteína (concentração final de 1%, u- sando 5,71 χ nitrogênio para proteínas de soja e 6,38 χ nitrogênio para case- ína) (Morr, C.J. , Food Sei. 47:1751, 1982) foi lentamente adicionada a uma solução de sacarose a 5% usando um misturador Dispermat e NaCI a 0,4% (na fase aquosa) foi adicionado à mistura. Os pHs iniciais das soluções fo- ram ajustados de acordo com experimentos anteriores de modo que o pH final da solução será próximo do pH alvo. Óleo de amendoim foi adicionado lentamente à solução de proteína no Dispermat (cerca de 3 minutos). As formulações foram sonificadas (160 watts) por 1 minuto no béquer de plásti- co com um sonda de sonificação numa profundidade da marca de 20 ml no béquer.
Tratamento por calor: Emulsões estabilizadas por proteínas (20 ml) foram transferidas para frascos de vidro com tampas de topo roscadas, submergidas num banho de água a 90°C por 60 minutos e estocada num refrigerador de um dia para o outro.
Medidas do tamanho das partículas e viscosidade: Amostras foram testadas quanto a vicosidade usando um reômetro Bohlin (copo C14 e feixe serrilhado, tempo de equilíbrio de 5 minutos, 5 graus C, taxa de cisa- Ihamento de 14,6 l/segundos, 5 minutos de cisalhamento), e foram testados para determinação do diâmetro médio da partícula usando um analisador de tamanho de partícula Horiba LA910 (base em volume, índice de refração relativo de 1,10, a mais baixa velocidade de circulação).
Resultados: Caseinato de sódio é um bom emulsificante e uma proteína estável contra agregação como ilustrado pelos pequenos diâmetros médios das partículas (0,9-1,0 mícron) das emulsões preparadas sob várias condições. A emulsão estabilizada por caseína num pH de 6,7 na presença de CaCI2 4 mM não mostrou qualquer separação de soro durante a estoca- gem. Diferente do SPI Comercial A, ambos os BC-SPIs exibiram boa estabi- lidade de congelamento-descongelamento como indicado pelos pequenos diâmetros médios das partículas das gotículas da emulsão (3,5 +/- 0,2 mí- crons). As gotículas da emulsão estabilizadas por BC-SPI (ácido) mostraram a melhor estabilidade contra agregação das amostras de proteína de soja num pH de 6,5, como indicado pelo pequeno diâmetro médio da partícula (2,9 mícrons). Entretanto , as gotículas de emulsão estabilizadas por BC-SPI UF foram as mais estáveis das amostras de proteína de soja contra agrega- ção na presença de íons de cálcio (pH 6,7).
Tabela 6. Diâmetros médios das partículas de emulsões estabilizadas por proteínas preparadas ou estocadas sob pH, sal e condições de congelamen- to indicadas. Todas as emulsões continham 0,4% de NaCI e 5% de sacarose na fase água e 1 % de proteína e 10% de óleo de amendoim.
<table>table see original document page 30</column></row><table> Os parênteses mostram o desvio padrão de amostras duplica- das.
Tabela 7. Diâmetos médios das partículas de emulsões estabilizadas por que foram tratadas por calor (banho de água a 90°C por 30 minutos).
BC-SPI (ácido) tinha o mesmo grau de estabilidade ao calor que
o SPI Comercial num pH de 6,7 e tinha melhor estabilidade ao calor num pH de 6,5 do que ambos os SPI Comercial e o BC-SPI feito por ultrafiltração.
<table>table see original document page 30</column></row><table> Parênteses mostram derivação padrão de amostras duplicatas. Exemplo 6
Propriedades de texturizacão de BC-SPIs sob condições modelando um sis- tema de carne emulsificada.
Materiais: Isolado de proteína de soja (SPI Comercial A) é manu- faturado com um SPI de alto calor. Amostras de BC-SPI foram feitas através dos métodos no Exemplo 2. BC-SPI de alto calor pode também ser feito dis- persando-se BC-SPI de baixo calor numa solução aquosa num frasco de vidro e submergindo-se o frasco num banho de água a 90°C por 30 minutos. O isolado de proteína de soja comercial foi fornecido por Protein Technologi- es International, St. Louis1 Missouri. A Clara de ovo foi fornecida pela Cana- dian Inovatech Inc., Abbotsford, British Columbia.
Formação da emulsão: Proteína (concentração final de 1%, u- sando 5,71 χ nitrogênio para proteínas de soja e 6,25 χ nitrogênio para pro- teína de clara de ovo) foi lentamente adicionada a uma solução de sacarose a 5% usando um misturador Dispermat e NaCI a 3,5% (na fase aquosa) foi adicionado à mistura. Os pHs iniciais das soluções foram ajustados de acor- do com experimentos anteriores de modo que o pH final da solução será próximo do pH alvo. Óleo de amendoim foi adicionado lentamente à solução de proteína no Dispermat (cerca de 3 minutos). As formulações foram sonifi- cadas (160 watts) por 1 minuto no béquer de plástico com um sonda de soni- ficação numa profundidade da marca de 20 ml no béquer
Gelificacão: 20 ml de cada uma das amostras acima foram a- quecidos num frasco de vidro num banho de água a 70°C por 30 minutos ou num banho de água a 80°C por 30 minutos, e então estocadas num refrige- rador (5°C) de um dia para o outro.
Medidas do tamanho de partícula e viscosidade: Amostras foram testadas quanto á vicosidade usando um reômetro Bohlin (copo C14 e feixe serrilhado, tempo de equilíbrio de 5 minutos de 5 minutos, 5°C, taxa de cisa- Ihamento de 14,6 l/seg, 5 minutos de cisalhamento), e foram testados para determinação do diâmetro médio da partícula usando um analisador de ta- manho de partícula Horiba LA910 (base em volume, índice de refração rela- tivo de 1,10, e a mais baixa velocidade de circulação). Resultados: Clara de ovo é um excelente agente gelificante usa- do em numerosos alimentos incluindo produtos de carne tais como surimi (análogos das patas de caranguejo). Entretanto, como a proteína de carne, a clara de ovo é cara comparado com a proteína de soja. Os ingredientes da proteína de soja que mais se aproximam do desempenho da proteína de clara de ovo, sob condições que imitam um sistema de carne emulsificada, foram os BC-SPIs de alto calor como mostrado na Tabela 8. A manufatura de BC-SPI de alto calor é feito num pH neutro onde ocorre a desnaturação da proteína, mas a agregação das proteínas é inibida. As viscosidades mais altas ou firmeza ou ligação de água e gordura ocorrem quando a proteína desnaturada é exposta a condições que são ótimas para a formação de es- truturas gel/agregado finas. A condição de gelificação é próxima de pH 5,8 para BC quando a BC é desnaturada. BC-SPIs de baixo calor foram também testados para comparação. A diferença entre as viscosidades das amostras feitas com BC-SPIs de baixo calor e aquelas feitas com com BC-SPI de alto calor quantifica ao valor adicionado pela desnaturação das proteínas de soja usando-se um tratamento por alto calor. Existe menos valor adicionado pelo preaquecimento do SPI normal porque a glicinina forma complexos com a BC alterando a natureza das reações de gelificação subsequentes (por e- xemplo, as condições ótimas de gelificação são movidas para valores de pH diferentes e existem menos sítios não agregados na BC disponíveis para formação de gel).
Tabela 8. Viscosidades (em unidades de mPa s) das emulsões tratadas por calor preparadas com BC-SPIs comparada com isolados de proteína de soja comercial, pH 5,8, 3,5% de NaCI em água, 5% de sacarose em água.
<table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> * dispersão de SPI Comercial num frasco de vidro foi aquecida num banho de água a 90°C por 30 minutos e resfriada num refrigerador. "Alto calor" está entre aspas por que o SPI comercial é altamente tratado por calor durante a produção comercial. Este teste mostra que adicional tratamento por calor não melhora o desempenho do isolado.
As figuras entre parênteses indicam os valores de desvio padrão para os testes em duplicado. Exemplo 7
Composições de proteína e aminoácido de feijões-soja com BC foram comparadas à composições médias de 58 linhas diversas de feijões- soja como indicado nas Tabelas 9 e 10. Feijões-soja (7-10 gramas) foram finamente triturados e analisados quanto à composição de aminoácidos, pro- teínas e umidade pelo Ralston Analytical Laboratories, St. Louis , Missouri de acordo com os procedimentos padrões. Os feijões-soja ricos em beta- conglicinina tinha altos níveis de proteína, cisteína, metionina, arginina e Iisi- na que são especialmente valorizados para alimentação animal. Tabela 9. Mostra os teores de aminoácidos e proteínas em unidades de: porcento, base seca. A linha elite é um Hartz 5350
<table>table see original document page 34</column></row><table> Tabela 10. Dados de aminoácidos para feijões-soja em unidades de mg/grama de proteína Exemplo 8
Composição de aminoácidos de isolados de proteína de soia Tabela 11
<table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> Exemplo 9
Foram feitos análogos de queijo processado usando-se BC-SPI parcialmente hidrolizado , BC-SPI não-hidrolizado, Supro 760 SPI A Comer- ciai, Supro 710, SPI C Comercial ou somente caseína de coalho. Métodos:
.1. BC-SPI (45 g; 30% da proteína na fórmula do queijo) foi adi- cionado à água (414 g) a 50°C e misturados completamente com movimen- tos rápidos até ficar liso (55°C).
.2. Foi ajustado o pH da solução para 8,0 usando-se NaOH a 1N.
.3. Alcalase (0,18 g) foi adicionada à mistura e agitada.
.4. A mistura foi colocada num fogão Stephan à aproximadamen- te 50°C e misturada á 600 rpm por 20 minutos para permitir tempo para hi- drólise limitada das proteínas de soja.
.5. A mistura foi então transferida para um béquer e aquecida á 60°C por 10 minutos.
.6. A pasta fluida foi adicionada a uma mistura de citrato de só- dio, cloreto de sódio, caseína de coalho, e óleo (50°C) contido numa caldeira dupla.
.7. A massa foi conduzida a 66°C e ácido lático foi adicionado (pH de 5,65-5,75) e a mistura foi agitada por 4 minutos, o tempo para a mas- sa alcançar 80°C.
.8. A massa quente foi transferida para um Fogão Cooker (80°C) e misturada a 600 rpm por 3 minutos e então derramada num recipiente e plástico, resfriada por 5 minutos , selada com um a tampa e estocada num refrigerador (4°C).
BC-SPI não-hidrolizado, SPI A Comercial, ou isolado C Comer- cial foram também usados para fazer análogo de queijo processado mistu- rando-se a proteína hidratada com os outros ingredientes na caldeira dupla e seguindo-se as etapas 7-8 acima. A fórmula na Tabela 12 indica que os queijos eram constituídos de 19% de proteína, 30% de gordura, e 46% de umidade. Os níveis de umidade desses queijos foram maiores do que os do produto comercial para tornar viável comparar as propriedades de uma faixa mais ampla de ingredientes de proteína de soja no sistema modelo, algumas das quais se misturariam deficientemente em níveis mais baixos de umida- de. Resultados: Como mostrado na Tabela 12, o SPI comercial hi- drolizado (SPI C Comercial) e o BC-SPI parcialmente hidrolizado apresenta- vam texturas elásticas e derretiam de modo o mais similar possível aos quei- jos contendo somente caseína de coalho como fonte de proteína.
Tabela 12. Fórmula do análogo de queijo <table>table see original document page 37</column></row><table>
Tabela 13. Resultados
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* % decréscimo em altura de 14 mm de um cubo alto aquecido à 100°C num forno por 15 minutos.
Números entre parênteses mostram o desvio padrão dos dados em dois dias. Exemplo 10
A preparação de novos BC-SPIs com baixo teor de metionina e alto teor de arginina são concebidos na invenção que são úteis com suple- mentos nutritivos e dietéticos para modular o nível de homocisteína total no plasma. Os BC-SPIs podem ser preparados usando-se condições que limita as reações de intercâmbio de dissulfeto entre as proteínas de soja (por e- xemplo, usando-se um agente redutor como o bissulfeto de sódio) e ultrafil- tração para reter beta-conglicinina, glicinina e gama-conglicininas. A cisteína de peso molecular mais baixo e proteínas ricas em metionina irão passar através da membrana no permeado. Exemplo 11
Enzimas Iipoxigenases são conhecidas por causar o desenvol- vimento de sabor fora do padrão em ingredientes de proteína de soja catali- sando-se a oxidação de gorduras poliinsaturadas. A Iipoxigenase de caracte- rística nula de uma variedade de feijão-soja desenvolvida por Keisuke Kita- mura foi transferida para um feijão alimentício norte-americano com falta de dois genes da Iipoxigenase e cruzou então com a variedade com alto teor de beta-conglicinina para criar uma variedade de feijão-soja com alto teor de beta-conglicinina e baixo sabor da invenção faltando pelo menos duas Iipo- xigenases.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes como forma de ilustração e exemplos para os propósitos de a tor- nar clara e compreensível, é óbvio que certas mudanças e modificações po- dem ser praticadas dentro do escopo da invenção, limitada apenas pelo es- copo das reivindicações anexas.

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES
1. Farinha de soja caracterizada pelo fato de ser produzida a partir de feijões-soja com altos teores de BC que é rica nos aminoácidos Iisi- na, metionina, cisteína e arginina.
2. Farinha fina de soja caracterizada pelo fato de ser produzida a partir de feijões-soja com altos teores de BC que é rica nos aminoácidos lisina, metionina, cisteína e arginina.
3. Ingrediente de alimentação animal caracterizado pelo fato de ser produzido através do uso de uma farinha feita a partir de feijões-soja com altos teores de BC, que é rica nos aminoácidos lisina, metionina, cisteí- na e arginina.
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