CN103642749B

CN103642749B - 一种无载体细胞片及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103642749B
Application number: CN201310611198.2A
Authority: CN
Inventors: 武征; 王颖薇; 蔡冬青; 张建华; 周清; 张中夏; 樊泽培; 秦子夕; 禹艳红; 林熙; 秦俊文; 齐绪峰
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103642749A

Abstract

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种无载体细胞片及其制备方法与应用。该种无载体细胞片的制备方法包含如下步骤：把自杀基因转染到支持细胞中；在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；把目的细胞种植于支持细胞之上；在目的细胞之间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。本发明可获得具有良好生物学特性的无载体细胞片，是组织工程领域构建无载体细胞片上的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明原理科学可靠，工艺制作简单灵活。

Description

一种无载体细胞片及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种无载体细胞片及其制备方法与应用。

背景技术

相对于包含支架材料（胶原凝胶、纤维蛋白凝胶或生物膜）的细胞片产品来说，无载体细胞片的构建和使用，具备的优势在于：①能够高效率地收集完整、连续的高密度细胞片，均匀建立二维和三维结构的组织或器官；②无载体细胞片基底部与细胞外基质具有好的黏附性，易于移植至体外其他培养容器中或体内组织表面，在移植时不用缝合，可直接黏附于受创伤的组织上；③由于无需使用支架材料，可避免体内移植后由于支架降解所诱发的炎症反应和组织纤维化等副作用。④具有灵活方便的可加工性，通过细胞片的堆叠和重建成更厚更复杂的组织结构，从而获得适用于各种组织病变的修复再生。目前，无载体细胞片已在动物实验、临床前研究以及临床应用等不同研究条件下取得了成功，为临床修复缺损组织提供了极具前景的治疗途径。

现行的组织工程构建方案中，无载体细胞片的构建方法包括：①温敏培养皿法；②胶原凝胶法；③磁力法；④聚合电解质法；⑤粗糙颗粒法。不同的无载体细胞片构建方法直接影响细胞片的结构和生物学特性，最终影响移植后宿主对细胞片反应。其中：①温敏培养皿法指的是使用温敏材料作为细胞培养皿，通过改变温度使培养皿实现固液转换，从而使细胞片与培养皿分离，此方法的优点在于控制简单条件而实现细胞片与培养容器的分离，此方法的缺点在于细胞片可能会存在有机物质的残留，而且把细胞片从培养皿中取下的操作难度大。②凝胶法是通过把细胞种植在凝胶上，然后先用镊子把凝胶从培养容器中撕取下，再用蛋白酶把凝胶消化从而获取细胞片，此方法操作简单，但缺点在于合成凝胶过程复杂，而且在蛋白酶消化过程会对细胞造成损伤。③磁力法是通过制备具有磁性的阳离子脂质体MCLS，把MCLS与RGD结合成胶体涂料，在培养孔底部涂上此涂料，并在培养孔底部放置磁铁，把细胞种植在培养孔中，待细胞融合后移去磁铁，融合的细胞开始从外周逐渐与培养板脱离形成细胞片，此方法优点在于移植简便，可减少移植过程的机械损伤，但存在的缺点是此方法收获的细胞片残留有磁性物质，对宿主的毒性影响未知。④聚合电解质法通过形成聚合电解质薄膜，待细胞在薄膜上融合后，通过施加电压的方法使薄膜溶解，从而获取细胞片，此方法操作简便，使细胞保留了较好的机械性能和黏附性；不足之处是聚合电解质薄膜对目的细胞的生物学活性不能提供帮助和支持。⑤粗糙颗粒法是通过使用粗糙颗粒形成粗糙的单分子层，待细胞在单分子层上融合后通过吹打使细胞片自行脱落，此方法无需酶解消化作用，减低了对细胞的损伤，同时能获得较均匀的细胞片，然而此方法中使用的粗糙颗粒制法复杂，不易于操作。

以上技术的共同特点在于：借助各种因素实现培养细胞片与培养容器的分离，从而获取完整的细胞片产品，操作过程中并未涉及维持目的细胞生物学活性的方案和步骤。目前这类方法制备的细胞片产品多为一些稳定的终末分化细胞，包括角膜上皮细胞，内皮细胞，心肌细胞等。虽然这些终末分化细胞的体外增殖能力以及旁分泌功能有限，但借助这些方法，可实现制备细胞片的目的，满足一定的临床应用需求。随着细胞片产品应用实践的深入开展，临床上对该类产品治疗效果提出了更高要求。众所周知，在临床应用中，治疗价值更高的目的细胞通常来源于一些低分化细胞，例如胚胎干细胞，诱导性多潜能分化细胞，骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞，羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心肌祖细胞等。这些细胞对于体外培养条件要求较高，通常需要一定的支持细胞（成纤维细胞、间质细胞，胶质细胞或其它种类干细胞）作为饲养层，借助支持细胞复杂的生理旁分泌作用来维持它们的低分化特点和相应生理功能。对于这类培养要求更高的低分化细胞来说，现行的各类方法，虽然也可制备出3～5层的细胞片产品，但由于这些低分化细胞脱离了体内生理微环境，并且缺乏相应支持细胞旁分泌作用的支持，低分化的目的细胞往往会快速分化，由细胞的低分化状态转变为终末分化状态，目的细胞原有的生物学特性很难维持，降低了细胞片产品的理论治疗效果。因此，如何在实现细胞片分离的同时进一步保障细胞的生物学特性和功能，是制约细胞片产品（尤其是干细胞来源的细胞片）应用的一个关键问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种无载体细胞片的制备方法，该方法可实现细胞片分离的同时进一步保障细胞的生物学特性和功能。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的无载体细胞片。

本发明的再一目的在于提供上述无载体细胞片在组织工程领域中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种无载体细胞片的制备方法，包含如下步骤：

（1）把自杀基因转染到支持细胞中；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上；

（4）在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片。

所述的自杀基因包含胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶（E.coli-gpt）基因、细胞色素P450(Cytochrome P450/cytochrome P450reductase)基因、硝基还原酶(Nitroreductase)基因、羧肽酶(Carboxypeptidase G2)基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶（E.coli-DeoD）基因、白喉毒素(DTA)基因和FAS基因中的任何一种或一种以上；

所述的支持细胞指的是对目的细胞起到支持和营养作用，可维持目的细胞的生物学活性的细胞；

所述的支持细胞包含成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、角膜基质细胞中的任何一种或一种以上；

所述的转染方法为病毒或非病毒转染方法；

所述的病毒转染方法包含利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、人类疱疹病毒载体、细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中的任何一种或一种以上；

所述的非病毒转染方法包含阳离子聚合物转染法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法、二乙氨乙基葡聚糖介导转染法、直接注射法、电穿孔法、激光辐射法、磁性微粒法和基因枪法中的任何一种或一种以上；

所述的目的细胞种植方法指的是目的细胞与支持凝胶混合后进行种植；

所述的支持凝胶包含纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶、胶原凝胶、纳米多肽凝胶、天然生物凝胶中的任何一种或一种以上；

所述的目的细胞包含全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或一种以上；

所述的目的细胞进一步优选为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞中任何一种或一种以上；

所述的启动支持细胞的自杀基因指的是在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，利用低毒或无毒的药物前体与支持细胞中携带自杀基因编码的特异性酶类作用而导致携带该基因的支持细胞凋亡；

所述的药物前体包含无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、6-甲氧基阿糖核苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷、羧肽酶、异环磷酰胺、N-芳香基谷氨酸盐类前药、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷中的任何一种或一种以上。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明选用带自杀基因的细胞作为支持细胞构建无载体细胞片，根据不同的目的细胞片，可选用不同种类的细胞作为支持细胞，也可选用不同的细胞组合或细胞与凝胶组合灵活制备所需的细胞片，在支持细胞与目的细胞层分离时，可实现支持细胞凋亡去除，而目的细胞不受损伤并保持完整结构。其特征和优点在于：

可实现目的细胞片的有效分离：目的细胞相互融合后，启动支持细胞内的自杀基因，可仅使位于底部的支持细胞发生凋亡，从而去除支持细胞。由于不损伤目的细胞，最终和获得纯净的目的细胞片层结构。这种借助生物学原理实现细胞片分离的方式，同样可保持目的细胞的完整性，可获取完整的带有细胞外基质的细胞片。

可保障目的细胞的生物学特性：目的细胞增殖融合过程在支持细胞上进行，支持细胞能为目的细胞提供支撑作用，同时支持细胞通过旁分泌的方式分泌各种生长因子和细胞因子发挥对目的细胞层的营养支持作用，此时，目的细胞的培养环境由培养基中的营养物质和支持细胞的旁分泌物质共同组成，其所处的微环境会更贴近体内所处的微环境，从而更好地维持目的细胞的生物学特性，避免目的细胞在体外培养过程中的过度分化，有利于细胞片移植后在体内更好地发挥其生物学功能。

避免了非生物物质的残留：在整个细胞片培养过程中，除了一般细胞培养所需的营养物质外，所用的材料均具良好生物相容性，并未涉及对细胞存在潜在危害的物质。另外，在启动支持细胞自杀基因的过程，只针对支持细胞，因此对目的细胞的影响很低甚至不存在影响。由于整个过程并未用到非天然生物物质，避免了这类物质对于宿主的潜在危险。

通过本发明所述的方法，可获得具有较好生物学特性的无载体细胞片，不但是组织工程领域的新突破，也为临床疾病治疗开拓了新途径。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活，产品质量明显提高，且重现性好，可实现产业化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：无载体的乳鼠心肌细胞片

（1）把自杀基因转染到支持细胞中：

以小鼠的心脏成纤维细胞选作支持细胞，采用磷酸钙共沉淀转染法，把胸苷激酶基因（TK基因）转染入小鼠心脏成纤维细胞中；筛选稳定表达TK基因的成纤维细胞，扩增后备用；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞：

1×10⁶个稳定表达TK基因的小鼠成纤维细胞种植在3cm直径的侵袭小室(Transwell)的上表面，加入培养液3mL后培养2～3天，直至成纤维细胞完全融合；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上：

胶原酶消化法分离3日龄乳鼠心肌细胞，使用200μL纳米多肽凝胶混悬获取的3×10⁶/mL心肌细胞，将混悬液均匀滴加在已融合的心肌成纤维细胞表面；静态培养12小时后，给予连续灌注培养72小时后，促使心肌细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接；

（4）在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片：

按照20μmol/L浓度一次性添加针对TK自杀基因的特定的药物前体更昔洛韦3～5mL，诱导位于底部的成纤维细胞凋亡；2小时后使用镊子把小鼠的心肌细胞片从培养容器上取下，从而获取了包含3～5层心肌细胞无载体的细胞片。

经检测，细胞片中心肌细胞存活率80%～90%，细胞间连接紧密，细胞片带有完整的细胞外基质，黏附性强，自发性搏动心肌细胞静息电位为70～85mV,相对于未使用支持细胞的细胞片制备方法，心肌细胞的存活率和电生理活性均大幅提高。

实施例2：无载体小鼠骨髓间充质干细胞片

（1）把自杀基因转染到支持细胞中：

以大鼠的胚胎成纤维细胞选作支持细胞，采用脂质体转染法，将细胞色素P450基因导入大鼠的胚胎成纤维细胞中；筛选稳定表达细胞色素P450基因的成纤维细胞，扩增后备用；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞：

1×10⁶个稳定表达细胞色素P450基因的大鼠成纤维细胞种植在6cm直径培养皿的上表面，加入10mL培养液后培养2～3天，直至成纤维细胞完全融合；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上：

取4周龄小鼠股骨用培养液冲出骨髓腔中的骨髓将充质干细胞，经原代培养2～3天后，使用150μL纤维蛋白凝胶混悬获取的3×10⁶/mL骨髓间充质干细胞细胞，将混悬液均匀滴加在已融合的成纤维细胞表面；静态培养12小时后，给予连续灌注培养72小时，促使骨髓间充质干细胞建立了良好的细胞间联系；

按照5～50μmol/L浓度一次性添加药物前体环磷酰胺3～5mL，与小鼠成纤维细胞中的自杀基因表达的特异性酶类起反应，诱导小鼠成纤维细胞12小时后全部凋亡，用镊子收获含4～6层细胞的骨髓间充质干细胞片。

经检测，大鼠骨髓间充质干细胞在成纤维细胞支持下实现良好的增殖活性，使用流式细胞仪检测的代表骨髓间充质干细胞低分化的标志实验显示：相对于未使用支持细胞的细胞片制备方法，本方法白细胞分化抗原CD31从3.9%提高到30%，白细胞分化抗原CD34从11.3%提高到50.6%。骨髓间充质干细胞间建立了良好的细胞间联系，蛋白定量分析显示：细胞间连接蛋白Cx43表达量，从3.77%提高到22%。石蜡切片观察得到细胞片与纤维蛋白凝胶实现有效交联，细胞片强度大，黏附性好，适合用于组织器官的构建。

实施例3：无载体的人角膜缘干细胞片

（1）把自杀基因转染到支持细胞中：

以人角膜基质细胞作为支持细胞，采用腺病毒载体转染的方法，将胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)和胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)，同时导入人角膜基质细胞中；筛选稳定表达CD基因和TK基因的人角膜基质细胞，扩增后备用；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞：

将1×10⁶个带有CD基因和TK基因的人角膜基质细胞种植在3cm直径侵袭小室(Transwell)的上表面，后培养2～3天，直至角膜基质细胞完全融合；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上：

从活体取材获取的人角膜缘组织中分离角膜缘干细胞进行体外扩增，扩增后的细胞经流式细胞仪筛选多药耐药蛋白ABCG2表达阳性细胞作为种植的目的细胞；去除侵袭小室中的培养液，将包含1×10⁶个角膜缘干细胞(ABCG2表达阳性)5mL细胞悬液添加到侵袭小室中角膜基质细胞表面，静态培养48小时后，去除侵袭小室上方培养液，进行气液界面培养3天；

（4）在目的细胞之间实现良好的细胞连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片：

添加包含药物前体5-氟胞嘧啶（浓度：10～20μmol/L）和更昔洛韦（浓度：10～20μmol/L）的培养液5mL，其中5-氟胞嘧啶能与角膜基质细胞中的CD自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的5-氟胞嘧啶代谢为5-氟尿嘧啶，产生细胞毒性，更昔洛韦可与TK自杀基因表达的特异性酶类起反应，将更昔洛韦代谢为三磷酸化产物，产生细胞毒性产物；这两种药物前体可共同作用，导致角膜基质2～3小时后全部凋亡。使用用镊子收获含3～5层人角膜缘干细胞的细胞片产品。

经检测,人角膜缘干细胞片生物学活性好，与未使用支持细胞的细胞片制备方法比较，代表角角膜缘干细胞增殖功能的细胞克隆形成率由3～5%从提高到了10～15％，流式细胞仪检测代表兔角膜上皮细胞低分化标志的P63蛋白表达率从12％提高到了72％左右，核抗原Ki67从26％增长到60％。角膜上皮细胞间建立了良好的细胞间联系，代表兔角膜上皮细胞连接蛋白的标志桥粒蛋白表达率从3%提高到15%。

实施例4：无载体的乳鼠血管内皮细胞片

（1）把自杀基因转染到支持细胞中：

以大鼠的胚胎干细胞选作支持细胞，采用脂质体转染的方法，将胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK基因)导入大鼠的胚胎干细胞中；筛选稳定表达TK基因的大鼠胚胎干细胞，扩增后备用；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞：

将1×10⁵个带有TK基因的大鼠胚胎干细胞种植在3cm直径培养皿的中，加入培养液后培养3～5天，直至大鼠胚胎干细胞完全融合；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上：

胶原酶消化法分离1～4日龄乳鼠血管内皮细胞备用，使用200μL胶原凝胶混悬获取的1×10⁶/mL乳鼠血管内皮细胞后，均匀种植于已融合的大鼠胚胎干细胞表面；静态培养12小时后，给予连续灌注培养72小时，促使血管内皮细胞建立了良好的细胞间联系；

分两次添加包含药物前体更昔洛韦（5～50μmol/L浓度）的培养液5mL。更昔洛韦与胚胎干细胞中的TK自杀基因表达的特异性酶类起反应，将更昔洛韦代谢为三磷酸化产物，产生细胞毒性产物，最终导致大鼠胚胎干细胞全部凋亡；3～5小时后，使用滴管向细胞片底部吹打，吹打过程中，把已脱离培养皿底部的细胞片部分用镊子提起，收获单层无载体乳鼠血管内皮细胞片。

经检测，人的血管内皮细胞在胚胎干细胞支持下实现良好的增殖融合，与未使用支持细胞的细胞片制备方法比较，反映细胞增殖活性的核蛋白Ki67阳性细胞从3～5％增殖到9～12％，血管内皮细胞间建立了良好的细胞间联系，代表性连接蛋白的标志血管内皮钙粘蛋白表达量升高，血管内皮细胞与胶原凝胶实现有效的交联，细胞片强度大，黏附性好，利于在血管构建中使用。

实施例5：无载体的人皮肤细胞片

（1）把自杀基因转染到支持细胞中：

以人骨髓间充质干细胞选作支持细胞，采用磷酸钙共沉淀法转入将细胞色素P450基因导入人得骨髓间充质干细胞中；筛选稳定表达细胞色素P450基因的骨髓间充质干细胞，扩增后备用；

（2）在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞：

将4×10⁶个带有细胞色素P450自杀基因的人骨髓间充质干细胞种植在9cm直径培养皿中，加入培养液后培养2～3天，直至骨髓间充质干细胞完全融合；

（3）把目的细胞种植于支持细胞之上：

通过原代培养获取人表皮干细胞至1×10⁷，人皮肤成纤维细胞2×10⁶。使用500μL凝胶同时混悬2种目的细胞，将混悬液均匀滴加在已融合的骨髓间充质干细胞表面；静态培养12小时后，给予连续灌注培养72小时，最后至于动态气液界面培养系统培养48小时，促使目的细胞间建立了良好的细胞间联系；

一次性添加包含药物前体环磷酰胺（5～50μmol/L浓度）的培养液10mL，与骨髓间充质干细胞中的自杀基因表达的特异性酶类起反应，将无毒性的环磷酰胺代谢为有细胞毒性的4-羟基环磷酰胺，最终导致骨髓间充质干细胞2～3天后全部凋亡；使用细胞刮刀把表皮细胞片从培养皿中刮取下来，获取具有5～7层细胞结构的人皮肤无载体细胞片。

经检测，人皮肤干细胞和人成纤维细胞在成骨髓间充质干细胞支持下实现良好的增殖融合，与未使用支持细胞的细胞片制备方法比较，代表皮肤干细胞的G0/G1期细胞比例从55％提高到85％，流式细胞仪检测显示细胞表达的低分化标志角蛋白P63表达率从9.1%提高到26%，β1整合素表达率从11.2%提高到42%，皮肤干细胞与成纤维细胞间建立了良好的细胞间联系，两种目的细胞与纤维蛋白凝胶进行有效的交联，细胞片强度大，黏附性好，适合皮肤修复或组织器官的构建。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)把自杀基因转染到支持细胞中；

(2)在培养容器底部种植已转染自杀基因的支持细胞；

(3)把目的细胞种植于支持细胞之上；

(4)在目的细胞之间实现良好的融合和建立细胞间连接后，启动支持细胞中的自杀基因使其凋亡，获取含纯净目的细胞的无载体细胞片；

所述的支持细胞仅仅只转染自杀基因；

所述的支持细胞包含成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、角膜基质细胞中的任何一种或一种以上。

2.根据权利要求1所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：

所述的自杀基因包含胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因、白喉毒素基因和FAS基因中的任何一种或一种以上；

所述的转染方法为病毒或非病毒转染方法；

所述的目的细胞包含全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或一种以上。

3.根据权利要求2所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：

所述的目的细胞包含胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞中的任何一种或一种以上。

4.根据权利要求2所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：

所述的非病毒转染方法包含阳离子聚合物转染法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法、二乙氨乙基葡聚糖介导转染法、直接注射法、电穿孔法、激光辐射法、磁性微粒法和基因枪法中的任何一种或一种以上。

5.根据权利要求1所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：所述的目的细胞种植方法指的是目的细胞与支持凝胶混合后进行种植。

6.根据权利要求5所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：所述的支持凝胶包含纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶、胶原凝胶、纳米多肽凝胶、天然生物凝胶中的任何一种或一种以上。

7.根据权利要求1所述的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：

所述的启动支持细胞的自杀基因指的是在目的细胞间实现良好的融合和建立细胞间连接后，利用低毒或无毒的药物前体与支持细胞中携带自杀基因编码的特异性酶类作用而导致携带该基因的支持细胞凋亡。

8.根据权利要求7的一种无载体细胞片的制备方法，其特征在于：

所述的药物前体为无环鸟苷、更昔洛韦、5-氟胞嘧啶、6-巯基黄嘌呤、环磷酰胺、6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷、6-甲氧基阿糖核苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2-脱氧尿苷、羧肽酶、异环磷酰胺、N-芳香基谷氨酸盐类前药、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷中的任何一种或一种以上。

9.一种无载体细胞片，其特征在于：采用权利要求1～8任一项所述方法制备得到。

10.权利要求9所述的一种无载体细胞片在组织工程领域中的应用。