CN101189327A

CN101189327A - 人无限增殖神经前体细胞系

Info

Publication number: CN101189327A
Application number: CNA2006800197314A
Authority: CN
Inventors: 本特·朱丽叶森
Original assignee: NS Gene AS
Current assignee: NS Gene AS
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-30
Publication date: 2008-05-28

Abstract

本发明涉及无限增殖的人神经前体细胞系，NGC－407。该细胞系建立自人胎儿组织。细胞系已使用含v－myc癌基因的逆转录病毒载体加以无限增殖。该细胞系是能分化成星形胶质细胞和包括多巴胺能神经元在内的神经元的神经前体细胞系。NGC－407细胞能迁移至植入大鼠脑中的成胶质细胞瘤，并与肿瘤细胞形成缝隙连接。表达自杀基因的NGC－407细胞可被用于向肿瘤递送活化的核苷类似物形式的活化前药。

Description

人无限增殖神经前体细胞系

本发明涉及无限增殖(immortalised)人类神经前体细胞系NGC-407。此细胞系已经从人胎儿组织建立。

发明背景

通过移植人胎儿组织治疗神经变性疾病的有效性已经在动物模型中显示[Brundin等，Behavioural effects of human fetal dopamine neurons grafted in arat model of Parkinson′s disease，Exp Brain Res，65(1986)235-40.；Wictorin等，Reformation of long axon pathways in adult rat central nervous system by humanforebrain neuroblasts，Nature，347(1990)556-8.]，并在患帕金森氏病(PD)和亨廷顿氏病的患者中显示[Bachoud-Levi等，Motor and cognitive improvementsin patients with Huntington′s disease after neural transplantation，Lancet，356(2000)1975-9.；Freed等，Transplantation of embryonic dopamine neurons forsevere Parkinson′s disease，N Engl J Med，344(2001)710-9.；Hagell等，Sequential bilateral transplantation in Parkinson′s disease：effects of the secondgraft，Brain，122(Pt 6)(1999)1121-32.；Kordower等，Neuropathologicalevidence of graft survival and striatal reinnervation after the transplantation offetal mesencephalic tissue in a patient with Parkinson′s disease，N Engl J Med，332(1995)1118-24.；Lindvall等，Grafts of fetal dopamine neurons survive andimprove motor function in Parkinson′s disease，Science，247(1990)574-7；Olanow等，Fetal nigral transplantation as a therapy for Parkinson′s disease，Trends Neurosci，19(1996)102-9.]。然而，人源胎儿供体细胞带来伦理和操作上的难题，因此必须开发用于未来移植的替代细胞来源。已经提议将经过遗传修饰表达治疗性基因的细胞植入到脑部，作为对神经变性疾病有潜力的治疗[Villa，A.，Navarro，B.and Martinez-Serrano，A.，Genetic perpetuation of invitro expanded human neural stem cells：cellular properties and therapeuticpotential，Brain Res Bull，57(2002)789-94.]。因此，当将遗传改造和细胞移植结合时，重要的问题是发现合适的细胞载体。

经过修饰表达胸苷激酶(TK)基因的肿瘤细胞获得将无毒核苷类似物更昔洛韦(ganciclovir，GCV)转变为其细胞毒性代谢物更昔洛韦-三磷酸盐的能力。经过遗传改造表达此种“自杀”基因的细胞如果接触到更昔洛韦会被去除。肿瘤细胞的实验室组织培养物，和由表达TK的细胞和未经修饰的“天然”肿瘤细胞的混合物组成的脑部肿瘤植入物，在更昔洛韦处理后也减退，而不对邻近的正常组织造成伤害。此种现象被称为“旁观者效应(bystandereffect)”，其中少数表达TK的细胞会使不表达TK的邻近天然肿瘤细胞死亡并被去除。

恶性脑部肿瘤是自杀基因递送的有吸引力的目标，因为整个恶性肿瘤都局限于脑部并且易被旁观者效应根除。此策略成功的关键成分是表达自杀基因的遗传载体及其传递载体。因为不可能分别注射基因治疗载体来靶向例如在多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)中所有的个别肿瘤，所以需要另一种递送策略。能追踪神经胶质瘤细胞并已经被改造来递送治疗分子的迁移细胞代表一种解决侵入正常脑组织的神经胶质瘤细胞问题的理想解决办法。已经证明神经干细胞(NSC)的迁移能力极为适合需要整个脑范围内的细胞替代及基因表达的神经变性疾病模型的治疗。已经假设NSC可特异性地归巢至脑内的疾病部位。也有研究得到有趣的观察结果：移植的NSC在距肿瘤自身一定距离注射时能够归巢到原发肿瘤团块；另外，观察到NSC将自身分散到整个瘤床，甚至并列迁移到进展的单个肿瘤细胞中(Dunn&Black，Neurosurgery 2003，52：1411-1424；Aboody等，PNAS，2000，97：12846-12851)。这些作者显示NSC能够追踪脑组织中肿瘤团块周围的浸润神经胶质瘤细胞，并“追踪(piggy back)”单个肿瘤细胞来进行细胞与细胞的接触。

本发明针对了在治疗神经变性疾病和治疗癌症领域的几个问题。因此，本发明一个目标是提供用于替代细胞疗法的充足材料，而避免需要大量胎儿组织。另一个目标是提供在植入CNS后能稳定表达转基因的细胞。另一个目标是提供能与癌细胞形成缝隙连接的细胞。另一个目标是提供能追踪CNS中的癌细胞的细胞。最终，这些细胞应能够增殖，从而它们能被足够多次地被传代，以被扩增、用治疗性基因转染并库存。

发明概述

本发明一方面涉及可从NGC-407细胞获得的、或从NGC-407细胞衍生的、或由NGC-407细胞组成的人类细胞系。此细胞系已经根据布达佩斯条约用登录号DSM ACC2718于2005年3月31日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany。

本发明细胞系有多个优点。它是稳定、无限增殖细胞系，它已经在130次以上的群体倍增过程中被扩增并保持稳定。该细胞系是神经先祖细胞系，取决于分化条件，它可以分化为神经元、星形胶质细胞和多巴胺能神经元。NGC-407细胞系可用于移植。已经显示该细胞系能够在移植入大鼠后存活至少3周。因此，希望NGC-407细胞系能够在人脑存活更长时间。在移植的过程中，此细胞系能稳定表达异源基因。NGC-407细胞系从而既能用作替代疗法(替代神经系统中丧失的或受损的细胞)又能用于保护性疗法(作为载体来传递生物功能，如分泌型生长因子、神经营养因子或神经递质)。

该细胞系已经过转导来表达异源胸苷激酶。已经选出表达高水平的此种异源激酶的单克隆细胞系。这些细胞系可用作将胸苷激酶递送到神经系统中的肿瘤细胞的载体。还显示NGC-407细胞系能够朝中枢神经系统中的癌细胞迁移，并且NGC-407细胞系能够与癌细胞形成缝隙连接并从细胞系转移低分子量化合物到癌细胞。因此，在NGC-407细胞系已迁移到癌细胞并与这些癌细胞形成缝隙连接之后，此细胞系能用作递送载体来活化前药物(prodrug)(例如AZT，更昔洛韦)。然后活化的前药将会转移到癌细胞并杀死它们及递送细胞系。这是一种治疗多形性成胶质细胞瘤的可行且有希望的方法。

另一个方面，本发明涉及NGC-407细胞系的试验用途，如用于体外药物筛选和表征。例如，该用途可能是安全性和毒性研究的一部分。与中脑来源的已知细胞系(MES-II(I)-C2，见WO 00/09669所述；也称作MESC2.10，见Lotharius等，J Biol Chem 2002，277：38884-38894所述)相比，NGC-407表达干细胞标记物巢蛋白(nestin)，并且能够分化成神经元和星形胶质细胞。另一方面，MESC2.10不表达巢蛋白并仅被诱导分化成神经元。因此，NGC-407代表较早的发育阶段，比MESC2.10潜力更广阔。星形胶质细胞分泌若干对维持神经元功能性有重要意义的生长因子(包括GDNF)和激素。在鉴定可能的用于治疗(例如帕金森氏病)的生物制品药物方面，含显著比例星形胶质细胞的细胞系是比神经元细胞系好的模型系统。

另一方面，本发明涉及NGC-407细胞系用于治疗应用，以及在另一方面用于替代疗法的用途。在特别优选的实施方案中，所述细胞系用于癌症治疗。

又一方面，本发明涉及生物适合的(biocompatible)胶囊，其包含核心(core)和半透膜，所述核心含有衍生自NGC-407细胞系的细胞组合物(acomposition of cells)，所述细胞能分泌将生物功能传递给个体的化合物，所述半透膜包绕细胞组合物并允许细胞组合物所分泌的化合物通透。

在本发明一个实施方案中，“治疗”、“疗法”和“医疗用途”应包括预防。“治疗”、“疗法”和“医疗用途”也可以(但不绝对)包括对疾病或紊乱的抑制、防护和/或预防。“治疗”、“疗法”和“医疗用途”也可包括治愈性(curative)、改善性(ameliorative)和/或对症性(symptomatic)治疗、疗法和医疗用途。

附图简述

图1是分化的免疫标记的NGC-407细胞的照片。图1A中，TH标记的神经元用箭头标记。图B中，β-III-微管蛋白标记的细胞用箭头标记，而GFAP标记的细胞用箭头的尖端标记。

图2显示了用不同标记物标记的分化的NGC-407细胞的百分比图表。TH神经元是用TH抗体标记的细胞，神经元是用β-III-微管蛋白抗体标记的细胞，而星形胶质细胞是用GFAP抗体标记的细胞。此图表显示四个不同组：增殖细胞(Prolif)和三个根据Riaz等(Bradford diff)，Sah等(Sah diff)和Storch等(Storch diff)的三种分化方案分化的组。

图3显示了在移植到大鼠纹状体(striatum)后1和3周，表达hNuc-和GFP-的NGC-407细胞的免疫组化可视图。在1周，发现大部分hNuc-阳性细胞在注射位置周围，但一些细胞迁移开(B)。GFP-染色显示，大约50％的hNuc-阳性细胞共表达GFP并且表现出星形胶质细胞形态(A，C和A′，C′)。A′-C′是A-C中白色方框中表示的细胞群的特写。在3周后，高百分比(＞35％)的hNuc-阳性细胞仍表达转基因(箭头的尖端)并展示分化程度更高的形态(D-F)。D-F中的箭头指示GFP阴性的hNuc-阳性细胞。C、C′和F中的比例尺为50μm。

图4.A.对照细胞缝隙连接介导的钙荧光素(calcein)转移。在接受来自黄色(点状箭头)双标记(红色亲脂类碳花青(red DiI)和绿色钙荧光素)的NGC-407细胞的可转移钙荧光素染料后，未标记的U343MGa-cl 2:6细胞已经变为绿色(直线箭头)。两种细胞彼此都通过延伸的突起来物理接触。B.PB处理的细胞。突起由于PB处理已经变得更突出(三重箭头)，并且此组中绿色受体细胞的数目也显著变多。

图5.用于使NGC-407细胞系无限增殖的TD1-2无限增殖载体的载体图谱。

图6：NGC-407细胞系(图6A)和表达番茄胸苷激酶的NGC-407细胞系(图6B)对于AZT的IC₅₀值。具体参见实施例6。

发明详述

NGC-407细胞系的转染或转导

在优选的实施方案中，本发明衍生自NGC-407细胞系的细胞包含异源DNA元件，其整合到基因组并与其整合进入的染色体一起复制，并可操作地组合真核启动子、异源治疗性基因、多聚腺苷酸化信号(pA)。

异源DNA元件可以来自任何合适来源，但优选选自本文所述的那些。

在优选的实施方案中，异源治疗性基因可受人泛蛋白(ubiquitin)(UbC)启动子转录控制来表达。

对表达的可能下调可以通过指导转基因及其随同启动子的位点特异性整合的方法实现。

根据本发明一个实施方案，启动子是组成型启动子，其选自下组：泛蛋白启动子、CMV启动子、JeT启动子(US 6,555,674)、SV40启动子、延伸因子1α启动子(EF1-alpha)、RSV、和Mo-MLV-LTR。

诱导型/阻遏型启动子的例子包括：Tet-On，Tet-Off，纳巴霉素(rapamycin)-诱导型启动子，Mx1。

合适的表达控制序列包括启动子、增强子、转录终止子、起始密码、内含子的剪接信号、和终止密码，它们都保持在本发明多核苷酸的准确阅读框内，从而允许适当地翻译mRNA。表达控制序列也可包括其它组分，如前导序列和融合配偶体序列。

合适的表达载体可以是病毒载体，其衍生自单纯疱疹病毒(Herpessimplex)，甲病毒属(alphavirus)，腺病毒属，腺伴随病毒属，杆状病毒属，HSV，冠状病毒属，牛乳头瘤病毒(Bovine papilloma virus)，Mo-MLV，优选腺伴随病毒属，或来自多种从细菌制备的质粒。

其他转染方法包括但不限于脂质体转染，电穿孔，和用含核或其他定位信号的载体肽转染。

其他合适的表达载体包括一般目的的哺乳动物载体，其也能从商业途径(Invitrogen Inc.，Clontech，Promega，BD Biosecences等)购得，还包括对遗传霉素(Geneticin)/新霉素(neomycin)(G418)，潮霉素B(hygromycin B)，嘌呤霉素(puromycin)，Zeocin/博来霉素(bleomycin)，杀稻瘟素(blasticidin)S1，霉酚酸(mycophenolic acid)或组氨醇(histidinol)的选择。

所述载体包括如下种类的载体：一般真核表达载体，用作稳定和瞬时表达的载体，和用于迅速克隆所需插入片段的epitag载体以及它们的TOPO衍生物(见下面非限制目的的载体举例的列表)。

蜕皮激素(ecdysone)-诱导型表达：pIND(SP1)载体；pIND/V5-His标签载体组；pIND(SP1)/V5-His标签载体组；EcR细胞系；Muristerone A。

稳定表达：pcDNA3.1/Hygro；PCI；PSI；pSecTag A，B&C；pcDNA3.1(-)/MycHis A，B&C；pcDNA3.1+/-；pcDNA3.1/Zeo(+)和pcDNA3.1/Zeo(-)；pcDNA3.1/His A，B，&C；pRc/CMV2；pZeoSV2(+)和pZeoSV2(-)；pRc/RSV；pTracer^TM-CMV；pTracer^TM-SV40。

瞬时表达：pCDM8；pcDNA1.1；pcDNA1.1/Amp。

Epitag载体：pcDNA3.1/MycHis A，B和C；pcDNA3.1/V5-His A，B和C。

异源治疗性基因

异源治疗性基因是编码治疗活性多肽或蛋白(也称为治疗因子)的基因。优选的治疗活性多肽或蛋白是能改善或治疗神经学紊乱的多肽或蛋白。

在优选的实施方案中，异源治疗性基因编码神经营养因子。在更优选的实施方案中，神经营养因子是神经生长因子(NGF)；胰岛素样生长因子(IGF)，尤其是IGF I或IGF II；转化生长因子(TGF)超家族成员，包括转化生长因子-α和转化生长因子-β(TGFα和TGFβ)，转化生长因子-β2(TGF-β2)，Neurturin(NTN)，Persephin(PSP)；神经胶质细胞系来源的(glial cell-line derived)神经营养因子(GDNF)；Neublastin(NBN)；睫状神经营养因子(CNTF)；脑源(brainderived)神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白(Neurotrophin，NT)，尤其是NT 3到9；肿瘤坏死因子(TNF)，尤其是TNF-α。

在另一个优选实施方案中，异源治疗性基因编码神经元存活因子(neuronal survival factor)。在更优选的实施方案中，神经元存活因子是可溶性或分泌型超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)，Bcl2，BCIX_L或Hedgehog蛋白。

在第三个优选实施方案中，异源治疗性基因编码神经生长因子。在更优选的实施方案中，神经生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)，尤其是酸性或碱性成纤维细胞生长因子(aFGF或bFGF)；内皮生长因子(EGF)，尤其是血管内皮细胞生长及通透因子(VEGPF)；干扰素，尤其是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ；白介素(IL)1，尤其是IL-1、IL-1β、GMCSF和IL-2到IL-14。

在第四个优选实施方案中，异源治疗性基因编码参与神经递质物质合成的生物活性分子。在更优选的实施方案中，神经递质物质是乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素、3，4-二羟苯丙氨酸(3，4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)、多巴胺、章鱼涎胺(octopamine)、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸(taurine)、丙氨酸、胱硫醚(cystathione)、组胺、5-羟色胺(serotonine，5-hydroxytryptamine)、P物质、神经肽(Neuropeptid)Y(NPY)、缩胆囊素(Cholecystokinin)、神经降压肽(neurotensin)、脑啡肽(enkephalin)、或促生长素抑制素(somatostatin)。在另一个优选的实施方案中，在神经递质物质合成中起作用的生物活性分子是胆碱乙酰基转移酶；酪氨酸羟化酶(TH)；酪氨酸脱羧酶；胸苷激酶，胞嘧啶脱酰胺酶(cytosine deamidase)，单胺氧化酶，L-DOPA脱羧酶，组氨酸脱羧酶，谷氨酸脱羧酶，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)。

在第五个优选实施方案中，异源治疗性基因编码受体。在更优选的实施方案中，受体是结合乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素、3，4-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章鱼涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸、丙氨酸、胱硫醚、组胺、5-羟色胺、P物质、神经肽Y(NPY)、缩胆囊素、神经降压肽、脑啡肽、或促生长素抑制素的受体。

替代疗法

本发明细胞系可以经过或不经过操作来包含编码特定治疗因子的其他异源DNA。在本发明细胞系不包含编码特定治疗因子的其他异源DNA的情况下，它特别适于康复疗法(restorative therapy)。

在本文，替代疗法的定义涉及源于神经系统内的细胞的移植，在植入移植物之后，所述细胞在CNS和/或PNS的特定位置中或全部替代缺陷的(defective)、缺无的(absent)或丧失的细胞及它们的功能。

本发明另一方面提供了在CNS之内或之外的替代疗法中使用的方法和组合物。本发明替代疗法可以特别用于细胞替代，由细胞产生的细胞分泌的内源性物质的递送，用于造血系统的疗法，哺乳动物包括人的神经学疾病。

本发明范围内的神经学缺损(neurological deficit)包括任何神经变性的疾病、紊乱或状况。神经缺损可能尤其是与如下有关的神经变性疾病：受损害的和受创伤的神经元，尤其是外周神经、髓质、和/或脊髓的创伤损害，大脑缺血性神经损伤，神经病尤其是外周神经病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病，帕金森氏病，成胶质细胞瘤，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)或任何其他神经变性疾病，以及与痴呆相关联的记忆障碍(memoryimpairment)。

保护性疗法

不含编码特定治疗因子的其他异源DNA的本发明的无限增殖细胞系可能非常适于置换疗法，而已经引入了编码特定治疗因子的其他异源DNA的本发明的无限增殖细胞系可能非常适于保护性疗法。

在本文，保护性疗法的定义涉及源于神经系统内的细胞的移植，在植入移植物之后，所述细胞在CNS和/或PNS的特定位置中或全部产生内源或外源的治疗因子，所述因子会预防或防止受体个体的神经系统中细胞的死亡或功能障碍，或刺激这些细胞的功能或再生和神经再分布(re-innervation)的能力。

本发明特别提供了在保护性疗法中使用的方法和组合物。更具体地，本发明提供了为治疗性和/或预防性目的通过植入正常的或免疫抑制的哺乳动物(包括人类)的脑部来使用的方法和组合物。本发明特别提供了用于持续并安全地治疗神经学缺损的方法和组合物。

本发明范围内的神经学缺损包括任何神经变性的疾病、紊乱或状况。神经学缺损可能尤其是与如下有关的神经变性疾病：受损害的和受创伤的神经元，尤其是外周神经、髓质、和/或脊髓的创伤损害，大脑缺血性神经损伤，神经病尤其是外周神经病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病，帕金森氏病，成胶质细胞瘤，肌萎缩性侧索硬化或任何其他神经变性疾病，以及与痴呆相关联的记忆障碍。

分化

除了其他已知的分化方法，如WO 02/086106(NsGene)所述的TH诱导方法，NGC-407细胞系可以用已知的体外分化方法，如实施例1所述的那些(Bardford分化；Sah分化；Storch分化)来处理。这种分化可在替代疗法之前进行或作为体外试验或基因表达绘图(profiling)的一部分。

对分化规程的更具说明性的举例包括实施例8中描述的两个规程(在无EGF和bFGF的N2培养基中分化(N2分化)；在无EGF和bFGF但有cAMP和GDNF的N2培养基(DA分化培养基)中分化)。

进一步地，NGC-407细胞可通过用编码负责或涉及多巴胺能分化的转录因子(如Nurri，Pitx3，En和Lmxib)的表达载体转导或转染来分化。优选的转录因子是Andersson等所述的Lmxla(Andersson等，2006，″Identification ofintrinsic determinants of midbrain dopamine neurons″，Cell 124：393-405)。

体外试验

在多项体外试验中，NGC-407细胞系可用于试验潜在的药物(既可以是低分子量，也可以是蛋白质、基因或iRNA)。简言之，细胞系接触所需化合物，并将其反应与对照处理比较。所述反应可以是存活、分化、代谢活动、信号传导、受体激活等。

基因绘图(profiling)

已经在多巴胺能神经元在人胎儿腹侧中脑(ventral midbrain)恰当发育时从腹侧中脑建立了NGC-407细胞系。可以用其调控对NGC-407特异的基因作为来自腹侧中脑的细胞的标记物，作为多巴胺能神经元的标记物，或作为来自腹侧中脑的干细胞/先祖细胞的标记物。用NGC-407鉴定的基因的治疗潜力也可被试验。

自杀基因疗法

如本申请发明背景部分所述，神经干细胞可用作向癌细胞递送自杀基因的产物的递送载体。如本文实施例所证明，NGC-407事实上能够迁移到成胶质细胞瘤的肿瘤同时保持标记基因(GFP)的表达。因此，细胞系可用作载体来向肿瘤递送异源自杀基因。已经观察到给予4-PB会增加围绕植入的肿瘤的GFP阳性细胞的数目。因此，在优选的实施方案中，将4-PB给予已植入了表达自杀基因的NGC-407细胞的患者。给予4-PB和与自杀基因疗法有关联的类似物的方法和剂量见WO 2005/079849所述。

脱氧核苷激酶

在旁观者(bystander)介导的自杀基因疗法的优选实施方案中，已经遗传改造本发明的细胞系来过表达异源脱氧核苷激酶。来自多种生物体的脱氧核苷激酶(dNK)在它们的底物特异性、基因表达的调控和细胞定位方面不同。在哺乳动物细胞中，有四种酶具有重叠的特异性，胸苷激酶1(TK1)和2(TK2)，脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)使嘌呤和嘧啶脱氧核苷磷酸化。TK1和TK2是嘧啶特异性的并且使脱氧尿苷(dUrd)和胸苷(dThd)磷酸化，TK2也使脱氧胞苷(dCyd)磷酸化。dCK使dCyd、脱氧腺苷(dAdo)和脱氧鸟苷(dGuo)磷酸化，但不使dThd磷酸化。dGK使dGuo和dAdo磷酸化。在哺乳动物中，TK1是胞质的，并且TK2和dGK定位于线粒体中，但近来的报道指出TK2也胞浆定位。

最知名的并且研究最多的自杀基因疗法例子是单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(tk)基因(Karreman，1998，A new set of positive/negative selectable markersfor mammalian cells.Gene.218：57-61)。当生长细胞接触到治疗疱疹(antiherpetic)核苷类似物如更昔洛韦(GCV)，HSV tk基因导致细胞死亡，因为这一前药和其它前药被HSV TK代谢为毒性代谢产物。

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)脱氧核苷激酶(Dm-dNK)使所有四种天然脱氧核苷以及多种核苷类似物磷酸化(Munch-Petersen等，1998，Fourdeoxynucleoside kinase activities from Drosophila melanogaster are containedwithin a single monomeric enzyme，a new multifunctional deoxynucleosidekinase.J Biol Chem.273：3926-31；Munch-Petersen等，2000，Functionalexpression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophilamelanogaster and its C-terminal deletion mutants.J Biol Chem.275：6673-9；W000/36099“New medical use of gene and vector encoding a multisubstratedeoxyribonucleoside kinase(dNK)”)。这种酶的宽底物特异性以及高催化率使其在在癌症的联合基因/化疗中用作自杀基因的核苷激酶中是独特的。

已经开发了黑腹果蝇Dm dNK的突变型，其具有宽底物特异性(WO01/88106″Multi-substrate insect deoxynucleoside kinase variants″)。特别优选的变体是变体B5，因为其活化度就吉西他滨(gemcitabine)而言比野生型DmdNK高大约50倍。活化度被定义为非转染细胞系中前药的IC₅₀与转染细胞系中核苷类似物的IC₅₀的比例。

在基因疗法途径中的这些及其它重组激酶通过将其处于强组成型启动子控制下而可以在NGC-407细胞中过表达，所述启动子如CMV启动子，人UbiC启动子，JeT启动子(US 6,555,674)，SV40启动子，和延伸因子1α启动子(EF1-α)。

脱氧核苷激酶的具体已知序列的非限制性例子包括，例如见下：

野生型HSV-tk，登录号V00470(SEQ ID NO 1)

MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRD

DIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHA

PPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLD

LAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDL

YNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN

黑腹果蝇野生型激酶GenBanK ACCN Y18048(SEQ ID NO 2)

MAEAASCARKGTKYAEGTQPFTVLIEGNIGSGKTTYLNHFEKYKNDICLLTEPVEKWRNVNGVNLLELMYKDPKKW

AMPFQSYVTLTMLQSHTAPTNKKLKIMERSIFSARYCFVENMRRNGSLEQGMYNTLEEWYKFIEESIHVQADLIIY

LRTSPEVAYERIRQRARSEESCVPLKYLQELHELHEDWLIHQRRPQSCKVLVLDADLNLENIGTEYQRSESSIFDA

ISSNQQPSPVLVSPSKRQRVAR

番茄TK(SEQ ID NO 3)

MAFSSSARNPVDLRNGSKNSFCPVGEIHVIVGPMFAGKTTALLRRVNLESNDGRNVVLIKSSKDARYAVDAVVTHD

GTRFPCWSLPDLSSFKQRFGKDAYEKVDVIGIDEAQFFGDLYEFCCNAADFDGKIIVVAGLDGDYLRKSFGSVLDI

IPLADTVTKLTARCELCNRRAFFTFRKTNETETELIGGADIYMPVCRQHYVNGQSVNESAKMVLESHKVSNELILE

SPLVDP

拟南芥(Arabidopsis thaliana)dNK(SEQ ID NO 4)

MVDYLRSSVGIIHRNHAESITTFIKESVDDELKDSGPEPNLNVKKRLTFCVEGNISVGKSTFLQRIANETVELQDL

VEIVPEPVDKWQDVGPDHFNILDAFYSEPQRYAYTFQNYVFVTRLMQEKESASGVKPLRLMERSVFSDRMVFVRAV

HEAKWMNEMEISIYDSWFDPVVSSLPGLVPDGFIYLRASPDTCHKRMMLRKRAEEGGVSLKYLQDLHEKHESWLLP

FESGNHGVLSVSRPSLHMDNSLHPDIKDRVFYLEGNHMHSSIQKVPALVLDCEPNIDFSRDIEAKTQYARQVAEFF

EFVKKKQETSTEKSNSQSPVLLPHQNGGLWMGPAGNHVPGLDLPPLDLKSLLTRPSA

黑腹果蝇B5突变体(SEQ ID NO 5)

MAEAASCARKGTKYAEGTQPFTVLIEGNIGSGKTTYLNHFEKYKNDICLLTEPVEKWRNVNGVNLLELMYKDPKKW

AMPFQSYATLTMLQSHTAPTNKKLKIMERSIFSARYCFVENMRRNGSLEQGMYNTLEEWYKFIEESIHVQADLIIY

LRTSPEVAYERIRQRARSEESCVPLKYLQELHELHEDWLIHQRRPQSCKVLVLDADLDLENIGTEYQRSESSIFDA

ISSNQQPSPVPVSPSKRQRVAR

拟南芥dCGK_NP 565032(SEQ ID NO 6)

1 mqkilckstt sstpvlstpv nslaagfisl gfktpvknlp pcsttkplst cffstsampt

61 ttasvssggv gfsaylqrtv hkpapasvrf stagyrtcrc sidgtnrawv grtgswralf

12l csdstggltp vnatagavve seeesdgede deekdekpvr mnrrnrsssg sgefvgnpdl

181 lkipgvglrn qrklvdngig dvaelkklyk dkfwkasqkm vdylrssvgi ihrnhaesit

241 tfikesvdde lkdsgpepnl nvkkrltfcv egnisvgkst flqrianetv elqdlveivp

301 epvdkwqdvg pdhfnildaf ysepqryayt fqnyvfvtrl mqekesasgv kplrlmersv

361 fsdrmvfvra vheakwmnem eisiydswfd pvvsslpglv pdgfiylras pdtchkrmml

421 rkraeeggvs lkylqdlhek heswllpfes gnhgvlsvsr psLhmdnslh pdikdrvfyl

481 egnhmhssiq kvpalvldce pnidfsrdie aktqyarqva effefvkkkq etsteksnsq

541 spvllphqng glwmgpagnh vpgldlppld lkslltrpsa

稻(Oryza sativa)dCGK BAB86213(SEQ ID NO 7)

1 mveflqssvg iihknhaesi tlfikesvde elkgtdspnv sknkrltfcv egnisvgktt

61 flqrianeti elrdlveivp epiakwqdvg pdhfnildaf yaepqryayt fqnyvfvtrv

121 mqekesssgi kplrlmersv fsdrmvvkfl kvfvravhea nwmnemeisi ydswfdpvvs

181 slpglipdgf iylraspdtc hkrmmvrkrs eeggvtldyl rglhekhesw llpskgqgpg

241 vlsvsqvpvh megslppdir ervfylegdh mhssiqkvpa lvldcehdid fnkdieakrq

人类(H.sapiens)dCK XP_003471(SEQ ID NO 8)

MATPPKRSCPSFSASSEGTRIKKISIEGNIAAGKSTFVNILKQLCEDWEVVPEPVARWCNVQSTQDEFEELTMSQK

NGGNVLQMMYEKPERWSFTFQTYACLSRIRAQLASLNGKLKDAEKPVLFFERSVYSDRYIFASNLYESECMNETEW

TIYQDWHDWMNNQFGQSLELDGIIYLQATPETCLHRIYLRGRNEEQGIPLEYLEKLHYKHESWLLHRTLKTNFDYL

QEVPILTLDVNEDFKDKYESLVEKVKEFLSTL

人类dGK XP_002341(SEQ ID NO 9)

MAAGRLFLSRLRAPFSSMAKSPLEGVSSSRGLHAGRGPRRLSIEGNIAVGKSTFVKLLTKTYPEWHVATEPVATWQ

NIQAAGNQKACTAQSLGNLLDMMYREPARWSYTFQTFSFLSRLKVQLEPFPEKLLQARKPVQIFERSVYSDRYIFA

KNLFENGSLSDIEWHIYQDWHSFLLWEFASRITLHGFIYLQASPQVCLKRLYQRAREEEKGIELAYLEQLHGQHEA

WLIHKTTKLHFEALMNIPVLVLDVNDDFSEEVTKQEDLMREVNTFVKNL

＞人类TK2 NP_004605(SEQ ID NO 10)

MGAFCQRPSSDKEQEKEKKSVICVEGNIAGGKTTCLEFFSNATDVEVLTEPVSKWRNVRGHNPLGLMYHDASRWGL

TLQTYVQLTMLDRHTRPQVSSVRLMERSIHSARYIFVENLYRSGKMPEVDYVVLSEWFDWILRNMDVSVDLIVYLR

TNPETCYQRLKKRCREEEKVIPLEYLEAIHHLHEEWLIKGSLFPMAAPVLVIEADHHMERMLELFEQNRDRILTPE

NRKHCP

人类TK1 XP_037195(SEQ ID NO 11)

MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEAL

PACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIMEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAV

CMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQIL

QCSPAN

家蚕(Bombyx mori)dNK AAK28318(SEQ ID NO 12)

1 msannvkpft vfvegnigsg kttflehfrq feditlltep vemwrdlkgc nllelmykdp

61 ekwamtfqsy vsltmldmhr rpaptpvklm erslfsaryc fvehimrnnt lhpaqfavld

121 ewfrfiqhni pidadlivyl ktspsivyqr ikkrarseeq cvplsyieel hrlhedwlin

181 rihaecpapv lvldadldls qitdeykrse hqilrkavnv vmsspnkhsp kkpisttpik

241 itphmril

＞按蚊属(Anopheles)dNK AAO49462(SEQ ID NO 13)

MPPIASEKLGASGKKPFTVFVEGNIGSGKTTFLNHFQKFNDICLLTEPVEKWRNCGGVNL

LDLMYKESHRWAMPFQTYVTLTMLDMHTCQTDKSVKLMERSLFSARNCFVESMLASGSLH

QGMYNVLQEWYDFICCNIHIQADLIVYLQTSPEVVYERMKQRARSEESCVPLEYLKELHE

LHENWLIHGASPRPAPVLVLNADLDLNTIGAEYERSETSILKPILIENTNQHAILTSPAK

RAKTDF

＞水稻(Rice)TK1(SEQ ID NO 14)

MSSICAMRSLLAASTFLRSGASPLLRPLSRPLPSRLNLSRFGPVRPVSAAAAAADKSRGGGG

SAMEAQPSYPGEIHVIVGPMFAGKTTALLRRVQVEAGTGRNVALIKSDKDNRYGLDSVVTHD

GTKMPCWALPELSSFQDKLGTEAYDKVDVIGIDEAQFFDDLHDFCCKAADRDGKIVVVAGLD

GDYKRNKFGSVLDIIPLADSVTKLTARCELCGRRAFFTLRKTRETKTELIGGADVYMPVCRQ

HYLDGQIVIEATRIVLDLEKSKVIHAFK

＞拟南芥(A.thaliana)TK1 AAF13097(SEQ ID NO 15)

MATLKASFLIKTLDSDVTGDFLSDLERRGSGAVHVIMGPMFSGKSTSLLRRIKSEISDGRS

VAMLKSSKDTRYAKDSVVTHDGIGFPCWALPDLMSFPEKFGLDAYNKLDVIGIDEAQFFG

DLYEFCCKVADDDGKIVIVAGLDGDYLRRSFGAVLDIIPIADSVTKLTARCEVCGHKAFF

TLRKNCDTRTELIGGADVYMPVCRKHYITNHIVIKASKKVLEDSDKARAESCVAATI

＞拟南芥TK1b(SEQ ID NO 16)

MRTLISPSLAPFSLHLHKPSLFSTALRFSFSINNITPTNSPPST

ISTRKLQTKATRVTSSSSSQPLSSSSPGEIHVVVGPMFSGKTTTLLRRILAERETGKR

IAIIKSNKDTRYCTESIVTHDGEKYPCWSLPDLSSFKERFGFDDYENRLDVIGIDEAQ

FFGDLYEFCREAADKEGKTVIVAGLDGDFMRRRFGSVLDLIPIADTVTKLTSRCEVCG

KRALFTMRKTEEKETELIGGAEVYMPVCRSHYVCGQNVLETARAVLDSSNNHSVVASS

L

＞番茄dCGK(SEQ ID NO 17)

MVEFLQSSIGIIHRNHAESITTYIRKSVDEELKENNSDS

NVKSTQKKRLTFCVEGNISVGKTTFLQRIANETLELQDLVEIVPEPIAKWQDIGPDHFNI

LDAFYAEPQRYAYTFQNYVFVTRVMQERESSGGIRPLRLMERSVFSDRMVFVRAVHEANW

MNEMEISIYDSWFDPVVSTLPGLIPDGFIYLRASPDTCHKRMMLRKRTEEGGVSLEYLRG

LHEKHESWLFPFESGNHGVLSVSELPLNFDKFCVPPEIRDRVFYLEGNHMHPSIQKVPAL

VLDCEPNIDFNRDIEAKRQYARQVADFFEFVKKKQEVMPGAGEEQPKGNQAPVMLPQNGG

LWVPGGKFSESTLNLDFRRNMSFMSH

对应的核苷酸序列可用如上给出的登录号在Genbank中、在如上给出的参考文献中、和WO 03/100045(胸苷激酶)和WO 2004/003185(dCK/dGK)(对于植物激酶)中见到。

在优选的实施方案中，脱氧核苷激酶选自下组：

a)具有SEQ ID No 1-17任一的氨基酸序列的脱氧核苷激酶；

b)脱氧核苷激酶变体，其包含与SEQ ID No 1-17任一具有至少50％序列同一性的氨基酸序列；

c)脱氧核苷激酶，其由能与编码SEQ ID No 1-17任一的核苷酸序列在高严谨条件杂交的核苷酸序列编码。

在本发明的范围内，术语激酶变体为多肽(或蛋白)，其具有的氨基酸序列与表示为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17的序列在一或多个氨基酸位点上不同，并且具有dNK活性。这些类似多肽包括包含保守取代的多肽，剪接变体，同种型(isoform)，来自其它物种的同源物(homologue)，和多态性(polymorphism)。

在本文，术语“保守取代”的定义为氨基酸残基被另一种生物学类似的残基取代。保守取代的例子包括

(i)一个非极性或疏水性残基(如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸或色氨酸)被另一个取代，尤其是丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸或脯氨酸被另一个取代；或

(ii)一个中性(不带电荷)的极性残基(如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或半胱氨酸)被另一个取代，尤其是精氨酸被赖氨酸取代，谷氨酸被天冬氨酸取代，或者谷氨酰胺被天冬酰胺取代；或

(iii)带正电荷的残基(如赖氨酸，精氨酸或组氨酸)被另一个取代；或

(iv)带负电荷的残基(如天冬氨酸或谷氨酸)被另一个取代。

对这种一级氨基酸序列作修饰可得到与未经修饰的对应多肽相比具有基本等同活性的蛋白，因此可认为这些蛋白是亲代蛋白的功能类似物。这种修饰可以例如通过定点诱变有意产生，或者它们可自发发生，它们包括剪接变体，同种型，来自其它物种的同源物，和多态性(polymorphism)。这种功能类似物也在本发明范围内。

已经发现，C-和/或N-末端有改变的脱氧核苷激酶显著改变它们的特性，尤其是动力学特性，如转换(turnover)和底物特异性。所以，本发明的脱氧核苷激酶可以从具有更局限的特异性，通常是脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)活性，转变为基本上有多重底物的酶，后者具有使所有四种脱氧核苷磷酸化的能力。

脱氧核苷激酶变体可以参照已知的脱氧核苷激酶(如本文公开的任一种激酶)的氨基酸序列来定义。在优选的实施方案中，激酶变体与参照序列具有至少50％序列同一性，更优选至少60％序列同一性，更优选至少70％序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性。单个参照序列可以是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，和SEQ ID NO：17的任一个。

在更优选的实施方案中，脱氧核苷激酶包含选自由下列组成的组的脱氧核苷激酶：

a)具有SEQ ID No 1-5任一的氨基酸序列的脱氧核苷激酶；和

b)脱氧核苷激酶变体，其包含与SEQ ID No 1-5任一具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并具有dNK活性。

也可以将两种或多种脱氧核苷激酶给予同一个体。

不受限制地，优选如下激酶和核苷类似物的组合：

HSV-tk-GCV，ACV，喷昔洛韦(penciclovir)

黑腹果蝇dNK或B5-吉西他滨，CdA，FaraA，araC，ddC

植物TK包括番茄TK-AZT，D4T，ddT，5’-氟尿苷(fluorouridine)

植物dNK包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)dNK-吉西他滨，CdA，FaraA，araC，ddC。

用于比对序列和计算序列同一性的数学算法的优选非限制性例子是Myers and Miller CABIOS(1989)算法。此算法并入了作为FASTA序列比对软件包一部分的ALIGN程序(2.0版)(Pearson WR，Methods MoI Biol，2000，132：185-219)。Align基于整体序列对比计算序列的同一性。AlignO不对序列末端的缺口罚分。当利用ALIGN或AlignO程序来比较氨基酸序列时，优选使用缺口的开放/延伸罚分为-12/-2的BLOSUM50替代矩阵。

胶囊化作用(encapsulation)

胶囊化(encapsulated)细胞疗法是基于在植入宿主前用半渗透性的生物适合材料包绕细胞，从而使所述细胞与受体宿主的免疫系统隔离的概念。本发明包括将本发明细胞包裹在免疫隔离的胶囊内的装置。“免疫隔离的(immunoisolatory)胶囊”指一种胶囊，它在植入受体宿主后，使宿主免疫系统对装置核心的细胞的有害作用最小。通过将细胞封闭在微孔膜所形成的可植入的聚合物胶囊内，来使细胞与宿主免疫隔离。此种方法避免了宿主和植入组织之间的直接细胞-细胞接触，通过直接呈递消除了抗原识别。也可定制(tailor)所用的膜来基于分子(如抗体和补体)的分子量控制所述分子的渗透，同时允许治疗性蛋白的渗透。利用胶囊化技术，无论是否利用免疫抑制药物，都可以将细胞移植到宿主但不引起免疫排斥。可用的生物适合性聚合物胶囊常包含含细胞的核心及选择通透的(permselective)基质或膜的周围或外周区(“外套(jacket)”)，所述细胞悬浮于液态培养基中或固定在固定化(immobilizing)基质内；所述周围或外周区不包含分离的细胞，是生物适合的并且足以保护核内的细胞不受有害的免疫学攻击。胶囊化作用妨碍免疫系统的元素进入胶囊，从而保护被包裹的细胞不受免疫破坏。胶囊的膜的半渗透性也允许所需的生物活性分子容易地从胶囊渗透到周围的宿主组织中。

可从生物适合性材料制备胶囊。“生物适合性材料”是一种材料，它在植入宿主后不引起有害的宿主反应，该反应足以导致对胶囊的排斥或妨碍胶囊起作用，例如通过降解。生物适合性材料对于大分子(如宿主免疫系统的组分)是相对不可渗透的，但对小分子(如胰岛素，生长因子和营养素)是可渗透的，同时还可使代谢废物排出。多种生物适合性材料适于通过本发明组合物来递送生长因子。多种生物适合性材料是已知的，具有多种外表面形态和其它的机械和结构特性。优选地，本发明胶囊与WO 92/19195或WO 95/05452中所述的类似，在此引入作为参考；或与美国专利5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美国专利5,550,050所述的那些类似，引入作为参考。这种胶囊允许代谢物、营养物和治疗性物质通过，而使宿主免疫系统的有害作用最小化。生物适合性材料的组分可包括周围的半透膜和内部支持细胞的骨架(scaffolding)。优选地，将重组细胞接种在骨架上，所述骨架被选择通透的膜包裹。丝状的支持细胞的骨架可用任何选自如下组成的组的生物适合性材料制备：丙烯酸，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚乙腈(polyacetonitrile)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene teraphthalate)，尼龙，聚酰胺，聚氨酯，聚丁酯(polybutester)，丝，棉，壳多糖(chitin)，碳，或生物适合的金属。粘合的(bonded)纤维结构也可用于细胞植入(或美国专利5,512,600，引入作为参考)。可生物降解的聚合物包括如下的那些：聚乳酸(PLA)，乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA)，和聚乙醇酸(PGA)及其等效物。已经用泡沫骨架来提供移植的细胞可粘附其上的表面(WO 98/05304，引入作为参考)。已经用编织网状管(woven mesh tube)作为血管移植物(WO 99/52573，引入作为参考)。另外，核心可由使细胞位置稳定的水凝胶所形成的固定化基质组成。水凝胶是基本由水组成的呈凝胶形式的交联亲水聚合物的三维网络。

外套的优选分子量阈值不到1000kD，更优选为50-700kD，最优选为70-300kD。应选择分子量阈值来确保生物活性治疗性蛋白可离开胶囊，同时保护被包裹的细胞免受患者免疫系统的攻击。

外套的厚度通常为2-200微米，更优选为50-150微米。外套的厚度应赋予胶囊足够强度来保持细胞被包裹，并应记住要尽可能薄以占据尽可能少的空间。

多种聚合物和聚合物共混物(blend)可用于制备周围的半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚偏二乙烯(polyvinylidene)，聚偏二氯乙烯(polyvinyl chloride)共聚物，聚氨酯，聚苯乙烯，聚酰胺，醋酸纤维素酯，硝酸纤维素酯，聚砜(polysulfone)(包括聚醚砜(polyether sulfones))，聚磷腈(polyphosphazene)，聚丙烯腈，丙烯腈/氯乙烯共聚物，及它们的衍生物，共聚物和混合物。优选地，周围的半透膜是生物适合的半渗透空心纤维的膜。这种膜及它们的制备方法公开见美国专利5,284,761和5,158,881，引入作为参考。周围的半透膜可从聚醚砜空心纤维形成，如美国专利4,976,859或美国专利4,968,733所述的那些，引入它们作为参考。替代的周围的半透膜材料是丙烯腈/氯乙烯共聚物。

胶囊可以是为了维持生物活性和提供递送产物或传递功能的途径的任何合适构型，包括例如圆柱形的、矩形的、圆盘形的、片状的、卵圆形的、星形的或球形的。而且，胶囊可以卷或缠成网孔状或巢状结构。如果胶囊在植入后要将其回收，那么不优选使胶囊从植入位置迁移的构型，如小到可以在受体宿主的血管中运动的球形胶囊。某些形状，如矩形、片状、圆盘形、圆柱形和平片状提供了较高的结构完整性，因此在需要回收时是优选的。特别优选的形状是圆柱形的，因为此形状能用工业生产的空心纤维容易地制备。

在使用大胶囊时，优选在每个装置中包裹至少10³个细胞，如包裹10³-10⁸个细胞，最优选包裹10⁵-10⁷个细胞。当然，每个胶囊中的细胞数取决于胶囊大小。根据经验，本发明的发明人发现在一种(下述的)泡沫胶囊中可装载10,000-100,000个细胞/μl胶囊(体积以包括泡沫的内部体积加以计算)，更优选25,000-50,000个细胞/μl，更优选30,000-40,000个细胞/μl。要装载的细胞数也取决于细胞大小。

可以通过植入较少或较多数目的胶囊来控制剂量，优选每名患者1-10粒胶囊。

本发明范围内的大胶囊是体积至少1μL，如1-10μL的胶囊。

可用胞外基质(ECM)分子来包被骨架。胞外基质分子的合适例子包括例如胶原蛋白，层粘连蛋白(laminin)和粘连蛋白(fibronectin)。骨架表面也可以通过用血浆照射处理来赋予电荷、从而增强细胞的粘着来进行修饰。

可使用任何密封胶囊的合适方法，包括利用聚合物粘合剂或卷曲(crimping)，打结(knotting)和热封。另外，也可如美国专利5,653,687(引入作为参考)所述使用任何合适的“干”封法。

用已知技术植入胶囊化的细胞装置。很多植入位置对于本发明装置和方法是可用的。这些植入位置包括但不限于中枢神经系统，包括脑，脊髓(见美国专利5,106,627，5,156,844，和5,554,148，引入作为参考)，以及眼睛的房水和玻璃体液(见WO 97/34586，引入作为参考)。

泡沫骨架：

可用任何合适材料组成泡沫骨架，该合适材料形成带有开孔(open cell)的生物适合性泡沫、或具有孔网络的大孔结构。开孔泡沫是由相互连接的孔组成的网状结构。泡沫骨架提供了不可生物降解的稳定骨架材料，贴壁细胞可附着其上。在用于形成本发明装置所用的泡沫骨架的聚合物中，有热塑性塑料(thermoplastics)和热塑性弹性体(elastomer)。

用于形成合适的泡沫骨架的材料的一些例子列于表1。

表1

热塑性塑料：热塑性弹性体：

丙烯酸聚酰胺

变性聚丙烯腈(Modacrylic) 聚酯

聚酰胺聚乙烯

聚碳酸酯(Polycarbonate) 聚丙烯

聚酯聚苯乙烯

聚乙烯聚氨酯

聚丙烯聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol)

聚苯乙烯硅酮(Silicone)

聚砜

聚醚砜

聚偏二氟乙烯

优选从聚砜和聚醚砜制备的热塑性泡沫骨架，以及从聚氨酯和聚乙烯醇制备的热塑性弹性体泡沫骨架。

泡沫中一些(不必所有的)孔的尺寸必须允许细胞附着于孔内的壁或表面。泡沫骨架的孔径、孔密度及空隙体积(void volume)可以变化。孔的形状可以是圆形的、椭圆形的或不规则的。因为孔的形状可以有显著差别，其尺寸可根据被测量的轴而有差别。为本发明目的，泡沫中至少一些孔应具有20-500μm，优选50-150μm的孔直径。优选地，上述尺寸代表了泡沫的平均孔径。如果孔不是圆形的，它可能具有反复不定的尺寸，只要其大小足以允许贴壁细胞附着于孔内的壁或表面。在一个实施方案中，预计泡沫具有一些椭圆形孔，所述孔在沿短轴直径为20-500μm，沿长轴直径最大1500μm。

除了上述的细胞允许的孔径，优选泡沫中的至少一部分孔应小于10μm，使细胞不能通过，但仍可提供运输营养物和生物活性分子至整个泡沫的通道。

泡沫的孔密度(即每个单位体积中如上所述容纳细胞的孔的数目)可在20-90％间变化，优选在50-70％j。

类似地，泡沫的空隙体积在20-90％间变化，优选在30-70％间变化。

孔的壁或表面通常包被一或多个胞外基质分子或其它合适的分子。此包被可利于细胞贴在孔壁上，使细胞保持特定表型和/或诱导细胞分化。

可附着于泡沫孔内表面的胞外基质分子(ECM)的优选例子包括：胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、聚鸟氨酸和粘连蛋白。其它合适的ECM分子包括糖胺聚糖和蛋白聚糖；如硫酸软骨素，硫酸肝素，透明质酸酶(hyaluron)，硫酸皮肤素，硫酸角质素，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和弹性蛋白。

ECM可以通过培养已知沉积ECM的细胞来获得，包括间充质或星形胶质细胞来源的细胞。神经膜细胞(Schwann cell)在用抗坏血酸盐和cAMP处理时可经诱导合成ECM。见例如Baron-Van Evercooren等，″Schwann Celldifferentiation in vitro：Extracellular Matrix Deposition and Interaction，″Dev.Neurosci.，8，pp.182-96(1986)。

另外，粘着肽(adhesion peptide)片段，如含RGD的序列(ArgGlyAsp)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg)，以及含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal)已经发现对于促进细胞附着有用。一些含RGD的分子可商购得到，如PepTite-2000^TM.(Telios)。

本发明泡沫骨架也可用其它材料处理，来改进装置内的细胞分布。例如，可用抑制细胞增殖或移动的非允许性(non-permissive)水凝胶填充泡沫的孔。这种改进可提高贴壁细胞对泡沫骨架的附着。适合的水凝胶包括由于电荷而排斥细胞的阴离子水凝胶(例如藻酸盐或鹿角菜胶)。或者，“实体(solid)”水凝胶(如琼脂糖或聚环氧乙烯)也可用于通过阻碍细胞所分泌的胞外基质分子的结合来抑制细胞增殖。

用非允许性材料区域处理泡沫骨架可以将装置内的两或多种不同的细胞群胶囊化，而不会让一种细胞群生长超过另一种。因此，可在泡沫骨架内使用非允许性材料来分隔不同的被包裹细胞群。不同的细胞群可以是相同或不同的细胞种类，并可以产生相同或不同的生物活性分子。在一个实施方案中，一种细胞群产生增强其它细胞群生长和/或存活的物质。在另一个实施方案中，产生多种生物活性分子的多种细胞种类被包裹。这为接受者提供了治疗性物质的混合物或“混合液(cocktaiL)”。

本发明装置可用任何合适方法制备。在一个实施方案中，可以预先形成泡沫骨架，并将其插入作为个别组分的预制备的外套，如空心纤维膜。

可以预形成任何合适的热塑性塑料或热塑性弹性体泡沫骨架材料来插入预制备的外套。在一个实施方案中，我们优选聚乙烯醇(PVA)海绵用作泡沫骨架。数种PVA海绵都可以商购得到。例如，PVA泡沫海绵#D-3，60μm孔径是合适的(Rippey Corp，Kanebo)。类似地，PVA海绵可以从Ivalon Inc.(San Diego，Cailf.)商购得到。PVA海绵是通过充气的聚乙烯醇溶液与作为交联剂的甲醛蒸汽反应形成的不溶水性海绵。PVA的羟基基团与醛基团共价交联来形成聚合物网络。所述泡沫在湿的时候是柔性且有弹性的，在干燥时是半刚性的。

可选地，筛或纱可用作支持物，如US 6,627,422所述。为了回收容易，可给胶囊装配用来系绳的系缚物。

本发明NGC-407或源自NGC-407的细胞可如实施例所述扩增并装载入免疫隔离的胶囊。装载后，可体外保存胶囊数周。在此阶段，生长培养基可以是允许在胶囊内持续增殖以使胶囊更完整填充的培养基，或者可将该培养基替换为分化培养基来使被包裹的细胞分化，从而终止增殖。

用于本发明的细胞的支持基质

本发明方法还包括在植入哺乳动物脑部之前，在支持基质上体外培养本发明的细胞。植入脑部之前细胞预先粘附到微载体，被设计用于提高移植细胞的长期生存力，并提供长期功能益处。在支持基质上培养细胞的方法和将所述细胞植入脑部的方法见US 5,750,103(Cherksey)所述。

为提高移植细胞的长期生存力，要移植的细胞可在移植前体外附着于支持基质上。支持基质所包含的材料包括如下材料，体外温育后细胞附着在所述材料上并在其上生长，并且所述材料可植入哺乳动物体内而不产生毒性反应或会破坏植入细胞或者干扰它们的生物或治疗活性的炎性反应。这些材料可以是合成的或天然的化学物质，或具有生物来源的物质。

基质材料包括但不限于玻璃及其他二氧化硅，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯，聚藻酸盐，聚砜，聚乙烯醇，丙烯腈聚合物，聚丙烯酰胺，聚碳酸酯，polypentent，尼龙，淀粉酶，天然的和经过修饰的明胶，和天然的和经过修饰的胶原蛋白，天然的和经过修饰的多糖，包括葡萄糖和纤维素(如硝化纤维素)，琼脂，和磁铁矿。可以使用可再吸收的(resorbable)或不可再吸收的材料。本领域公知的胞外基质材料也包括在内。胞外基质材料可通过商购得到，或者其可通过培养分泌此种基质的细胞，除去分泌细胞，再使要被移植的细胞与基质相互作用并附着于基质上来制备得到。使要植入的细胞在其上生长或与所述细胞混合的基质材料，可以是细胞的天然产物。因此，例如，该基质材料可以是胞外基质或基底膜材料，它们是由要植入的细胞产生并分泌的。

为了提高细胞的粘着、存活和功能，固相(solid)基质可选在其外表面用本领域已知的因子包被，来促进细胞粘着、生长或存活。这些因子包括细胞粘着分子，胞外基质如纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白，糖胺聚糖或蛋白聚糖或生长因子。

或者，如果植入细胞所附着的固相基质由有孔(porous)材料构成，可以将促进生长或存活的一或多种因子掺入基质材料，它们会在植入体内后从基质材料缓慢释放。

用于移植的细胞在附着到本发明支持物上时，通常在支持物“外表面”上。支持物可以是实心或有孔的。然而，即使在有孔的支持物中，细胞仍直接接触外部环境，没有挡在中间的膜或其他障碍物。因此，根据本发明，即使细胞所附着的表面可以是有孔支持物材料向内的褶或盘旋的、其自身不在颗粒或珠子外部的形式，所述细胞仍被认为在支持物“外表面”上。

支持物构型优选是球形，如在珠子中，但也可以是圆柱形，椭圆形，平片状或条状，针状或大头针状等。支持基质的优选形式是玻璃珠。另一种优选的珠子是聚苯乙烯珠子。

珠子大小大约直径10μm-1mm，优选大约90μm至大约150μm。对多种微载体珠子的描述，例如见Fisher Biotech Source 87-88，Fisher ScientificCo.，1987，pp.72-75；Sigma Cell Culture Catalog，Sigma Chemical Co.，St，Louis，1991，pp.162-163；Ventrex Product Catalog，Ventrex Laboratories，1989；这些参考文献引入作为参考。珠子大小的上限由珠子刺激不良宿主反应而决定，所述不良宿主反应可能干扰被移植细胞的功能或对周围组织造成损伤。珠子大小的上限也由给予方法决定。本领域技术人员可以容易地确定这些限制范围。

实施例

实施例1NGC-407细胞系的生成和表征

本实施例举例说明了NGC-407细胞系的生成和体外表征。

从前三个月的人胚胎脑(获自Lund University，Sweden)制备处于初级培养物中的人中脑细胞。遵照瑞典法律和规章获得组织。切下腹侧中脑后，立刻将组织置于培养皿中的一滴细胞解离溶液(Sigma#C5914)中并切成小于0.5mm³的块。将两片解剖刀彼此移动来切碎组织。将组织转移至2ml培养基中，该培养基由DMEM/F12(Gibco#31331-028)、补充有0.5％HSA(Sigma#A1653)的N2添加物(Gibco#17502-048)、0.6％葡萄糖(Sigma#G8769)、5mM HEPES(Gibco#15630-056)、B27添加物(Gibco#17504-044)、40μg/ml bFGF(R&D Systems#233-FB)、20μg/ml EGF(R&D Systems#236-EG)组成，1,000rpm离心5分钟，重悬于新鲜培养基。组织块接种于用PLL/纤连蛋白包被的4孔腔式载玻片或24孔板的1-4个孔中。使用标准细胞培养塑料制品，PLL/纤连蛋白包被根据如下进行：

培养容器的包被：

1.用0.01％多聚-L-赖氨酸溶液(Sigma#P4832)于37℃孵育1小时；

2.除去PLL，用dH₂O(Gibco#15230-071)漂洗，使表面干燥2小时。

3.临接种细胞前，加入足量的于dH₂O中稀释至50μg/ml的纤连蛋白溶液以覆盖表面，立刻吸干，让表面干燥45分钟，然后加入组织/细胞。

细胞接种后第4天，以MOI＝1加入病毒原液来用TD1-2逆转录病毒载体转导培养物，温育过夜，通过换培养基除去病毒。通过将v-myc(作为gag-vmyc片段)(GenBank登录号：AF033809)克隆为pLXSN(BD Clontech，目录号631509，GenBank登录号：M28248)的EcoRI和HpaI位点之间的EcoRI/DraI片段制备载体TD1-2。载体中也存在赋予新霉素抗性的基因。将培养物在培养基和PLL/纤连蛋白包被的容器中扩增，至T25培养瓶满板。以800μg/ml的浓度加入遗传霉素，来选择转导的细胞。选择后，培养物在上述培养基中以单层维持生长。接近满板的培养物用细胞刮具传代，每3-7天以1∶4分瓶。

除去生长因子bFGF和EGF导致细胞系分化。加入不同因子也影响分化后细胞表型的组成(图1和2)。使用三种不同的分化培养基：

1.促有丝分裂生长因子bFGF和EGF用50ng/ml BDNF、20ng/mlCNTF、100ng/ml IGF-1和50μM毛喉素代替的培养基(Sah et al，1997)。

2.促有丝分裂生长因子bFGF和EGF用50ng/ml BDNF、50μM毛喉素和50μM多巴胺代替的培养基(Bradford；Riaz et al，2002)。

3.促有丝分裂生长因子bFGF和EGF用10％FCS、100pg/ml IL-1b、1ng/ml IL-11、1ng/ml LIF、10ng/ml GDNF代替的培养基(Storch et al，2001)。

分化后，观察TH(酪氨酸羟化酶)、β-III-微管蛋白和GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)免疫反应性细胞。为进行这种免疫细胞化学，细胞用4％低聚甲醛固定，用含一级抗体(TH抗体Chemicon#AB152，GFAP抗体DAKO#Z0334，β-III-微管蛋白抗体Sigma#T-8660)的封闭缓冲液室温温育2小时，漂洗，然后用含有荧光团共轭的(FITC或Cy3，Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc)物种特异性二级抗体的封闭缓冲液于室温再温育1小时。培养物然后用PBS漂洗，滴加DAKO封固剂后用盖玻片覆盖，然后计数细胞，对代表性视野拍照。不同细胞类型的百分数根据用于分化的因子类型而有所不同。分化培养基中TH阳性细胞的数量大约为总细胞数量的2％。神经元(β-III-微管蛋白阳性细胞)的数量在4-17％间变化，GFAP阳性星形胶质细胞的数量在0-6％之间变化。增殖细胞培养物始终含有1％以下的用任一标记物免疫标记的细胞(图1和2)。

这些结果显示NGC-407是能分化成神经元、星形胶质细胞和多巴胺能神经元的神经先祖细胞系。

参考文件

Riaz SS，Jauniaux E，Stern GM，Bradford HF，The controlled conversion ofhuman neural progenitor cells derived from foetal ventral mesencephalon intodopaminergic neurons in vitro，Brain Res Dev Brain Res.，2002May30；136(1)：27-34.

Sah DW，Ray J，Gage FH，Bipotent progenitor cell lines from the humanCNS，Nat Biotechnol 1997Jun；15(6)：574-80

Storch A，Paul G，Csete M，Boehm BO，Carvey PM，Kupsch A，Schwarz J.，Long-term proliferation and dopaminergic differentiation of humanmesencephalic neural precursor cells，Exp Neurol.2001 Aug；170(2)：317-25.

实施例2NGC-407细胞系的移植和体内转基因表达

本实施例举例说明了慢病毒转导、转基因表达的稳定性和NGC-407细胞系在实验性移植入大鼠脑之后的整合。

NGC-407细胞根据实施例1描述的方法扩增。移植前48小时，NGC-407细胞用表达GFP的自我灭活的慢病毒载体(LV-GFP-SIN；Zufferey R et al，1998)转导。所使用的感染复数为1，导致60-70％的转导率。移植当天，将细胞洗三次，胰蛋白酶消化，600rpm离心5分钟，细胞沉淀重悬于Hank’s平衡盐溶液(HBSS；Gibco，Sweden)。用血球计数仪估计细胞数，以50,000细胞/μl的密度在HBSS中制成单细胞悬液。

总共40只成年雌性Sprague-Dawley大鼠(B&K Universal，Stockholm，Sweden)，每只笼子住有3只大鼠，在12小时的明暗周期中自由接触食物和水。所有外科手术程序经过瑞典兰德大学实验室动物使用伦理委员会批准，并按该委员会指导方针进行。动物用氟烷(在O₂中，2％)麻醉，放入立体定位框架(Kopf Instruments，Tujunga，CA，USA)。根据Paxinos和Watson(Paxinos and Watson，1986)，在从前囟起算的如下坐标点用10μl Hamilton注射器将100,000个细胞双侧注射入纹状体：前-后：±1.2；中-侧：±3.0；背-腹：-4.0和-5.0，将钉齿耙的钉齿座杆设置于0.0mm。为了评估GFP在移植后是否从被植入细胞向宿主细胞转移，一只动物接受双侧细胞注射，通过反复冰冻-融熔周期杀死动物。在这些移植物中没有发现GFP-或人核(hNuc)-阳性细胞(数据未显示)。

第一组的12只动物在手术前1和2天分别用倍他米松(20mg/kg，Betapred^TM，Defiante Farmaceutica)和环孢菌素A(10mg/kg，SandimmunNeoral

，Novartis)进行免疫抑制，而第二轮17只动物从手术前第2天开始仅接受环孢菌素A(15mg/kg)。试剂用带硅头的塑料管沿食道每天经口给予，直到动物被杀死。

移植后第3天、1周、2周和3周，大鼠用戊巴比妥深麻醉，并如前所述灌注(Ericson C et al，2002)，然后在冷冻阶段显微镜用薄片切片机上以60μm的厚度切片6次。如别处所述进行亮视野和荧光染色(Ericson C et al，2002)，所用的一级抗体为：鸡抗GFP(1∶5000；Chemicon)，小鼠抗hNuc(1∶100；Chemicon)，这是两种神经胶质标记物；兔抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP；1∶5000；DAKO A/S)和小鼠抗S100(1∶500；Sigma)，神经胶质先祖标记物兔抗NG-2(1∶200；Chemicon)，神经元标记物小鼠抗NeuN(1∶1000；Chemicon)，未成熟神经细胞和反应性星形胶质细胞的两种标记物；兔抗巢蛋白(1∶200；Chemicon)和小鼠抗波形蛋白(1∶50；DAKO A/S)和早期神经元标记物小鼠抗βIII微管蛋白(1∶333；Sigma)。

如前所述(Ericson C et al，2002)，使用光学筛分仪(optical fractionator)公式(West MJ，1999)或通过Abercrombie公式(Abercrombie M，1946)通过立体测量学估计植入物中hNuc-和GFP阳性细胞的总数。

移植后植入细胞存活长达3周，这是所研究过的最长时间点，是通过hNuc检测的。立体测量学估计显示表达hNuc的细胞在前2周内减少，但在3周内细胞数量得以维持(NGC-407：3天，3271±1866；1周，3729±3715；2周，1159±865；3周，1207±1225)。此外，至少35％的hNuc阳性细胞在所有时间点共表达GFP(3天，2358±1070(72％)；1周，1487±821(40％)；2周，560±403(48％)；3周，425±275(35％))。

在12只动物中，与hNuc阳性细胞相比检测到更多数量的表达GFP的细胞，提示hNuc检测不到所有植入细胞。因此，在所有植入物中见到所估计的hNuc-阳性细胞的低数量可能是由于hNuc表达的减量调节，导致未知数量的未检测到的细胞，其结果是植入细胞的总数被低估。

结论是，慢病毒转导的NGC-407细胞在移植入大鼠脑后存活和整合良好，没有任何炎症或肿瘤形成的迹象。占大比率的植入细胞表达转基因长达至少3周。

参考文献

Abercrombie，M.，Estimation of nuclear populations from microtomesections.，Anat.Rec.，94(1946)239-247.

Ericson，C.，Wictorin，K.and Lundberg，C.，Ex vivo and in vitro studies oftransgene expression in rat astrocytes transduced with lentiviral vectors，ExpNeurol，173(2002)22-30.

Paxinos，G.and Watson，C.，The rat brain in stereotxic coordinates.，Academic Press，San Diego，1986.

West，M.J.，Stereological methods for estimating the total number ofneurons and synapses：issues ofprecision and bias，Trends Neurosci，22(1999)51-61.

Zufferey，R.，Dull，T.，Mandel，R.J.，Bukovsky，A.，Quiroz，D.，Naldini，L.and Trono，D.，Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivogene delivery，J Virol，72(1998)9873-80.

实施例3用荧光染料转移分析NGC-407和U343MGa-cl 2:6细胞间的缝隙连接通讯，并用4-苯基丁酸盐/酯对该缝隙连接通讯进行增强

方法

供体人胚胎神经干细胞(NGC-407)和受体人成胶质细胞瘤细胞(U343MGa-cl 2:6)各自生长于2个独立的35mm培养皿中(1×10⁵/皿)。对于NGC-407细胞，培养皿用多聚-L-赖氨酸(Sigma)包被，培养基为DMEM/F12与glutamax I (Invitrogen)1∶1，含有40ng/ml bFGF2(R&D Systems)、20ng/ml rhEGF、1xN2补充物，1x非必需氨基酸、5mM HEPES缓冲液溶液(来自Invitrogen)、0.5％人血清白蛋白和6g/L D-葡萄糖(来自Sigma)。受体细胞生长在含有10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(来自Invitrogen)的DMEM中。当细胞大约60％满板，开始用0和0.5mM 4-苯基丁酸盐/酯(PB)处理供体细胞，用0和4mM PB处理受体细胞，并持续72小时。供体细胞然后用1ml含有10μM亲脂类碳花青(DiI)和5μM钙荧光素-AM(Molecular Probes)的细胞培养基温育20分钟来双标记。吸去含染料的培养基后，细胞用纯培养基洗4-5次，然后用PBS洗，以除去游离染料。短暂胰蛋白酶消化后，将细胞离心，并重悬于共培养培养基(含0.5％FBS的供体细胞培养基)。受体细胞的培养基用共培养培养基代替，将5×10⁴供体细胞加入到一个受体培养皿中。将用PB处理的供体细胞与用PB处理的受体细胞混合，在0.5mM PB浓度下继续处理。共培养4小时后，用Olympus荧光显微镜观察到钙荧光素染料从供体向受体细胞转移。

结果

发现NGC-407细胞与U343MGa-cl 2:6细胞通过形成缝隙连接细胞偶联来功能性地进行通讯，该通讯被4-PB显著增强。参见附图4。

在另一类似实验中，显示HDAC抑制剂4-PB增强NGC-407细胞之间的缝隙连接通讯(GJC)和NGC-407细胞与U87成胶质细胞瘤细胞之间的缝隙连接通讯。通过使用荧光染料转移技术对此进行半定量/定性分析。很显然在体外分化和增殖条件下4-苯基丁酸盐/酯都增强缝隙连接通讯。这是有关联的，因为体内环境可能呈现给被移植的细胞既不刺激分化、也不刺激增殖的条件。

实施例4：BrdU标记的NGC-407细胞朝U87MG成胶质细胞瘤细胞异体移植物体内迁移

方法

将U87细胞(2μl中200,000个)注射入裸鼠脑，从前囟向右侧3mm、向尾侧2mm、深5mm。U87-MG细胞获自ATCC，登录号HTB-14。一周后，当肿瘤已建立时，NGC-407细胞用2μM BrdU预标记72小时，在从前囟向右侧3mm、向额侧1mm、深5mm的位置注射。

注射干细胞两周后，处死动物，对脑进行切片(14μm)，使用抗BrdU和人巢蛋白的抗体进行免疫荧光染色。

结果

沿肿瘤边界和在肿瘤内发现较少数量的BrdU标记细胞。这些细胞也是人巢蛋白阳性的。

结果指示这一神经先祖细胞系从注射位点向U87细胞肿瘤的向性迁移。

实施例5：将番茄TK1激酶克隆入干细胞逆转录病毒表达载体

含有源自莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)和莫洛尼鼠肉瘤病毒的(MoMuSV)的元件、并被设计用于逆转录病毒基因递送和表达的逆转录病毒表达载体pLHCX(获自BD Biosciences Clontech，目录号K1061-1)被用于表达番茄TK1激酶。pLHCX的多克隆位点由HindIII-HpaI-ClaI换成HindIII-XhoI-SalI-BamHI-SphI-MfeI-ClaI。这一改变通过两个寡核苷酸5′-AGCTTCTCGAGGTCGACGGATCCGCATGCCAATTGAT-′3和5′-CGATCAATTGGCATGCGGATCCGTCGACCTCGAGA-′3获得，这两个寡核苷酸被连接入用HindII/ClaI切割的pLHCX载体。被修饰的载体的新多聚接头被命名为pLHCXZ，通过DNA测序证实。

分别将番茄TK1野生型和番茄TK1ΔC基因(编码C末端缺失26个氨基酸的番茄胸苷激酶I，WO03/100045)作为XhoI/BgIII片段从pZG69(TomTK1)和pZG59(TomTK1ΔC26)(均在WO 03/100045中描述)中切下，克隆入pLHCXZ载体的XhoI/BamHI位点。pLHCXZ中含番茄TK1野生型基因的构建体命名为pZG556，pLHCXZ中的番茄TK1ΔC基因被命名为pZG561。

实施例6：用pZG556和pZG561转导NGC-407细胞

细胞培养在多聚-L-赖氨酸(Sigma#P4832)包被的培养瓶/平板(CM-Lab，丹麦)上，在用人血清白蛋白(HSA)(Sigma#A 1653)、N2(Gibco#17502-048)、B27(Gibco#17504-044)、葡萄糖(Sigma#G8769)、bFGF(R&DSystems#233-FB)、EGF(R&D Systems#236-EG)、MEM NEAA，x100(Gibco#11140-035)、HEPES(Gibco#15630-056)条件化的DMEM/F12(Gibco#31331-028)中培养人神经元先祖细胞系NGC-407。细胞在湿润的温育箱中在37℃和5％CO₂中培养。

逆转录病毒载体的构建和转导规程

在293T细胞中进行莫洛尼鼠白血病毒(MMLV)来源的复制缺陷VSV-G假型逆转录病毒的中等规模生产和浓缩，典型地产生总共10⁷个转导单位。293T包装细胞(ATTC CRL-11268)于37℃、5％CO₂在OPTIMEM 1培养基(Life Technologies，Inc.)中培养。

根据供应商提供的实验方案使用LipofectAMINE PLUS(Invitrogen-LifeTechnologies，Inc.)将所构建的pLHCXZ(Clontech)质粒载体pZG561(编码C末端缺失26个氨基酸的番茄胸苷激酶I，WO03/100045)和pVPack-GP(Stratagene)加上pVPack-VSV-G(Stratagene)转染入包装细胞。转染后48和72小时收集来自培养在DMEM(Invitrogen)中的被转染细胞的培养基，经过0.45μm滤器过滤，用超速离心沉淀(50,000g，4℃，90分钟)，溶解于DMEM(Invitrogen)。用逆转录酶测试确定病毒滴度。病毒随后用于转导NGC-407细胞系。

逆转录病毒转导

转导前一天，将1×10⁶细胞/孔接种于6孔平板。转染当天，以MOI＝1加入病毒。细胞温育3小时，此后更新培养基，扩增细胞，通过加入潮霉素(Sigma#H3274)选择14天。随后细胞可用于实验。

AZT在U87MG/番茄激酶阳性细胞中的细胞杀伤效应

对数生长的NGC-407野生型和表达番茄激酶(ZG561)的细胞以5,000细胞/孔的密度在100μl条件培养基中铺板于多聚-L-赖氨酸包被的平板，于37℃在含5％CO₂的气相中在湿润温育箱中温育。48小时后，培养基用含有不同浓度AZT的培养基代替，AZT浓度从20mM开始递减。此后，细胞连续120小时暴露于药物条件化的培养基中。通过将存活细胞分数作为药物浓度的函数监测培养细胞的化学抗性。通过显色XTT测定(XTT kit II-Roche，cat no.1465015)确定细胞生存力。简言之，小心移除培养基，每孔加入100μl新鲜培养基和50μl XTT混合物。使用ELISA平板读数仪(Ascent，ThermoLab)确定450和690nm吸光度。所研究的化合物的IC₅₀值(50％抑制浓度)使用SigmaPlot

(Dyrberg Trading，DK)以每次实验的平均值加以计算。

结果

测试潮霉素选择的ZG561和亲代细胞的AZT活化。与亲代细胞系相比，敏感性显著升高(IC₅₀降低)(潮霉素选择的ZG561和亲代细胞的IC₅₀分别为0.05105mM和11.781mM)，参见图6A和6B。

结论

番茄胸苷激酶明显使NGC-407细胞对核苷类似物AZT的敏感性提高230倍的数量级，因此指示在人类多形性神经胶质瘤治疗背景中的临床相关性。

实施例7：选择表达番茄TK1的NGC-407细胞单克隆

分离表达番茄TK1的NGC-407细胞系的单克隆细胞系，使用胸苷和AZT为底物测试酶活性。最好的单克隆细胞系所具有的AZT活性是表达番茄TK1的多克隆细胞系活性的2倍(图6B)。

选择单克隆

通过添加100μg潮霉素/ml培养基(Sigma#H3274)14天，选择逆转录病毒诱导的、表达番茄TKΔC pLHCXZ(ZG561)的NGC-407细胞(参见实施例6)。此后，细胞以30细胞/孔的细胞密度接种于4个多聚-L-赖氨酸包被的24孔平板，置于37℃、5％CO₂的湿润温育箱中。经常换培养基，21天后通过抽吸挑取32个克隆，转移至多聚-L-赖氨酸包被的6孔平板。

扩增后，细胞冷冻保存，制备沉淀用于激酶活性测定。

胸苷激酶测定

收获用于活性测定的细胞，于-80℃储存，直到进行活性测试。在提取缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.5、1mM DTT、10％(v/v)甘油、1％(v/v)TritonX-100、蛋白酶抑制剂混合液(Complete^TM，来自Roche Diagnostics)中对细胞进行短暂超声处理，并且此后通过基于四次样品(four time sample)的起始速率测量、使用氚标记的核苷底物、通过DE-81滤纸测定，测定细胞提取物的胸苷激酶活性。大约20μg提取物被用于测定。如Munch-Petersen et al.[Munch-Petersen，B.，Knecht，W.，Lenz，C.，Sondergaard，L.&Piskur，J：Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase fromDrosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants；J.Biol.Chem.20002756673-6679]所述进行测定。以200μM的固定浓度测试脱氧核苷。1单位脱氧核苷激酶活性定义为每分钟每mg蛋白质形成的1nmol相应单磷酸盐。

根据Bradford以BSA为标准蛋白确定蛋白浓度[Bradford M M：A rapidand sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding；Anal.Biochem.197672248-254]。

这些实验的结果显示于下表2。

表2.NGC-407单克隆细胞粗提物中的胸苷激酶活性

单位单位

Thd AZT

Thd AZT 比率比率

Cl.1 0,075 0,053 1,3 1,2

Cl.2 0,059 0,046 1,0 1,0

Cl.3 0,086 0,071 1,5 1,6

Cl.4 0,114 0,085 1,9 1,9

Cl.5 0,057 0,043 1,0 1,0

Cl.6 0,069 0,050 1,2 1,1

Cl.7 0,081 0,061 1,4 1,4

Cl.8 0,046 0,037 0,8 0,8

Cl.9 0,111 0,098 1,9 2,2

Cl.10 0,042 0,024 0,7 0,5

Cl.11 0,082 0,056 1,4 1,2

Cl.12 0,047 0,032 0,8 0,7

Cl.13 0,068 0,050 1,2 1,1

Cl.14 0,038 0,027 0,7 0,6

Cl.15 0,056 0,037 1,0 0,8

Cl.16 0,077 0,054 1,3 1,2

Cl.17 0,070 0,057 1,2 1,3

Cl.18 0,075 0,044 1,3 1,0

Cl.19 0,079 0,044 1,4 1,0

Cl.20 0,073 0,051 1,2 1,1

Cl.21 0,061 0,045 1,0 1,0

Cl.22 0,061 0,033 1,0 0,7

Cl.23 0,091 0,058 1,6 1,3

Cl.24 0,075 0,042 1,3 0,9

NGC-407，ZG651 0,059 0,045 1,0 1,0

NGC-407，亲代 0,016 0,014 0,3 0,3

与亲本细胞和用ZG651转导的细胞相比，两个单克隆(第4号和第9号)显示对胸苷和AZT的较高磷酸化活性。

实施例8比较NGC-407和MESC2.10

材料和方法

通过切下8周人胚胎腹侧中脑并用含有v-myc癌基因的逆转录病毒载体在tet-off系统控制下无限增殖而产生MESC2.10人中脑细胞系(兰德大学与Signal Pharmaceuticals Inc，LA Jolla，CA，USA[Lotharius，J.，et al.，Effect ofmutant alpha-synuclein on dopamine homeostasis in a new human mesencephaliccell line.J Biol Chem，2002.277(41)：p.38884-94])。MESC2.10细胞培养在含有N2补充物(N2培养基)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12中、并通过将细胞铺板于由含有四环素的N2培养基组成的分化培养基进行分化(“在N2培养基中分化)，或者对于多巴胺能分化，培养在含有四环素、二丁酰cAMP(dbcAMP，Sigma)和神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF，RDsystems)(“DA分化培养基”)中。

NGC-407细胞系通过切下7周人胚胎腹侧中脑并用含有v-myc癌基因的逆转录病毒载体无限增殖而产生。在这一细胞系中，无限增殖基因在常规生长培养基中组成型表达，通过改变细胞培养条件控制增殖。因此，在含有DMEM-F12、并添加有N2补充物+表皮生长因子(EGF)和bFGF的培养基中NGC-407细胞以贴壁单层生长。当细胞被转移入不含bFGF和EGF的N2培养基(“在N2培养基中分化)，或对于多巴胺能分化被转移入不含bFGF和EGF、而含有GDNF和dbcAMP的N2培养基(“DA分化培养基”)中时，它们开始分化成神经元和星形胶质细胞(详细内容参见表3)。

免疫细胞化学和细胞计数

平行分化4天的MESC2.10和NGC-407细胞培养物用4％多聚甲醛室温固定20分钟，然后进行免疫细胞化学染色。被固定的培养物用含有5％正常山羊血清和0.3％Triton-X-100的封闭缓冲液预温育，然后用稀释于含有2％正常山羊血清和0.3％TritonX-100的PBS中的一种如下抗体温育：小鼠抗微管蛋白β-III(1∶750；Sigma)、兔抗GFAP(1∶200；DAKO)、兔抗TH(1∶400，Chemicon)或兔抗巢蛋白(1∶200；chemicon)。温育在4℃过夜进行。冲洗后，培养物用异硫氰酸荧光素(FITC)或得克萨斯红共轭的物种特异的二级抗体温育，再次漂洗，核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1μg/ml，Sigma)复染。为了从总群体中定量出TH免疫阳性细胞的百分比，在200x放大下计数细胞，每个培养物中随机选择三个视野，通过DAPI阳性核来指示TH免疫阳性细胞相对于细胞总数的百分比。数据来自三个独立实验。平均每个实验检查400个细胞。

细胞系分化结果

使用免疫细胞化学，对处于不同神经元和多巴胺能分化阶段的两个源自胚胎人腹侧中脑的人细胞系进行表征。这些无限增殖的细胞系可以长期扩增和培养而不会发生不受控制的转化，代表均一、稳定、可再生的细胞来源。在不同分化操作方案中TH阳性细胞的百分比显示于表3。在“DA分化培养基”中4天后，在19.1+/-0.2％的已分化MESC2.10细胞和3.5+/-1.2％的已分化NGC-407细胞中检测到TH免疫阳性神经元，而只有0.6+/-0.1％的MESC2.10细胞和0.5+/-％的NGC-407细胞“在N2培养基中分化”4天后TH阳性。NGC-407具有分化成βIII-微管蛋白阳性神经元(18.1⁺/_-4.9％)和GFAP阳性星形胶质细胞(26.5⁺/_-4.0％)的能力，而MESC2.10细胞只产生βIII-微管蛋白阳性神经元(＞90％)。因此，多克隆NGC-407细胞系可描述为神经干/先祖细胞系，MESC2.10细胞系描述为单能性神经元先祖细胞系。

表3本研究中所用的两个人中脑细胞系的特征

实施例9NGC-407细胞在人多形性成胶质细胞瘤的裸鼠模型中(使用U87MG细胞系)的体内迁移研究

材料和方法

平均体重200g的8-9周大的无胸腺雄性裸鼠(rnu/rnu；Harlan，德国)被用于我们的人多形性成胶质细胞瘤异种移植模型。它们以每组3只关在标准化的大笼子里，相对湿度50-70％，温度20°-24℃，12/12昼/夜变化。用于这些无免疫应答能力动物的食物(随意)、水和其他材料在使用前高压灭菌。动物通过异氟烷吸入麻醉，头固定在定向性装置中。在显微镜指引下，在右侧半球、前囟右侧2mm处钻一直径1mm孔。使用5μl体积的Hamilton注射器，将3μl体积的1.5×10⁵个U87MG细胞从表面以3.5mm深度缓慢注射以到达胼胝体。

将重组表达绿色荧光蛋白(GFP)的2×10⁶神经先祖(NGC-407)铺板于100mm培养皿中，以神经球的形式生长48小时。将它们收集、离心并重悬于50μl生长培养基中。肿瘤细胞植入1周后，(为了使肿瘤生长，)将3μl神经球刚好在U87MG细胞植入的对侧注射入每只大鼠脑。从神经干细胞接种时开始，一半动物用250mg/kg体重的4-苯基丁酸盐/酯每天两次腹膜内处理，余下的接受磷酸盐缓冲盐水作为载体。对所有动物每天两次观察显著体重丧失、异常行为或其它神经学症状，将此设为实验的终点。否则的话，则继续治疗2周，然后通过断头处死动物。所收集的脑在干冰冷却的2-甲基丁烷中冷冻，然后置于-75℃冰箱中，直到用恒冷切片机以14μm厚度切片。

用苏木精和伊红染色对切片进行组织病理学分析来确定植入物的大小和定位。用鸡抗GFP抗体(Chemicon#AB16901)进行免疫荧光研究来追踪大鼠脑中的NGC-407细胞。用免疫组织化学的方法，通过与组织学分析进行关联和通过当切片用hoechst复染时的细胞密度确定肿瘤位置。

结果

当前结果证实了先前的体外结果，将其扩展以包括人NGC-407神经干细胞的体内迁移。

使用重组表达自杀基因的NGC-407细胞的自杀基因治疗性范例依赖于NGC-407细胞经过脑迁移到肿瘤位点，以及被活化的前药向邻近的肿瘤细胞的有效转移。

表达绿色荧光蛋白(GFP)的NGC-407细胞在裸鼠已形成的异种移植肿瘤的对侧被植入后，能迁移过胼胝体到达瘤床，甚至进入肿瘤。腹膜内添加4-PB来治疗大鼠，几天内增强了肿瘤周围以及内部的GFP染色。对这一现象的解释是更多的表达GFP的细胞存在于肿瘤周围和内部，突现了这些细胞未来可用于转移自杀基因至脑肿瘤位点。然而不能排除GFP染色增强是由于4-PB对驱动GFP基因的CMV启动子的诱导。

序列表

<110>Ns基因公司(NsGene A/S)

<120>人(Homo sapiens)无限增殖神经前体细胞系

<130>P537PC00

<150>DK PA 2005 00461

<151>2005-04-01

<150>DK PA 2005 00523

<151>2005-04-12

<160>17

<170>PatentIn 3.3型

<210>1

<211>376

<212>PRT

<213>单纯疱疹病毒7(herpes simplex virus 7)

<400>1

Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg

20 25 30

Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr

35 40 45

Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr

50 55 60

Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr

65 70 75 80

Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr

85 90 95

Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile

100 105 110

Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met

115 120 125

Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly

130 135 140

Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile

145 150 155 160

Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg

165 170 175

Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala

180 185 190

Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly

210 215 220

Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg

245 250 255

Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala

260 265 270

Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu

275 280 285

Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu

290 295 300

Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg

305 310 315 320

Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys

325 330 335

Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val

340 345 350

Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe

355 360 365

Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

370 375

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)

<400>2

Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu

1 5 10 15

Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys

35 40 45

Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn

50 55 60

Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe

65 70 75 80

Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr

85 90 95

Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser Ala Arg Tyr

100 105 110

Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu Gln Gly Met

115 120 125

Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu Ser Ile His

130 135 140

Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro Glu Val Ala

145 150 155 160

Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser Cys Val Pro

165 170 175

Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp Trp Leu Ile

180 185 190

His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu Asp Ala Asp

195 200 205

Leu Asn Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Ser Ser

210 215 220

Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro Val Leu Val

225 230 235 240

Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg

245 250

<210>3

<211>234

<212>PRT

<213>蕃茄(Lycopersicon esculentum)

<400>3

Met Ala Phe Ser Ser Ser Ala Arg Asn Pro Val Asp Leu Arg Asn Gly

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Phe Cys Pro Val Gly Glu Ile His Val Ile Val Gly

20 25 30

Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Leu Arg Arg Val Asn Leu

35 40 45

Glu Ser Asn Asp Gly Arg Asn Val Val Leu Ile Lys Ser Ser Lys Asp

50 55 60

Ala Arg Tyr Ala Val Asp Ala Val Val Thr His Asp Gly Thr Arg Phe

65 70 75 80

Pro Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Gln Arg Phe Gly

85 90 95

Lys Asp Ala Tyr Glu Lys Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln

100 105 110

Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys Asn Ala Ala Asp Phe Asp

115 120 125

Gly Lys Ile Ile Val Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Tyr Leu Arg Lys

130 135 140

Ser Phe Gly Ser Val Leu Asp Ile Ile Pro Leu Ala Asp Thr Val Thr

145 150 155 160

Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Leu Cys Asn Arg Arg Ala Phe Phe Thr

165 170 175

Phe Arg Lys Thr Asn Glu Thr Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Asp

180 185 190

Ile Tyr Met Pro Val Cys Arg Gln His Tyr Val Asn Gly Gln Ser Val

195 200 205

Asn Glu Ser Ala Lys Met Val Leu Glu Ser His Lys Val Ser Asn Glu

210 215 220

Leu Ile Leu Glu Ser Pro Leu Val Asp Pro

225 230

<210>4

<211>361

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

Met Val Asp Tyr Leu Arg Ser Ser Val Gly Ile Ile His Arg Asn His

1 5 10 15

Ala Glu Ser Ile Thr Thr Phe Ile Lys Glu Ser Val Asp Asp Glu Leu

20 25 30

Lys Asp Ser Gly Pro Glu Pro Asn Leu Asn Val Lys Lys Arg Leu Thr

35 40 45

Phe Cys Val Glu Gly Asn Ile Ser Val Gly Lys Ser Thr Phe Leu Gln

50 55 60

Arg Ile Ala Asn Glu Thr Val Glu Leu Gln Asp Leu Val Glu Ile Val

65 70 75 80

Pro Glu Pro Val Asp Lys Trp Gln Asp Val Gly Pro Asp His Phe Asn

85 90 95

Ile Leu Asp Ala Phe Tyr Ser Glu Pro Gln Arg Tyr Ala Tyr Thr Phe

100 105 110

Gln Asn Tyr Val Phe Val Thr Arg Leu Met Gln Glu Lys Glu Ser Ala

115 120 125

Ser Gly Val Lys Pro Leu Arg Leu Met Glu Arg Ser Val Phe Ser Asp

130 135 140

Arg Met Val Phe Val Arg Ala Val His Glu Ala Lys Trp Met Asn Glu

145 150 155 160

Met Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Ser Trp Phe Asp Pro Val Val Ser Ser

165 170 175

Leu Pro Gly Leu Val Pro Asp Gly Phe Ile Tyr Leu Arg Ala Ser Pro

180 185 190

Asp Thr Cys His Lys Arg Met Met Leu Arg Lys Arg Ala Glu Glu Gly

195 200 205

Gly Val Ser Leu Lys Tyr Leu Gln Asp Leu His Glu Lys His Glu Ser

210 215 220

Trp Leu Leu Pro Phe Glu Ser Gly Asn His Gly Val Leu Ser Val Ser

225 230 235 240

Arg Pro Ser Leu His Met Asp Asn Ser Leu His Pro Asp Ile Lys Asp

245 250 255

Arg Val Phe Tyr Leu Glu Gly Asn His Met His Ser Ser Ile Gln Lys

260 265 270

Val Pro Ala Leu Val Leu Asp Cys Glu Pro Asn Ile Asp Phe Ser Arg

275 280 285

Asp Ile Glu Ala Lys Thr Gln Tyr Ala Arg Gln Val Ala Glu Phe Phe

290 295 300

Glu Phe Val Lys Lys Lys Gln Glu Thr Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ser

305 310 315 320

Gln Ser Pro Val Leu Leu Pro His Gln Asn Gly Gly Leu Trp Met Gly

325 330 335

Pro Ala Gly Asn His Val Pro Gly Leu Asp Leu Pro Pro Leu Asp Leu

340 345 350

Lys Ser Leu Leu Thr Arg Pro Ser Ala

355 360

<210>5

<211>250

<212>PRT

<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)

<400>5

Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu

1 5 10 15

Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys

35 40 45

Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn

50 55 60

Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe

65 70 75 80

Gln Ser Tyr Ala Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr

85 90 95

Asn Lys Lys Leu Lys Ile Met Glu Arg Ser Ile Phe Ser Ala Arg Tyr

100 105 110

Cys Phe Val Glu Asn Met Arg Arg Asn Gly Ser Leu Glu Gln Gly Met

115 120 125

Tyr Asn Thr Leu Glu Glu Trp Tyr Lys Phe Ile Glu Glu Ser Ile His

130 135 140

Val Gln Ala Asp Leu Ile Ile Tyr Leu Arg Thr Ser Pro Glu Val Ala

145 150 155 160

Tyr Glu Arg Ile Arg Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser Cys Val Pro

165 170 175

Leu Lys Tyr Leu Gln Glu Leu His Glu Leu His Glu Asp Trp Leu Ile

180 185 190

His Gln Arg Arg Pro Gln Ser Cys Lys Val Leu Val Leu Asp Ala Asp

195 200 205

Leu Asp Leu Glu Asn Ile Gly Thr Glu Tyr Gln Arg Ser Glu Ser Ser

210 215 220

Ile Phe Asp Ala Ile Ser Ser Asn Gln Gln Pro Ser Pro Val Pro Val

225 230 235 240

Ser Pro Ser Lys Arg Gln Arg Val Ala Arg

245 250

<210>6

<211>580

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>6

Met Gln Lys Ile Leu Cys Lys Ser Thr Thr Ser Ser Thr Pro Val Leu

1 5 10 15

Ser Thr Pro Val Asn Ser Leu Ala Ala Gly Phe Ile Ser Leu Gly Phe

20 25 30

Lys Thr Pro Val Lys Asn Leu Pro Pro Cys Ser Thr Thr Lys Pro Leu

35 40 45

Ser Thr Cys Phe Phe Ser Thr Ser Ala Met Pro Thr Thr Thr Ala Ser

50 55 60

Val Ser Ser Gly Gly Val Gly Phe Ser Ala Tyr Leu Gln Arg Thr Val

65 70 75 80

His Lys Pro Ala Pro Ala Ser Val Arg Phe Ser Thr Ala Gly Tyr Arg

85 90 95

Thr Cys Arg Cys Ser Ile Asp Gly Thr Asn Arg Ala Trp Val Gly Arg

100 105 110

Thr Gly Ser Trp Arg Ala Leu Phe Cys Ser Asp Ser Thr Gly Gly Leu

115 120 125

Thr Pro Val Asn Ala Thr Ala Gly Ala Val Val Glu Ser Glu Glu Glu

130 135 140

Ser Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Glu Lys Asp Glu Lys Pro Val Arg

145 150 155 160

Met Asn Arg Arg Asn Arg Ser Ser Ser Gly Ser Gly Glu Phe Val Gly

165 170 175

Asn Pro Asp Leu Leu Lys Ile Pro Gly Val Gly Leu Arg Asn Gln Arg

180 185 190

Lys Leu Val Asp Asn Gly Ile Gly Asp Val Ala Glu Leu Lys Lys Leu

195 200 205

Tyr Lys Asp Lys Phe Trp Lys Ala Ser Gln Lys Met Val Asp Tyr Leu

210 215 220

Arg Ser Ser Val Gly Ile Ile His Arg Asn His Ala Glu Ser Ile Thr

225 230 235 240

Thr Phe Ile Lys Glu Ser Val Asp Asp Glu Leu Lys Asp Ser Gly Pro

245 250 255

Glu Pro Asn Leu Asn Val Lys Lys Arg Leu Thr Phe Cys Val Glu Gly

260 265 270

Asn Ile Ser Val Gly Lys Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ile Ala Asn Glu

275 280 285

Thr Val Glu Leu Gln Asp Leu Val Glu Ile Val Pro Glu Pro Val Asp

290 295 300

Lys Trp Gln Asp Val Gly Pro Asp His Phe Asn Ile Leu Asp Ala Phe

305 310 315 320

Tyr Ser Glu Pro Gln Arg Tyr Ala Tyr Thr Phe Gln Asn Tyr Val Phe

325 330 335

Val Thr Arg Leu Met Gln Glu Lys Glu Ser Ala Ser Gly Val Lys Pro

340 345 350

Leu Arg Leu Met Glu Arg Ser Val Phe Ser Asp Arg Met Val Phe Val

355 360 365

Arg Ala Val His Glu Ala Lys Trp Met Asn Glu Met Glu Ile Ser Ile

370 375 380

Tyr Asp Ser Trp Phe Asp Pro Val Val Ser Ser Leu Pro Gly Leu Val

385 390 395 400

Pro Asp Gly Phe Ile Tyr Leu Arg Ala Ser Pro Asp Thr Cys His Lys

405 410 415

Arg Met Met Leu Arg Lys Arg Ala Glu Glu Gly Gly Val Ser Leu Lys

420 425 430

Tyr Leu Gln Asp Leu His Glu Lys His Glu Ser Trp Leu Leu Pro Phe

435 440 445

Glu Ser Gly Asn His Gly Val Leu Ser Val Ser Arg Pro Ser Leu His

450 455 460

Met Asp Asn Ser Leu His Pro Asp Ile Lys Asp Arg Val Phe Tyr Leu

465 470 475 480

Glu Gly Asn His Met His Ser Ser Ile Gln Lys Val Pro Ala Leu Val

485 490 495

Leu Asp Cys Glu Pro Asn Ile Asp Phe Ser Arg Asp Ile Glu Ala Lys

500 505 510

Thr Gln Tyr Ala Arg Gln Val Ala Glu Phe Phe Glu Phe Val Lys Lys

515 520 525

Lys Gln Glu Thr Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ser Gln Ser Pro Val Leu

530 535 540

Leu Pro His Gln Asn Gly Gly Leu Trp Met Gly Pro Ala Gly Asn His

545 550 555 560

Val Pro Gly Leu Asp Leu Pro Pro Leu Asp Leu Lys Ser Leu Leu Thr

565 570 575

Arg Pro Ser Ala

580

<210>7

<211>300

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>7

Met Val Glu Phe Leu Gln Ser Ser Val Gly Ile Ile His Lys Asn His

1 5 10 15

Ala Glu Ser Ile Thr Leu Phe Ile Lys Glu Ser Val Asp Glu Glu Leu

20 25 30

Lys Gly Thr Asp Ser Pro Asn Val Ser Lys Asn Lys Arg Leu Thr Phe

35 40 45

Cys Val Glu Gly Asn Ile Ser Val Gly Lys Thr Thr Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Ile Ala Asn Glu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Leu Val Glu Ile Val Pro

65 70 75 80

Glu Pro Ile Ala Lys Trp Gln Asp Val Gly Pro Asp His Phe Asn Ile

85 90 95

Leu Asp Ala Phe Tyr Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Ala Tyr Thr Phe Gln

100 105 110

Asn Tyr Val Phe Val Thr Arg Val Met Gln Glu Lys Glu Ser Ser Ser

115 120 125

Gly Ile Lys Pro Leu Arg Leu Met Glu Arg Ser Val Phe Ser Asp Arg

130 135 140

Met Val Val Lys Phe Leu Lys Val Phe Val Arg Ala Val His Glu Ala

145 150 155 160

Asn Trp Met Asn Glu Met Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Ser Trp Phe Asp

165 170 175

Pro Val Val Ser Ser Leu Pro Gly Leu Ile Pro Asp Gly Phe Ile Tyr

180 185 190

Leu Arg Ala Ser Pro Asp Thr Cys His Lys Arg Met Met Val Arg Lys

195 200 205

Arg Ser Glu Glu Gly Gly Val Thr Leu Asp Tyr Leu Arg Gly Leu His

210 215 220

Glu Lys His Glu Ser Trp Leu Leu Pro Ser Lys Gly Gln Gly Pro Gly

225 230 235 240

Val Leu Ser Val Ser Gln Val Pro Val His Met Glu Gly Ser Leu Pro

245 250 255

Pro Asp Ile Arg Glu Arg Val Phe Tyr Leu Glu Gly Asp His Met His

260 265 270

Ser Ser Ile Gln Lys Val Pro Ala Leu Val Leu Asp Cys Glu His Asp

275 280 285

Ile Asp Phe Asn Lys Asp Ile Glu Ala Lys Arg Gln

290 295 300

<210>8

<211>260

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Met Ala Thr Pro Pro Lys Arg Ser Cys Pro Ser Phe Ser Ala Ser Ser

1 5 10 15

Glu Gly Thr Arg Ile Lys Lys Ile Ser Ile Glu Gly Asn Ile Ala Ala

20 25 30

Gly Lys Ser Thr Phe Val Asn Ile Leu Lys Gln Leu Cys Glu Asp Trp

35 40 45

Glu Val Val Pro Glu Pro Val Ala Arg Trp Cys Asn Val Gln Ser Thr

50 55 60

Gln Asp Glu Phe Glu Glu Leu Thr Met Ser Gln Lys Asn Gly Gly Asn

65 70 75 80

Val Leu Gln Met Met Tyr Glu Lys Pro Glu Arg Trp Ser Phe Thr Phe

85 90 95

Gln Thr Tyr Ala Cys Leu Ser Arg Ile Arg Ala Gln Leu Ala Ser Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Leu Lys Asp Ala Glu Lys Pro Val Leu Phe Phe Glu Arg

115 120 125

Ser Val Tyr Ser Asp Arg Tyr Ile Phe Ala Ser Asn Leu Tyr Glu Ser

130 135 140

Glu Cys Met Asn Glu Thr Glu Trp Thr Ile Tyr Gln Asp Trp His Asp

145 150 155 160

Trp Met Asn Asn Gln Phe Gly Gln Ser Leu Glu Leu Asp Gly Ile Ile

165 170 175

Tyr Leu Gln Ala Thr Pro Glu Thr Cys Leu His Arg Ile Tyr Leu Arg

180 185 190

Gly Arg Asn Glu Glu Gln Gly Ile Pro Leu Glu Tyr Leu Glu Lys Leu

195 200 205

His Tyr Lys His Glu Ser Trp Leu Leu His Arg Thr Leu Lys Thr Asn

210 215 220

Phe Asp Tyr Leu Gln Glu Val Pro Ile Leu Thr Leu Asp Val Asn Glu

225 230 235 240

Asp Phe Lys Asp Lys Tyr Glu Ser Leu Val Glu Lys Val Lys Glu Phe

245 250 255

Leu Ser Thr Leu

260

<210>9

<211>277

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Met Ala Ala Gly Arg Leu Phe Leu Ser Arg Leu Arg Ala Pro Phe Ser

1 5 10 15

Ser Met Ala Lys Ser Pro Leu Glu Gly Val Ser Ser Ser Arg Gly Leu

20 25 30

His Ala Gly Arg Gly Pro Arg Arg Leu Ser Ile Glu Gly Asn Ile Ala

35 40 45

Val Gly Lys Ser Thr Phe Val Lys Leu Leu Thr Lys Thr Tyr Pro Glu

50 55 60

Trp His Val Ala Thr Glu Pro Val Ala Thr Trp Gln Asn Ile Gln Ala

65 70 75 80

Ala Gly Asn Gln Lys Ala Cys Thr Ala Gln Ser Leu Gly Asn Leu Leu

85 90 95

Asp Met Met Tyr Arg Glu Pro Ala Arg Trp Ser Tyr Thr Phe Gln Thr

100 105 110

Phe Ser Phe Leu Ser Arg Leu Lys Val Gln Leu Glu Pro Phe Pro Glu

115 120 125

Lys Leu Leu Gln Ala Arg Lys Pro Val Gln Ile Phe Glu Arg Ser Val

130 135 140

Tyr Ser Asp Arg Tyr Ile Phe Ala Lys Asn Leu Phe Glu Asn Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Asp Ile Glu Trp His Ile Tyr Gln Asp Trp His Ser Phe Leu

165 170 175

Leu Trp Glu Phe Ala Ser Arg Ile Thr Leu His Gly Phe Ile Tyr Leu

180 185 190

Gln Ala Ser Pro Gln Val Cys Leu Lys Arg Leu Tyr Gln Arg Ala Arg

195 200 205

Glu Glu Glu Lys Gly Ile Glu Leu Ala Tyr Leu Glu Gln Leu His Gly

210 215 220

Gln His Glu Ala Trp Leu Ile His Lys Thr Thr Lys Leu His Phe Glu

225 230 235 240

Ala Leu Met Asn Ile Pro Val Leu Val Leu Asp Val Asn Asp Asp Phe

245 250 255

Ser Glu Glu Val Thr Lys Gln Glu Asp Leu Met Arg Glu Val Asn Thr

260 265 270

Phe Val Lys Asn Leu

275

<210>10

<211>234

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Met Gly Ala Phe Cys Gln Arg Pro Ser Ser Asp Lys Glu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Glu Lys Lys Ser Val Ile Cys Val Glu Gly Asn Ile Ala Gly Gly Lys

20 25 30

Thr Thr Cys Leu Glu Phe Phe Ser Asn Ala Thr Asp Val Glu Val Leu

35 40 45

Thr Glu Pro Val Ser Lys Trp Arg Asn Val Arg Gly His Asn Pro Leu

50 55 60

Gly Leu Met Tyr His Asp Ala Ser Arg Trp Gly Leu Thr Leu Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Val Gln Leu Thr Met Leu Asp Arg His Thr Arg Pro Gln Val Ser

85 90 95

Ser Val Arg Leu Met Glu Arg Ser Ile His Ser Ala Arg Tyr Ile Phe

100 105 110

Val Glu Asn Leu Tyr Arg Ser Gly Lys Met Pro Glu Val Asp Tyr Val

115 120 125

Val Leu Ser Glu Trp Phe Asp Trp Ile Leu Arg Asn Met Asp Val Ser

130 135 140

Val Asp Leu Ile Val Tyr Leu Arg Thr Asn Pro Glu Thr Cys Tyr Gln

145 150 155 160

Arg Leu Lys Lys Arg Cys Arg Glu Glu Glu Lys Val Ile Pro Leu Glu

165 170 175

Tyr Leu Glu Ala Ile His His Leu His Glu Glu Trp Leu Ile Lys Gly

180 185 190

Ser Leu Phe Pro Met Ala Ala Pro Val Leu Val Ile Glu Ala Asp His

195 200 205

His Met Glu Arg Met Leu Glu Leu Phe Glu Gln Asn Arg Asp Arg Ile

210 215 220

Leu Thr Pro Glu Asn Arg Lys His Cys Pro

225 230

<210>11

<211>234

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser

50 55 60

Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu

65 70 75 80

Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Met Glu Phe Cys Glu Ala Met

100 105 110

Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe

115 120 125

Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala

l45 150 155 160

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

165 170 175

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys

180 185 190

Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val

195 200 205

Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro

210 215 220

Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn

225 230

<210>12

<211>248

<212>PRT

<213>家蚕(Bombyx mori)

<400>12

Met Ser Ala Asn Asn Val Lys Pro Phe Thr Val Phe Val Glu Gly Asn

1 5 10 15

Ile Gly Ser Gly Lys Thr Thr Phe Leu Glu His Phe Arg Gln Phe Glu

20 25 30

Asp Ile Thr Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Met Trp Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Gly Cys Asn Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Glu Lys Trp Ala

50 55 60

Met Thr Phe Gln Ser Tyr Val Ser Leu Thr Met Leu Asp Met His Arg

65 70 75 80

Arg Pro Ala Pro Thr Pro Val Lys Leu Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser

85 90 95

Ala Arg Tyr Cys Phe Val Glu His Ile Met Arg Asn Asn Thr Leu His

100 105 110

Pro Ala Gln Phe Ala Val Leu Asp Glu Trp Phe Arg Phe Ile Gln His

115 120 125

Asn Ile Pro Ile Asp Ala Asp Leu Ile Val Tyr Leu Lys Thr Ser Pro

130 135 140

Ser Ile Val Tyr Gln Arg Ile Lys Lys Arg Ala Arg Ser Glu Glu Gln

145 150 155 160

Cys Val Pro Leu Ser Tyr Ile Glu Glu Leu His Arg Leu His Glu Asp

165 170 175

Trp Leu Ile Asn Arg Ile His Ala Glu Cys Pro Ala Pro Val Leu Val

180 185 190

Leu Asp Ala Asp Leu Asp Leu Ser Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Arg

195 200 205

Ser Glu His Gln Ile Leu Arg Lys Ala Val Asn Val Val Met Ser Ser

210 215 220

Pro Asn Lys His Ser Pro Lys Lys Pro Ile Ser Thr Thr Pro Ile Lys

225 230 235 240

Ile Thr Pro His Met Arg Ile Leu

245

<210>13

<211>246

<212>PRT

<213>疟蚊(Anopheles gambiae)

<400>13

Met Pro Pro Ile Ala Ser Glu Lys Leu Gly Ala Ser Gly Lys Lys Pro

1 5 10 15

Phe Thr Val Phe Val Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly Lys Thr Thr Phe

20 25 30

Leu Asn His Phe Gln Lys Phe Asn Asp Ile Cys Leu Leu Thr Glu Pro

35 40 45

Val Glu Lys Trp Arg Asn Cys Gly Gly Val Asn Leu Leu Asp Leu Met

50 55 60

Tyr Lys Glu Ser His Arg Trp Ala Met Pro Phe Gln Thr Tyr Val Thr

65 70 75 80

Leu Thr Met Leu Asp Met His Thr Cys Gln Thr Asp Lys Ser Val Lys

85 90 95

Leu Met Glu Arg Ser Leu Phe Ser Ala Arg Asn Cys Phe Val Glu Ser

100 105 110

Met Leu Ala Ser Gly Ser Leu His Gln Gly Met Tyr Asn Val Leu Gln

115 120 125

Glu Trp Tyr Asp Phe Ile Cys Cys Asn Ile His Ile Gln Ala Asp Leu

130 135 140

Ile Val Tyr Leu Gln Thr Ser Pro Glu Val Val Tyr Glu Arg Met Lys

145 150 155 160

Gln Arg Ala Arg Ser Glu Glu Ser Cys Val Pro Leu Glu Tyr Leu Lys

165 170 175

Glu Leu His Glu Leu His Glu Asn Trp Leu Ile His Gly Ala Ser Pro

180 185 190

Arg Pro Ala Pro Val Leu Val Leu Asn Ala Asp Leu Asp Leu Asn Thr

195 200 205

Ile Gly Ala Glu Tyr Glu Arg Ser Glu Thr Ser Ile Leu Lys Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Glu Asn Thr Asn Gln His Ala Ile Leu Thr Ser Pro Ala Lys

225 230 235 240

Arg Ala Lys Thr Asp Phe

245

<210>14

<211>276

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>14

Met Ser Ser Ile Cys Ala Met Arg Ser Leu Leu Ala Ala Ser Thr Phe

1 5 10 15

Leu Arg Ser Gly Ala Ser Pro Leu Leu Arg Pro Leu Ser Arg Pro Leu

20 25 30

Pro Ser Arg Leu Asn Leu Ser Arg Phe Gly Pro Val Arg Pro Val Ser

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala

50 55 60

Met Glu Ala Gln Pro Ser Tyr Pro Gly Glu Ile His Val Ile Val Gly

65 70 75 80

Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Leu Arg Arg Val Gln Val

85 90 95

Glu Ala Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Leu Ile Lys Ser Asp Lys Asp

100 105 110

Asn Arg Tyr Gly Leu Asp Ser Val Val Thr His Asp Gly Thr Lys Met

115 120 125

Pro Cys Trp Ala Leu Pro Glu Leu Ser Ser Phe Gln Asp Lys Leu Gly

130 135 140

Thr Glu Ala Tyr Asp Lys Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln

145 150 155 160

Phe Phe Asp Asp Leu His Asp Phe Cys Cys Lys Ala Ala Asp Arg Asp

165 170 175

Gly Lys Ile Val Val Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Tyr Lys Arg Asn

180 185 190

Lys Phe Gly Sar Val Leu Asp Ile Ile Pro Leu Ala Asp Ser Val Thr

195 200 205

Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Leu Cys Gly Arg Arg Ala Phe Phe Thr

210 215 220

Leu Arg Lys Thr Arg Glu Thr Lys Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Asp

225 230 235 240

Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Gln His Tyr Leu Asp Gly Gln Ile Val

245 250 255

Ile Glu Ala Thr Arg Ile Val Leu Asp Leu Glu Lys Ser Lys Val Ile

260 265 270

His Ala Phe Lys

275

<210>15

<211>238

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>15

Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp

1 5 10 15

Val Thr Gly Asp Phe Leu Ser Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Val His Val Ile Met Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Ser Leu

35 40 45

Leu Arg Arg Ile Lys Ser Glu Ile Ser Asp Gly Arg Ser Val Ala Met

50 55 60

Leu Lys Ser Ser Lys Asp Thr Arg Tyr Ala Lys Asp Ser Val Val Thr

65 70 75 80

His Asp Gly Ile Gly Phe Pro Cys Trp Ala Leu Pro Asp Leu Met Ser

85 90 95

Phe Pro Glu Lys Phe Gly Leu Asp Ala Tyr Asn Lys Leu Asp Val Ile

100 105 110

Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys

115 120 125

Lys Val Ala Asp Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp

130 135 140

Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Phe Gly Ala Val Leu Asp Ile Ile Pro

145 150 155 160

Ile Ala Asp Ser Val Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Val Cys Gly

165 170 175

His Lys Ala Phe Phe Thr Leu Arg Lys Asn Cys Asp Thr Arg Thr Glu

180 185 190

Leu Ile Gly Gly Ala Asp Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Lys His Tyr

195 200 205

Ile Thr Asn His Ile Val Ile Lys Ala Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp

210 215 220

Ser Asp Lys Ala Arg Ala Glu Ser Cys ValAla Ala Thr Ile

225 230 235

<210>16

<211>277

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>16

Met Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ser Leu Ala Pro Phe Ser Leu His Leu

1 5 10 15

His Lys Pro Ser Leu Phe Ser Thr Ala Leu Arg Phe Ser Phe Ser Ile

20 25 30

Asn Asn Ile Thr Pro Thr Asn Ser Pro Pro Ser Thr Ile Ser Thr Arg

35 40 45

Lys Leu Gln Thr Lys Ala Thr Arg Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gln

50 55 60

Pro Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ile His Val Val Val Gly Pro

65 70 75 80

Met Phe Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ala Glu

85 90 95

Arg Glu Thr Gly Lys Arg Ile Ala Ile Ile Lys Ser Asn Lys Asp Thr

100 105 110

Arg Tyr Cys Thr Glu Ser Ile Val Thr His Asp Gly Glu Lys Tyr Pro

115 120 125

Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Phe Gly Phe

130 135 140

Asp Asp Tyr Glu Asn Arg Leu Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln

145 150 155 160

Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Arg Glu Ala Ala Asp Lys Glu

165 170 175

Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Phe Met Arg Arg

180 185 190

Arg Phe Gly Ser Val Leu Asp Leu Ile Pro Ile Ala Asp Thr Val Thr

195 200 205

Lys Leu Thr Ser Arg Cys Glu Val Cys Gly Lys Arg Ala Leu Phe Thr

210 215 220

Met Arg Lys Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Glu

225 230 235 240

Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Ser His Tyr Val Cys Gly Gln Asn Val

245 250 255

Leu Glu Thr Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser Ser Asn Asn His Ser Val

260 265 270

Val Ala Ser Ser Leu

275

<210>17

<211>365

<212>PRT

<213>蕃茄(Lycopersicon esculentum)

<400>17

Met Val Glu Phe Leu Gln Ser Ser Ile Gly Ile Ile His Arg Asn His

1 5 10 15

Ala Glu Ser Ile Thr Thr Tyr Ile Arg Lys Ser Val Asp Glu Glu Leu

20 25 30

Lys Glu Asn Asn Ser Asp Ser Asn Val Lys Ser Thr Gln Lys Lys Arg

35 40 45

Leu Thr Phe Cys Val Glu Gly Asn Ile Ser Val Gly Lys Thr Thr Phe

50 55 60

Leu Gln Arg Ile Ala Asn Glu Thr Leu Glu Leu Gln Asp Leu Val Glu

65 70 75 80

Ile Val Pro Glu Pro Ile Ala Lys Trp Gln Asp Ile Gly Pro Asp His

85 90 95

Phe Asn Ile Leu Asp Ala Phe Tyr Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Ala Tyr

100 105 110

Thr Phe Gln Asn Tyr Val Phe Val Thr Arg Val Met Gln Glu Arg Glu

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Ile Arg Pro Leu Arg Leu Met Glu Arg Ser Val Phe

130 135 140

Ser Asp Arg Met Val Phe Val Arg Ala Val His Glu Ala Asn Trp Met

145 150 155 160

Asn Glu Met Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Ser Trp Phe Asp Pro Val Val

165 170 175

Ser Thr Leu Pro Gly Leu Ile Pro Asp Gly Phe Ile Tyr Leu Arg Ala

180 185 190

Ser Pro Asp Thr Cys His Lys Arg Met Met Leu Arg Lys Arg Thr Glu

195 200 205

Glu Gly Gly Val Ser Leu Glu Tyr Leu Arg Gly Leu His Glu Lys His

210 215 220

Glu Ser Trp Leu Phe Pro Phe Glu Ser Gly Asn His Gly Val Leu Ser

225 230 235 240

Val Ser Glu Leu Pro Leu Asn Phe Asp Lys Phe Cys Val Pro Pro Glu

245 250 255

Ile Arg Asp Arg Val Phe Tyr Leu Glu Gly Asn His Met His Pro Ser

260 265 270

Ile Gln Lys Val Pro Ala Leu Val Leu Asp Cys Glu Pro Asn Ile Asp

275 280 285

Phe Asn Arg Asp Ile Glu Ala Lys Arg Gln Tyr Ala Arg Gln Val Ala

290 295 300

Asp Phe Phe Glu Phe Val Lys Lys Lys Gln Glu Val Met Pro Gly Ala

305 310 315 320

Gly Glu Glu Gln Pro Lys Gly Asn Gln Ala Pro Val Met Leu Pro Gln

325 330 335

Asn Gly Gly Leu Trp Val Pro Gly Gly Lys Phe Ser Glu Ser Thr Leu

340 345 350

Asn Leu Asp Phe Arg Arg Asn Met Ser Phe Met Ser His

355 360 365

加拿大

申请人要求，直到基于本申请的加拿大专利被授权，或该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回，专利委员会才能授权将本申请中所提及的被保藏生物材料的样本提供给由委托人(commissioner)提名的独立专业技术人员。

丹麦

申请人在此要求，直到该申请对公众查阅开放(通过丹麦专利局)，或者丹麦专利局最终决定不对公众查阅开放，才仅对本领域专业技术人员提供本申请所提及的被保藏生物材料的样本。

芬兰

申请人在此要求，直到该申请对公众查阅开放(通过芬兰国家专利与注册委员会)，或芬兰国家专利与注册委员会最终决定不对公众查阅开放，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。

冰岛

申请人在此要求，直到专利被授权，或冰岛专利局作出涉及该申请的最终决定，而该决定并不导致授予专利权，本申请中提及的被保藏生物材料的样本的提供才对本领域专业技术人员生效。

挪威

申请人在此要求，直到该申请对公众查阅开放(通过挪威专利局)，或者挪威专利局最终决定不对公众查阅开放，才仅对本领域专业技术人员提供本申请所提及的被保藏生物材料的样本。

英国

申请人在此要求，仅对专业技术人员提供本申请所提及的被保藏生物材料的样本。

瑞典

申请人在此要求，直到该申请对公众查阅开放(通过瑞典专利局)，或者瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放，才仅对本领域专业技术人员提供本申请所提及的被保藏生物材料的样本。

新加坡

西班牙

申请人在此要求，直到授予西班牙专利的公告(mention)被公开，或者如果该申请被驳回或撤回，则自其申请日起计算20年起，才可以将生物材料通过向独立专业技术人员发放本申请中所提及的被保藏生物材料的样本的方式如西班牙专利法45条所规定的进行发放。

布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格

Ns基因公司(NsGene A/S) 原始保藏情况下的收据

Baltorpvej 154 其按照细则7.1，由在本页底部确认的

2750 Ballerup 国际保藏单位

丹麦颁布

当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。

表DSMZ-BP/4(只此一页)12/2001

Ns基因公司(NsGene A/S) 存活证明

Baltorpvej 154 其按照细则10.2，由在本页底部确认的

2750 Ballerup 国际保藏单位

丹麦颁布

¹指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

²对于那些细则10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

³用打叉表示选定。

⁴如果要求该信息并且如果检验结果为阴性，则填写此项。

表DSMZ-BP/9(只此一页)12/2001

Claims

1.一种人细胞系，所述细胞系可获自NGC-407细胞，或源自NGC-407细胞，或由NGC-407细胞构成，所述NGC-407细胞根据布达佩斯条约于2005年3月31日以保藏号DSM ACC 2718保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心。

2.权利要求1的细胞系，其为多克隆细胞系。

3.权利要求1的细胞系，其为单克隆细胞系。

4.权利要求1的细胞系，其进一步用能指导异源治疗性基因表达的表达构建体转染或转导。

5.权利要求4的细胞系，其中所述异源基因编码治疗性多肽。

6.权利要求4的细胞系，其中所述异源基因包含自杀基因。

7.权利要求6的细胞系，其中所述自杀基因是选自由下列组成的组的脱氧核苷激酶：

a.具有SEQ ID NO.1-17中任一的氨基酸序列的脱氧核苷激酶；

b.脱氧核苷激酶变体，其包含与SEQ ID NO.1-17中任一具有至少50％序列同一性的氨基酸序列；和

c.脱氧核苷激酶，其由能在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO.1-17中任一的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列编码。

8.权利要求7的细胞系，其中所述脱氧核苷激酶包含选自由下列组成的组的脱氧核苷激酶：

a.具有SEQ ID NO.1-5中任一的氨基酸序列的脱氧核苷激酶；

b.脱氧核苷激酶变体，其包含与SEQ ID NO.1-5中任一具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并具有dNK活性。

9.权利要求4的细胞系，其中所述异源治疗性基因编码神经营养因子，特别是神经生长因子(NGF)；胰岛素样生长因子(IGF)，特别是IGFI或IGF II；转化生长因子(TGF)超家族成员，包括转化生长因子-α和-β(TGFα和TGFβ)，转化生长因子-β2(TGFβ2)，Neurturin(NTN)，Persephin(PSP)；神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)；Neublastin(NBN)；睫状神经营养因子(CNTF)；脑来源的神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白(NT)，特别是NT3-9；肿瘤坏死因子(TNF)，特别是TNF-α。

10.权利要求2的细胞系，其中所述异源治疗性基因编码神经元存活因子，特别是超氧化物歧化酶(SOD)，或者Hedgehog。

11.权利要求2的细胞系，其中所述异源治疗性基因编码神经生长因子，特别是成纤维细胞生长因子(FGF)，特别是酸性或碱性成纤维细胞生长因子(aFGF或bFGF)；内皮生长因子(EGF)，特别是血管内皮生长和通透因子(VEGPF)；干扰素，特别是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ；白细胞介素(IL)，特别是IL-1、IL-1β、GMCSF和IL2-14。

12.权利要求2的细胞系，其中所述异源治疗性基因编码参与神经递质物质合成的生物活性分子，特别是胆碱乙酰基转移酶；酪氨酸羟化酶(TH)；酪氨酸脱羧酶；胸苷激酶，胞嘧啶脱酰胺酶，单胺氧化酶，L-DOPA脱羧酶，组氨酸脱羧酶，谷氨酸脱羧酶，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)。

13.权利要求12的细胞系，其中神经递质物质是乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素、3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章鱼涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸、丙氨酸、胱硫醚、组胺、5-羟色胺(5-HT)、P物质、神经肽Y(NPY)、缩胆囊素、神经降压肽、脑啡肽或促生长素抑制素。

14.权利要求2的细胞系，其中所述异源治疗性因子编码受体，特别是与乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素、3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章鱼涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸、丙氨酸、胱硫醚、组胺、5-羟色胺(5-HT)、P物质、神经肽Y(NPY)、缩胆囊素、神经降压肽、脑啡肽或促生长素抑制素结合的受体。

15.权利要求6的细胞系，其中所述自杀基因是胸苷激酶(TK)基因，特别是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、巨细胞病毒胸苷激酶基因、或带状疱疹病毒胸苷激酶基因；Gpt基因；或胞嘧啶脱氨酶基因。

16.权利要求1的细胞系，其能够分化成星形胶质细胞。

17.权利要求1的细胞系，其能够分化成神经元，例如多巴胺能神经元。

18.权利要求1的细胞系，其能够分化成神经胶质。

19.权利要求1的细胞系，其能够作为贴壁培养物而生长。

20.根据权利要求1-19中任一项的无限增殖人神经细胞系用于实验性应用的用途，特别是用于药物的筛选和/或体外表征。

21.根据权利要求1-19中任一项的无限增殖细胞系用于治疗性应用的用途。

22.根据权利要求1-19中任一项的无限增殖细胞系用于替代疗法的用途。

23.根据权利要求22的用途，用于植入正常或免疫抑制的哺乳动物，包括人的脑，用于治疗涉及受损害和受创伤神经元的神经学疾病，特别是外周神经、延髓和/或脊髓的创伤损害，大脑缺血性神经元损伤、神经病并且特别是外周神经病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、成胶质细胞瘤、肌萎缩性侧索硬化或任何其他神经退化疾病、与痴呆相关联的记忆障碍或遗传的代谢性疾病。

24.根据权利要求1-19中任一项的无限增殖治疗性细胞系用于保护性疗法的用途。

25.根据权利要求24的用途，用于植入正常或免疫抑制的哺乳动物，包括人的脑，用于治疗涉及受损害和受创伤神经元的神经学疾病，特别是外周神经、延髓和/或脊髓的创伤损害，大脑缺血性神经元损伤、神经病并且特别是外周神经病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、成胶质细胞瘤、肌萎缩性侧索硬化或任何其他神经退化疾病、与痴呆相关联的记忆障碍或遗传的代谢性疾病。

26.根据权利要求1-19任一项的无限增殖治疗性细胞系用于抗癌疗法的用途。

27.一种生物适应胶囊，包含：

a.核心，其包含根据权利要求1的细胞组合物，所述细胞能分泌向个体传递生物学功能的化合物；和

b.包围细胞组合物、并能使得由细胞组合物所分泌的化合物通过的半透膜。

28.权利要求19的胶囊，其中所述核心包含细胞支持物。