CN110478497B - 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用 - Google Patents

一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110478497B
CN110478497B CN201910828342.5A CN201910828342A CN110478497B CN 110478497 B CN110478497 B CN 110478497B CN 201910828342 A CN201910828342 A CN 201910828342A CN 110478497 B CN110478497 B CN 110478497B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesoporous silica
delivery system
tumor
nucleolin
drug delivery
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910828342.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110478497A (zh
Inventor
王宗花
高晚霞
张怀荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao University
Original Assignee
Qingdao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao University filed Critical Qingdao University
Priority to CN201910828342.5A priority Critical patent/CN110478497B/zh
Priority to PCT/CN2019/111776 priority patent/WO2021042451A1/zh
Publication of CN110478497A publication Critical patent/CN110478497A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110478497B publication Critical patent/CN110478497B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本公开提供了一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用，纳米颗粒状结构，包括介孔二氧化硅纳米粒子、肿瘤药物和AS1411适配体，所述肿瘤药物负载在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔内，所述AS1411适配体封装在介孔二氧化硅纳米粒子表面。本公开以介孔二氧化硅纳米粒子作为药物载体，利用AS1411适配体可以靶向肿瘤细胞的标志物核仁素，结合PMA和DOX的联合治疗，构建了针对肿瘤靶向治疗的MSN@PMA@DOX双重载药系统，实验结果表明，该双重载药系统对HeLa肿瘤细胞核仁素有高效的靶向作用，并且本公开的双重载药系统具有靶向精确、治疗效果高效等优点。

Description

一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用
技术领域
本公开属于生物医药技术领域，涉及一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤。肉瘤是指间叶组织，包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等，发生的恶性肿瘤。抗肿瘤药物为治疗肿瘤疾病的一类药物。简单说来有化疗药物、生物制剂。近年来，分子肿瘤学、分子药理学的发展使肿瘤本质正在逐步阐明；大规模快速筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程；抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代。目前，国际上临床常见的抗肿瘤药物约80余种，大致可分为以下6类：细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体药物、其他类药物、辅助药。但是，临床使用的抗肿瘤药物通常存在选择性不高等缺陷，即在杀伤肿瘤细胞的同时对机体正常细胞，特别是增殖旺盛的细胞具有损害作用。这些缺陷成为限制抗肿瘤药物用量、阻碍抗肿瘤药物疗效发挥的主要问题。
随着社会和科技的发展，癌症治疗观念正在发生根本性的改变，即由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变。根据靶向部位的不同，又可以将肿瘤靶向治疗分为二大类，即肿瘤细胞靶向治疗和肿瘤血管靶向治疗。肿瘤细胞靶向治疗是利用肿瘤细胞表面的特异性抗原或受体作为靶向，而肿瘤血管靶向治疗则是利用肿瘤区域新生毛细血管内皮细胞表面的特异性抗原或受体起作用。
发明内容
本公开的目的是提供一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用，本公开的双重载药系统以核仁素作为靶向，将肿瘤药物直接释放至细胞核周围，能够使肿瘤药物直接作用于细胞核，从而有效杀死肿瘤细胞。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
第一方面，本公开提供了一种基于靶向核仁素的双重载药系统，为纳米颗粒状结构，包括介孔二氧化硅纳米粒子、肿瘤药物和AS1411适配体，所述肿瘤药物负载在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔内，所述AS1411适配体封装在介孔二氧化硅纳米粒子表面。
核仁素是一类高分子量(>200kD)糖蛋白，Ⅰ型跨膜蛋白，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在指数生长的真核细胞细胞核中高度表达，而较小量在细胞质和细胞表面表达。核仁素在核糖体生物转录调节，染色质重塑和核仁组织中起重要作用。本公开利用核仁素在癌细胞中表达异常的特点，选择核仁素作为肿瘤靶向治疗的标志物。
本公开的载药系统为纳米颗粒状结构能够使得药物直接进入细胞内，并通过封装在介孔二氧化硅表面的AS1411适配体与细胞内的核仁素进行特异性识别，特异性识别后，AS1411适配体脱离介孔二氧化硅表面，从而使得负载在介孔内的肿瘤药物裸露，进而释放，释放的肿瘤药物位于肿瘤细胞内，能够直接作用于细胞核，提高了靶向精确、治疗效果。
通过实验表明，当采用阿霉素(DOX)和佛波酯(PMA)联合使用作为肿瘤药物时，能够更加高效的杀死肿瘤细胞。
第二方面，本公开提供了一种上述基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，采用氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子进行改性，向改性后介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中添加肿瘤药物，肿瘤药物扩散至改性后介孔二氧化硅纳米粒子的介孔中，使介孔二氧化硅纳米粒子负载肿瘤药物，将负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子加入至含有AS1411适配体的溶液中，使AS1411适配体附着在改性后介孔二氧化硅纳米粒子的表面。
本公开采用氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子进行改性，使得介孔二氧化硅纳米粒子表面带有正电荷，从而能够将AS1411适配体附着在介孔二氧化硅纳米粒子的表面，从而实现封闭介孔二氧化硅纳米粒子的介孔，避免介孔中肿瘤药物泄漏。
本公开通过试验证明，当以阿霉素(DOX)和佛波酯(PMA)联合使用作为肿瘤药物，其药物的靶向效果更好。
第三方面，本公开提供了一种上述基于靶向核仁素的双重载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
本公开的有益效果为：
本公开以介孔二氧化硅纳米粒子作为药物载体，利用AS1411适配体可以靶向肿瘤细胞的标志物核仁素，结合PMA和DOX的联合治疗，构建了针对肿瘤靶向治疗的MSN@PMA@DOX双重载药系统，实验结果表明，该双重载药系统对HeLa肿瘤细胞核仁素有高效的靶向作用，并且本公开的双重载药系统具有靶向精确、治疗效果高效等优点。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统在肿瘤治疗中应用的示意图；
图2为本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统透射电镜照片，A为MSN，B为MSN@PMA@DOX双重载药系统；
图3为本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统细胞毒性实验结果柱状图；
图4为本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统用Annexin-FITC/PI试剂盒染色的流式细胞实验数据结构图，A为LO-2细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统作用24小时，B为HeLa细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统作用24小时，C为HeLa细胞与MSN@DOX单载药系统作用24小时，D为HeLa细胞与MSN@PMA单载药系统作用24小时；
图5为LO-2细胞与本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统孵育24小时用AnnexinV-EGFP/PI凋亡试剂盒染色的激光共聚焦图像，A为LO-2细胞明场图，B为LO-2细胞质染色图，C为LO-2细胞核染色图，D为LO-2细胞叠加图；
图6为HeLa肿瘤细胞与本公开实施例1制备的MSN@PMA@DOX双重载药系统孵育24小时用AnnexinV-EGFP/PI凋亡试剂盒染色的激光共聚焦图像，A为HeLa细胞明场图，B为HeLa细胞质染色图，C为HeLa细胞核染色图，D为HeLa细胞叠加图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本公开提出了一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用。该双重载药系统能够使肿瘤药物直接作用于细胞核，从而有效杀死肿瘤细胞。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种基于靶向核仁素的双重载药系统，为纳米颗粒状结构，包括介孔二氧化硅纳米粒子、肿瘤药物和AS1411适配体，所述肿瘤药物负载在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔内，所述AS1411适配体封装在介孔二氧化硅纳米粒子表面。
核仁素是一类高分子量(>200kD)糖蛋白，Ⅰ型跨膜蛋白，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在指数生长的真核细胞细胞核中高度表达，而较小量在细胞质和细胞表面表达。核仁素在核糖体生物转录调节，染色质重塑和核仁组织中起重要作用。本公开利用核仁素在癌细胞中表达异常的特点，选择核仁素作为肿瘤靶向治疗的标志物。
本公开的载药系统为纳米颗粒状结构能够使得药物直接进入细胞内，并通过封装在介孔二氧化硅表面的AS1411适配体与细胞内的核仁素进行特异性识别，特异性识别后，AS1411适配体脱离介孔二氧化硅表面，从而使得负载在介孔内的肿瘤药物裸露，进而释放，释放的肿瘤药物位于肿瘤细胞内，能够直接作用于细胞核，提高了靶向精确、治疗效果。
该实施方式的一种或多种实施例中，肿瘤药物为阿霉素和佛波酯。通过实验表明，当采用DOX和PMA联合使用作为肿瘤药物时，能够更加高效的杀死肿瘤细胞。
该实施方式的一种或多种实施例中，纳米颗粒状结构的粒径为170～190nm。
本公开的另一种实施方式，提供了一种上述基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，采用氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子进行改性，向改性后介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中添加肿瘤药物，肿瘤药物扩散至改性后介孔二氧化硅纳米粒子的介孔中，使介孔二氧化硅纳米粒子负载肿瘤药物，将负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子加入至含有AS1411适配体的溶液中，使AS1411适配体附着在改性后介孔二氧化硅纳米粒子的表面。
本公开采用氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子进行改性，使得介孔二氧化硅纳米粒子表面带有正电荷，从而能够将AS1411适配体附着在介孔二氧化硅纳米粒子的表面，从而实现封闭介孔二氧化硅纳米粒子的介孔，避免介孔中肿瘤药物泄漏。
该实施方式的一种或多种实施例中，介孔二氧化硅纳米粒子改性的方法为：向介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中添加氨丙基三乙氧基硅烷，加热至35～40℃反应。
该系列实施例中，反应时间为5～7h。
该系列实施例中，介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中的溶剂为乙醇。
该系列实施例中，反应后过滤，滤渣采用乙醇洗涤后干燥。
该实施方式的一种或多种实施例中，负载肿瘤药物的温度为室温。本公开所述的室温是指室内环境温度，一般为15～30℃。
该实施方式的一种或多种实施例中，将负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子加入至含有AS1411适配体的溶液中，在人体温度下进行反应。所述人体温度一般为36.2～37.2℃。
该系列实施例中，反应时间为0.5～1.5h。
该实施方式的一种或多种实施例中，负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子与AS1411适配体的加入比例为0.5～1.5：5×10-10，mg：mol。
该实施方式的一种或多种实施例中，介孔二氧化硅纳米粒子的粒径为170～190nm。
本公开的第三种实施方式，提供了一种上述基于靶向核仁素的双重载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述抗肿瘤为抗宫颈癌。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
仪器与试剂
PMA、DOX购买于美国Sigma公司。细胞毒性试剂盒(CCK-8)购买于DOJINDO化学研究所。Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒购买于联科生物公司，Annexin-EGFP/PI凋亡检测试剂盒购买于上海Yeasen生物科技有限公司。本实验采用超纯水(18.25MΩcm，24℃)，其他试剂均为分析纯。CCK-8测定在酶标仪(EP0CH2)上进行。细胞凋亡图像在激光共聚焦显微镜(Nikon，C2plus)和流式细胞仪(cytoFLEX，A00-1-1102)上进行。DNA购买于上海生工生物工程股份有限公司，序列如下：
Figure BDA0002189838850000051
介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)的合成：
将CTABr(正十六烷基三甲基溴化铵)(0.052g)溶解在25mL超纯水中。后向溶液中加入1mL NaOH溶液(0.36M)，并将混合物加热至95℃。在连续搅拌下，逐滴加入2.0mL TEOS(正硅酸乙酯)，将反应混合物在95℃下搅拌3小时。过滤混合物，并用超纯水和乙醇离心。最后，将白色沉淀物在60℃下干燥，并在550℃下煅烧5小时，得到MSN。
实施例1
将1.0000g介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)悬浮在100mL无水乙醇中，并加入过量的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES 1mL)。将混合物在36℃下连续搅拌6小时，过滤，用乙醇洗涤，在60℃下干燥，得到APTES-MSN。将1.0000g APTES-MSN粉末分散至1mL超纯水中获得悬浮液。然后在100μL悬浮液中加入PMA(0.05mL，5μg mL-1)和DOX(0.05mL，0.25mg mL-1)并在室温下搅拌过夜，用超纯水离心，真空干燥，得到白色粉末。将1mg白色粉末分散在1mL PBS(1mg mL-1)中并与AS1411适配体(50μL，10μM)混合，在37℃下反应1小时。然后，离心混合物，获得AS1411适配体包裹的MSN@PMA@DOX双重载药系统，用超纯水离心两次并重悬于PBS中。最后，将获得的MSN@PMA@DOX双重载药系统在4℃避光存储。
以同样的方法步骤分别合成MSN@PMA和MSN@DOX单载药系统，在4℃避光存储。
本公开的原理如图1所示，首先在介孔二氧化硅中填充抗癌药物PMA和DOX，后用AS1411适配体封装，得到MSN@PMA@DOX双重载药系统。将双重载药系统与HeLa细胞孵育，双重载药系统的AS1411适配体与HeLa细胞的核仁素靶向结合，从介孔硅表面脱落从而双重载药系统释放出PMA和DOX，抗癌药物在HeLa细胞核周围大量聚集，进而导致细胞凋亡。
对获得的MSN@PMA@DOX双重载药系统进行实验如下：
细胞毒性实验：
为了评估MSN@PMA@DOX双重载药系统对细胞的毒性，采用CCK-8测定法。在96孔板的孔中，将HeLa肿瘤细胞(10μL，2.0×106个细胞mL-1)与90μL培养基一起孵育。为了显示MSN@PMA@DOX双重载药系统的生物相容性，我们设置了对照实验。实验组为HeLa肿瘤细胞与6μL MSN@PMA@DOX双重载药系统分别孵育2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时和24小时。对照组是HeLa细胞与6μL MSN和LO-2细胞与6μL MSN@PMA@DOX双重载药系统在相同时间梯度下孵育。然后，在每个孔中加入10μL CCK-8(5mg mL-1)并在37℃细胞培养箱中孵育1小时。最后，使用酶标仪测量每个孔在450nm处的吸光度。根据下式：细胞活力(％)＝[(Atest-Ablank)/(Acontrol-Ablank)]×100％。计算细胞的存活率。
流式细胞试验：
将HeLa肿瘤细胞或LO-2细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统一起孵育24小时后，通过膜联蛋白Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒测定细胞凋亡率，按照的说明书进行流式细胞试验。简而言之，孵育后收集2×105个细胞，在黑暗中用2μL Annexin-FITC染色5分钟，用5μLPI染色10分钟，然后通过流式细胞仪分析。Annexin-FITC和PI均不能染色活细胞。早期凋亡的细胞对PI是阴性但对Annexin-FITC是阳性的，而晚期凋亡细胞对PI和Annexin-FITC都呈阳性。
激光共聚焦显微镜图像：
将HeLa肿瘤细胞或LO-2细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统一起孵育24小时后，通过凋亡试剂盒Annexin-EGFP/PI测定细胞凋亡率，并通过激光共聚焦显微镜成像分析。简言之，孵育1×104个细胞，在黑暗中用0.5μL Annexin-EGFP染色5分钟，用0.5μL PI染色10分钟，然后通过共聚焦显微镜分析。活细胞均不能被Annexin-EGFP和PI染色。早期凋亡的细胞对PI是阴性但对Annexin-EGFP是阳性的，晚期凋亡细胞对PI和Annexin-EGFP都染色。
其中，细胞培养如下：
将HeLa肿瘤细胞和LO-2细胞在含有1％链霉素和青霉素，10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，5％CO2和95％空气，湿润的，37℃恒温箱中孵育。通过胰蛋白酶(0.1％，m/v)消化指数生长期的细胞1分钟，然后从细胞培养基中分离。用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mM，pH 7.4)以800rpm离心3分钟洗涤三次，收集细胞。然后将细胞重新悬浮在10mL DMEM中。
表征结果：
MSN与MSN@PMA@DOX双重载药系统的透射电镜如图2所示，图2A中，MSN尺寸均匀，平均直径约为180nm，孔径明亮，结构呈中空多孔状。而图2B中，MSN的孔变暗，说明MSN@PMA@DOX双重载药系统成功合成。
采用CCK-8测定法评估MSN@PMA@DOX双重载药系统对细胞的生物相容性。将细胞与双重载药系统在设定的时间梯度下孵育，后与CCK-8试剂作用并在酶标仪中测量每个孔在450nm处的吸光度。根据下式：细胞活力(％)＝[(Atest-Ablank)/(Acontrol-Ablank)]×100％，获得细胞存活率。从图3中可以看出，HeLa细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统作用后，随着时间的不断增加，细胞的存活率不断减小，作用24小时后，细胞的存活率仅为46％。HeLa细胞与MSN双重载药系统孵育后存活率超过90％，LO-2细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统孵育后存活率超过90％。实验结果表明，MSN对LO-2细胞和HeLa细胞均无生物毒性，是一种优良的药物载体。LO-2细胞中作为普通体细胞不存在核仁素，因此MSN@PMA@DOX双重载药系统对LO-2细胞无毒性。但是，由于HeLa细胞中的核仁素可以与双重载药系统的AS1411适配体靶向结合，释放双重载药系统中的PMA和DOX，所以该双重载药系统可靶向并高效的杀死HeLa细胞。
HeLa肿瘤细胞的凋亡通过流式细胞仪定量表达。将细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统一起孵育24小时，并用Annexin-FITC/PI试剂盒进行染色。图4A是用MSN@PMA@DOX双重载药系统孵育的LO-2细胞，显示2.50％的LO-2细胞处于凋亡阶段。图4B是用MSN@PMA@DOX双重载药系统孵育的HeLa肿瘤细胞，显示12.35％的HeLa肿瘤细胞处于凋亡阶段，图4C是用MSN@DOX单载药系统孵育的HeLa肿瘤细胞，显示3.45％的HeLa肿瘤细胞处于凋亡阶段，图4D是用MSN@PMA单载药系统孵育的HeLa肿瘤细胞，显示2.23％的HeLa肿瘤细胞处于凋亡阶段，通过流式细胞实验表明，MSN@PMA@DOX双重载药系统可以靶向并有效的杀死肿瘤细胞而对普通体细胞无损伤作用，且对肿瘤细胞的治疗效果明显高于单载药系统。
细胞激光共聚焦实验进一步研究了MSN@PMA@DOX双重载药系统诱导HeLa肿瘤细胞凋亡的过程。将细胞与MSN@PMA@DOX双重载药系统一起孵育24小时，并用Annexin-EGFP/PI试剂盒进行染色。图5是LO-2细胞与双重载药系统孵育24小时之后的激光共聚焦图像，其中图5A是LO-2细胞的明场图像；图5B是LO-2细胞的细胞质单色图，没有染色现象；图5C是LO-2细胞的细胞核单色图，无染色现象；图5D是LO-2细胞的叠加图。结果表明MSN@PMA@DOX双重载药系统对LO-2细胞无损伤作用。原因是LO-2细胞中无核仁素，双重载药系统在细胞中无法释放药物，因此对细胞无损伤。图6是HeLa肿瘤细胞与双重载药系统孵育24小时之后的激光共聚焦图像，其中图6A是HeLa肿瘤细胞的明场图像；图6B是HeLa肿瘤细胞的细胞质单色图，细胞质为绿色的细胞为早期凋亡细胞；图6C是HeLa肿瘤细胞的细胞核单色图，细胞核呈红色的细胞为晚期凋亡细胞；图6D是HeLa肿瘤细胞的叠加图，早期凋亡的HeLa肿瘤细胞对Annexin-EGFP染色，晚期凋亡的HeLa肿瘤细胞对Annexin-EGFP和PI双染色。原因是HeLa细胞中的核仁素靶向结合双重载药系统的AS1411适配体，双重载药系统释放出PMA和DOX，导致细胞凋亡。结果表明MSN@PMA@DOX双重载药系统可靶向治疗HeLa肿瘤细胞，而对普通体细胞无损害。
结论：
本公开以MSN作为药物载体，利用AS1411适配体可以靶向肿瘤细胞的标志物核仁素，结合PMA和DOX的联合治疗，构建了针对肿瘤靶向治疗的MSN@PMA@DOX双重载药系统。实验结果表明，该双重载药系统对HeLa肿瘤细胞核仁素有高效的靶向作用，并且本公开具有实验操作简便、靶向精确、治疗效果高效等优点。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggggttgg tggtggtggt tgtggtggtg gtgg 34

Claims (10)

1.一种基于靶向核仁素的双重载药系统，其特征是，为纳米颗粒状结构，包括介孔二氧化硅纳米粒子、肿瘤药物和AS1411适配体，所述肿瘤药物负载在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔内，所述AS1411适配体封装在介孔二氧化硅纳米粒子表面；
肿瘤药物为阿霉素和佛波酯；
纳米颗粒状结构的粒径为170~190nm；
所述AS1411序列5`-3`为GGG GGG TTG GTG GTGGTG GTT GTG GTGGTGGTG G。
2.一种权利要求1所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，采用氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子进行改性，向改性后介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中添加肿瘤药物，肿瘤药物扩散至改性后介孔二氧化硅纳米粒子的介孔中，使介孔二氧化硅纳米粒子负载肿瘤药物，将负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子加入至含有AS1411适配体的溶液中，使AS1411适配体附着在改性后介孔二氧化硅纳米粒子的表面。
3.如权利要求2所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，介孔二氧化硅纳米粒子改性的方法为：向介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中添加氨丙基三乙氧基硅烷，加热至35~40℃反应。
4.如权利要求3所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，反应时间为5~7h。
5.如权利要求3所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中的溶剂为乙醇。
6.如权利要求2所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，负载肿瘤药物的温度为室温。
7.如权利要求2所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，将负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子加入至含有AS1411适配体的溶液中，在人体温度下进行反应。
8.如权利要求7所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，反应时间为0.5~1.5h。
9.如权利要求2所述的基于靶向核仁素的双重载药系统的制备方法，其特征是，负载肿瘤药物的改性后介孔二氧化硅纳米粒子与AS1411适配体的加入比例为 0.5~1.5 mg：5×10-10 mol。
10.一种权利要求 1所述的基于靶向核仁素的双重载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
CN201910828342.5A 2019-09-03 2019-09-03 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用 Active CN110478497B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910828342.5A CN110478497B (zh) 2019-09-03 2019-09-03 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用
PCT/CN2019/111776 WO2021042451A1 (zh) 2019-09-03 2019-10-17 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910828342.5A CN110478497B (zh) 2019-09-03 2019-09-03 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110478497A CN110478497A (zh) 2019-11-22
CN110478497B true CN110478497B (zh) 2020-07-10

Family

ID=68556266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910828342.5A Active CN110478497B (zh) 2019-09-03 2019-09-03 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110478497B (zh)
WO (1) WO2021042451A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111068066A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 福州大学 一种生物纳米材料及其应用与制备
CN111789961B (zh) * 2020-08-26 2022-03-29 西南大学 一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用
CN113018453B (zh) * 2021-03-19 2023-04-14 河南省人民医院 一种靶向药物共递送纳米系统及其制备方法和应用
CN113082226B (zh) * 2021-04-27 2023-12-15 山东中医药大学 一种载药纳米笼的制备方法与其靶向循环肿瘤细胞释放雷公藤甲素的应用
CN113769107A (zh) * 2021-09-16 2021-12-10 泉州师范学院 一种双靶向dna纳米载药复合体的制备方法及其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7459145B2 (en) * 2002-10-25 2008-12-02 Georgia Tech Research Corporation Multifunctional magnetic nanoparticle probes for intracellular molecular imaging and monitoring
TWI383808B (zh) * 2009-11-23 2013-02-01 Nat Univ Tsing Hua 磷脂質包覆中孔洞二氧化矽奈米球的合成與其生醫應用
CN109045304B (zh) * 2018-04-13 2022-04-05 中山大学 一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备方法和应用
CN109044993A (zh) * 2018-09-18 2018-12-21 华南理工大学 一种以核酸适配体靶向聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021042451A1 (zh) 2021-03-11
CN110478497A (zh) 2019-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110478497B (zh) 一种基于靶向核仁素的双重载药系统及制备方法与应用
Zhang et al. Cell-free 3D scaffold with two-stage delivery of miRNA-26a to regenerate critical-sized bone defects
Narayanan et al. Hijacking the cellular mail: exosome mediated differentiation of mesenchymal stem cells
Feng et al. Delivery of therapeutic miRNAs using nanoscale zeolitic imidazolate framework for accelerating vascularized bone regeneration
Martucci et al. Nanoparticle-based strategy for personalized B-cell lymphoma therapy
CN112353950B (zh) 一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用
Liu et al. Graphitic carbon nitride nanosheets as a multifunctional nanoplatform for photochemical internalization-enhanced photodynamic therapy
CN105087596B (zh) 一种cd20核酸适配体及其应用
Chen et al. EDTA-modified 17β-estradiol-laden upconversion nanocomposite for bone-targeted hormone replacement therapy for osteoporosis
Yang et al. The development of laminin-alginate microspheres encapsulated with Ginsenoside Rg1 and ADSCs for breast reconstruction after lumpectomy
Xu et al. Bone formation promoted by bone morphogenetic protein-2 plasmid-loaded porous silica nanoparticles with the involvement of autophagy
Patrício et al. Bio-inspired polymeric iron-doped hydroxyapatite microspheres as a tunable carrier of rhBMP-2
Liang et al. Siglec15 checkpoint blockade for simultaneous immunochemotherapy and osteolysis inhibition in lung adenocarcinoma spinal metastasis via a hollow nanoplatform
Lee et al. 3D printed micro-chambers carrying stem cell spheroids and pro-proliferative growth factors for bone tissue regeneration
Lai et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes loaded with miR-26a through the novel immunomodulatory peptide DP7-C can promote osteogenesis
Delint et al. An artificial membrane binding protein-polymer surfactant nanocomplex facilitates stem cell adhesion to the cartilage extracellular matrix
Shou et al. 3WJ RNA Nanoparticles-Aptamer Functionalized Exosomes From M2 Macrophages Target BMSCs to Promote the Healing of Bone Fractures
Deng et al. Exchangeability of FITC-SiO2 nanoparticles between cancer cells increases the range of drug delivery
US20230324326A1 (en) Nano-ligand for promoting cell adhesion and differentiation of stem cells and method of promoting cell adhesion and differentiation of stem cells by using the same
WO2014060443A2 (en) A composite scaffold for use as a tissue engineering implant
Zhao et al. Genetic engineered ultrasound-triggered injectable hydrogels for promoting bone reconstruction
CN108451907A (zh) 多功能聚合物囊泡在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用
Jamal et al. Growth and differentiation of dental stem cells of apical papilla on polycaprolactone scaffolds
CN114225044A (zh) 一种修饰细胞外囊泡的试剂及制备方法
CN113058028A (zh) 一种复合纳米药物的制备及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant