JPWO2002026243A1 - 血中中性脂肪低減用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血中の中性脂肪低減用組成物に関する。
背景技術
大豆蛋白質は植物性蛋白質の中で栄養性が優れているだけでなく、近年では様々な生理活性効果が見い出され、生理機能剤としても注目される食品素材である。
大豆蛋白質の持つ血中の中性脂肪低下能は、大豆蛋白質が体脂肪率を下げる効果などから既に確認されており、そのメカニズムは肝臓での脂肪酸合成酵素の活性を抑えるためであることを、入谷ら(J.Nutr.,126,380,1996)が明らかにしている。さらに、全大豆グロブリン、7Sグロブリン、11Sグロブリンの各々について、血中及び肝臓脂質に与える影響が検討されており、それらは動物性蛋白質であるカゼインに比べて、血中のコレステロールや中性脂肪を低減する能力において総じて優れている(沖田らのJ.Nutr.,27,379,1981)。
また、育種による11Sグロブリン欠損大豆、すなわち7Sグロブリンに富んだ種子についての報告があり(Breeding Science,46,11,1996)、それを応用した報告(Breeding Science,50,101,2000)や特許(US 6,171,640 B1)も出されている。
しかしながら、7Sグロブリンを含め大豆蛋白質はフィチン酸との複合体を形成し、大豆蛋白質の消化性に影響していることが知られている(リターら、J.Food Sci.,52,325,1987)。
さらに大豆由来の蛋白には、細胞膜をはじめプロテインボディー・オイルボディー等の膜を構成する極性脂質との親和力の高い蛋白も存在しており、佐本らにより「脂質会合蛋白質」(Oil−Body Associated Proteins)と名付けられている。脂質会合蛋白質は膜蛋白質を主体とする蛋白群の総称で、特にSDS−ポリアクリルアミド電気泳動による推定分子量において主に34kDa、24kDa、18kDaを示す蛋白質を含み、クロロホルム:エタノール=2:1の極性溶媒により抽出される極性脂質を10〜12重量%程度の極性脂質を含有する画分であり、工業的に生産される分離大豆蛋白の約35%をも占めていることが佐本らにより報告されている(B.B.B.,62(5),935−940(1998))。また、脂質会合蛋白質は風味が悪く、高いアレルゲン性を有している。
しかし、大豆蛋白質の蛋白質組成の検定によく用いられるSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法では、脂質会合蛋白質は染色性に乏しいため、実際の存在量よりもはるかに低く見積もられるか、全く考慮されない場合が多い。つまり従来の分画法は7Sと11Sのみに注目しており、各画分に混在する脂質会合蛋白質については考慮されていない。しかし、生理学的見地より、純度の高い7Sや11Sを得るには、この脂質会合蛋白質の挙動を考慮する必要がある。
大豆蛋白質から7Sグロブリンを効率よく調製し、かつ複合体として結合しているフィチン酸を分解、除去すると同時に脂質会合蛋白質の混在を抑え、純度を高めることは、血中の中性脂肪低減剤として、安全性のきわめて高い医薬品素材としてだけでなく、食品用素材として利用する上で重要な因子である。
本発明は、大豆蛋白質中の血中の中性脂肪低下能を有している画分を分画して、さらにその効果を高める処理を施すことで、食品あるいは医薬品として提供することを課題とする。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討の結果、次のことを見出した。
(1)脱脂大豆より、大豆蛋白質成分の一般的な分画法であるタン・シバサキらによる方法によって11Sグロブリンを除去した後、そこから7Sグロブリンを分画する場合、還元剤を使用せずとも50%以上の純度にまで分画出来る。
(2)上記7Sグロブリンおよび7Sグロブリンに結合したフィチン酸を分解、除去した7Sグロブリン(「低フィチン7Sグロブリン」という、以下同様。)を、カゼインを比較対照としたラットを用いた21日間の動物実験により、血中の中性脂肪低減能はカゼインに比べ、7Sグロブリンおよび低フィチン7Sグロブリンで優れており、特に低フィチン7Sグロブリンが高い中性脂肪低減能を有していた。
(3)また、この中性脂肪低減能の発現に伴い、血中のコレステロール値も低下する。このコレステロール低下能は、7Sグロブリンにも低フィチン7Sグロブリンにも、同様に見られるが、HDL−コレステロール(HDLC)は低フィチン7Sグロブリンの方が向上すること。
HDLCは余分のコレステロールを回収するいわゆる善玉コレステロールであって、これの向上効果は総コレステロール低下効果とあいまって動脈硬化指数を大きく低下させる。
動脈硬化指数=(総コレステロール―HDLコレステロール)/HDLコレステロール
(4)さらに、大豆蛋白質をフィチン酸分解酵素で処理することにより、フィチン酸が分解、除去された低フィチン7Sグロブリンが分画される。
(5)加えて、大豆蛋白質に混在する膜蛋白質に富む脂質会合蛋白質を除去することにより、有効成分である7Sグロブリンの効力をより強化することができる。
かくして、血中の中性脂肪低減能を有するとされる7Sグロブリンからフィチン酸を分解、除去し、さらに脂質会合蛋白質を除去して純度を上げることで、その効果が著しく向上することが判明し、その分、投与量は少量で済むことが期待できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、7Sグロブリンに富む低フィチン酸大豆蛋白を有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物を提供するものである。また、大豆蛋白質の主要構成成分である7Sグロブリンに富む画分を分画し、蛋白質純度(後述SPE基準)として50%以上で分画された7Sグロブリンに富む大豆蛋白で、脂質会合蛋白質の指標であるクロロホルム・メタノールで抽出される極性脂質を1/3以下に低減し、さらに、市販の大豆蛋白製品では蛋白当たり約2%であるフィチン酸含量を蛋白当たり0.2%以下まで分解、除去した低フィチン酸高純度7Sグロブリンを有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物を提供するものである。つまり、膜蛋白質に富む脂質会合蛋白質の混在を極力おさえ、フィチン酸を分解・除去する分画手段を講じることにより、より効力のつよい血中中性脂肪低減用組成物を提供するものである。一方、分画の手段として、大豆蛋白質製造工程においてフィチン酸分解酵素を作用させることで、7Sグロブリンの分画を容易にし、かつ、フィチン酸を蛋白当たり0.2%以下、脂質会合蛋白質を10%以下にまで分解、除去した高純度な低フィチン酸7Sグロブリンを有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物を提供するものである。また、上記製造工程において還元剤を添加しないで調製された血中中性脂肪低減用組成物を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、7Sグロブリンとは、一般に可溶性の球状蛋白質の総称であるグロブリンの中、分子量の超遠心沈降係数が7Sに相当するものを言う。グロブリンにはその分子量分布で2S、7S、11S、15Sが存在し、そのうち、7Sと11Sが大豆の様な豆科植物の貯蔵蛋白質には多量に含まれていることが知られている。なお、大豆の7Sグロブリンは免疫学的命名法にいうβ−コングリシニンに実質的に相当する。
本発明においては、大豆蛋白質から分画した7Sグロブリンの含量の高い画分を主成分として用いる。大豆蛋白質から7Sグロブリンを分画するには、まず、11Sグロブリンを除去する。その除去には、現在各グロブリン成分の分画方法として広く用いられいるタン・シバサキの方法(Thahn,V.H.,and Shibasaki,K.,J.Agric.Food Chem.,24,117,1976)はもちろん、その他いわゆるクリオプレシピテーション(Briggs,D.R.,and Mann,R.L.,Cereal Chem,27,243,1950)による冷却不溶区分(Cold−insoluble fraction/CIFと呼ばれる)や、ウルフらによる(Wolf,W.J.,and Sly,D.A.,Cereal Chem,44,653,1967)0.1N塩化カルシウム添加による分画法いずれの分画法によっても良い。また、後述の製造例2で示すような方法で、11Sおよび脂質会合蛋白質を除いたものを用いてもよい。
上記いずれかの方法により11Sグロブリンを除去した後、7Sグロブリンを通常の分離大豆蛋白質の調製方法によって分画する。ただし、この際、還元剤は用いずとも十分使用に耐えうる純度の7Sグロブリンが分画でき、さらに中性脂肪低減剤として使用する場合も、還元剤を含まない方がより広い範囲の用途が期待できる。蛋白質純度(SPE基準)として50%以上、好ましくは60%以上、更に好ましくは80%以上、特に好ましくは85%以上で分画された7Sグロブリンに富む大豆蛋白が得られる。さらに得られた7Sグロブリンに富む画分に、フィチン酸分解活性を有するフィターゼやホスファターゼのような酵素または酵素剤を作用させ、フィチン酸を分解、除去する。この様にしてフィチン酸を蛋白当たり0.2%以下、好ましくは、0.1%以下、より好ましくは0.05%以下まで分解、除去した低フィチン7Sグロブリンが本来有している血中の中性脂肪低減能を高める。
このフィチン酸が分解、除去された低フィチン7Sグロブリンを分画する方法として、大豆蛋白質に直接フィチン酸分解活性を有するフィターゼやホスファターゼのような酵素または、酵素剤を作用させることで、11Sグロブリンの除去とを同時に行うことも可能である。
さらに脂質会合蛋白質を除去することにより、低フィチン化7Sグロブリンの血中中性脂肪低減能をさらに高めることができる。その方法として、脂質会合蛋白質が不溶化しやすい微酸性領域(pH3.8〜6.8)で加温(30−75℃)を行い、pH5.6から6.8における沈殿画分として除去することができる。
本発明の組成物は、得られた画分や大豆蛋白を有効成分として経口投与用の組成物とすることができ、例えば、公知の方法に従って粉末状、糖衣錠、顆粒状等の剤形の組成物とすることができ、適宜、他の賦形剤、添加剤を添加することができる。
本発明の有効成分として用いる画分や大豆蛋白は食用として使用できる安全なものであり、組成物への配合量、摂取量は特に限定するものではなく、そのまま摂取しても、また、食餌療法として食品に添加してもよい。好ましい摂取量は、体重1kgあたり、7Sグロブリンに富む低フィチン酸大豆蛋白の量として50〜500mg、好ましくは100〜300mgの範囲にある。
実施例
以下に、本発明の有効性を実施例と共に示すが、これらの例示によって本発明の技術思想が限定されるものではない。
本発明に用いた主な分析方法は以下の通りである。
*粗蛋白質;ケールダール法に基づき窒素含量を求め、係数6.25をかけて粗蛋白質に換算した。
*SDS−ポリアクリルアミド電気泳動;Laemmli(Nature,227,680(1970))の方法に基づきゲル濃度10−20%のグラディエントゲルで分析した。アプライ量は10μgとした。
*フィチン酸;Alii Mohamedの方法(Cereal Chemistry 63,475−478.1986)に準拠して測定した。
*クロメタ油分;試料乾物に対してクロロホルム・メタノールの混合液(容量比、2:1)を約50倍加え、還流抽出される固形分の重量比をクロメタ油分として測定した。
*純度(SPE基準);上記のSDS−ポリアクリルアミド電気泳動で得られた泳動パターンをデンシトメーターで測定し、その全体に対する該当画分の面積比率を純度(SPE基準)とした。ここに7Sグロブリン含量はα、α’、βサブユニットの総量を指し、11Sグロブリン含量は酸性ポリペプチド(A)と塩基性ポリペプチド(B)の総量を指す。
*補正純度;上記で得られた純度(SPE基準)から、混在する脂質会合蛋白質の量も考慮した補正純度を以下のように算出した。すなわち試料の純度(SPE基準)の値をA%として、当該試料中には7Sグロブリンおよび11Sグロブリン以外にクロメタ油分の少なくとも10重量倍に相当する脂質会合蛋白質も存在するので、7Sグロブリン及び11Sグロブリンに脂質会合蛋白質の量を含めた合計蛋白に対する純度として算出する。
補正純度(%)=(100(%)−クロメタ油分(%)*10)*A(%)/100
* 中性脂質、総コレステロール、HDLコレステロール(HDLC);フジフィルム社製ドライケム5500装置にて、固相法で測定。
以下に本発明の好ましい態様を記載する。
製造例1(7Sグロブリン=「7S」及び低フィチン7Sグロブリン=「7S−PH」の調製)
脱脂大豆に1:10の重量割合で水を加え、随時pHを7.0に調整しながら1時間撹拌後遠心分離(4,000r.p.m.,20℃で10分間)し上澄液を得た。得られた上澄液をpH6.4に調整して、4℃にて一晩放置して、遠心分離(4,000r.p.m.,4℃で10分間)して沈殿を除去した。得られた上澄液を、pH4.5に調整し、遠心分離(4,000r.p.m.,4℃で10分間)して得られた沈殿物を回収して7Sグロブリンカードとした。
この7Sグロブリンカードに4倍量の水を加え、pH6.0に調整後、フィターゼ(ノボ社製「PYTASE NOVO L」)を蛋白当たり0.2%添加後、40℃で1時間反応させた。この反応液をpH5.0に調整後、遠心分離(4,000r.p.m.,20℃で10分間)してホエー画分を除き、低フィチン7Sグロブリンカードを得た。7Sグロブリンカード、低フィチン7Sグロブリンカードはともに加水後、pH7.0に中和し、140℃15秒間殺菌を行った後、直ちに噴霧乾燥して7Sグロブリンおよび低フィチン7Sグロブリンを得た。このようにして得られた各7SグロブリンをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後染色された蛋白質のバンドの染色度の測定から、純度として80%であることが示された。また両者のフィチン酸含量は蛋白当たり各々1.8%と0.05%であり、フィターゼ処理によりフィチン酸がほぼ完全に分解、除去されていることを確認した。また本品のクロメタ油分含量は2.8%であった。一方、シスチンとメチオニンの含硫アミノ酸の合計は25mg/g蛋白質で、本来5mg/g蛋白質である精製7Sに比べて高い値を示し、まだ不純物の多いことが示唆された。
製造例2(高純度低フィチン7Sグロブリン:「7S―PH―LP」の調製)
低変性脱脂大豆1重量部に、10重量部の40℃の抽出水を加え、塩酸にてpH5.3に調整した。この溶液に蛋白重量あたり8unit相当のフィターゼ(ノボ社製「PYTASE NOVO L」)を加え、40℃にて蛋白の抽出と酵素反応を併せた30分間の処理を行い、酵素処理した抽出スラリーを得た。この酵素処理抽出スラリーを25℃付近まで冷却し、塩酸にてpH6.1に調整し、バッチ式遠心分離機(3,000G)で遠心分離した。このとき可溶性画分と不溶性画分は明確な分離をした。なお、この遠心分離時の溶液温度は25℃付近であった。次に、可溶性画分を塩酸にてpH4.9に調整後、遠心分離して沈澱カード得た。沈澱カードは10倍量の水で水洗後、加水(4倍重量)し、苛性ソーダで中和し、140℃15秒間殺菌を行ったのち直ちに噴霧乾燥してフィターゼ処理した7Sグロブリンに富んだ分画大豆蛋白を得た(「7S―PH―LP」)。
このようにして得られた低フィチン7SグロブリンをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後染色された蛋白質のバンドの染色度の測定から、純度として95%であることがしめされた。またフィチン酸含量が蛋白当たり0.05%であり、フィチン酸がほぼ完全に分解、除去されていることを確認した。一方、本品のクロメタ油分含量は0.5%であり製造例1に比較して大きく低下していることが確認された。さらにシスチンとメチオニンの含硫アミノ酸の合計は12mg/g蛋白質で本来5mg/蛋白質である精製7Sに比べてかなり不純物の少ない高純度の7Sであることが示唆された。
実施例1(ラットによる血中中性脂肪低減効果確認試験)
ラットを用いて血中中性脂肪低減効果の確認試験を行った。試験飼料としては、上記製造例2で得られた大豆蛋白と、さらに比較対照としてカゼイン(ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母(株)製)をそれぞれ食餌蛋白質として20%含み、コレステロール0.5%とコール酸ナトリウム0.125%を添加し、さらにシュクロースとコーンスターチの混合比率を1:2としたものを用いた。具体的配合を下記表1に示す。
実験動物は5週齢(成長期)および20週齢(成熟期)のウィスター系雄ラット(体重100〜120g、330〜360g程度のもの)を日本SLCより購入し、市販固形飼料(オリエンタルCRF−1)で1週間予備飼育した後、各試験飼料群の体重が揃うように1群6匹で計2群に分け、試験飼料で10日間飼育した。飼育はラットを個別ケージに1匹ずつ入れ、温度23±1℃、湿度55±5%で12時間明暗サイクル(AM7:00からPM7:00まで照明)の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
試験期間は10日間とし、その期間の体重の増減を測定した。その結果を下記表2および表3に示す。なお、各試験間の体重の増加量に有意差は認められなかった。
10日間の試験食終了後、11日目の朝(AM8:00)より7時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離(3、000r.p.m.,5℃で15分間)にて血漿を分離し、中性脂肪およびコレステロールを測定した。測定値については群毎に平均値と標準誤差を算出し、有意差の検定はDuncan’s multiple range testによって行った。その結果を以下の表4および表5に示す。なお表中の中性脂肪低下率およびコレステロール低下率は各項目のカゼイン区とテスト区の差のカゼイン区に対する比率(%)で示した。
以上のように、低フィチン7Sグロブリンは成長期(5週齢)および成熟期(20週齢)のいずれにおいても顕著なコレステロールおよび血中中性脂肪の低減効果を示した。
比較実施例1(ラットによる血中中性脂肪低減効果確認試験)
実施例1と同様に、ラットによる血中中性脂肪低減効果の確認試験を行った。試験飼料として、実施例1と同様の組成のものを使用した。ただし、大豆蛋白としては、製造例1で得た7Sグロブリン(7S)を使用した。
実験動物は5週齢のウィスター系雄ラット(体重90〜110g程度のもの)を日本SLCより購入し、市販固形飼料(オリエンタルCRF−1)で1週間予備飼育した後、各試験飼料群の体重が揃うように1群6匹で計3群に分け、試験飼料で3週間飼育した。飼育はラットを個別ケージに1匹ずつ入れ、温度23±1℃、湿度55±5%で12時間明暗サイクル(AM7:00からPM7:00まで照明)の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
試験期間は21日間とし、その期間の体重の増加を測定した。結果を下記表6に示す。なお、各試験間の体重の増加量に有意差は認められなかった。
21日間の試験食終了後、22日目の朝(AM8:00)より6時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離(3、000r.p.m.,5℃で10分間)にて血漿を分離し、中性脂肪およびコレステロールを測定した。測定値については群毎に平均値と標準偏差を算出し)有意差の検定はDuncan’s multiple range testによって行った。その結果を以下の表7に示す。各低下率の求め方は実施例1の表4,5と同じである。
実施例1で用いた低フィチン7Sグロブリンのカゼインに対するコレステロールおよび中性脂肪低減効果に比較し、比較実施例1の7Sグロブリンは低減効果が弱く、低フィチン7Sグロブリンが7Sグロブリンに比較して、高い血中脂質改善効果を有していることが明らかとなった。
実施例2
製造例2で調製した精製度の高い低フィチン7Sグロブリン(7S−PH−LP)を用いて、その血中中性脂肪低減効果を調べた。対照として、実施例1と同様のカゼイン、7Sグロブリン(7S)、低フィチン7Sグロブリン(7S−PH)、および市販の分離大豆蛋白質(SPI)を用いた。各蛋白質試料の組成は表8に示した。
動物実験は実施例1と同様の5週齢のラットを用い、実施例1と同条件で体重を測定しながら2週間飼育した。試験食終了後実施例1と同様な方法で採血し、中性脂肪、コレステロールを測定した。
その結果の、体重の推移を表9に、中性脂肪、コレステロール、HDLCおよび以上のデータにより算出した動脈硬化指数を表10に示す。
以上の結果より、中性脂肪及びコレステロール低減効果はほぼ
カゼイン<<SPI=7S<7S−PH<7S−PH−LP
の順でみとめられ、また、HDLCはフィチン酸を除去した群で向上することが認められた。すなわちフィチン酸を除去し、さらに脂質会合蛋白質をも除いた高純度の低フィチン7Sグロブリンにもっとも顕著な血清脂質改善効果、特に動脈硬化指数低減効果のあることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、血中中性脂肪濃度を効率的に低減せしめることができ、しかも安全性がきわめて高いので、本発明の組成物は血中中性脂肪の濃度低減のための予防ないし、治療剤として有用であるだけでなく、そのための飲食品として供することが出来る。
Claims (8)
- 7Sグロブリンに富む低フィチン酸大豆蛋白を有効成分とする血中中性脂肪低減用組成物。
- 蛋白当たり7Sグロブリンを50%以上含有した請求項1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
- フィチン酸含量が、蛋白当たり0.2%以下である請求項1または2記載の血中中性脂肪低減用組成物。
- 蛋白質中の脂質会合蛋白質が10%以下である請求項1または2記載の血中中性脂肪低減用組成物。
- 蛋白中のクロロホルム:メタノール=2:1の溶媒に溶解する画分が1%以下である請求項1または2記載の血中中性脂肪低減用組成物
- 大豆蛋白質にフィチン酸分解酵素を作用させて得られたものである請求項1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
- 7Sグロブリンが蛋白質の50%以上含む大豆種子より調製した請求項1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
- その製造工程において還元剤を添加しないで調製された請求項1記載の血中中性脂肪低減用組成物。
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