CN115975947A - 一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miR‑99b‑5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用，间充质干细胞外泌体可运载miR‑99b‑5p特异性归巢到肿瘤部位，靶向结直肠癌细胞，进而在体内和体外抑制结直肠癌细胞的生长和转移。因而，miR‑99b‑5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用。为探索利用外泌体作为天然的纳米运载工具装载miRNA治疗结直肠癌的新方法提供理论基础。

Description

一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用

【技术领域】

本发明属于间充质干细胞基因改造技术领域，涉及一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用。

【背景技术】

结直肠癌是国内外高发的恶性肿瘤之一，为全球第四大常见恶性肿瘤，每年约有90万人死于结直肠癌，占世界每年癌症和癌症相关死亡的近10％。目前治疗结直肠癌的主要方法有手术治疗、化学治疗和放射治疗，除此之外还有内分泌治疗等。传统的治疗方法虽然有一定效果，但面临着疗效不佳，易转移复发，以及存在不良反应等问题亟待解决。因此，急需探寻新的替代策略用于结直肠癌的干预治疗。

骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。骨髓间充质干细胞的功能主要通过其分泌的产物——外泌体来实现的。干细胞源外泌体可通过细胞间通讯递送内容物(miRNA、mRNA、蛋白质等)到肿瘤细胞，从而发挥治疗作用。干细胞外泌体作为药物载体具有以下显著优势：在所有能产生外泌体的细胞中，干细胞生产外泌体的能力最强；干细胞源外泌体具有很高的修饰灵活性；具有良好的治疗效果；具有较高的生物相容性和较低的免疫原性；具有从亲代细胞继承的肿瘤趋向性。因此，间充质源外泌体成为肿瘤“非细胞治疗”的新策略。

目前已有相关的研究，例如中国专利申请CN202111299968.5一种结直肠癌细胞外泌体及其分离提取方法与应用，所述分离提取方法包括以下步骤：将结直肠癌细胞，采用含血清培养基培养后转移至不含血清的培养基中培养，收集培养基上清液；将培养基上清液低速离心，收集液相；将得到的液相高速离心，收集固相；将固相复溶，透析；透析液进行过滤得到滤液；将滤液2-6℃，100000-120000g离心，收集固相，即为外泌体，方法简单，制备得到的外泌体纯度高，稳定性好。

又例如中国专利申请CN201710476829.2外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用，研究结果表明，正常非癌细胞的培养液中的外泌体中不含p-ERK，结直肠癌细胞的培养液中的外泌体中含有较多p-ERK，因此可将外泌体中p-ERK作为诊断结直肠癌的分子标志物，为临床提供了一种具有广泛应用前景的结直肠癌无创诊断方法。

近年来的研究展示外泌体源外泌体有巨大潜力作为非编码RNA递送系统用于肿瘤的治疗。到目前为止，间充质干细胞源外泌体miR-99b-5p在结直肠癌侵袭转移过程中的作用及机制的研究尚未见报道，更无miR-99b-5p高表达的干细胞源外泌体用于结直肠癌治疗领域的相关报道。

【发明内容】

针对现有技术中缺少miR-99b-5p高表达的干细胞源外泌体用于制备结直肠癌治疗药物的研究，本发明提供了一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法及其应用，是一种miR-99b-5p修饰的间充质干细胞、外泌体的制备方法，以及miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体对结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移的抑制作用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)细胞转染：

转染前1天，将细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，当细胞融合度达到70-90％时转染；分别用miR-99b-5p/NCmimic按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明书转染MSCs；

2)MSCs源外泌体的提取：

收集用无外泌体血清培养体系培养48h后的细胞上清30ml，以500g离心5分钟，用于样品中除去残余细胞；

收集上清液转移到新的离心管中，以2000g离心10分钟，用于消除样品中的死细胞；

收集上清液并将其转移到新的离心管中，以10000g离心30分钟，用于消除细胞碎片；

以100000g离心70分钟，弃上清，将外泌体沉淀用PBS重悬，以100000g离心70分钟将外泌体用PBS重悬后，保存在-80℃备用；

3)提取外泌体的鉴定：

①透射电镜见对外泌体粒径和形态的鉴定：用移液器吸取10μl的外泌体重悬液置于铜网上，室温下静置10分钟；加入2％水醋酸双氧铀10μl，染色3分钟，使用滤纸将多余染料吸净后，室温下晾干，于透射电镜下观察外泌体大小形态并拍照记录；

②用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测外泌体粒径：取2μl提取的间充质干细胞(MSCs)外泌体进行稀释后，于NTA上检测；

③Westernblot检测外泌体表面标记蛋白：将提取的外泌体充分裂解，用RIPA裂解缓冲液分离总蛋白，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移到PVDF膜上，室温下用5％(w/v)脱脂奶粉室温封闭1小时后，分别用一抗(TSG101、CD63和CD9)4℃孵育过夜，然后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1小时，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测；

透射电镜对外泌体的形态进行鉴定，观察到直径约为100nm的茶托状双层膜囊泡状结构；用NTA检测外泌体的粒径约为100nm；用westernblot检测到外泌体表面特异性的标记蛋白(TSG101、CD63和CD9)呈阳性表达。

本发明还涉及上述一种mir-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的应用，所述的应用是miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用，包括以下步骤：

1)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞有效摄取的验证：

根据PKH-26荧光标记试剂盒说明书进行，将收集的外泌体重悬于PKH26染料溶液中，轻柔吹打混合，室温孵育3分钟后，加入等体积的无外泌体血清停止染色；加入PBS至30ml，以100000g，离心70分钟以清洗外泌体，重复该步骤，离心后弃上清，用不含血清的的RPMI1640培养基重悬底部外泌体，然后将PKH26标记的外泌体与CRC细胞共培养48小时，用4％(w/v)多聚甲醛固定细胞后，用DAPI对CRC细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞对外泌体的摄取；

2)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞增殖的影响：

将CRC细胞在含EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化离心后，用含10％(v/v)FBS的1640培养基重悬细胞，配成4×10⁴个/ml的细胞悬液；取100μl细胞悬液加入至96孔板中，种板后将细胞置于细胞培养箱培养24小时，并在96孔板外周一圈每孔加100μlPBS，防止水分蒸发；

将细胞分为Exo-miR-99b-5p组(转染miR-99b-5pmimic后的MSCs源外泌体)和Exo-miR-NC(转染mimicNC后的MSCs源外泌体)组，分别用两组外泌体与CRC细胞共培养；在加入外泌体共培养后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时，将96孔板从培养箱中取出，弃掉对应孔旧培养基，根据CCK8试剂盒说明书及需要检测孔的数量，按照培养基：CCK8＝10:1配制CCK8检测液，后每个待检测孔加入110μl/CCK8检测液，将加样的96孔板置于培养箱中，孵育2h，利用全自动酶标仪中，测定每孔在450nm处吸光度值(OD值)；

3)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响：

将Matrigel胶置于冰上，在4℃冰箱中放置24小时使其融化，使用无血清培养基按照1:7比例稀释Matrigel胶，将其配置成200-300μg/ml的工作液，此过程需全程冰上操作；

将8μm孔径的Transwell小室置于24孔板中，在上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel胶，放置于细胞培养箱，37℃孵育1小时，小心去除上层液态培养基；

将CRC细胞用含EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化离心后，用无血清培养基配成浓度为5×10⁵个/ml的细胞悬液，向每个Transwell小室中加入100μl细胞悬液；将细胞分为Exo-miR-99b-5p组和Exo-miR-NC组，分别加入相应外泌体与CRC细胞共培养；在下室中加入600μl含20％(v/v)FBS的培养基，放入细胞培养箱中培养24小时，然后取出小室，吸去上室内液体，弃掉下室培养基，每孔内加入600μl4％多聚甲醛固定液，将小室浸泡固定固定30分钟，固定完成后用PBS清洗小室3遍，于通风处倒置晾干；每孔中加入600μl结晶紫染色剂，将小室浸泡染色30分钟，染色完成后用PBS清洗小室3遍，棉签轻轻擦去上室细胞，注意擦拭时不要损伤小室，之后置于室温晾干；

用显微图像采集系统进行观察和拍照，随机选取4个高倍视野(200×)进行细胞计数，计算4个视野下的平均细胞数，将细胞置于无基质胶包被的小室内，检测细胞的迁移情况；

4)MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体的体内安全性评估：

为评价MSCs源外泌体的体内安全性，将12只雄性BALB/C裸鼠分为三组，分别通过尾静脉注射2.6×10⁸Exo-miR-99b-5p，2.6×10⁸Exo-miR-NC或相同体积PBS到裸鼠，共5次重复剂量，最后一次注射后，处死裸鼠，收集血液样本1ml至无EDTA干燥EP管中，室温静置30分钟后，2500rpm，离心10分钟，小心吸取上部血清；采用BS-2000全自动生化分析仪检测裸鼠血清的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和血尿素氮(BUN)；收集裸鼠主要脏器组织(心、脑、肝、肺、脾、肾)，制备组织蜡块，冰冻切片机连续切片，厚度为5μm左右，进行HE染色；

5)MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体体内抑制结直肠癌细胞的生长和上皮间质转化：

将处于对数生长期的LoVo细胞消化制作细胞悬液，将LoVo细胞悬液，2×10⁶细胞/只小鼠的量皮下注射到裸鼠；待肿瘤体积生长至约100mm³时，将裸鼠随机分为2组(5只/组)，Exo-miR-NC和Exo-miR-99b-5p组；两组裸鼠每隔5天分别通过尾静脉注射两种外泌体到体内，重复注射5次；随后处死裸鼠，取出瘤体测量和称重，以观察不同组别瘤体的生长状态；并用weseternblot检测各组肿瘤中上皮间质转化相关标志物(E-cadherin,N-cadherin和vimentin)的表达。

本发明所述的miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用，是利用miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体作为治疗结直肠癌的天然的纳米运载工具。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法，结果显示：用透射电镜对外泌体的形态进行鉴定，可观察到直径约为100nm的茶托状双层膜囊泡状结构；用NTA检测外泌体的粒径约为100nm；用westernblot检测到外泌体表面特异性的标记蛋白(TSG101、CD63和CD9)呈阳性表达。

2、本发明所述的一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的应用：

①通过MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞有效摄取的验证，结果显示：过表达miR-99b-5p的间充质干细胞源外泌体可以被CRC细胞所摄取，并且，用Real-timePCR技术检测证明与外泌体共孵育后CRC细胞中miR-99b-5p的表达水平显著上调；

②通过MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞增殖的影响，CCK8细胞增殖实验的结果显示：与对照组相比，MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的增殖；

③通过MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响，结果显示：与对照组相比，MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力；

④通过MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体的体内安全性评估，结果显示：实验组患者的血清学标志物水平均无显著差异，说明外泌体处理对肝肾功能无不良影响；此外，接受Exo-miR-NC/Exo-miR-99b-5p处理的裸鼠主要器官组织HE染色未见明显的组织病理学异常或病变，说明外泌体对裸鼠主要器官没有明显的毒性作用，间充质干细胞源外泌体是一种安全性的给药载体可用于非编码RNA在体内的递送，

⑤通过MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体体内抑制结直肠癌细胞的生长和上皮间质转化，结果显示：相对于Exo-miR-NC组，Exo-miR-99b-5p组肿瘤的体积和重量显著较低，并且，Exo-miR-99b-5p组肿瘤组织中E-cadherin表达显著升高，N-cadherin和vimentin的表达显著降低；结果表明：MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体可在体内有效抑制结直肠癌细胞的生长并抑制上皮间质转化。

以上结果表明，间充质干细胞外泌体可运载miR-99b-5p特异性归巢到肿瘤部位，靶向结直肠癌细胞，进而在体内和体外抑制结直肠癌细胞的生长和转移。因而，miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用。为探索利用外泌体作为天然的纳米运载工具装载miRNA治疗结直肠癌的新方法提供理论基础。

【附图说明】

图1是本发明实施例外泌体的鉴定的图(A，电镜鉴定；B，NTA粒径分析结果；C.Western blot检测外泌体表面特异蛋白的表达)；

图2是本发明实施例MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞摄取的鉴定的图(A，激光共聚焦显微镜检测LoVo细胞对外泌体的摄取；B，过表达miR-99b-5p的外泌体与LoVo细胞共培养后细胞中的miR-99b-5p表达上调)；

图3是本发明实施例MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的图(A，transwell实验检测对LoVo细胞和SW480细胞侵袭和迁移能力的影响；B，CCK8实验检测对LoVo细胞增殖能力的影响)；

图4是本发明实施例裸鼠体内实验评估MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体的安全性的图(A，三个处理组血清学指标(ALT、AST、CRE和BUN)的检测；B，HE染色后用显微镜观察三组处理对心、脑、肝、肺、脾、肾的影响(200×))；

图5是本发明实施例MSCs源外泌体miR-99b-5p在体内抑制肿瘤生长和上皮间质转化的图(A，裸鼠肿瘤；B，裸鼠肿瘤的生长曲线；C，裸鼠的肿瘤重量；D，Westernblot检测肿瘤组织中E-cadherin,Vimentin和N-cadherin的表达)。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1.细胞转染：

转染前1天，将细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，当细胞融合度达到70-90％时转染；分别用miR-99b-5p/NCmimic按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明书转染MSCs；

2.MSCs源外泌体的提取：

收集用无外泌体血清培养体系培养48h后的细胞上清30ml，以500g离心5分钟，用于样品中除去残余细胞；

收集上清液转移到新的离心管中，以2000g离心10分钟，用于消除样品中的死细胞；

收集上清液并将其转移到新的离心管中，以10000g离心30分钟，用于消除细胞碎片；

以100000g离心70分钟，弃上清，将外泌体沉淀用PBS重悬，进一步以100000g离心70分钟将外泌体用PBS重悬后，保存在-80℃备用；

3.提取外泌体的鉴定：

(1)透射电镜见对外泌体粒径和形态的鉴定：用移液器吸取10μl的外泌体重悬液置于铜网上，室温下静置10分钟；加入2％水醋酸双氧铀10μl，染色3分钟，使用滤纸将多余染料吸净后，室温下晾干，于透射电镜下观察外泌体大小形态并拍照记录；

(2)用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测外泌体粒径：取2μl提取的间充质干细胞(MSCs)外泌体进行稀释后，于NTA上检测；

(3)Westernblot检测外泌体表面标记蛋白：将提取的外泌体充分裂解，用RIPA裂解缓冲液分离总蛋白，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移到PVDF膜上，室温下用5％(w/v)脱脂奶粉室温封闭1小时后，分别用一抗(TSG101、CD63和CD9)4℃孵育过夜，然后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1小时，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测；

结果显示：用透射电镜对外泌体的形态进行鉴定，可观察到直径约为100nm的茶托状双层膜囊泡状结构；用NTA检测外泌体的粒径约为100nm；用westernblot检测到外泌体表面特异性的标记蛋白(TSG101、CD63和CD9)呈阳性表达。

上述得到的一种mir-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的应用，所述的应用是miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用，包括以下步骤：

4.MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞有效摄取的验证：

根据PKH-26荧光标记试剂盒说明书进行，将收集的外泌体重悬于PKH26染料溶液中，轻柔吹打混合，室温孵育3分钟后，加入等体积的无外泌体血清停止染色；加入PBS至30ml，以100000g，离心70分钟以清洗外泌体，重复该步骤，离心后弃上清，用不含血清的的RPMI1640培养基重悬底部外泌体，然后将PKH26标记的外泌体与CRC细胞共培养48小时，用4％(w/v)多聚甲醛固定细胞后，用DAPI对CRC细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞对外泌体的摄取；

结果显示：过表达miR-99b-5p的间充质干细胞源外泌体可以被CRC细胞所摄取，并且，用Real-timePCR技术检测证明与外泌体共孵育后CRC细胞中miR-99b-5p的表达水平显著上调。

5.MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞增殖的影响：

将CRC细胞在含EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化离心后，用含10％(v/v)FBS的1640培养基重悬细胞，配成4×10⁴个/ml的细胞悬液；取100μl细胞悬液加入至96孔板中，种板后将细胞置于细胞培养箱培养24小时，并在96孔板外周一圈每孔加100μlPBS，防止水分蒸发；

将细胞分为Exo-miR-99b-5p组(转染miR-99b-5pmimic后的MSCs源外泌体)和Exo-miR-NC(转染mimicNC后的MSCs源外泌体)组，分别用两组外泌体与CRC细胞共培养；在加入外泌体共培养后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时，将96孔板从培养箱中取出，弃掉对应孔旧培养基，根据CCK8试剂盒说明书及需要检测孔的数量，按照培养基：CCK8＝10:1配制CCK8检测液，后每个待检测孔加入110μl/CCK8检测液，将加样的96孔板置于培养箱中，孵育2h，利用全自动酶标仪中，测定每孔在450nm处吸光度值(OD值)；

CCK8细胞增殖实验的结果显示：与对照组相比，MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的增殖。

6.MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响：

将Matrigel胶置于冰上，在4℃冰箱中放置24小时使其融化，使用无血清培养基按照1:7比例稀释Matrigel胶，将其配置成200-300μg/ml的工作液，此过程需全程冰上操作；

将8μm孔径的Transwell小室置于24孔板中，在上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel胶，放置于细胞培养箱，37℃孵育1小时，小心去除上层液态培养基；

将CRC细胞用含EDTA的0.25％(w/v)胰酶消化离心后，用无血清培养基配成浓度为5×10⁵个/ml的细胞悬液，向每个Transwell小室中加入100μl细胞悬液；将细胞分为Exo-miR-99b-5p组和Exo-miR-NC组，分别加入相应外泌体与CRC细胞共培养；在下室中加入600μl含20％(v/v)FBS的培养基，放入细胞培养箱中培养24小时，然后取出小室，吸去上室内液体，弃掉下室培养基，每孔内加入600μl4％多聚甲醛固定液，将小室浸泡固定固定30分钟，固定完成后用PBS清洗小室3遍，于通风处倒置晾干；每孔中加入600μl结晶紫染色剂，将小室浸泡染色30分钟，染色完成后用PBS清洗小室3遍，棉签轻轻擦去上室细胞，注意擦拭时不要损伤小室，之后置于室温晾干；

用显微图像采集系统进行观察和拍照，随机选取4个高倍视野(200×)进行细胞计数，计算4个视野下的平均细胞数，将细胞置于无基质胶包被的小室内，检测细胞的迁移情况；

结果显示：与对照组相比，MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力。

7.MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体的体内安全性评估：

由广西医科大学实验动物中心提供BALB/C裸鼠并进行饲养；

为评价MSCs源外泌体的体内安全性，将12只雄性裸鼠分为三组，分别通过尾静脉注射2.6×10⁸Exo-miR-99b-5p，2.6×10⁸Exo-miR-NC或相同体积PBS到裸鼠，共5次重复剂量，最后一次注射后，处死裸鼠，收集血液样本1ml至无EDTA干燥EP管中，室温静置30分钟后，2500rpm，离心10分钟，小心吸取上部血清；采用BS-2000全自动生化分析仪检测裸鼠血清的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和血尿素氮(BUN)；收集裸鼠主要脏器组织(心、脑、肝、肺、脾、肾)，制备组织蜡块，冰冻切片机连续切片，厚度为5μm左右，进行HE染色；

结果显示：三组患者的上述血清学标志物水平均无显著差异，说明外泌体处理对肝肾功能无不良影响；此外，接受Exo-miR-NC/Exo-miR-99b-5p处理的裸鼠主要器官组织HE染色未见明显的组织病理学异常或病变，说明外泌体对裸鼠主要器官没有明显的毒性作用，间充质干细胞源外泌体是一种安全性的给药载体可用于非编码RNA在体内的递送。

8.MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体体内抑制结直肠癌细胞的生长和上皮间质转化：

将处于对数生长期的LoVo细胞消化制作细胞悬液，将LoVo细胞悬液，2×10⁶细胞/只小鼠的量皮下注射到裸鼠；待肿瘤体积生长至约100mm³时，将裸鼠随机分为2组(5只/组)，Exo-miR-NC和Exo-miR-99b-5p组；两组裸鼠每隔5天分别通过尾静脉注射两种外泌体到体内，重复注射5次；随后处死裸鼠，取出瘤体测量和称重，以观察不同组别瘤体的生长状态；并用weseternblot检测各组肿瘤中上皮间质转化相关标志物(E-cadherin,N-cadherin和vimentin)的表达；

结果显示：相对于Exo-miR-NC组，Exo-miR-99b-5p组肿瘤的体积和重量显著较低，并且，Exo-miR-99b-5p组肿瘤组织中E-cadherin表达显著升高，N-cadherin和vimentin的表达显著降低；

结果表明：MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体可在体内有效抑制结直肠癌细胞的生长并抑制上皮间质转化。

图1是外泌体的鉴定的图(A，电镜鉴定；B，NTA粒径分析结果；C.Westernblot检测外泌体表面特异蛋白的表达)；

图2是MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞摄取的鉴定的图(A，激光共聚焦显微镜检测LoVo细胞对外泌体的摄取；B，过表达miR-99b-5p的外泌体与LoVo细胞共培养后细胞中的miR-99b-5p表达上调)；

图3是MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的图(A，transwell实验检测对LoVo细胞和SW480细胞侵袭和迁移能力的影响；B，CCK8实验检测对LoVo细胞增殖能力的影响)；

图4是裸鼠体内实验评估MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体的安全性的图(A，三个处理组血清学指标(ALT、AST、CRE和BUN)的检测；B，HE染色后用显微镜观察三组处理对心、脑、肝、肺、脾、肾的影响(200×))；

图5是MSCs源外泌体miR-99b-5p在体内抑制肿瘤生长和上皮间质转化的图(A，裸鼠肿瘤；B，裸鼠肿瘤的生长曲线；C，裸鼠的肿瘤重量；D，Westernblot检测肿瘤组织中E-cadherin,Vimentin和N-cadherin的表达)。

以上结果表明：

间充质干细胞外泌体可运载miR-99b-5p特异性归巢到肿瘤部位，靶向结直肠癌细胞，进而在体内和体外抑制结直肠癌细胞的生长和转移。因而，miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用。为探索利用外泌体作为天然的纳米运载工具装载miRNA治疗结直肠癌的新方法提供理论基础。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (3)

1.一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)细胞转染：

转染前1天，将细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，当细胞融合度达到70-90％时转染；分别用miR-99b-5p/NCmimic按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明书转染MSCs；

2)MSCs源外泌体的提取：

收集用无外泌体血清培养体系培养48h后的细胞上清30ml，以500g离心5分钟，用于样品中除去残余细胞；

收集上清液转移到新的离心管中，以2000g离心10分钟，用于消除样品中的死细胞；

收集上清液并将其转移到新的离心管中，以10000g离心30分钟，用于消除细胞碎片；

以100000g离心70分钟，弃上清，将外泌体沉淀用PBS重悬，以100000g离心70分钟将外泌体用PBS重悬后，保存在-80℃备用；

3)提取外泌体的鉴定：

①透射电镜见对外泌体粒径和形态的鉴定：用移液器吸取10μl的外泌体重悬液置于铜网上，室温下静置10分钟；加入2％水醋酸双氧铀10μl，染色3分钟，使用滤纸将多余染料吸净后，室温下晾干，于透射电镜下观察外泌体大小形态并拍照记录；

②用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径：取2μl提取的间充质干细胞外泌体进行稀释后，于纳米颗粒跟踪分析仪上检测；

③Westernblot检测外泌体表面标记蛋白：将提取的外泌体充分裂解，用RIPA裂解缓冲液分离总蛋白，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移到PVDF膜上，室温下用5％w/v脱脂奶粉室温封闭1小时后，分别用一抗，TSG101、CD63和CD9，4℃孵育过夜，然后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1小时，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测；

透射电镜对外泌体的形态进行鉴定，观察到直径约为100nm的茶托状双层膜囊泡状结构；用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体的粒径约为100nm；用westernblot检测到外泌体表面特异性的标记蛋白，TSG101、CD63和CD9呈阳性表达。

2.权利要求1所述的一种miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的应用，其特征在于：所述的应用是miR-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用，包括以下步骤：

1)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体被结直肠癌细胞有效摄取的验证：

根据PKH-26荧光标记试剂盒说明书进行，将收集的外泌体重悬于PKH26染料溶液中，轻柔吹打混合，室温孵育3分钟后，加入等体积的无外泌体血清停止染色；加入PBS至30ml，以100000g，离心70分钟以清洗外泌体，重复该步骤，离心后弃上清，用不含血清的的RPMI1640培养基重悬底部外泌体，然后将PKH26标记的外泌体与CRC细胞共培养48小时，用4％w/v多聚甲醛固定细胞后，用DAPI对CRC细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞对外泌体的摄取；

2)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞增殖的影响：

将CRC细胞在含EDTA的0.25％w/v胰酶消化离心后，用含10％v/vFBS的1640培养基重悬细胞，配成4×10⁴个/ml的细胞悬液；取100μl细胞悬液加入至96孔板中，种板后将细胞置于细胞培养箱培养24小时，并在96孔板外周一圈每孔加100μlPBS，防止水分蒸发；

将细胞分为Exo-miR-99b-5p组，即转染miR-99b-5pmimic后的MSCs源外泌体组，和Exo-miR-NC组，即转染mimicNC后的MSCs源外泌体组，分别用两组外泌体与CRC细胞共培养；在加入外泌体共培养后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时，将96孔板从培养箱中取出，弃掉对应孔旧培养基，根据CCK8试剂盒说明书及需要检测孔的数量，按照培养基：CCK8＝10:1配制CCK8检测液，后每个待检测孔加入110μl/CCK8检测液，将加样的96孔板置于培养箱中，孵育2h，利用全自动酶标仪中，测定每孔在450nm处吸光度值；

3)MSCs源过表达miR-99b-5p的外泌体对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响：

将Matrigel胶置于冰上，在4℃冰箱中放置24小时使其融化，使用无血清培养基按照1:7比例稀释Matrigel胶，将其配置成200-300μg/ml的工作液，此过程需全程冰上操作；

将8μm孔径的Transwell小室置于24孔板中，在上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel胶，放置于细胞培养箱，37℃孵育1小时，小心去除上层液态培养基；

将CRC细胞用含EDTA的0.25％w/v胰酶消化离心后，用无血清培养基配成浓度为5×10⁵个/ml的细胞悬液，向每个Transwell小室中加入100μl细胞悬液；将细胞分为Exo-miR-99b-5p组和Exo-miR-NC组，分别加入相应外泌体与CRC细胞共培养；在下室中加入600μl含20％v/vFBS的培养基，放入细胞培养箱中培养24小时，然后取出小室，吸去上室内液体，弃掉下室培养基，每孔内加入600μl4％多聚甲醛固定液，将小室浸泡固定固定30分钟，固定完成后用PBS清洗小室3遍，于通风处倒置晾干；每孔中加入600μl结晶紫染色剂，将小室浸泡染色30分钟，染色完成后用PBS清洗小室3遍，棉签轻轻擦去上室细胞，注意擦拭时不要损伤小室，之后置于室温晾干；

用显微图像采集系统进行观察和拍照，随机选取4个高倍视野，20×，进行细胞计数，计算4个视野下的平均细胞数，将细胞置于无基质胶包被的小室内，检测细胞的迁移情况；

4)MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体的体内安全性评估：

为评价MSCs源外泌体的体内安全性，将12只雄性BALB/C裸鼠分为三组，分别通过尾静脉注射2.6×10⁸Exo-miR-99b-5p，2.6×10⁸Exo-miR-NC或相同体积PBS到裸鼠，共5次重复剂量，最后一次注射后，处死裸鼠，收集血液样本1ml至无EDTA干燥EP管中，室温静置30分钟后，2500rpm，离心10分钟，小心吸取上部血清；采用BS-2000全自动生化分析仪检测裸鼠血清的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和血尿素氮；收集裸鼠主要脏器组织，即心、脑、肝、肺、脾、肾，制备组织蜡块，冰冻切片机连续切片，厚度为5μm左右，进行HE染色；

5)MSCs源过表达miR-99b-5p外泌体体内抑制结直肠癌细胞的生长和上皮间质转化：

将处于对数生长期的LoVo细胞消化制作细胞悬液，将LoVo细胞悬液，2×10⁶细胞/只小鼠的量皮下注射到裸鼠；待肿瘤体积生长至约100mm³时，将裸鼠随机分为2组，5只/组，Exo-miR-NC和Exo-miR-99b-5p组；两组裸鼠每隔5天分别通过尾静脉注射两种外泌体到体内，重复注射5次；随后处死裸鼠，取出瘤体测量和称重，以观察不同组别瘤体的生长状态；并用weseternblot检测各组肿瘤中上皮间质转化相关标志物，E-cadherin,N-cadherin和vimentin的表达。

3.根据权利要求2所述的一种mir-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体的应用，其特征在于：所述的mir-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体具有抑制结直肠癌恶性进展的作用，是利用mir-99b-5p过表达的工程化间充质干细胞源外泌体作为治疗结直肠癌的天然的纳米运载工具。

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