CN103301072A

CN103301072A - 一种索拉非尼纳米微粒的制备方法

Info

Publication number: CN103301072A
Application number: CN2013102185084A
Authority: CN
Inventors: 秦建民; 盛霞; 殷佩浩; 李琦; 黄涛; 撒忠秋; 杨林; 张敏
Original assignee: Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Current assignee: Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-04
Also published as: CN103301072B

Abstract

本发明公开了一种索拉非尼纳米微粒的制备方法，其包含：步骤1，将聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物和索拉非尼溶解于四氢呋喃和甲醇中，搅拌形成澄清溶液；步骤2，除去有机溶剂，离心除去聚集体，制得索拉非尼纳米微粒；该索拉非尼纳米微粒是以索拉非尼为活性成分，以聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料形成的靶向纳米药物。本发明提供的方法，包封率高，成球性好，可用于制备抗肿瘤靶向药物，聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物能够增加索拉非尼在肝癌细胞聚集，提高局部药物浓度，使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，降低毒副反应；具有肿瘤精确靶向性、抗肿瘤效应好和缓控释药物的作用。

Description

一种索拉非尼纳米微粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种索拉非尼纳米微粒的制备方法，具体地，涉及一种肝癌特异性靶向治疗药物—聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒。

背景技术

索拉非尼（Sorafenib）是丝、苏氨酸蛋白激酶（RAF）和酪氨酸激酶抑制剂，分子式：C28H24ClF3N4O6S，分子量：637.0266，其化学结构如下：

Figure 2013102185084100002DEST_PATH_IMAGE001

该索拉非尼是一种弱碱性合成制剂，水溶性差，作为一种新型多靶点抗肿瘤药物，具有双重抗肿瘤效应，不仅通过抑制RAF激酶/有丝分裂原细胞外激酶 /细胞外调节蛋白激酶（RAF／MEK／ERK）信号传导通路，直接抑制肿瘤生长，而且通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板衍生生长因子受体（PDGFR）而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。孙广涛等研究发现索拉菲尼可通过抑制肝癌细胞系（HepG2）自噬的产生，导致自噬抑制后细胞增殖受到明显抑制且凋亡明显增加，从而抑制肝癌细胞自噬作用，证实了索拉非尼在一定程度上抑制肝癌细胞生长。李卿等采用树突状细胞（DC）和细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）共培养联合索拉非尼体内外作用于肝癌细胞BEL-7402，结果发现对肝癌细胞的杀伤率及诱导凋亡率均明显高于各单独治疗组，联合组杀伤率高达(75.24±1.91)％，是DC-CIK组的1.8倍，是索拉菲尼单药组的2.1倍；联合组诱导肝癌细胞凋亡率达(78.32±2.54)％，与单独治疗组相比差异有统计学意义；明显抑制裸鼠BEL-7402移植瘤的生长，抑制率为(83.37±0.16)％，与单独治疗组相比差异有显著。DC-CIK共培养细胞联合索拉菲尼在体内、外可显著抑制肝癌细胞的生长，索拉非尼联合细胞免疫治疗可能成为新的肝癌综合治疗有发展前景的治疗方法。

已有技术研究：（1）制备索拉非尼固体脂质纳米微粒，与索拉非尼溶液对比，用新西兰大白兔进行药代动力学研究发现，索拉非尼固体脂质纳米微粒清除速率比索拉非尼慢0.14倍，明显延长索拉非尼在血液中滞留时间；（2）采用纳米沉淀透析法研制葡聚糖-聚乳酸聚乙醇酸嵌段共聚物索拉菲尼纳米微粒，体外研究发现具有较好的缓释作用，显著抑制人胆管癌细胞生长；（3）采用高压匀化技术研制紫杉醇-索拉菲尼白蛋白纳米微粒，体外缓释性好，体内静脉应用于荷人乳腺癌细胞裸鼠，显著抑制肿瘤生长，溶血、骨髓抑制等副作用显著低于紫杉醇和索拉菲尼单体药物；（4）采用容积置换法和超声乳化法分别研制丙烯酸酯共聚物索拉菲尼纳米胶剂和基质，与索拉菲尼片剂相比，兔灌胃应用后体内研究发现索拉菲尼纳米胶剂生物相容性最好，是一种具有潜在应用前景的纳米药物。

我们近期研究发现索拉非尼与索拉非尼-聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒显著抑制H22肝癌细胞生长，与索拉非尼相比，同一浓度索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞H22生长抑制作用增强，抑制率差异具有统计学意义（F=74.988，P<0.05），且随索拉非尼浓度增加，抑制作用显著增强。体内药物代谢动力学研究发现，索拉非尼半衰期为（t_1/2）8.22±2.35（h），索拉非尼纳米微粒半衰期为（t_1/2）12.92±0.57（h），差异具有统计学意义（P<0.05）。体内应用后，索拉非尼纳米微粒对肝肾功能（ALT、AST、ALB、ALP、BUN和Cr）影响差异无统计学意义（P>0.05）。索拉非尼纳米微粒显著降低荷肝癌小鼠外周血AFP表达（0.178 ±0.0163 pg/ml vs0.675 ±0.1773pg/ml,P<0.05）。索拉非尼纳米微粒静脉应用后，主要分布于肝脏和肿瘤组织，尤以肿瘤组织药物聚集为主，通过抑制肝癌细胞增殖和肿瘤微血管新生，发挥抗肝癌作用，为索拉非尼用于靶向治疗肝细胞癌的深入研究奠定了理论基础。

但索拉非尼由于阻断RAF-MEK-ERK通路信号传递，直接抑制VEGFR-2,3和PDGFR-β，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，对机体其它细胞存在影响，临床应用过程中存在药物治疗相关不良事件，总体发生率为80％，程度主要为1或2级，主要为胃肠道、全身性或皮肤病变、腹泻、体重下降、手-足皮肤反应、脱发、食欲减退以及声音改变等。3级药物相关不良事件包括腹泻(8％)、手-足皮肤反应(8％)、高血压(2％)以及腹部疼痛(2％)，未发生4级药物相关不良事件。3级以上药物相关不良反应是肝癌治疗过程中药物减量、停药甚至中途退出治疗的主要原因之一。如何进一步改善索拉非尼的靶向性和肿瘤局部药物聚集、持续发挥抗肿瘤效应，降低全身毒副反应，是提高索拉非尼抗肝癌效应的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供一种在细胞和分子水平双重靶向抗肝脏肿瘤纳米药物—聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒，用于肝脏肿瘤靶向治疗，同时具有肿瘤精确靶向性、抗肿瘤效应好和缓控释药物的作用。

为实现以上目的，本发明提供了一种索拉非尼纳米微粒的制备方法，该方法包含以下具体步骤：

步骤1，将聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物和索拉非尼溶解于四氢呋喃和甲醇混合有机溶剂中，搅拌混合形成澄清透明溶液；

步骤2，除去有机溶剂，离心除去聚集体，制得索拉非尼纳米微粒浓缩液；该索拉非尼纳米微粒是以索拉非尼为活性成分，以聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料形成的靶向纳米药物。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的制备方法为：使得聚乙二醇单甲醚、外消旋丙交酯在催化剂辛酸亚锡作用下反应获得。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的聚乙二醇单甲醚和外消旋丙交酯以重量比例为1:1.1~2的比例共聚形成聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料；所述的聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的通式为mPEG-PDLLA，其分子量的范围为40-45kD。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的索拉非尼纳米微粒中，索拉非尼与聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:15~25。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的索拉非尼纳米微粒中，索拉非尼与聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:20。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的索拉非尼纳米微粒携载索拉非尼含量为5~7%，包封率为92~98%。

上述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其中，所述的索拉非尼纳米微粒携载索拉非尼含量6.5 ±0.2%，包封率为95 ±2.2%。

本发明利用聚乙二醇单甲醚与外消旋丙交酯形成嵌段共聚物，共聚物末端含有水溶性聚合物聚乙二醇单甲醚镶嵌，显著提高体内长循环时间，避免索拉非尼纳米微粒体内释药速度过快，难以在局部达到有效抗癌药物浓度等缺陷。利用纳米粒子具有小尺寸效应，表面效应及很强的吸附性和生物活性，作为药物载体，不仅能够改变药物体内分布特征，提高药物吸收利用度和稳定性，而且改善药物性质和靶向性，使药物体内缓释，药物作用时间延长，减轻或避免药物毒副作用。本发明制备的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒，用于肝细胞癌治疗，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，在细胞和分子水平极大发挥索拉非尼抗肿瘤作用，最大限度地降低索拉非尼的毒副反应。

本发明以索拉非尼为活性成分，以生物降解材料聚乙二醇单甲醚（mPEG）和外消旋丙交酯(DLLA) 作为药物辅料，通过开环聚合技术研制聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物，采用化学沉淀法制备工艺技术，制备索拉非尼-聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒（Sorafenib/mPEG/PLA Nanoparticles， SMPNS）。粒径127.3±2.0 nm，Zeta 电位为-3.35±0.42mV，载药率：6.5±0.2%，包封率：95±3.2%，携载索拉非尼浓度为950μg/ml。体外药物释放结果：索拉非尼24小时累积释放超过50.90%，48小时、72小时、96小时释放率分别为56.24%、60.26%、63.28%。

本发明聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒体内代谢、组织分布与抗肿瘤作用：

大鼠体内索拉非尼与索拉非尼纳米微粒体内代谢的半衰期（t_1/2）分别为8.22±2.35 h、12.92±0.57 h。索拉非尼纳米微粒半衰期明显长于索拉非尼，体内代谢过程初始是一个快速代谢的过程，后期消除缓慢，表现出明显的缓释性，具有二房室代谢特点。而索拉非尼体内呈现一个快速代谢过程。

给药3周后索拉非尼组荷瘤小鼠体内脑、心、肺、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、脾、肝和肿瘤各组织中索拉非尼浓度分别为19.40±2.16 ng/mg、153.67±25.72 ng/mg、292.67±37.00 ng/mg、289.00±11.14 ng/mg、293.67±59.77 ng/mg、281.67±6.43 ng/mg、457.67±37.07 ng/mg、81.37±5.98 ng/mg、214.33±17.21 ng/mg、3030.00±537.03 ng/mg、860.00±152.39 ng/mg，索拉非尼纳米微粒组各组织中索拉非尼浓度分别为7.96±3.85 ng/mg、17.90±1.56 ng/mg、92.20±32.77 ng/mg、61.93±5.41 ng/mg、241.23±71.39 ng/mg、49.97±15.17 ng/mg、37.80±13.85 ng/mg、64.60±14.20 ng/mg、45.47±12.70 ng/mg、728.77±156.39 ng/mg、2751.33±629.60 ng/mg；索拉非尼和索拉非尼纳米微粒在癌旁肝组织中索拉非尼浓度分别为3030.00±537.03 ng/mg、728.77±156.39 ng/mg，肝癌组织中索拉非尼浓度分别为860.00±152.39 ng/mg、2751.33±629.60 ng/mg，索拉非尼纳米微粒组索拉非尼在肝癌组织中的药物浓度高于索拉非尼组，癌旁肝组织中索拉非尼纳米微粒组索拉非尼药物浓度明显低于索拉非尼组，差异具有统计学意义（F=69.47，P<0.05）。

索拉非尼纳米微粒组给药1周（W）、3W时抑瘤率分别为62.17%、78.31%,显著高于索拉非尼组。生理盐水组、索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组荷瘤动物生存期（d）分别为18.20±2.514、24.30±2.830、36.50±2.066，尤以索拉非尼纳米微粒组生存时间最长，与其他实验组相比差异显著（F=9.282，P<0.05）。

本发明聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒，具有以下突出的优点：

1. 制备工艺简便，包封率高，药物释放稳定，成球性好，所制备的靶向纳米药物微粒在理化性质等方面符合肿瘤靶向治疗的需要。

2．利用聚乙二醇单甲醚和聚乳酸的释药性质，以索拉非尼、聚乙二醇单甲醚和聚乳酸嵌段交联为骨架结构制备纳米微粒，避免了单独用聚乙二醇单甲醚释药速度过快，体内滞留时间短，难以在肿瘤局部达到有效抗癌药物浓度等缺陷。

3.成功控制聚乙二醇单甲醚和聚乳酸形成嵌段共聚物与索拉非尼药物混合比例，显著提高了药物包封效率和载药量，不仅能够控制纳米药物在体内释放和降解速度，而且达到精准靶向，提高药物疗效，极大降低了索拉非尼药物毒副反应。

4.靶向纳米药物材料选择生物相容性好、可降解的聚合物聚乳酸作为骨架载体，聚合物末端由含有水溶性聚合物PEG镶嵌，达到体内长循环的控释效果。

附图说明

图1a是聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒透射电镜图，透射电镜×10,000。

图1b是聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒扫描电镜图，扫描电镜×50,000。

图2是聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒粒径分布图（127.3±2.0 nm）。

图3示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒体外药物释放。

图4示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞生长抑制作用。

图5示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒药代动力学。

图6示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒在荷瘤小鼠体内组织分布。

图7示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒对荷瘤动物生存期的影响。

图8a、8b分别示出聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒给药1周及3周对肝癌组织侵袭转移相关因子蛋白表达的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施例详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1 mPEG-PDLLA的制备

首先将聚乙二醇单甲醚（Methoxypolyethylene glycols，简称mPEG ）放入schlenk管中，熔融状态下真空除水；然后将事先精制过的外消旋丙交酯（DLLA）与催化剂辛酸亚锡加入反应管，反复抽真空，通氮气，最后真空封管，放入140℃油浴中反应10 h。反应结束后，用二氯甲烷将产物溶解，然后在冷乙醚中沉淀出来，真空干燥后得到目标产物。其中，聚合物材料（mPEG-PDLLA）是聚乙二醇单甲醚和外消旋丙交酯以重量比例为1：1.1~2的比例（优选1.5：2.5）共聚形成的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物；其通式为mPEG-PDLLA，其分子量的范围为40-45kD，其反应路线如下所示：

其中，m的取值范围为45～46，n的其取值范围为15～16。

实施例2 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒的制备方法

原料配方如下：

四氢呋喃（C₄H₈O ） 12ml

聚合物材料（mPEG-PDLLA） 0.25g

索拉非尼（Sorafenib） 12.5mg

甲醇（CH₃OH） 6ml

制成18ml索拉非尼纳米乳液

将上述混合物搅拌，形成澄清透明的溶液，然后在60℃真空旋蒸，将有机溶剂除尽后，加入60℃ 50 mL蒸馏水，常压旋蒸10分钟，离心10分钟（4000 r/min），取上清液即是所需要的索拉非尼纳米粒溶液，⁶⁰Co辐照灭菌，4℃冰箱保存备用。

索拉非尼纳米微粒检测结果表明，微粒大小均匀，外形圆整，如图1a、图1b所示，粒径127.3±2.0 nm，如图2所示，Zeta 电位为-3.35±0.42mV，载药率：6.78±0.2%，包封率：96.21±2.3%，携载索拉非尼浓度为980μg/ml，符合纳米药物理化特性，可以用于进一步实验研究。

实施例3 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒体外药物释放试验

配制浓度为0.5 wt%的索拉非尼载药纳米粒的磷酸盐缓冲液（PBS）(pH7.4, 0.01M)溶液，然后量取5 ml装入透析袋(截留分子量3500)中，将透析袋放入50 ml容量瓶中，加入35 ml PBS，密封后放入恒温气浴振荡器中进行释放(37℃，75 rpm)。释放开始后2、4、8、16、24、48、72、96、120、144、168h，分别取样20 ml释放液，并补充等量的新鲜PBS溶液。样品在263nm波长下测定UV吸收值，计算释放介质中索拉非尼的浓度和累积释放百分率。

另配制浓度为0.5 wt%的索拉非尼PBS溶液，精密移取该溶液5.0ml，置于截留分子量为3500道尔顿的透析袋中，两端扎紧，平行操作3份，投入到35ml pH7.4的PBS介质中，于37℃，75rpm转速条件下进行体外释放，释放开始后第10、30、60、180、360、480、600、720、1080、1200、1440min分别取样20ml，补液20ml，样品在263nm波长下测定UV吸收值，计算释放介质中索拉非尼的浓度和累积释放百分率，用于考察透析袋对索拉非尼碱释放的阻滞作用。

体外释放结果表明：索拉非尼8小时释放完全，索拉非尼纳米微粒在24h、48h、72h和96h索拉非尼累积释放率分别为50.91%、56.24%、60.26%和63.28%，索拉非尼纳米微粒体外具有良好的缓释性。如图3所示。

实施例4 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞生长抑制作用

依据实验需要分为RPMI-1640培养液组、mPEG-PDLLA嵌段共聚物纳米微粒组、索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组、5-FU组。索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组分别选取6.9、13.8、20.8μmol／L不同索拉非尼浓度，空白纳米微粒对照组用量与对应含索拉非尼的纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量。体外分别作用于H22肝癌细胞48h后，加入CCK8溶液20μl/孔，37℃孵育2h后，酶联免疫分析仪检测每孔的光密度值(OD)。计算细胞增殖抑制率：抑制率(％)=(对照组OD值―实验组OD值)／对照组OD值×100％。结果表明：（1）阴性对照组（RPMI-1640培养液组、mPEG-PDLLA嵌段共聚物纳米微粒组）不同浓度的药物作用48h对H22肝癌细胞生长均无明显抑制作用，差异无统计学意义（P>0.05）。（2）索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞H22生长具有明显抑制作用，且随药物浓度的增加抑制作用呈递增趋势，具有浓度依赖性，如表1所示；索拉非尼用药6.9μmol／L时，索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞H22的生长抑制作用强于索拉非尼（索拉非尼抑制率为31±3.64%；索拉非尼纳米微粒为43.35±2.3% ，F=74.988，P<0.05）。

表1 索拉非尼、索拉非尼纳米微粒对肝癌细胞H22生长抑制率（

±s%，n=3）

Figure 2013102185084100002DEST_PATH_IMAGE007

注：◆ 与同浓度索拉非尼相比，P<0.05；▲ 与6.9μmol／L索拉非尼纳米微粒相比，P<0.05。

实施例5 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒体内药物代谢

选取健康雄性维斯塔尔（Wistar）大鼠6只，以20mg/kg的剂量经尾静脉注入索拉非尼、索拉非尼纳米微粒，注入后5min、15min、30min、45min、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h分别尾静脉取血0.5ml置于抗凝试管中，1500rpm×5min，吸取血浆于冻存管4℃备用。采用3200Q-Trap串联质谱仪测定各时间点血浆中索拉非尼浓度。索拉非尼t_1/2为8.22±2.35 h，索拉非尼纳米微粒t_1/2为12.92±0.57 h，结果表明，相对索拉非尼，索拉非尼纳米微粒显著延长索拉非尼在体内循环时间（见表2，图4）。

表2：索拉非尼、索拉非尼纳米微粒静脉给药后体内药代动力学 (

±s ，n=3)

。

实施例6 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒在荷肝癌小鼠体内组织分布

建立ICR小鼠原位移植肝癌模型，造模后2周，通过鼠尾静脉给药，以20mg/kg的剂量经尾静脉注入索拉非尼、索拉非尼纳米微粒，给药后3周，留取荷瘤裸鼠心、肺、肾、脑、胃、小肠、大肠、肌肉、脾、癌旁肝组织、肝癌组织，按重量体积比1:2加蒸馏水，组织匀浆，取匀浆液100μl，加10μl内标（氯雷他定100ng/ml），加400μl乙腈，涡旋振荡，15000rpm离心3min，取上清液100μl转移至进样管中进样，采用3200Q-Trap串联质谱仪测定索拉非尼纳米微粒在体内组织分布。结果表明给药3周后, 索拉非尼组（S）荷瘤小鼠体内脑、心、肺、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、脾、肝和肿瘤各组织中索拉非尼浓度分别为19.40±2.16 ng/mg、153.67±25.72 ng/mg、292.67±37.00 ng/mg、289.00±11.14 ng/mg、293.67±59.77 ng/mg、281.67±6.43 ng/mg、457.67±37.07 ng/mg、81.37±5.98 ng/mg、214.33±17.21 ng/mg、3030.00±537.03 ng/mg、860.00±152.39 ng/mg，索拉非尼纳米微粒组（SNP）各组织中索拉非尼浓度分别为7.96±3.85 ng/mg、17.90±1.56 ng/mg、92.20±32.77 ng/mg、61.93±5.41 ng/mg、241.23±71.39 ng/mg、49.97±15.17 ng/mg、37.80±13.85 ng/mg、64.60±14.20 ng/mg、45.47±12.70 ng/mg、728.77±156.39 ng/mg、2751.33±629.60 ng/mg；索拉非尼和索拉非尼纳米微粒在癌旁肝组织中索拉非尼浓度分别为3030.00±537.03 ng/mg、728.77±156.39 ng/mg，肝癌组织中索拉非尼浓度分别为860.00±152.39 ng/mg、2751.33±629.60 ng/mg，索拉非尼纳米微粒组索拉非尼在肝癌组织中的药物浓度高于索拉非尼组，癌旁肝组织中索拉非尼纳米微粒组的索拉非尼药物浓度明显低于索拉非尼组，差异具有统计学意义（F=69.47，P<0.05）。研究结果表明静脉给药后索拉非尼纳米微粒组在脑、心、肺、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、脾和癌旁肝组织中索拉非尼含量显著低于索拉非尼组，索拉非尼纳米微粒具有较好的肿瘤组织靶向性，提高肿瘤组织局部药物浓度，如图5所示。

实施例7 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒对肝、肾功能和甲胎蛋白（AFP）影响

用生理盐水（NS）、空白纳米微粒（mPEG-PDLLA）、索拉非尼、索拉非尼纳米微粒治疗1周、3周荷瘤小鼠血浆100μl，用贝克曼全自动生化分析仪检测肝肾功能，肝功能指标包括血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）；肾功能指标包括血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）。采用全自动酶免分析系统ELISA法测定治疗3周荷瘤小鼠各组外周血AFP水平。结果显示：用药1周各组血ALB、ALT、AST、ALP、BUN和Cr水平间差异无统计学意义（P＞0.05）；用药3周各组血ALB、ALT、BUN和Cr水平间差异无统计学意义（P＞0.05），索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组血AST、ALP水平高于NS组，差异具有统计学意义（F=3.958，F=3.764，P＜0.05），结果表明索拉非尼纳米微粒对机体肝肾功能无明显损害。用药3周索拉非尼纳米微粒组血AFP水平显著低于NS组和索拉非尼组，差异具有统计学意义（0.178±0.016 pg/ml vs 0.675±0.177 pg/ml，0.379±0.0512 pg/ml，F=1.267，P＜0.05），表明索拉非尼纳米微粒显著提高了索拉非尼治疗肝癌作用。

实施例8 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒治疗荷瘤小鼠肝癌作用

建立ICR小鼠原位移植肝癌模型，随机分为NS组、mPEG-PDLLA组、索拉非尼组（S）、索拉非尼纳米微粒组（SNP）。分别经尾静脉注入生理盐水、索拉非尼（用量为20mg/kg），空白纳米微粒用量为对应含索拉非尼纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量。各组治疗1周、3周后处死小鼠，比较各组肿瘤体积和肿瘤转移数；采用HE方法测定各组肿瘤坏死程度，免疫组化SP法检测治疗1周、3周各组肿瘤组织Ki-67和CD34的表达。结果显示: （1）NS组与mPEG-PDLLA组相比，治疗1周、3周肿瘤抑瘤率无统计学差异（P＞0.05）；NS组、索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组1周肿瘤抑制率分别为-2.937±1.37%、7.507 ±4.321%、22.761 ±4.612%，索拉非尼和索拉非尼纳米微粒显著抑制肿瘤生长，抑制作用以索拉非尼纳米微粒最为显著，与NS组、索拉非尼组比较差异具有统计学意义（F=6.215，P＜0.05）；NS组、索拉非尼组、索拉非尼纳米微粒组3周肿瘤抑制率分别为-4.871±2.713%、21.583 ±3.286%、45.784 ±7.463%，索拉非尼纳米微粒抑制肿瘤生长作用最强，与NS组、索拉非尼组比较差异具有统计学意义（F=12.384，P＜0.05），如图6所示。（2）索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗1周，肿瘤坏死程度高于NS组与mPEG-PDLLA组，但索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间比较差异无统计学意义（22.83±10.68% vs 25.67±9.35%，P＞0.05）；索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗3周，索拉非尼纳米微粒组肿瘤坏死程度最为严重，与索拉非尼组比较差异具有统计学意义（46.17±12.58% vs 63.57±15.08%，F=21.834，P＜0.05）。（3）索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗3周，肝脏、肺和腹腔肿瘤转移数低于NS组与mPEG-PDLLA组，索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间肝脏肿瘤转移数比较差异有统计学意义（16.36±1.63% vs 12.24±1.37%，F=11.316，P＜0.05），索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间腹腔肿瘤转移数比较差异有统计学意义（17.41±1.87% vs 12.35±2.17%，F=8.126，P＜0.05），索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间肺脏肿瘤转移数比较差异无统计学意义（10.15±1.32% vs 8.50±0.48%，P＞0.05）。（4）索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗1周，肿瘤细胞增殖程度低于NS组与mPEG-PDLLA组，但索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间比较肿瘤细胞增殖数差异无统计学意义（58.3±16.6% vs 53.5±18.9%，P＞0.05）；索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗3周，索拉非尼纳米微粒组肿瘤细胞增殖数显著低于索拉非尼组，差异具有统计学意义（46.6±11.3% vs 35.5±7.2%，F=6.321，P＜0.05）。（5）索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗1周，肿瘤组织微血管密度低于NS组与mPEG-PDLLA组，但索拉非尼和索拉非尼纳米微粒组间比较肿瘤组织血管密度差异无统计学意义（76.3±22.5% vs 68.6±21.7%，P＞0.05）；索拉非尼和索拉非尼纳米微粒治疗3周，索拉非尼纳米微粒组肿瘤组织血管密度显著低于索拉非尼组，差异具有统计学意义（60.8±18.9% vs 33.5±9.8%，F=10.263，P＜0.05）。研究结果表明索拉非尼纳米微粒通过抑制肝癌细胞增殖和肿瘤组织微血管新生，加速肿瘤组织坏死，从而抑制肿瘤细胞转移和生长，作用强于索拉非尼。

实施例9 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒对荷瘤动物生存期影响

建立小鼠原位移植肝癌模型，随机分为NS组（即不含索拉非尼组）、mPEG-PDLLA组、S组（索拉非尼组）、SNP组（索拉非尼纳米微粒组）。分别经尾静脉注入生理盐水、索拉非尼（用量为20mg/kg），空白纳米微粒用量为对应含索拉非尼纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量。治疗结果显示，NS组、S组、SNP组荷瘤动物生存期（d）分别为18.20±2.51、24.30±2.83、36.50±2.06，尤以索拉非尼纳米微粒组生存时间最长，与其他组相比差异具有统计学意义（F=6.103，P<0.05），表明索拉非尼纳米微粒具有很好的抗肿瘤靶向性，显著提高索拉非尼抗肿瘤效应，延长荷瘤动物生存期，如图7所示。

实施例10 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物索拉非尼纳米微粒抗肝癌作用机制研究

取NS、mPEG-PDLLA纳米微粒、索拉非尼、索拉非尼纳米微粒治疗1周、3周荷瘤小鼠肝癌组织和癌旁肝组织各50mg，分别应用蛋白裂解液裂解组织，用Bicinchoninic acid (BCA )法测定蛋白浓度。用RNA抽提剂（TRIzol）和氯仿等提取各组织RNA，用分光光度计（A260）进行RNA纯度鉴定。采用蛋白印迹（Western Blotting）法测定各组组织E-钙粘蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）和VEGF蛋白表达，采用Q-RT-PCR法测定各组组织E-cadherin、β-catenin、MMP-9、TIMP-1和VEGF mRNA表达。结果显示：给药1周，索拉非尼纳米微粒显著增加肝癌组织E-cadherin mRNA，抑制肿瘤组织VEGF mRNA表达，与对照组和索拉非尼组相比，差异具有统计学意义（F=10.812，F=3.657，P<0.05）；索拉非尼纳米微粒使肿瘤组织β-catenin mRNA表达显著降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（F=6.243，P<0.05）；各组间肿瘤组织MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达差异无统计学意义（F=16.135，F=7.326，P>0.05）。给药3周，索拉非尼纳米微粒显著增加肝癌组织E-cadherin mRNA，抑制肿瘤组织VEGF mRNA表达，与对照组和索拉非尼组相比，差异具有统计学意义（F=12.736，F=5.361，P<0.05）；索拉非尼纳米微粒使肿瘤组织β-catenin mRNA表达显著降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（F=8.493，P<0.05）；各组间肿瘤组织MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达差异无统计学意义（F=14.135，F=6.718，P>0.05），（见表3,4）。

表3: 给药1周各组肝癌组织侵袭转移相关因子mRNA表达 (

±s ，n=3)

因子/组别	NS	S	SNP
				E-cadherin	0.005125±0.001652	0.002076±0.001234	0.053702±0.036271^◆
beta-catenin	0.012259±0.014267	0.009652±0.003163	0.004962±0.001368^▲
				TIMP-1	0.028164±0.017512	0.022054±0.015432	0.023683±0.017663
MMP-9	0.025516±0.009615	0.021054±0.012243	0.023683±0.023712
				VEGF	0.001410±0.012531	0.000887±0.000165	0.000268±0.000132^◆

注：◆ 与NS、S相比，P<0.05；▲ 与NS相比，P<0.05。

表4: 给药3周各组肝癌组织侵袭转移相关因子mRNA表达 (

±s ，n=3)

因子/组别	NS	S	SNP
				E-cadherin	0.002463±0.001562	0.003045±0.001351	0.065129±0.024627^◆
beta-catenin	0.014680±0.015327	0.008032±0.021243	0.004848±0.000863^▲
				TIMP-1	0.029360±0.018563	0.023519±0.017263	0.025321±0.012548
MMP-9	0.027969±0.014675	0.021631±0.009152	0.020824±0.017265
				VEGF	0.004692±0.002623	0.001004±0.000852	0.000611±0.000367^◆

注：◆ 与NS、S相比，P<0.05；▲ 与NS相比，P<0.05。

给药1周，索拉非尼纳米微粒显著增加肝癌组织E-cadherin表达，与对照组和索拉非尼组相比，差异具有统计学意义（F=22.312，P<0.05）；抑制肿瘤组织β-catenin表达，与对照组相比，差异具有统计学意义（F=18.561，P<0.05）；各组间肿瘤组织MMP-9、VEGF和TIMP-1表达差异无统计学意义（F=16.235，F=5.326，F=3.872，P>0.05）。给3周，索拉非尼纳米微粒显著增加肝癌组织E-cadherin表达，与对照组和索拉非尼组相比，差异具有统计学意义（F=10.573，P<0.05）；抑制肿瘤组织β-catenin表达，与对照组相比，差异具有统计学意义（F=26.764，P<0.05）；各组间肿瘤组织MMP-9、VEGF和TIMP-1表达差异无统计学意义（F=8.917，F=15.576，F=4.732，P>0.05），如表5-6及图8a,8b所示，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）作为一个稳定表达的参照物，表中的数值是由各待测因子实际表达值分别与GAPDH表达值相除后的值。

表5: 给药1周各组肝癌组织侵袭转移相关因子蛋白表达 (±s ，n=3)

因子/组别	NS	S	SNP
				E-cadherin	0.5293±0.0123	0.8079±0.0214	1.1461±0.0167^◆
beta-catenin	1.2993±0.0154	1.1422±0.0263	0.5507±0.0307^▲
				MMP-9	0.4891±0.0041	0.5766±0.0146	0.4720±0.0025
VEGF	0.7801±0.0215	0.8520±0.0301	0.7502±0.0174
				TIMP-1	0.4539±0.0009	0.5078±0.0106	0.4776±0.0016

注：◆ 与NS、S相比，P<0.05；▲ 与NS相比，P<0.05。

表6: 给药3周各组肝癌组织侵袭转移相关因子蛋白表达 (

±s ，n=3)

因子/组别	NS	S	SNP
				E-cadherin	0.5932±0.0317	0.8768±0.0168	1.6909±0.0205^◆
beta-catenin	2.8449±0.0116	2.5594±0.0316	0.9625±0.0382^▲
				MMP-9	0.5114±0.0113	0.6186±0.0231	0.5893±0.0033
VEGF	1.1160±0.0012	1.2044±0.0022	1.0605±0.0015
				TIMP-1	0.5025±0.0018	0.5596±0.0012	0.4847±0.0092

注：◆ 与NS、S相比，P<0.05；▲ 与NS相比，P<0.05。

本发明以索拉非尼为活性成分，以生物降解材料聚乙二醇单甲醚和聚乳酸作为药物辅料，通过开环聚合技术研制聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物，采用化学沉淀法制备工艺技术，制备索拉非尼-聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒，用于肝细胞癌治疗，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，极大发挥索拉非尼抗肿瘤作用，最大限度地降低索拉非尼的毒副作用。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，该方法包含以下具体步骤：

2.如权利要求1所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的制备方法为：使得聚乙二醇单甲醚、外消旋丙交酯在催化剂辛酸亚锡作用下反应获得。

3.如权利要求2所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇单甲醚和外消旋丙交酯以重量比例为1:1.1~2的比例共聚形成聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料；所述的聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的通式为mPEG-PDLLA，其分子量的范围为40-45kD。

4.如权利要求1所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的索拉非尼纳米微粒中，索拉非尼与聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:15~25。

5.如权利要求4所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的索拉非尼纳米微粒中，索拉非尼与聚乙二醇单甲醚-外消旋聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:20。

6.如权利要求1所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的索拉非尼纳米微粒携载索拉非尼含量为5~7%，包封率为92~98%。

7.如权利要求6所述的索拉非尼纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的索拉非尼纳米微粒携载索拉非尼含量6.5 ±0.2%，包封率为95 ±2.2%。