WO2016190288A1 - 幹細胞培養用の培地、増殖促進剤及び培養方法 - Google Patents

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WO2016190288A1
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stem cells
amino acid
irf3
medium
acid sequence
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PCT/JP2016/065231
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義基 中島
健史 大政
正義 塚原
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協和発酵キリン株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a medium for culturing stem cells, a growth promoter, a culture method, and the like. More specifically, the present invention relates to a stem cell culture medium containing an IRF3 (Interferon regulatory factor 3) inhibitory peptide that exhibits activity to promote the survival and proliferation of stem cells.
  • IRF3 Interferon regulatory factor 3
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and inducible pluripotent stem cells (iPS cells) are promising candidates as cell sources for regenerative medicine technology.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • iPS cells have problems that cell death is more likely to occur during passage, division is very slow, and differentiation is more likely than normal cell lines. Therefore, a technique for efficiently culturing human iPS cells while maintaining undifferentiation is desired.
  • Interferon regulatory factor 3 (GenBank accession number: Q14653) is one of the interferon regulatory factor molecules, and is known to control physiological phenomena such as virus-induced cell death (non-patent literature). 1).
  • Non-Patent Document 2 reports that Interferon regulatory factor 3 (hereinafter referred to as “IRF3”) induces caspase activation and controls cell death.
  • IRF3 Interferon regulatory factor 3
  • Non-patent Document 3 reports that IRF3 functions in the control of DNA damage.
  • no report has yet been made on the function of IRF3 or its inhibition in the context of stem cell culture.
  • the main object of the present invention is to provide a technique for efficiently culturing stem cells such as iPS cells.
  • the present invention provides the following [1] to [36].
  • [1] A medium for stem cell culture containing an IRF3 inhibitory peptide.
  • the IRF3 inhibitory peptide includes any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • [4] The medium according to any one of [1] to [3], wherein the stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • An IRF3 inhibitory peptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12.
  • a stem cell proliferation promoter comprising an IRF3 inhibitory peptide.
  • the IRF3 inhibitory peptide comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • the growth promoter according to any one of [9] to [12], wherein the stem cells are derived from human.
  • a method for culturing stem cells comprising a step of culturing stem cells in a medium containing an IRF3 inhibitory peptide.
  • the culture method according to [14], wherein the IRF3 inhibitory peptide comprises any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 12.
  • the IRF3 inhibitory peptide includes any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • the culture method of [14]. [17] The culture method according to any one of [14] to [16], wherein the stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells. [18] The culture method according to any one of [14] to [17], wherein the stem cell is derived from a human.
  • a method for producing a stem cell comprising a step of culturing the stem cell in a medium containing an IRF3 inhibitory peptide.
  • the production method of [20] wherein the IRF3 inhibitory peptide comprises any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 12.
  • the IRF3 inhibitory peptide comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • the medium is a serum-free medium.
  • a method for producing differentiated cells comprising a step of culturing stem cells in a medium containing an IRF3 inhibitory peptide and a step of inducing stem cell differentiation.
  • the production method of [26], wherein the IRF3 inhibitory peptide comprises any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 12.
  • the IRF3 inhibitory peptide comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • [29] The production method according to any one of [26] to [28], wherein the stem cells are embryonic stem cells, inducible pluripotent stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • a cell composition comprising an IRF3 inhibitory peptide and stem cells and / or differentiated cells derived from stem cells.
  • the IRF3 inhibitory peptide comprises any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 12.
  • the IRF3 inhibitory peptide comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 12, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence.
  • the stem cell is derived from a human.
  • the present invention provides a technique for efficiently culturing stem cells such as iPS cells.
  • Peptide is a D-MEMF12 medium containing IRF3 inhibitory peptide 1 (GVGDFSQPD), Control is a D-MEMF12 medium containing a negative control peptide (GTPKPRILPWL), and Vehicle is a D-MEMF12 medium containing no peptide, respectively. It is the graph which evaluated growth promotion activity.
  • the medium for culturing stem cells according to the present invention comprises an inhibitory peptide of IRF3 (GenBank accession number: Q14653).
  • the IRF3 inhibitory peptide that inhibits IRF3 can be appropriately selected according to the origin of the stem cell to be cultured.
  • a peptide that inhibits IRF3 of the same origin as the stem cell to be cultured can be used.
  • IRF3 inhibitory peptide examples include peptides having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2-12.
  • a peptide comprising the above amino acid sequence can also be used as an IRF3-inhibiting peptide as long as it exhibits an activity that promotes the survival and proliferation of stem cells (hereinafter referred to as “proliferation promoting activity”).
  • proliferation promoting activity an activity that promotes the survival and proliferation of stem cells
  • the IRF3 inhibitory peptide is composed of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the above amino acid sequence, or the amino acid sequence May be included.
  • the IRF3 inhibitory peptide is preferably a peptide comprising the amino acid sequence of “GVGDFSQPD” (eg, SEQ ID NO: 3), more preferably a peptide consisting of the same amino acid sequence (SEQ ID NO: 2).
  • the cell membrane-penetrating peptide means a peptide that, when added to a cell culture medium as a fusion molecule with another peptide, polypeptide or protein, allows the fusion molecule to permeate the cell membrane and transfer into the cell.
  • cell membrane-penetrating peptides include arginine-rich basic peptides (TAT peptides) derived from the Tat protein RNA binding region (positions 48-60) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1); Examples include 12 continuous oligo homopeptides; peptides having a basic amphipathic helix structure derived from the DNA binding region of the Drosophila transcription factor Antennapedia protein, and the like.
  • TAT peptides arginine-rich basic peptides
  • HAV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • Examples include 12 continuous oligo homopeptides; peptides having a basic amphipathic helix structure derived from the DNA binding region of the Drosophila transcription factor Antennapedia protein, and the like.
  • the length of the IRF3 inhibitory peptide is preferably 9 to 11 in terms of the number of amino acid residues, but may be 8 or less or 10 or more as long as the proliferation promoting activity against stem cells is maintained, for example, 4 to 8 Alternatively, it may be about 10 to 50, or about 6 to 8 or about 10 to 20.
  • the IRF3 inhibitory peptide can be obtained by a conventionally known peptide synthesis step.
  • IRF3-inhibitory peptides can include those in which one or more of the functional groups of the peptide are replaced with other functional groups as long as they have growth promoting activity against stem cells.
  • the composition of the medium according to the present invention may be the same as that conventionally used for culturing stem cells, except that it contains an IRF3 inhibitory peptide.
  • Examples of such a medium include RPMI-1640 medium, Eagle's MEM medium, Dulbecco's modified MEM medium, Glasgow's MEM medium, ⁇ -MEM medium, 199 medium, IMDM medium, DMEM medium Hybridoma Serum free medium, and Chemical Defined.
  • Hybridoma Serum Free medium Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5AL s L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymout 's MB752 / 1, CMRL-1066, William's medium E, Brinster's BMC-3 Medium, Essential8 Medium (above Thermo Fisher Scientific), mTeSR1 (Stem Cell Technologies), TeSR-E8 Medium ), StemSure (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), mESF medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), StemFit (Ajinomoto Co., Inc.), S-medium (DS Pharma), ReproXF (Reprocell), PSGro-free Human iPSC / ESC Growth Medium (S
  • the medium according to the present invention can be prepared by adding an IRF3 inhibitory peptide to these media in advance or during cell culture.
  • concentration of the IRF3-inhibiting peptide added to the medium is not particularly limited as long as it exhibits growth promoting activity against stem cells, but is, for example, 1 to 500 ⁇ g / ml, preferably 10 to 200 ⁇ g / ml.
  • physiologically active substances and nutrient factors necessary for cell survival or growth can be added to the medium as necessary.
  • additives may be added in advance to the medium, or may be added during cell culture.
  • the method to be added during the culture may be in any form such as one solution or a mixed solution of two or more, and may be continuous or intermittent addition.
  • Nutritional factors include sugars, amino acids, vitamins, hydrolysates or lipids.
  • sugar include glucose, mannose, fructose, sialic acid and the like, and one kind or a combination of two or more kinds is used.
  • vitamins examples include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyrodoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin or DL- ⁇ -tocopherol, and one or a combination of two or more Used.
  • hydrolyzate examples include hydrolyzed soybeans, wheat, rice, peas, corn, cotton seeds or yeast extracts.
  • lipids include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • an antibiotic such as kanamycin, streptomycin, penicillin or hygromycin may be added to the medium as necessary.
  • an acidic substance such as sialic acid is added to the medium, it is desirable to adjust the pH of the medium to pH 5 to 9, preferably 6 to 8, which is a neutral range suitable for cell growth.
  • the medium according to the present invention may be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of preventing contamination with heterogeneous animal-derived components, it is preferable not to contain serum or to use serum derived from the same species as the cultured stem cells.
  • the serum-free medium means a medium containing no unadjusted or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain animal tissue-derived components such as purified blood-derived components and growth factors.
  • the medium according to the present invention may or may not contain a serum substitute, like serum.
  • Serum substitutes include, for example, albumin substitutes such as albumin, lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran, protein hydrolysates, transferrin or other iron transporters, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace amounts Examples thereof include elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol, and equivalents thereof.
  • Specific examples of serum substitutes include, for example, those prepared by the method described in WO 98/30679, commercially available knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Life Technologies) and Gluten. (Life Technologies).
  • the “stem cell” targeted by the present invention refers to an immature cell having self-replication ability and differentiation / proliferation ability, and depending on the differentiation ability, a pluripotent stem cell, a multipotent stem cell (multipotent stem cell). cell), unipotent stem cells, and the like.
  • a “stem cell” is generally defined as an undifferentiated cell having “self-renewal ability” capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and “differentiation pluripotency” capable of differentiating into all three germ layers.
  • a pluripotent stem cell means a cell having an ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body.
  • a multipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • the stem cell origin species is not particularly limited, and examples thereof include rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep, and cats such as dogs and cats.
  • rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs
  • rabbit eyes such as rabbits
  • ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep
  • cats such as dogs and cats.
  • Cells such as eyes, humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees, and the like can also be used.
  • pluripotent stem cells examples include the aforementioned ES cells or iPS cells.
  • Stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 1997, 385, 810; Science, 1998, 280, 1256; Nature). (Biotechnology, 1999, 17, 456; Nature, 1998, 394, 369; Nature Genetics, 1999, 22, 127; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 14984; Nature Genetics, 2000, 24, 109) .
  • Human ES cell lines are obtained from, for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Kyoto, Japan). Is possible.
  • iPS cells include cells obtained by introducing a plurality of genes (reprogramming factors) into somatic cells such as skin cells and having acquired pluripotency similar to ES cells.
  • somatic cells such as skin cells and having acquired pluripotency similar to ES cells.
  • iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and Sox2 gene, iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene (Nature Biotechnology, 2008) , 26, 101-106).
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • iPS cells can be obtained from predetermined institutions (RIKEN BioResource Center, Kyoto University, etc.).
  • multipotent stem cells examples include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, and reproductive stem cells.
  • the multipotent stem cell is preferably a mesenchymal stem cell, more preferably a bone marrow mesenchymal stem cell.
  • the mesenchymal stem cell broadly means a group of stem cells or progenitor cells that can differentiate into all or some mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts, and lipoblasts.
  • the medium according to the present invention can be suitably used for the proliferation of any stem cell, but preferably for culturing mesenchymal stem cells, ES cells or iPS cells, more preferably for culturing iPS cells.
  • it can be used for culturing human iPS cells.
  • human iPS cells include 253G1 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0002), 201B7 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0063), 409B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0076), 454E2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0077), HiPS -RIKEN-1A strain (RIKEN Cell Bank No.
  • HPS0003 HiPS-RIKEN-2A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0009), HiPS-RIKEN-12A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0029), Nips-B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0223).
  • the stem cell culturing method according to the present invention includes a procedure for culturing stem cells in the presence of an IRF3 inhibitory peptide. More specifically, the culture method according to the present invention is characterized by including a procedure of culturing stem cells in a medium containing an IRF3 inhibitory peptide. According to the medium of the present invention, the survival and proliferation of stem cells can be promoted by the action of the IRF3 inhibitory peptide. That is, in the present invention, the IRF3 inhibitory peptide can function as a proliferation promoter for stem cells.
  • the incubator used in the culture method according to the present invention is not particularly limited, but a culture tank such as a flask, dish, petri dish, microwell plate, microslide, chamber slide, tube, tray, culture bag, or tank. And so on.
  • the substrate of these incubators is not particularly limited, and examples thereof include glass, various plastics such as polypropylene and polystyrene, metals such as stainless steel, and combinations thereof.
  • the incubator may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator can be coated with any cell-supporting substrate such as an extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving the adhesion between the surface of the incubator and the cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell supporting substrate can be any substance intended for adhesion when stem cells or feeder cells are used.
  • Such cell-supporting substrates include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin or partial structures of laminin, and fibronectin and mixtures thereof such as matrigel and lysed cell membrane preparations (See Lancet, 2005, 365, 9471, 1636-1641).
  • Dispersed cells refer to cells that have been treated to promote cell dispersion. Examples of the dispersed cells include cells forming a small cell mass composed of 2 to 50, 2 to 20, or 2 to 10 cells.
  • the dispersed cells can be floating (suspension) cells or adherent cells.
  • the culture density of the stem cells in the presence of the IRF3 inhibitory peptide is not particularly limited as long as it can achieve the effect of promoting cell survival and proliferation.
  • Culture conditions such as temperature, CO 2 concentration, dissolved oxygen concentration, and pH can be appropriately set based on conventional techniques.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can be 1-10%, preferably 2-5%.
  • the oxygen partial pressure can be 1-10%.
  • the cells When performing adherent culture of stem cells, the cells may be cultured in the presence of feeder cells.
  • feeder cells stromal cells such as fetal fibroblasts can be used (for example, Manipulating the Mouse Embryo Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Pest, 1994); Oxford University Press, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 12, 7634-7638; Nature, 1981, 292, 5819, 154-156, J. Virol., 1969, 4, 5,549. -553; Science, 1996, 272, 5 62,722-724;.. J Cell Physiol, 1982,112,1,89-95;. See Nos. No. 2005/080554); International Publication No. WO 01/088100.
  • suspension culture of stem cells examples include suspension culture on a carrier (J. Biotechnology, 2007, 132, 2, 227-236) or suspension culture using a polymer such as methylcellulose (Stem Cell Reports, 2014, 2). 5,734-745).
  • Stem cell suspension culture refers to culturing stem cells in a medium under non-adherent conditions as compared with the case of using an incubator or feeder cells.
  • Stem cell suspension culture includes stem cell dispersion culture and stem cell aggregation suspension culture.
  • Stem cell dispersion culture refers to culturing suspended stem cells, and includes, for example, dispersion culture of small cell clusters composed of 2 to 20 stem cells.
  • the cultured dispersion cells form a larger stem cell mass, and then aggregated suspension culture can be performed.
  • agglutination suspension culture include embryoid body culture method (see Curr. Opin. Cell Biol., 1995, 7, 6, 862-869), SFEB method (Nature Neuroscience, 2005, 8, 3, 288-296). International Publication No. 2005/123902), and a sphere culture method (Stem Cell Reports, 2014, 2, 5, 734-745) in which a cell line is passaged by mechanical treatment using a mesh filter.
  • the survival and proliferation of the stem cells can be promoted by the procedure of culturing the stem cells in the presence of the IRF3 inhibitory peptide, so that it is vulnerable to stress such as stem cells, especially suspension and dispersion culture after dispersion.
  • the cell composition containing an IRF3 inhibitory peptide and stem cells obtained by the culture method according to the present invention can be used for further stem cell culture or for cell sources for regenerative medicine.
  • the culture method according to the present invention can be applied to a method for producing stem cells or a method for producing differentiated cells from stem cells.
  • the method for producing stem cells according to the present invention includes a step of culturing stem cells in the presence of the above-described IRF3 inhibitory peptide, and a step of substituting the stem cells as necessary.
  • the method for producing differentiated cells from stem cells according to the present invention includes a step of culturing stem cells in the presence of an IRF3 inhibitory peptide and a step of inducing stem cell differentiation, and a step of substituting cells as necessary. Including.
  • Stem cell passage and differentiation induction may be performed by a conventionally known technique.
  • BMP inhibitors, Wnt inhibitors, Nodal inhibitors, retinoic acid and the like can be used as the differentiation inducer.
  • differentiation induction is performed by culturing mesenchymal stem cells in a differentiation induction medium (90% ⁇ MEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 ⁇ M dexamethasone). be able to.
  • cardiomyocytes are cultured for 1 day in a medium in which 0.5 ng / ml BMP-4 is added to STEMdiff APEL Medium (STEMCELL), then 10 ng / ml BMP-4 in STEMdiff APEL Medium, The medium is replaced with a medium supplemented with 10 ng / ml Activin A and 5 ng / ml bFGF, and the culture is continued for another 4 days. Thereafter, the medium was replaced with a medium supplemented with 10 ng / ml VEGF and 150 ng / ml Dkk1 in STEMdiff APEL Medium, and cultured for 8 days.
  • STEMdiff APEL Medium STEMdiff APEL Medium
  • the survival and proliferation of the stem cells can be promoted by the step of culturing the stem cells in the presence of the IRF3 inhibitory peptide.
  • a cell composition comprising an IRF3 inhibitory peptide obtained by the method for producing stem cells and differentiated cells according to the present invention and stem cells and / or differentiated cells is used for further stem cell culture or for cell sources for regenerative medicine Can be used.
  • the cell composition according to the present invention may be a composition containing dispersed stem cells such as small cell clusters.
  • the cell composition according to the present invention can be used, for example, for preservation, transportation, and passage of stem cells by cryopreservation.
  • the cell composition according to the present invention may further contain serum as described above or an alternative thereof, or an organic solvent such as DMSO.
  • the concentration of serum or its substitute is not particularly limited, but may be 1 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v).
  • the cell composition according to the present invention may include feeder cells.
  • the present invention is illustrated by the following examples, but the scope of the present invention is not limited to the examples.
  • Example 1 Evaluation of growth promoting activity of IRF3 inhibitory peptide against iPS cells
  • human-induced pluripotent stem cells (201B7 and 409B2) established by Professor Shinya Yamanaka of the Kyoto University iPS Cell Laboratory were obtained from RIKEN Cell Bank (No.HPS0063, No. HPS0076) and used. .
  • the IRF3 inhibitory peptide was designed using a contract service of Protein Science Research Institute. It is known that portions having sequence information corresponding to each other are scattered in the amino acid sequence of the protein due to the relationship between the sense peptide and the antisense peptide (see Non-Patent Document 4). The function of IRF3 can be suppressed by synthesizing and acting a complementary peptide corresponding to a part related to the structure and activity of IRF3. Based on the amino acid sequence of IRF3, the complementary peptide was designed using the computer program MIMETIC (see Non-Patent Document 5). The amino acid sequences of IRF3 inhibitory peptides 1 to 11 designed based on the full-length amino acid sequence of IRF3 (SEQ ID NO: 1) are shown below.
  • Human iPS cells cultured as described above are dissociated from feeder cells as small cell masses, and serum-free Essential 8 assay medium (Life) is added to a culture plate coated with 0.1% gelatin to remove contaminating feeder cells. (Technologies) was added and cultured at 37 ° C. for 1 hour. The contaminating feeder cells are adsorbed to the bottom of the culture plate, and the isolated iPS cell mass is crushed into small cell masses by pipetting, and then, using a 48-well culture plate, Growth Factor Reduced BD Matrigel (BD). above, it was seeded medium 0.5ml (2 ⁇ 10 5 cells / ml) containing 1 ⁇ 10 5 cells.
  • BD Growth Factor Reduced BD Matrigel
  • IRF3 inhibitory peptide 1 GVGDFSQPD
  • GTPKPRILPWL negative control peptide
  • FIG. 1 shows the results of measuring the colony (ALP +) area after culturing in an assay medium containing 200 ⁇ g / ml of peptide for 4 days.
  • the colony area was 300% or more and the number of viable cells was significantly increased compared to the control group.
  • Cells cultured in the assay medium containing IRF3 inhibitory peptide 1 expressed alkaline phosphatase, a marker for undifferentiated embryonic stem cells.
  • the IRF3 inhibitory peptide 1 exhibited an activity of promoting cell survival immediately after the start of the dispersion culture, and also exhibited an activity of promoting the proliferation of the surviving cells.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of IRF3 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 1 SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 2 SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 3 SEQ ID NO: 5: of IRF3 inhibitory peptide 4 Amino acid sequence SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 5 SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 6 SEQ ID NO: 8: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 7 SEQ ID NO: 9: amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 8: Amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 9 SEQ ID NO: 11: Amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 10 SEQ ID NO: 12: Amino acid sequence of IRF3 inhibitory peptide 11

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Abstract

ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術として、幹細胞の生存及び増殖を促進する活性を示すＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　３）阻害ペプチドを含む幹細胞培養用の培地、及び該培地で幹細胞を培養する手順を含む幹細胞の培養方法等を提供する。

Description

幹細胞培養用の培地、増殖促進剤及び培養方法
　本発明は、幹細胞培養用の培地、増殖促進剤及び培養方法等に関する。より詳しくは、幹細胞の生存及び増殖を促進する活性を示すＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　３）阻害ペプチドを含有する幹細胞培地等に関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、再生医療技術のための細胞ソースとして有力な候補である。このうち、特にｉＰＳ細胞は、通常の細胞株と比較して、継代時に細胞死が起き易い上、分裂も非常に遅く、さらに分化が生じやすいという問題がある。そのため、ヒトｉＰＳ細胞を、未分化性を維持しながら効率的に培養するための技術が望まれている。
　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｑ１４６５３）は、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ分子の１つであり、ウイルスに誘導される細胞死等の生理現象を制御していることが知られている（非特許文献１）。非特許文献２には、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　３（以下「ＩＲＦ３」と称する）が、ｃａｓｐａｓｅの活性化を誘導し細胞死を制御することが報告されている。また、ＩＲＦ３については、ＤＮＡ損傷の制御に機能しているという報告（非特許文献３）もある。しかしながら、ＩＲＦ３の機能あるいはその阻害について、幹細胞の培養との関連での報告はいまだなされていない。
ＥＭＢＯ　Ｊ．，２０１０，２９，１０，１６２７-１６２８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１，８５，１０，５２２４-５２２７ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００６，２５，３，３４９-３６０ Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，１９９５，１，８９４‐９０１ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，４６，３，２１１‐２１５
　本発明は、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］～［３６］を提供する。
［１］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
［２］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、［１］の培地。
［３］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［１］の培地。
［４］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１］～［３］のいずれかの培地。
［５］前記幹細胞が、ヒト由来である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の培地。
［６］無血清の培地である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の培地。
［７］配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
［８］配列番号２記載のアミノ酸配列からなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
［９］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［１０］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、［９］の増殖促進剤。
［１１］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［９］の増殖促進剤。
［１２］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［９］～［１１］のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
［１３］前記幹細胞が、ヒト由来である、［９］～［１２］のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
［１４］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［１５］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、［１４］の培養方法。
［１６］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［１４］の培養方法。
［１７］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１４］～［１６］のいずれか一項に記載の培養方法。
［１８］前記幹細胞が、ヒト由来である、［１４］～［１７］のいずれか一項に記載の培養方法。
［１９］前記培地が無血清の培地である、［１４］～［１８］のいずれか一項に記載の培養方法。
［２０］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
［２１］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、［２０］の製造方法。
［２２］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［２０］の製造方法。
［２３］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２０］～［２２］のいずれか一項に記載の製造方法。
［２４］前記幹細胞が、ヒト由来である、［２０］～［２３］のいずれか一項に記載の製造方法。
［２５］前記培地が無血清の培地である、［２０］～［２４］のいずれか一項に記載の製造方法。
［２６］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞の製造方法。
［２７］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、［２６］の製造方法。
［２８］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［２６］の製造方法。
［２９］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２６］～［２８］のいずれか一項に記載の製造方法。
［３０］前記幹細胞が、ヒト由来である、［２６］～［２９］のいずれか一項に記載の製造方法。
［３１］前記培地が無血清の培地である、［２６］～［３０］のいずれか一項に記載の製造方法。
［３２］ＩＲＦ３阻害ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［３３］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、［３２］の細胞組成物。
［３４］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、［３２］の細胞組成物。
［３５］前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［３２］～［３４］のいずれか一項に記載の細胞組成物。
［３６］前記幹細胞が、ヒト由来である、［３２］～［３５］のいずれか一項に記載の細胞組成物。
　本発明によりｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術が提供される。
ＰｅｐｔｉｄｅはＩＲＦ３阻害ペプチド１（ＧＶＧＤＦＳＱＰＤ）を含むＤ－ＭＥＭＦ１２培地で、Ｃｏｔｒｏｌはネガティブコントロールペプチド（ＧＴＰＫＰＲＩＬＰＷＬ）を含むＤ－ＭＥＭＦ１２培地で、Ｖｅｈｉｃｌｅはペプチドを含まないＤ－ＭＥＭＦ１２培地でそれぞれヒトｉＰＳ細胞の細胞増殖促進活性を評価したグラフである。

　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

１．幹細胞培養用の培地

［ＩＲＦ３阻害ペプチド］

　本発明に係る幹細胞培養用の培地は、ＩＲＦ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｑ１４６５３）の阻害ペプチドを含むことを特徴とする。ＩＲＦ３を阻害するＩＲＦ３阻害ペプチドは、培養する幹細胞の由来種に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する幹細胞と同じ由来種のＩＲＦ３を阻害するペプチドを用いることが出来る。例えば、ヒト由来の細胞を培養する場合は、ヒト由来のＩＲＦ３を阻害するＩＲＦ３阻害ペプチドを用いるのが好ましい。

　ＩＲＦ３阻害ペプチドとしては、配列番号２～１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、幹細胞の生存及び増殖を促進する活性（以下「増殖促進活性」と称する）を示す限りにおいて、上記アミノ酸配列を含んでなるペプチドもＩＲＦ３阻害ペプチドとして用いることができる。さらに、幹細胞に対する増殖促進活性が維持される限りにおいて、ＩＲＦ３阻害ペプチドは、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるもの、あるいは該アミノ酸配列を含んでなるものであってもよい。ＩＲＦ３阻害ペプチドは、好ましくは「ＧＶＧＤＦＳＱＰＤ」のアミノ酸配列を含んでなるペプチド（例えば、配列番号３）であり、より好ましくは同アミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）である。

　付加されるアミノ酸として、例えば、細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列が例示される。細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合分子として細胞の培養液に添加すると、融合分子を、細胞膜を透過させて細胞内に移行させることができるペプチドを意味する。細胞膜透過ペプチドとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ結合領域（４８－６０位）由来の、アルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）；アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチド；ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）などが例示される。

　ＩＲＦ３阻害ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは９～１１であるが、幹細胞に対する増殖促進活性が維持される限りにおいて、８以下又は１０以上であってもよく、例えば４～８又は１０～５０程度、あるいは６～８又は１０～２０程度であってよい。

　ＩＲＦ３阻害ペプチドは、従来公知のペプチド合成ステップによって得ることができる。また、ＩＲＦ３阻害ペプチドには、ペプチドが有する官能基の１又は２以上を他の官能基置き換えたものも、幹細胞に対する増殖促進活性を備える限りにおいて、包含され得るものとする。

［基礎培地］

　本発明に係る培地の組成は、ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む点を除いて、幹細胞の培養のために従来用いられている培地と同様であってよい。このような培地としては、例えば、ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ培地、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１０、　Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ-３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８　Ｍｅｄｉｕｍ（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（和光純薬社）、ｍＥＳＦ培地（和光純薬社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマ社）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社）、ＰＳＧｒｏ-ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳＣ/ＥＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＲＤ社）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ　３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）など及びこれらの混合物などを挙げることができる。

　本発明に係る培地は、これらの培地にＩＲＦ３阻害ペプチドを予め添加あるいは細胞培養中に添加することによって調製できる。培地へのＩＲＦ３阻害ペプチドの添加濃度は、幹細胞に対する増殖促進活性を示す限りにおいて特に限定されないが、例えば１～５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０～２００μｇ／ｍｌである。

　また、培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってもよく、連続的または断続的な添加であってもよい。

　生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ10などが挙げられる。

　栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。

　糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースまたはシアル酸などが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。

　アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンまたはＬ－バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。

　ビタミンとしては、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。

　加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実または酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。

　脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。

　さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６～８に調整することが望ましい。

　本発明に係る培地は、血清含培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される幹細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や増殖因子などの動物組織由来成分を含有していてもよい。

　本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物を含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。

［幹細胞］

　本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。

　多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。

　複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。

　単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。

　幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。

　多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，８１０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，１２５６；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，４５６；Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，３６９；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，１２７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，１４９８４；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，１０９）。

　ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。

　ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008),Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9などに記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学など）より入手可能である。

　複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。

　本発明に係る培地は、いずれの幹細胞の増殖にも好適に使用することができるが、好ましくは、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養に、より好ましくはｉＰＳ細胞の培養に、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞の培養に使用することができる。ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には253G1株（理研セルバンクNo. HPS0002）、201B7株（理研セルバンクNo. HPS0063）、409B2株（理研セルバンクNo. HPS0076）、454E2株（理研セルバンクNo. HPS0077）、HiPS-RIKEN-1A株（理研セルバンクNo. HPS0003）、HiPS-RIKEN-2A株（理研セルバンク No. HPS0009）、HiPS-RIKEN-12A株（理研セルバンク No. HPS0029）、Nips-B2株（理研セルバンクNo. HPS0223）などを挙げることができる。

２．幹細胞の培養方法

［培養方法］

　本発明に係る幹細胞の培養方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で、幹細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。より具体的には、本発明に係る培養方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で、幹細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。本発明に係る培地によれば、ＩＲＦ３阻害ペプチドの作用によって、幹細胞の生存と増殖を促進することができる。すなわち、本発明において、ＩＲＦ３阻害ペプチドは、幹細胞の増殖促進剤として機能し得るものである。

　ここで、本発明に係る培養方法に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、又はタンクなどの培養槽などが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレイン及びポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

　培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面と細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞を用いる場合の接着を目的とする任意の物質であり得る。このような細胞支持用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン又はラミニンの一部構造体、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物が挙げられる（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，９４７１，１６３６-１６４１参照）。

　ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で培養される幹細胞は、分散細胞又は非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２～５０、２～２０、又は２～１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞、又は接着細胞であり得る。

　ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下における幹細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは１．０×１０1～１．０×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０2～１．０×１０7細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは１．０×１０3～１．０×１０7細胞／ｍｌ、最も好ましくは３．０×１０4～１．０×１０7細胞／ｍｌである。

　温度、ＣＯ2濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、従来技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０～４０℃、好ましくは３７℃であり得る。ＣＯ2濃度は、１～１０％、好ましくは２～５％であり得る。酸素分圧は、１～１０％であり得る。

　幹細胞の接着培養を行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９４；Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，１９８１，７８，１２，７６３４－７６３８；Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，５８１９，１５４－１５６；Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５，５４９－５５３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，５２６２，７２２－７２４；Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，１，８９－９５；国際公開第０１／０８８１００号；同第２００５／０８０５５４号参照）。
　幹細胞の浮遊培養の態様としては、担体上での浮遊培養（Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３２，２，２２７－２３６）又はメチルセルロースなどの高分子ポリマーを用いた浮遊培養（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,７３４－７４５）などが挙げられる。幹細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞を用いる場合に対して非接着性の条件下で幹細胞を培養することをいう。幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養及び幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。幹細胞の分散培養とは、懸濁された幹細胞を培養することをいい、例えば、２～２０個の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。このような凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，６，８６２-８６９参照）、ＳＦＥＢ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，８，３，２８８-２９６；国際公開第２００５／１２３９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,７３４－７４５）が挙げられる。
　本発明に係る培養方法では、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する手順によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞、特に分散及び分散後の浮遊培養等のストレスに弱いことが知られているｉＰＳ細胞を効率的に培養するために利用できる。本発明に係る培養方法により得られるＩＲＦ３阻害ペプチドと幹細胞とを含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
［幹細胞又は分化細胞の製造方法］
　本発明に係る培養方法は、幹細胞の製造方法あるいは幹細胞からの分化細胞の製造方法に応用できる。
　本発明に係る幹細胞の製造方法は、上述したＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程を含み、必要に応じて幹細胞を継代する工程を含む。また、本発明に係る幹細胞からの分化細胞の製造方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程と幹細胞の分化を誘導する工程を含み、必要に応じて細胞を継代する工程を含む。
　幹細胞の継代や分化誘導は、従来公知の手法によって行えばよい。分化誘導剤には、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸などを用いることができる。分化誘導は、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、分化誘導培地（９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ-グルタミン、０．１μＭのデキサメタゾン）中で、間葉系幹細胞を培養することによって行うことができる。
　心筋細胞の分化誘導プロセスでは、例えば、心筋細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に０．５ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４を添加した培地で１日培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ-４、１０ｎｇ／ｍｌ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦをそれぞれ添加した培地に交換して更に４日間培養を継続する。その後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１をそれぞれ添加した培地に交換して８日間培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ　Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦをそれぞれ添加した培地に交換することで自律的な拍動を伴う心筋細胞を確認できる。
　血小板分化誘導プロセスの過程で必要となる巨核球の形成には、血清含有培地（２０％ＦＣＳ）において誘導された胚葉体を経て、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）等の因子が使用され得る。
　また、レチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、幹細胞を神経系細胞などに分化させることが可能となる。
　本発明に係る幹細胞及び分化細胞の製造方法では、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞及びこれから誘導される分化細胞を効率的に製造できる。本発明に係る幹細胞及び分化細胞の製造方法により得られるＩＲＦ３阻害ペプチドと、幹細胞及び／又は分化細胞とを含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
　ここで、本発明に係る細胞組成物は、小さな細胞塊のような分散した幹細胞を含む組成物であり得る。本発明に係る細胞組成物は、例えば、凍結保存による幹細胞の保存、輸送、及び継代に用いられ得る。凍結保存等の保存に用いられる場合、本発明に係る細胞組成物は、上述したような血清あるいはその代替物、又はＤＭＳＯ等の有機溶剤をさらに含んでいてもよい。この場合、血清又はその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが、１～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが、０～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）であり得る。本発明に係る細胞組成物は、フィーダー細胞を含むものであってもよい。
　本発明は、以下の実施例によって例示されるが、本発明の範囲が実施例に限定されるものではない。
［実施例１：ｉＰＳ細胞に対するＩＲＦ３阻害ペプチドの増殖促進活性の評価］
　ヒトｉＰＳ細胞の培養において、ＩＲＦ３阻害ペプチドが細胞の生存及び増殖促進活性を示すことを以下の手順により確認した。
（方法）
　ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所の山中伸弥教授が樹立したヒト誘導性多能性幹細胞（２０１Ｂ７及び４０９Ｂ２）を、理化学研究所セルバンク（No.HPS0063、No. HPS0076）より入手し使用した。ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール（第２版）（理化学研究所　発生・再生科学総合研究センター　幹細胞研究支援・開発室作成　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｈｓｃｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ）に従い、細胞のフィーダー層としてマイトマイシン処理で不活化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を蒔いたプラスチック培養皿の上で未分化ヒトｉＰＳを培養した。
　ＩＲＦ３阻害ペプチドは、株式会社蛋白科学研究所の受託サービスを利用して設計した。タンパク質のアミノ酸配列内には、センスペプチド・アンチセンスペプチドの関係によって相互に対応する配列情報を持つ部分が散在することが知られている（非特許文献４参照）。ＩＲＦ３の構造や活性に関わる部分に対応する相補性ペプチドを合成して作用させることで、ＩＲＦ３の機能を抑制できる。上記受託サービスにより、ＩＲＦ３のアミノ酸配列に基づいてその相補性ペプチドを、コンピュータプログラムＭＩＭＥＴＩＣ（非特許文献５参照）を用いて設計した。ＩＲＦ３の全長アミノ酸配列（配列番号１）に基づき設計されたＩＲＦ３阻害ペプチド１～１１のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｄ-ＭＥＭＦ１２（Ｓｉｇｍａ　Ｄ６４２１）に最終濃度２０％　ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、最終濃度１％　ＮＯＮ-ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＡＭＩＮＯ　ＡＣＩＤ（非必須アミノ酸；ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ　Ｌ-グルタミン酸及び８０μＭ　２-メルカプトエタノールをそれぞれ添加した培地を用いて３７℃、５％　ＣＯ2下で培養を行い、３～４日毎に継代を行った。リン酸バッファー緩衝生理学的食塩水に０．２５％トリプシン、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ液、１ｍＭ　ＣａＣｌ2を添加した解離液（全てＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｉＰＳ細胞をフィーダー層から解離し、ピペッティングで約５０-１００個の小細胞塊に分散させた後、前日にＭＥＦを播種し形成させたフィーダー層の上に蒔いた。
　上記のように培養したヒトｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞から小細胞塊として解離し、混入するフィーダー細胞を除去するために０．１％　ゼラチンでコートした培養プレートに血清を含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ８アッセイ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して３７℃、１時間培養した。混入するフィーダー細胞を上記培養プレートの底に吸着させ、単離したｉＰＳ細胞塊をピペッティング操作により小細胞塊へ細かく砕いた後、４８ウェル培養プレートを用いて、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上に、１×１０5個の細胞を含む培地０．５ｍｌ（２×１０5細胞／ｍｌ）を播種した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１（ＧＶＧＤＦＳＱＰＤ）及びネガティブコントロールペプチド（ＧＴＰＫＰＲＩＬＰＷＬ）は、２００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１を含むアッセイ培地で数日間培養後に、形成されたアルカリフォスファターゼ染色陽性（ＡＬＰ＋）のコロニー面積を生存細胞量として計測し、コントロール群と比較した。
（結果）
　ペプチドを２００μｇ／ｍｌ含むアッセイ培地で４日間培養後、コロニー（ＡＬＰ＋）面積を測定した結果を図１に示す。実験群（ＩＲＦ３阻害ペプチド１）ではコントロール群に比べて、コロニー面積は３００％以上となり生存細胞数が有意に増加した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１を含むアッセイ培地にて培養された細胞は、未分化胚性幹細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼを発現していた。
　以上の結果から、ＩＲＦ３阻害ペプチド１は、分散培養開始直後において細胞の生存を促進する活性を示し、その後も生存した細胞の増殖を促進する活性を示すと考えられた。
配列番号１：ＩＲＦ３のアミノ酸配列
配列番号２：ＩＲＦ３阻害ペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３：ＩＲＦ３阻害ペプチド２のアミノ酸配列
配列番号４：ＩＲＦ３阻害ペプチド３のアミノ酸配列
配列番号５：ＩＲＦ３阻害ペプチド４のアミノ酸配列
配列番号６：ＩＲＦ３阻害ペプチド５のアミノ酸配列
配列番号７：ＩＲＦ３阻害ペプチド６のアミノ酸配列
配列番号８：ＩＲＦ３阻害ペプチド７のアミノ酸配列
配列番号９：ＩＲＦ３阻害ペプチド８のアミノ酸配列
配列番号１０：ＩＲＦ３阻害ペプチド９のアミノ酸配列
配列番号１１：ＩＲＦ３阻害ペプチド１０のアミノ酸配列
配列番号１２：ＩＲＦ３阻害ペプチド１１のアミノ酸配列

Claims (36)

  1. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
  2. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の培地。
  3. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の培地。
  4. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の培地。
  5. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地。
  6. 　無血清の培地である、請求項１～５のいずれか一項に記載の培地。
  7. 　配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
  8. 　配列番号２記載のアミノ酸配列からなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
  9. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
  10. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項９記載の増殖促進剤。
  11. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項９記載の増殖促進剤。
  12. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
  13. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
  14. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
  15. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４記載の培養方法。
  16. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４記載の培養方法。
  17. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の培養方法。
  18. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の培養方法。
  19. 　前記培地が無血清の培地である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の培養方法。
  20. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
  21. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０記載の製造方法。
  22. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０記載の製造方法。
  23. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の製造方法。
  24. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の製造方法。
  25. 　前記培地が無血清の培地である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の製造方法。
  26. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞の製造方法。
  27. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項２６記載の製造方法。
  28. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項２６記載の製造方法。
  29. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の製造方法。
  30. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の製造方法。
  31. 　前記培地が無血清の培地である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の製造方法。
  32. 　ＩＲＦ３阻害ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
  33. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含んでなる、請求項３２記載の細胞組成物。
  34. 　前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２～１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなる、請求項３２記載の細胞組成物。
  35. 　前記幹細胞が、胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の細胞組成物。
  36. 　前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の細胞組成物。

     
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