CN112029712A

CN112029712A - 一种牙龈干细胞的分离、培养方法及其应用

Info

Publication number: CN112029712A
Application number: CN201910397604.7A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Beijing Taisheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Taisheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明公开一种牙龈干细胞的分离、培养方法及其应用，分离培养方法包括对牙龈组织采用质量体积浓度小于0.3％的胶原酶‑磷酸盐缓冲液进行消化处理。本发明的分离方法仅采用Ⅰ型胶原酶消化处理牙龈组织，获得的原代牙龈干细胞数量多，而且活率高；而且分离速度快，处理时间短，显著降低了制备干细胞的成本；本发明方法分离培养的牙龈干细胞在青光眼手术后能显著延长滤过泡由功能性滤过泡过度到非功能滤过泡发生的时间，保持房水滤过道的流畅，使得房水能顺畅流畅，避免术后眼压再次升高，具有增强抗青光眼滤过术后滤过功能的作用，提高了青光眼手术成功率。

Description

一种牙龈干细胞的分离、培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种干细胞原代分离及培养方法，特别是涉及一种牙龈干细胞的分离、培养方法及牙龈干细胞的应用，属于干细胞培养领域。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力、向组织损伤部位定向迁移、促进组织修复、保护神经和调节免疫的作用。目前在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入.可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，可以分化为间叶和非间叶细胞谱系，是组织工程和再生医学研究中的重要种子细胞，因此临床应用价值不菲。

发现MSC具有免疫调控作用是干细胞研究领域中的一项重要突破，研究表明MSC可直接抑制T细胞的增殖、分化功能，也可通过抑制树突状细胞的分化和成熟，间接抑制T细胞。MSC还可调节自然杀伤性细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等的增殖、活化以及细胞因子的分泌和细胞毒活性等，并上调调节性T细胞(Treg细胞)，最终诱导抗炎效应和(或)免疫耐受状态。尽管如此，但MSC对于组织减少瘢痕的作用尚无研究报导。

青光眼是一类严重危害人类视觉健康的严重疾病，眼压增高导致视神经损伤，甚至出现萎缩，形成视功能不可逆转的损害，最终导致失明。抗青光眼滤过手术通过将房水引流到结膜瓣下，减少了眼内的放水量，从而达到降眼压的目的。但抗青光眼术后瘢痕形成，阻塞房水流畅的滤过道，导致房水不能顺畅流畅，眼压再次升高，青光眼手术失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速有效并且成本较低的牙龈干细胞分离、培养方法以及制备的牙龈干细胞在制备抗青术后滤过功能障碍的药物中的应用。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种牙龈干细胞的分离、培养方法，包括对牙龈组织进行消化处理，其中所述消化处理过程中消化牙龈组织的消化液为质量体积浓度小于0.3％的胶原酶-磷酸盐缓冲液。

其中，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液的质量体积浓度优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

特别是，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液为Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液。

尤其是，所述消化液按照如下方法制备而成：将质量体积浓度为1％的Ⅰ型胶原酶储存液用磷酸盐缓冲液稀释至质量体积浓度小于0.3％，优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

特别是，所述消化处理时间为25-40min；消化处理温度低于37℃；优选为35-37℃。

尤其是，所述消化处理在37℃，5％CO2，饱和湿度的标准环境下进行。

本发明另一方面提供一种牙龈干细胞的分离、培养方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将拔牙手术取下的牙齿清洗后，刮取牙齿根部的牙龈组织，并对牙龈组织进行剪切处理，制成预处理牙龈组织；

2)将预处理的牙龈组织置于消化液中，进行牙龈组织的消化处理，获得牙龈组织消化混合液；

3)将牙龈组织消化混合液与完全培养基混合，终止消化反应，并对终止混合液进行离心处理；

4)向离心沉淀中加入重悬液，进行重悬，获得重悬混合液；接着将重悬混合液与完全培养基混合后，进行孵育处理，获得牙龈干细胞。

其中，步骤1)中所述清洗时使用10,000U/ml青霉素及链霉素的磷酸盐缓冲液为清洗液。

特别是，所述清洗液中青霉素、链霉素分别为10,000U/ml。

特别是，将拔牙手术中拔出的牙齿先收集与收集液中保存，然后在进行清洗处理，其中，收集液为含有3％胎牛血清和青霉素-链霉素(10,000U/ml)的磷酸盐缓冲液。

青霉素、链霉素均为10,000U/ml的磷酸盐缓冲液。

其中，步骤2)中所述消化液为质量体积浓度小于0.3％的胶原酶-磷酸盐缓冲液。

特别是，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液的质量体积浓度优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

尤其是，所述胶原酶选择Ⅰ型胶原酶。

特别是，所述消化液按照如下方法制备而成：将质量体积浓度为1％的Ⅰ型胶原酶储存液用磷酸盐缓冲液稀释至质量体积浓度小于0.3％，优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

其中，所述消化处理时间为20-40min，优选为20-35min，进一步优选为20-25min；消化处理温度低于37℃；优选为35-37℃。

特别是，所述消化处理在37℃，5％CO2，饱和湿度的标准环境下进行。

尤其是，消化处理过程中，消化液浸没预处理的牙龈组织。

其中，步骤3)中所述完全培养基为：α-MEM培养基，含20％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，青霉素(10,000U/ml)和链霉素(10,000U/ml)。

特别是，步骤3)中所述完全培养基与牙龈组织消化混合液等体积混合。

尤其是，步骤3)中所述终止混合液于1000-2000rpm(优选为1500rpm)离心处理5-10min(优选为10min)。

其中，步骤4)中所述重悬液为完全培养基，所述完全培养基为：α-MEM培养基，含20％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，青霉素(10,000U/ml)和链霉素(10,000U/ml)。

特别是，步骤4)中所述培养处理条件为：37℃、5％CO₂。

本发明又一方面提供一种牙龈干细胞在制备药物或制剂中的应用，其中所述药物或制剂为抑制青光眼术后功能性滤过泡消退的药物、制剂。

本发明上述方法制备的牙龈干细胞在制备青光眼手术后抗瘢痕的药物中的应用。

本发明再一方面提供一种牙龈干细胞在维持功能性滤过泡形态和功能中的应用。

本发明上述方法制备的牙龈干细胞在抑制非功能性滤过泡发生中的应用；维持功能性滤过泡形态和功能中的应用。

本发明又再一方面提供一种牙龈干细胞在制备抗青术后滤过功能障碍的药物中的应用。

本发明上述方法制备的牙龈干细胞在制备抗青术(即抗青光眼手术)后滤过功能障碍的药物中的应用。

抑制功能性滤过泡消退，抑制非功能性滤过泡发生的药物中的应用，延长功能性滤过泡的功能，增长功能性滤过泡保持时间。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明方法中在牙龈组织消化处理过程中仅仅使用一种胶原酶----I型胶原酶，不需要其他胰酶或分散酶，显著降低了牙龈干细胞的分离、培养成本。

2、本发明方法还显著缩短了消化处理时间，消化处理时间仅仅只需要25-30min；现有消化处理过程中对消化温度要求严苛，而本发明的消化处理温度低，使得消化处理过程控制条件比较宽松，不必严格控制消化温度保持为37℃，简化操作，节省能源。

3、本发明方法分离培养牙龈干细胞迅速，酶解效率高，而且酶解效果显著提高，分离培养的效率高，降低了分离培养成本。

4、本发明方法分离培养获得的原代干细胞数量多，活率高，后续传代培养10代以上的细胞仍能保持良好的状态。

5、本发明的牙龈干细胞具有抗青光眼术后滤过功能障碍的作用，能显著延长抗青术后功能性滤过泡的功能，延长抗青术后功能性滤过泡的保持时间，增加功能性滤过泡存在时间，抑制、延缓非功能性滤过泡产生，增强抗青光眼术后的滤过功能，对抗青光眼手术的成功起重要作用。

附图说明

图1为本发明分离培养的原代牙龈干细胞在光学显微镜下的生长状况观察图。

图2为本发明分离培养的牙龈干细胞P3代流式鉴定图，其中A是空白组；B是CD34标记组；C是CD90标记组；D是ISO标记组；E是CD45标记组；F是CD73标记组。

图3为本发明分离培养的牙龈干细胞的胞油红O染色检测成脂分化图，其中A、B为显微镜下观察时不同视野中的成脂分化图。

图4为本发明分离培养的牙龈干细胞的茜素红染色检测成骨分化图，其中A、B为显微镜下观察时不同视野中的成骨成分分化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1牙龈干细胞的分离、培养

1、牙龈组织的预处理

1-1)将从手术台上取下的健康对象的牙齿(乳牙或第三磨牙)放入收集液中，所述收集液为含有3％胎牛血清和青霉素-链霉素(10,000U/ml)的磷酸盐缓冲液，低温保存，并转移至实验室；接着将收集的牙齿倒于100mm培养皿中，并用碘伏棉签对牙冠表面进行消毒，用持针器夹住牙冠部位，用一次性滴管吸取清洗液清洗牙齿表面，其中所述清洗液为含1倍体积青霉素及链霉素(10,000U/ml)的磷酸盐缓冲液；

磷酸缓冲液为本领域中常规使用的PBS，即中性磷酸缓冲溶液。收集液、清洗液中青霉素、链霉素均分别为10,000U/ml。

在进行拔牙手术时，均先进行牙龈剥离的操作，故所有取下的牙齿均有附着在牙齿表面的牙龈组织。或临床对于牙龈增生的患者会采取牙龈环切的方式得到牙龈组织。

1-2)用持针器夹住牙齿根部(防止反复摩擦，避免破坏牙周组织)，将手术刀刀柄沿牙釉本质界将牙龈组织割离牙齿表面后，用眼科镊夹取牙龈组织于准备好的平皿内；接着将分离下来的牙龈组织进行剪切、研磨，用刀柄对其进行反复切割，尽可能将牙龈组织切小、切碎，切割过程中要始终保持组织湿润，获得预处理后的牙龈组织。

2、消化处理

将预处理的牙龈组织和消化液放入离心管内，使得消化液没过牙龈组织，其中消化液为质量体积浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液，即将质量体积浓度为1％的Ⅰ型胶原酶(购自Sigma公司(西格玛)货号为C-0130)储存液用磷酸盐缓冲液稀释至质量体积浓度为0.25％；接着充分震动和晃动离心管，使得牙龈组织均匀悬浮于消化液中；然后将离心管放于孵育箱中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的标准环境下进行消化处理，并同时进行消化计时，消化处理25min(通常为20-40min，优选为20-35min)，获得牙龈组织消化混合液；

本发明的具体实施方式中，消化液以质量体积浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液为例，其他质量体积浓度小于0.3％的Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液的均适用于本发明，消化液的质量体积浓度优选为0.2％-0.3％。

本发明另一实例中消化处理温度为35℃，消化液的质量体积浓度为0.2％，消化处理时间为30min。

3、终止反应

将消化好的牙龈组织消化混合液加入到等倍体积的现用完全培养基中，混合均匀，终止消化反应，其中完全培养基为(α-MEM培养基，含20％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，青霉素(10,000U/ml)和链霉素(10,000U/ml)，其中α-MEM培养基、谷氨酰胺以及青霉素和链霉素购自Invitrogen公司旗下的Gbico品牌，货号分别为：11095-080，25030-081，15140-122)；

用一次性滴管将将终止反应的混合液转移至新的离心管内，室温离心1500rpm/10min；

4、重悬、培养处理

离心完毕后尽可能弃掉上清，用一次性滴管向离心管内加入重悬液，进行重悬，其中，所述重悬液选择完全培养基；获得重悬混合液；接着依据组织量的多少将重悬混合液加入到适当的容器(例如培养瓶)内，向容器内加入适量完全培养基，放入孵箱内，37℃、5％CO₂培养，3～5天即可见到生长的细胞，由此得到原代牙龈干细胞。

重悬液与完全培养基进行培养孵育过程中，加入适量的完全培养基用量是按照本领域公认的依据培养用容器的规格而定，即根据选择的培养容器的规格，选定添加到培养容器内的培养基的用量。

对分离培养得到的原代牙龈干细胞培养至对数生长期(即培养3-5天)后在光学显微镜下观察细胞。显微镜观察显示：本发明方法分离得到的牙龈干细胞为间充质干细胞形态，为长梭型成纤维样的间充质干细胞，如图1。本发明方法分离培养的细胞为原代培养得到的牙龈干细胞，数量大约为每毫升5×10⁶至1×10⁷个；待原代细胞生长至大约90％的融合度时进行传代培养处理，传至少10代以上的细胞仍能保持良好的状态，传代培养基与步骤4中的完全培养基相同。

实施例2牙龈干细胞的鉴定

以下实验使用的牙龈干细胞是按照上述方法培养的第二代至第五代的牙龈干细胞。

本发明分离培养的牙龈干细胞的细胞免疫表型鉴定及成脂、成骨分化鉴定的方法参照口腔相关干细胞的细胞表型鉴定和和成脂、成骨分化鉴定的参考方法(GANG DING,WEIWANG,YI LIU，et al.Effect of Cryopreservation on Biological and ImmunologicalProperties of Stem Cells From Apical Papilla.JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY,J.Cell.Physiol.223:415–422,2010.)；(F Feng1,K Akiyama2,Y Liu,et al,Utility ofPDL progenitors for in vivo tissue regeneration:a report of 3cases.OralDiseases(2010)16,20–28.)；(Takayoshi Yamaza,Akiyama Kentaro,Chider Chen,etal.Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduousteeth.Stem Cell Research&Therapy 2010,1:5.)进行，具体如下：

1、细胞免疫表型的流式细胞术鉴定

将细胞培养至P3代的牙龈细胞消化收集后离心计数；接着以每个样品1X10⁶的细胞总数进行表面标志物的孵育，其中选取阴性表面标志物CD34，CD45和阳性表面标志物CD73，CD90，设置空白对照组BLANK和阴性对照组ISO；室温避光孵育30分钟；400g离心5分钟，用PBS清洗2遍，后采用流式细胞仪，上机分析，本发明的牙龈干细胞流式细胞术鉴定结果如图2A-F所示，其中A是空白组；B是CD34标记组；C是CD90标记组；D是ISO标记组；E是CD45标记组；F是CD73标记组。

2、成脂、成骨分化鉴

将细胞培养至P3代的牙龈细胞接种于6孔板内，待细胞培养至对数生长期后更换GIBCO公司的分化培养基(即成骨/成脂培养基)；其中：

(成脂)培养至28天后弃去培养上清，用PBS清洗清洗1遍，加入10％福尔马林室温固定10分钟；弃上清，加入10％福尔马林固定至少一小时；弃上清，用纯水清洗2遍；弃上清，用60％异丙醇室温孵育5分钟；弃上清，加入1ml油红O染色液室温孵育10分钟；弃上清，加入纯化水清洗4遍；显微镜下观察，观察结果如图3A-B所示。

(成骨)培养至21天后，弃去培养上清，用PBS清洗2遍，加入70％预冷的乙醇固定至少一小时；弃上清，加入40mM的茜素红染色液室温孵育10分钟；弃上清，用纯水清洗5遍；显微镜下观察，观察结果如图4A-B所示。

按照上述方法分离培养得到的牙龈干细胞符合间充质干细胞的表达特性(例如：间充质干细胞高度表达CD29，CD73，CD90；不表达CD34，CD45)，并且具有多项分化的能力，能够分化为骨组织和脂肪组织，因而属于间充质干细胞。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述牙龈干细胞的有益效果，这些试验例包括了本发明的牙龈干细胞的动物试验。

试验例1牙龈间充质干细胞增强抗青光眼滤过术后滤过功能的实验

1、实验材料

1.1药物与试剂

速眠新Ⅱ注射液：敦化市圣达动物药品有限公司，批号：(2010)070031582；

盐酸丙美卡因滴眼液：比利时S.A.ALCON-COUVREUR N.V.，

乳酸左氧氟沙星滴眼液：比利时S.A.ALCON-COUVREUR N.V.，批号：H20090082；

5-0、10-0缝线：强生医疗器材有限公司；

Icare回弹式眼压计

Healaflow(海乐弗)：瑞士Anteis公司

1.2实验动物、细胞

新西兰大白兔，50只，雌雄各半，体重2700-3000克，购自北京利华实验动物中心。

实施例1分离、培养的原代牙龈干细胞继代培养的第二代至第五代的牙龈干细胞。

2、实验方法

正常新西兰白兔50只随机分为Ⅰ～Ⅴ组，每组10只。所有50只新西兰大白兔右眼均做小梁切除手术。Ⅰ～Ⅲ组术中分别给予结膜下注射10⁴个/ml牙龈间充质干细胞0.3ml、10⁵个/ml牙龈间充质干细胞0.3ml、10⁶个/ml牙龈间充质干细胞0.3ml；Ⅳ组巩膜瓣下注射Healaflow(海乐弗)0.05ml及结膜瓣下注射Healaflow 0.25ml；Ⅴ组结膜瓣下注射生理盐水组0.3ml。

术后连续10天每天用左氧氟沙星滴眼液点眼1次。

剔除动物意外死亡，以及术中淘汰，每天采用微观照相机(佳能)拍摄白兔小梁切除术后滤过泡的外眼像，观察和判断各组白兔的滤过泡由功能性滤过泡到非功能滤过泡发生的时间。

滤过泡分型标准如下：

Ⅰ型(微小囊泡型)：薄壁无血管，多成微囊状；Ⅱ型(扁平弥散型)：扁平、弥散、苍白状、相对壁厚，可见滤过泡微隆起，巩膜边界不清晰，滤过泡表面血管少；Ⅲ型(瘢痕型)：无滤过泡或球结膜充血微隆起，界面下瘢痕化粘连巩膜表面，多血管外观；Ⅳ型(包裹型)：周围圆顶状隆起，呈囊肿样增生，成为致密的球型空腔；其中：Ⅰ型、Ⅱ型为功能性滤过泡，Ⅲ型、Ⅳ型为非功能性滤过泡。

3、实验结果

将拍摄的各组实验组白兔的每一个外眼滤过泡照片与滤过泡分型标准进行比较，即可得到每只动物由功能性滤过泡到非功能性滤过泡的时间，每组的时间以均值±标准差的形式表示，观察结果如表1。

表1白兔术后滤过泡由功能性转为非功能性的时间(天)

组别	时间(天)
		Ⅰ	16.70±4.43
Ⅱ	19.40±5.02
		Ⅲ	20.80±6.26
Ⅳ	18.63±4.24
		Ⅴ	13.50±2.60

实验结果表明：

在白兔小梁切除术后，结膜下注射本发明制备的牙龈干细胞能延长功能性滤过泡存在时间，延缓非功能滤过泡发生时间；表明本发明分离培养的牙龈间充质干细胞可以增加功能性滤过泡存在时间，维持功能性滤过泡的形态和功能，增强抗青光眼术后的滤过功能，对抗青光眼手术的成功起重要作用。

术后观察各组滤过泡由功能性滤过泡到非功能滤过泡发生的时间中，Ⅰ组与Ⅴ组无显著性差异，而Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组与Ⅴ组都有显著性差异。p值分别为0.018、0.004、0.048。

Ⅱ组为牙龈间充质干细胞0.3ml、10⁵个/ml组；Ⅲ组为牙龈间充质干细胞0.3ml、10⁶个/ml组。经过上述研究表明，0.3ml、10⁵个/ml牙龈间充质干细胞组与0.3ml、10⁶个/ml牙龈间充质干细胞组，与单纯手术组(即Ⅴ组)比，具有显著性差异。表明该两组剂量的牙龈间充质干细胞可以增加功能性滤过泡存在时间，增强抗青光眼术后的滤过功能，对抗青光眼手术的成功起重要作用。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种牙龈干细胞的分离、培养方法，其特征是，包括对牙龈组织进行消化处理，其中所述消化处理过程中消化牙龈组织的消化液为质量体积浓度小于0.3％的胶原酶-磷酸盐缓冲液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液为Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述消化液按照如下方法制备而成：将质量体积浓度为1％的Ⅰ型胶原酶储存液用磷酸盐缓冲液稀释至质量体积浓度小于0.3％，优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％)。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征是，所述消化处理时间为25-40min；消化处理温度低于37℃；优选为35-37℃。

5.一种牙龈干细胞的分离、培养方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，步骤2)中所述消化液为质量体积浓度小于0.3％的胶原酶-磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，步骤2)中所述胶原酶选择Ⅰ型胶原酶。

8.一种如权利要求1-7任一方法制备的牙龈干细胞在维持功能性滤过泡形态和功能中的应用。

9.一种如权利要求1-7任一方法制备的牙龈干细胞在制备药物或制剂中的应用，其特征是，所述药物或制剂为抑制青光眼术后功能性滤过泡消退的药物、制剂。

10.一种如权利要求1-7任一方法制备的牙龈干细胞在制备抗青术后滤过功能障碍的药物中的应用。