CN114533890A - 一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法及产品，属于医药技术领域。所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，包括以下步骤：(1)将mPEG‑NH2溶解，加入BLG‑NCA和Phe‑NCA，反应完成后加入乙醚，过滤，得到mPEG‑b‑P(LP‑co‑BLG)；(2)将步骤(1)所得mPEG‑b‑P(LP‑co‑BLG)溶解，加入HBr/乙酸溶液，反应完成后加入乙醚，过滤，沉淀经透析后得到(mPEG‑b‑P(LP‑co‑LG))；(3)将步骤(2)所得mPEG‑b‑P(LP‑co‑LG)与叶酸溶解后加入三乙胺，反应完成后，再与索拉非尼溶液混合，搅拌，透析，得到索拉非尼肝癌靶向胶束。

Description

一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法及产品
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法及产品。
背景技术
癌症己严重危害人类的健康，成为人类杀手之一，居常见死亡原因的首位。原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡均较高，据统计每年全球肝癌发病率位居恶性瘤发病率的第5位，死亡率位居第3位，发病率及死亡率均较高，其进展迅速、生存质量差，是迄今全部肿瘤中治疗效果较差的恶性肿瘤之一，而且大部分确诊已属晚期，手术切除率低，对全身化疗及放疗均不敏感，且全身化疗存在靶向性差、疗效不佳、毒副作用大等缺点。
索拉非尼(SOR)是经FDA批准的第一个分子靶向药物，己被广泛用作一线癌症治疗，它是目前唯一能够改善晚期肝细胞肝癌(HCC)中位生存期的药物。SOR可作为多种酪氨酸蛋白激酶(包括Raf家族)的抑制剂；因此，它可以通过下调下游磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)水平来阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK途径，从而阻止肿瘤增殖。MAPK途径与包括肿瘤细胞生长，分化和凋亡等一系列肿瘤进展密切相关。MAPK途径通常能在多种肿瘤中被激活。ERK是MAPK途径的关键组成部分，肿瘤细胞增殖高度依赖于p-ERK的水平。此外，SOR也是细胞周期蛋白(cyclin)D1的拮抗剂，使细胞周期停滞，从而抑制肿瘤细胞增殖。
然而，不良反应仍然是限制SOR应用的主要障碍，并且20-30％的HCC患者由于其不耐受而终止治疗。此外，最近的临床试验结果显示，尽管SOR改善了治疗患者的中位生存期和放射学进展时间，但在中位时间到症状再出现之前没有统计学上的差异。因此，对于研发新的治疗方式以减少治疗相关毒性和改善治疗功效的需求仍然很迫切。
控释缓释剂(controlled-and sustained-release drugs)属于第三代药物剂型，将传统的药物包埋于基质或载体，利用基质的吸附、增粘、支架粘连或膜屏障等作用，提高药物稳定性，降低血浓峰谷现象，延缓药物释放速度，提高药物靶向定位，使药物吸收变慢、作用延长、毒性降低，提高药效和安全度，解决了传统药物尤其是抗肿瘤药物半衰期短、难于长期间维持血药浓度、全身毒副作用大、病人较难耐受等缺点，是目前抗肿瘤药物研究的重要发展趋势，并可为寻找新的治疗方法提供方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法及产品。通过自组装mPEG-b-P(LP-co-LG)胶束共同负载SOR与叶酸，为HCC的治疗提供了新策略。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案之一：提供一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氨基聚乙二醚单甲醚(mPEG-NH2)溶解，加入L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(BLG-NCA)和L-苯丙氨酸苄酯-N-羧酸酐(Phe-NCA)，反应完成后加入乙醚，过滤，得到甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-苯丙氨酸-co-苄基-L-谷氨酸)(mPEG-b-P(LP-co-BLG))；
(2)将步骤(1)所得mPEG-b-P(LP-co-BLG)溶解，加入HBr/乙酸溶液，反应完成后加入乙醚，过滤，沉淀经透析后得到聚乙二醇单甲醚-block-聚(苯丙氨酸-co-L-谷氨酸)(mPEG-b-P(LP-co-LG))；
(3)将步骤(2)所得mPEG-b-P(LP-co-LG)与叶酸溶解后加入三乙胺，反应完成后，再与索拉非尼溶液混合，搅拌，透析，得到索拉非尼肝癌靶向胶束。
本发明先利用Phe-NCA合成了mPEG-NH2及BLG-NCA；然后以mPEG-NH2做为大分子引发剂，引发经苄酯保护的氨基酸单体BLG-NCA和Phe-NCA发生开环聚合反应，形成mPEG-b-P(LP-co-BLG)，最后对mPEG-b-P(LP-co-BLG)进行脱苄酯保护处理，获得两亲性的聚氨基酸共聚物mPEG-b-P(LP-co-LG)，具体过程如图1所示。再以所制得两亲性共聚物接枝叶酸，最后与SOR溶液混合，得到叶酸接枝外壳并包覆SOR的肝癌靶向胶束。
优选的，步骤(1)中所述氨基聚乙二醚单甲醚、所述L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐与所述L-苯丙氨酸苄酯-N-羧酸酐的摩尔比为1:15:5；步骤(1)所述反应的时间为72h。
优选的，步骤(2)中所述甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-苯丙氨酸-co-苄基-L-谷氨酸)与所述HBr/乙酸溶液的质量与体积之比为1g:3ml；步骤(2)中所述HBr/乙酸溶液为质量分数为33％的HBr的乙酸溶液；步骤(2)中所述反应时间为1h。
优选的，步骤(2)和(3)中所述透析的时间为6-8h，透析所用透析袋的截留分子量≥3500。
优选的，步骤(3)中所述聚乙二醇单甲醚-block-聚(苯丙氨酸-co-L-谷氨酸)、所述叶酸与所述索拉非尼的质量比为5:1:1。
优选的，步骤(1)中所述氨基聚乙二醚单甲醚的制备步骤包括：将聚乙二醇单甲醚(mPEG)加热融化，加入反应溶剂、氢氧化钾和甲基磺酰氯，反应完成后过滤，滤液加入乙醚，过滤，沉淀与氯化铵混合，加入氨水，搅拌，反应液加入乙醚，过滤，沉淀干燥，制得氨基聚乙二醚单甲醚。
更优选的，所述聚乙二醇单甲醚、所述氢氧化钾与所述甲基磺酰氯的摩尔比为1:10:50；所述聚乙二醇单甲醚分子量为5000。
优选的，所述L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐的制备步骤包括：将谷氨酸苄酯与三光气溶解后反应，反应完成后加入正己烷，过滤，沉淀脱水，得到L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐；所述谷氨酸苄酯与所述三光气的质量比为10:6。
本发明技术方案之二：提供一种上述制备方法制得的索拉非尼肝癌靶向胶束。
本发明技术方案之三：提供一种上述索拉非尼肝癌靶向胶束在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
本发明的有益技术效果如下：
本发明利用自组装mPEG-b-P(LP-co-LG)胶束共同负载SOR与叶酸。选择mPEG-b-P(LP-co-LG)作为载体，是由于其生物相容性和生物降解性好；mPEG-b-P(LP-co-LG)在水溶液中可自发形成胶束，SOR可在自组装过程中直接被负载；外部PEG链保护胶束免受与血浆蛋白的不良相互作用，并通过阻止网状内皮系统(RES)的清除来延长胶束的血液循环，叶酸则为纳米胶束提供更强的靶向性；mPEG-b-P(LP-co-LG)中的谷氨酸单元提供胶束和负载药物之间的静电相互作用，而苯丙氨酸单元增强胶束内核的疏水作用，以提高胶束的稳定性，还可以促进细胞摄取。
本发明制备的共负载SOR与叶酸的mPEG-b-P(LP-co-LG)纳米胶束的平均粒径为89nm，符合纳米制剂的要求。所制得纳米胶束的药物释放系统能够在循环期间保护负载药物，从而增加肿瘤部位的药物积累并减少潜在的副作用，表现出显著的优势；同时该胶束药物释放系统表现出高稳定性，可控的药物释放，较长的血液循环时间和有利的生物分布，有效地降低了全身毒性，增强了抗肿瘤活性。
附图说明
图1为本发明mPEG-b-P(LP-co-LG)反应流程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
索拉非尼肝癌靶向胶束的制备步骤：
BLG-NCA的合成：
(1)称取110mL四氢呋喃加入彻底进行去水处理的250mL三口烧瓶内，持续通入氮气，使装置处于含氮气的惰性气体环境中，量取干燥的谷氨酸苄酯10g和6g三光气加入到烧瓶内，混匀并磁力搅拌，在50℃油浴中加热至上述溶液完全澄清，快速通入氮气，排出烧瓶内多余的三光气；
(2)将三口烧瓶中的溶液缓慢移入提前冷却处理的0.75L正己烷内，混匀并充分搅拌，观察到白色沉淀形成后，用抽滤的办法除去上层液体，用提前冷却的乙酸乙酯溶解该白色沉淀，之后经分液漏斗用冷的去离子水洗涤3次，去除杂质，最后把乙酸乙酯层转入锥形瓶中，加入无水硫酸镁后-20℃冷冻保存；
(3)将经去水处理的乙酸乙酯层溶液转移入安瓶中，用真空泵接冷肼抽干乙酸乙酯，得到含少量杂质的BLG-NCA；
(4)40℃加热四氢呋喃重新溶解BLG-NCA，之后加入相同质量的正己烷，温度加热至60℃，使固体完全溶解，后将安瓶转移入-2℃冰箱，使BLG-NCA重结晶，最后将用真空泵接冷肼抽干上清液，获取白色固体BLG-NCA，4℃冷藏保存。
氨基聚乙二醚单甲醚(mPEG-NH2)的合成：
(1)在干燥的安瓶中加入60g分子量为5000的mPEG，温度加热至120℃，使其融化后置于室温下降温，然后加入二氯甲烷200mL，KOH6.74g，11.50g甲基磺酰氯，使mPEG、KOH和甲基磺酰氯的摩尔比为1:10:50，混匀并充分磁力搅拌，反应持续7天；
(2)用2℃的氯化钠饱和溶液洗涤上述反应液6次后，将所得液体转移入锥形瓶，加无水硫酸镁常温干燥1天。
(3)滤液抽滤，加入无水乙醚得到黄色固体沉淀，称装并在干燥器中干燥；
(4)量取等质量的氯化铵，并与干燥产物一起加入30倍体积的25wt.％氨水中，混匀并磁力搅拌，常温反应7天；
(5)反应液中加入二氯甲烷并充分混合震荡，静置，至二氯甲烷层澄清，经分液漏斗获取二氯甲烷溶液，并用饱和的氯化钠溶液洗涤4遍，加无水硫酸镁干燥过夜，滤液抽滤，加无水乙醚沉降并干燥，获取黄色产物mPEG-NH2。
mPEG-b-P(LP-co-BLG)的合成：
首先将mPEG-NH2(5.0g，1.0mmol)加入安瓶(250.0mL)中，然后与甲苯共沸脱水，将脱水的mPEG-NH2溶解在无水DMF中，并将BLG-NCA(3.949g，15.0mmol)和Phe-NCA(0.955g，5.0mmol)加入上述溶液中，混匀搅拌3天后，将混合物沉淀到过量的冷乙醚中三次，真空干燥后，得到最终产物mPEG-b-P(LP-co-BLG)。
mPEG-b-P(LP-co-LG)的合成：
称取5g mPEG-b-P(LP-co-BLG)置于安瓶中，加入50.0mL二氯乙酸中使其溶解，并将15.0mL HBr/乙酸溶液(33wt.％)加入到上述溶液中，磁力搅拌1小时后，用过量冰无水乙醚沉淀混合物，如此重复三遍以提纯产物，然后将固体产物干燥处理，干燥产物加DMF溶解后转移入纤维素透析袋(MWCO:3500)中，透析处理8h后，冷冻干燥处理，得到mPEG-b-P(LP-co-LG)；
索拉非尼肝癌靶向胶束的制备：
(1)称取50mg mPEG-b-P(LP-co-LG)及10mg叶酸溶于7mL DMSO溶液中，加入三乙胺0.5mL，室温下反应24h，再与溶有10mg索拉非尼的1mL超纯水混合，磁力搅拌24h；
(2)将上述混合液转移入纤维素透析袋(MWCO:3500)，超纯水中透析8h，每2h换水1次；
(3)过滤透析袋内液体，并冻干处理，制得索拉非尼肝癌靶向胶束。
利用激光粒度分析仪测定实施例1所制得索拉非尼肝癌靶向胶束的粒径，测定结果显示其平均粒径为89nm。
对比例1
索拉非尼肝癌靶向胶束的制备步骤：
mPEG-b-P(LP-co-LG)的制备步骤同实施例1；
索拉非尼肝癌靶向胶束的制备：
(1)称取50mg mPEG-b-P(LP-co-LG)溶于7mL DMSO溶液中，再与溶有10mg索拉非尼的1mL超纯水混合，磁力搅拌24h；
(2)将上述混合液转移入纤维素透析袋(MWCO:3500)，超纯水中透析8h，每2h换水1次；
(3)过滤透析袋内液体，并冻干处理，制得索拉非尼肝癌靶向胶束。
利用激光粒度分析仪测定对比例1所制得索拉非尼肝癌靶向胶束的粒径，测定结果显示其平均粒径为83nm。
试验例1
测定实施例1制备的mPEG-b-P(LP-co-LG)、索拉非尼肝癌靶向胶束和对比例1制备的索拉非尼肝癌靶向胶束对HepG2细胞的抑制作用：
取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度为4×104个/mL，接种于96孔板。各孔分别加入100μL细胞悬液，常规培养20h(至细胞贴壁)，小心吸弃培养基。分别加入200μL含有浓度分别为10、1.0、0.1、0.01μg/mL的mPEG-b-P(LP-co-LG)培养基溶液；200μL含有浓度分别为10、1.0、0.1、0.01μg/mL的实施例1索拉非尼肝癌靶向胶束溶液；200μL含有浓度分别为10、1.0、0.1、0.01μg/mL的对比例1索拉非尼肝癌靶向胶束溶液；以仅加入200μL培养基为阴性对照组。
再利用CCK-8法检测细胞活性：取上述各组每一个处理孔设3个复孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养72h后取出各板。小心吸弃培养基，每孔再加入新鲜的含10％CCK-8溶液的培养基，培养2h，酶标仪在450nm处测定吸光度(OD值)，并计算药物对细胞增殖的抑制率，计算公式如下，计算结果见表1。
细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组OD值/阴性对照组OD值)×100％。
表1各组药物对HepG2细胞的增殖抑制率(％)(n＝3)
浓度(μg/mL) 10 1 0.1 0.01
mPEG-b-P(LP-co-LG) 95.2 93.6 92.5 93.2
实施例1 82.6 73.6 62.3 51.5
对比例1 75.6 63.1 48.9 36.3
从表1中可以看出，mPEG-b-P(LP-co-LG)对HepG2细胞的毒性可以忽略，与仅负载SOR的纳米胶束相比，共负载SOR与叶酸的纳米胶束具有更强的肝癌细胞增殖抑制率。
试验例2
对比在pH6.8的磷酸盐缓冲溶液中，实施例1与对比例1制备的索拉非尼肝癌靶向胶束中SOR的释放情况：
于1000mLpH6.8的磷酸盐缓冲溶液(37℃恒温)中分别加入实施例1与对比例1制备的索拉非尼肝癌靶向胶束20mg，设置三组平行实验，6组样品分别于3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h进行取样，利用HPLC测定各组样品的SOR释放率，并计算平均值，结果见表2。
表2实施例1与对比例1制得产品中SOR平均释放率(％)(n＝3)
溶出时间 3h 6h 9h 12h 24h 36h 48h 72h
实施例1 37.6 50.7 60.3 66.1 71.6 75.3 78.2 81.2
对比例1 35.2 46.7 57.4 55.9 61.3 64.3 68.0 71.3
从表2中可以看出，利用本发明制备的mPEG-b-P(LP-co-LG)负载药物后制成的纳米胶束具备缓释功能；另外，与单纯负载SOR的纳米胶束相比，同时负载SOR与叶酸的纳米胶束释放效率更低，稳定性相对较强。
试验例3
利用HepG2细胞皮下注射12周龄的雄性BALB/c小鼠(注射量为1×106个，0.1mL)建设皮下肝癌模型，选取24只肿瘤大小增长至约200mm3的小鼠，分为4组，每隔2d分别注射mPEG-b-P(LP-co-LG)(对照组)，实施例1制备的索拉非尼肝癌靶向胶束(实施例1组)，对比例1制备的索拉非尼肝癌靶向胶束(对比例1组)，与生理盐水(空白组)，实施例1与对比例1组中小鼠每次SOR的注射剂量为10mg/kg；对照组每次注射mPEG-b-P(LP-co-LG)的量与实施例1相同；空白组生理盐水的注射体积与对照组相同。共注射5次，15d后处死各组小鼠，去除肿瘤组织进行称重，并计算平均值，计算结果见表3。
表3各组小鼠肿瘤平均重量(n＝6)
对照组 实施例1组 对比例1组 空白组
肿瘤重量(g) 1.50 0.53 0.96 1.52
从表3中可以看出，mPEG-b-P(LP-co-LG)对肝癌并无治疗作用，负载SOR后具备治疗肝癌的作用；共负载SOR和叶酸的纳米胶束相较于仅负载SOR的纳米胶束，治疗效果提升十分显著，原因可能是，一方面共负载SOR和叶酸的纳米胶束的SOR释放效率更低，需要浓度更加稳定，另一方面共负载SOR和叶酸的纳米胶束外壳经叶酸修饰后，对肝癌肿瘤细胞具有更强的靶向性，因而治疗效果的提升十分明显。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨基聚乙二醚单甲醚溶解，加入L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸苄酯-N-羧酸酐，反应完成后加入乙醚，过滤，得到甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-苯丙氨酸-co-苄基-L-谷氨酸)；
(2)将步骤(1)所得甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-苯丙氨酸-co-苄基-L-谷氨酸)溶解，加入HBr/乙酸溶液，反应完成后加入乙醚，过滤，沉淀经透析后得到聚乙二醇单甲醚-block-聚(苯丙氨酸-co-L-谷氨酸)；
(3)将步骤(2)所得聚乙二醇单甲醚-block-聚(苯丙氨酸-co-L-谷氨酸)与叶酸溶解后加入三乙胺，反应完成后，再与索拉非尼溶液混合，搅拌，透析，得到索拉非尼肝癌靶向胶束。
2.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述氨基聚乙二醚单甲醚、所述L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐与所述L-苯丙氨酸苄酯-N-羧酸酐的摩尔比为1:15:5；步骤(1)所述反应的时间为72h。
3.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-苯丙氨酸-co-苄基-L-谷氨酸)与所述HBr/乙酸溶液的质量与体积之比为1g:3ml；步骤(2)中所述HBr/乙酸溶液为质量分数为33％的HBr的乙酸溶液；步骤(2)中所述反应时间为1h。
4.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所述透析的时间为6-8h，透析所用透析袋的截留分子量≥3500。
5.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述聚乙二醇单甲醚-block-聚(苯丙氨酸-co-L- 谷氨酸)、所述叶酸与所述索拉非尼的质量比为5:1:1。
6.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述氨基聚乙二醚单甲醚的制备步骤包括：将聚乙二醇单甲醚加热融化，加入反应溶剂、氢氧化钾和甲基磺酰氯，反应完成后过滤，滤液加入乙醚，过滤，沉淀与氯化铵混合，加入氨水，搅拌，反应液加入乙醚，过滤，沉淀干燥，制得氨基聚乙二醚单甲醚。
7.根据权利要求6所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇单甲醚、所述氢氧化钾与所述甲基磺酰氯的摩尔比为1:10:50；所述聚乙二醇单甲醚分子量为5000。
8.根据权利要求1所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法，其特征在于，所述L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐的制备步骤包括：将谷氨酸苄酯与三光气溶解后反应，反应完成后加入正己烷，过滤，沉淀脱水，得到L-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐；所述谷氨酸苄酯与所述三光气的质量比为10:6。
9.根据权利要求1～8任一项所述索拉非尼肝癌靶向胶束的制备方法制得的索拉非尼肝癌靶向胶束。
10.权利要求9所述索拉非尼肝癌靶向胶束在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
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