CN113712916A - 一种负载大麻二酚的纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药化工技术领域，提供了一种负载大麻二酚的纳米胶束及其制备方法和应用。本发明采用聚乙二醇‑聚丙交酯共聚物或聚乙二醇‑聚己内酯共聚物为载体对大麻二酚进行包载，所得负载大麻二酚的纳米胶束在水性介质中可自发组装成球形胶束，分子中亲水性聚乙二醇单甲醚在胶束外层，疏水性聚丙交酯或聚己内酯在胶束内核，通过物理包埋的方式对大麻二酚进行包载。本发明提供的负载大麻二酚纳米胶束具有良好的水溶性、稳定性及释药性能，在生理条件下较为稳定，可在体内长效循环而不被快速代谢，具有良好的缓释性，对人乳腺癌MCF‑7和MDA‑MB‑231细胞有更强的细胞毒性以及更显著的诱导自噬的作用，生物利用度显著优于游离大麻二酚。

Description

一种负载大麻二酚的纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药化工技术领域，尤其涉及一种负载大麻二酚的纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
大麻二酚是一种大麻素类化合物，来源于桑科植物大麻等植物或人工合成，临床上用于缓解多发性硬化症的痉挛状态，以及治疗2岁以上患者的Dravet综合征或Lennox-Gastaut综合征相关的癫痫等，疗效好且无精神作用。除抗癫痫、抗痉挛作用外，大麻二酚还具有显著的免疫调节、抗炎、抗焦虑、镇痛、抗氧化、抗肿瘤作用，对乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胶质瘤等都有很好的效果，且能减少化疗药物的心脏毒性和耐药性。
但是，大麻二酚水溶性较差，口服生物利用度低，因而其临床效果并不理想，一直未有相关产品上市。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种负载大麻二酚的纳米胶束及其制备方法和应用。本发明提供的负载大麻二酚的纳米胶束水溶性好，生物利用度高，且具有良好的稳定性和释药性能，能够增强大麻二酚的抗肿瘤活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种负载大麻二酚的纳米胶束，包括载体和包载在载体中的大麻二酚；所述载体为聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物形成的纳米胶束；所述负载大麻二酚的纳米胶束中载体的质量分数为70％～99％，大麻二酚的质量分数为1％～30％。
优选的，所述负载大麻二酚的纳米胶束的粒径为20～120nm，电位为-(1.63～10.6)mV，包封率为74.50％～99.23％，载药量为5％～12％。
优选的，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的结构式如式I所示：
Figure BDA0003253990580000011
式I中：m为10～500的整数，n为10～500的整数；
所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物的结构式如式II所示：
Figure BDA0003253990580000012
式II中：p为10～500的整数，q为10～500的整数。
本发明还提供了上述方案所述负载大麻二酚的纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
以聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物为载体材料，采用薄膜水化法对大麻二酚进行包载，得到负载大麻二酚的纳米胶束。
优选的，所述薄膜水化法包括：
将载体材料和大麻二酚溶于有机溶剂中，得到混合溶液；
将所述混合溶液中的溶剂蒸干，得到复合物薄膜；
将所述薄膜溶于无菌水中，过滤后得到负载大麻二酚的纳米胶束的溶液。
优选的，所述有机溶剂为醇类溶剂或酮类溶剂；所述蒸干的温度为30～80℃。
优选的，过滤后，还包括将所得负载大麻二酚的纳米胶束的溶液冷冻干燥，得到负载大麻二酚的纳米胶束粉末。
优选的，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的制备方法包括以下步骤：将聚乙二醇、D,L-丙交酯、第一催化剂和溶剂混合进行第一开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚丙交酯共聚物；
所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物的制备方法包括以下步骤：将聚乙二醇、ε-己内酯、第二催化剂和溶剂混合进行第二开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚己内酯共聚物。
优选的，所述第一催化剂和第二催化剂独立地包括二甲氨基吡啶、吡啶、辛酸亚锡和咪唑中的一种或几种；
所述第一开环聚合反应和第二开环聚合反应的温度独立地为0～150℃，时间独立地为1～72h。
本发明还提供了上述方案所述的负载大麻二酚的纳米胶束或上述方案所述制备方法制备的负载大麻二酚的纳米胶束在制备抗肿瘤药物的中的应用。
本发明提供了一种负载大麻二酚的纳米胶束，包括载体和包载在载体中的大麻二酚；所述载体为聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物形成的纳米胶束；所述负载大麻二酚的纳米胶束中载体的质量分数为70％～99％，大麻二酚的质量分数为1％～30％。本发明采用聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物为载体对大麻二酚进行包载，所得负载大麻二酚的纳米胶束在水性介质中可自发组装成球形胶束，分子中亲水性聚乙二醇单甲醚在胶束外层，疏水性聚丙交酯或聚己内酯在胶束内核，通过物理包埋的方式对大麻二酚进行包载。
本发明提供的负载大麻二酚纳米胶束具有良好的水溶性、稳定性及释药性能。实施例结果表明，本发明制得的负载大麻二酚纳米胶束在生理条件下较为稳定，可在体内长效循环而不被快速代谢，可以缓慢释放出有效药物成分，从而发挥抗肿瘤作用；和大麻二酚游离药相比，本发明提供的负载大麻二酚纳米胶束对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞有更强的细胞毒性以及更显著的诱导自噬的作用，在大鼠体内的生物利用度也显著优于游离大麻二酚。
附图说明
图1为实施例1制备的mPEG2k-PLA2k(A)、mPEG5k-PLA5k(B)、mPEG2k-PCL2k(C)和mPEG5k-PCLk(D)的核磁共振氢谱；
图2为mPEG2k-PLA2k的荧光谱图；
图3为mPEG2k-PLA2k的CMC值拟合结果；
图4为mPEG5k-PLA5k的荧光谱图；
图5为mPEG5k-PLA5k的CMC值拟合结果；
图6为mPEG2k-PCL2k的荧光谱图；
图7为mPEG2k-PCL2k的CMC值拟合结果；
图8为mPEG5k-PCL5k的荧光谱图；
图9为mPEG5k-PCL5k的CMC值拟合结果；
图10为实施例3中空白胶束的TEM形态图，其中：A为mPEG2k-PLA2k，B为mPEG5k-PLA5k，C为mPEG2k-PCL2k，D为mPEG5k-PCL5k；
图11为实施例3中负载大麻二酚纳米胶束的TEM形态图，其中：A为mPEG2k-PLA2k-CBD，B为mPEG5k-PLA5k-CBD，C为mPEG2k-PCL2k-CBD，D为mPEG5k-PCL5k-CBD；
图12为实施例4中负载大麻二酚的纳米胶束分别在室温(上)和37℃(下)条件下的稳定性结果图；
图13为实施例5中负载大麻二酚的纳米胶束的体外药物释放曲线图；
图14为实施例6中负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚在SD大鼠体内的药时曲线；
图15为实施例7中空白胶束作用48h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响；
图16为实施例7中空白胶束作用72h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响；
图17为实施例7中载药胶束及游离药作用24h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响；
图18为实施例7中载药胶束及游离药作用48h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响；
图19为载药胶束及游离药作用72h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如；
图20为实施例8中负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚对荷瘤小鼠肿瘤体积(左)和体重(右)的影响；
图21为实施例9中负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚作用MCF-7细胞12h和24h后，细胞线粒体膜电位的影响；
图22为实施例10中负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚作用细胞24h后，通过Western Blot检测细胞自噬相关蛋白的表达水平。
具体实施方式
本发明提供了一种负载大麻二酚的纳米胶束，包括载体和包载在载体中的大麻二酚；所述载体为聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物形成的纳米胶束；所述负载大麻二酚的纳米胶束中载体的质量分数为70％～99％，优选为75％～95％，大麻二酚的质量分数为1％～30％，优选为5％～25％。
在本发明中，所述负载大麻二酚的纳米胶束的粒径优选为20～120nm，更优选为50～700nm，电位优选为-(1.63～10.6)mV，更优选为-(2～8)mV，包封率优选为74.50％～99.23％，更优选为80％～99％，载药量优选为5％～12％。
在本发明中，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物具体为聚乙二醇单甲醚和聚丙交酯的共聚物，记为mPEG-PLA，结构式如式I所示：
Figure BDA0003253990580000041
式I中：m为10～500的整数，优选为50～450的整数，n为10～500的整数，优选为50～450的整数。
在本发明中，所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物具体为具体为聚乙二醇单甲醚和聚己内酯的共聚物，记为mPEG-PCL，结构式如式II所示：
Figure BDA0003253990580000042
式II中：p为10～500的整数，优选为50～450的整数，q为10～500的整数，优选为50～450的整数。
在本发明中，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物和聚乙二醇-聚己内酯共聚物的数均分子量独立地优选为2000～10000，更优选为4000～8000；在本发明的具体实施例中，所述聚乙二醇(mPEG)-聚丙交酯(PLA)共聚物优选为mPEG2k-PCL2k或mPEG5k-PCL5k，所述聚乙二醇(mPEG)-聚己内酯(PCL)共聚物优选为mPEG2k-PLA2k或mPEG5k-PLA5k。
在本发明中，所述大麻二酚(CBD)的结构式如式III所示：
Figure BDA0003253990580000043
本发明还提供了上述方案所述负载大麻二酚的纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
以聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物为载体材料，采用薄膜水化法对大麻二酚进行包载，得到负载大麻二酚的纳米胶束。
在本发明中，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的制备方法优选包括以下步骤：将聚乙二醇单甲醚、D,L-丙交酯、第一催化剂和溶剂混合进行第一开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚丙交酯共聚物。在本发明中，所述第一催化剂优选包括二甲氨基吡啶、吡啶、辛酸亚锡和咪唑中的一种或几种；所述第一催化剂的用量优选为聚乙二醇单甲醚和聚丙交酯总质量的0.01～10％，更优选为0.5～5％；所述溶剂优选包括二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙醚、二氧六环和二甲基甲酰胺中的一种或几种；所述溶剂和聚乙二醇单甲醚的摩尔比优选为1～10:1；所述聚乙二醇单甲醚和D,L-丙交酯的质量比优选为1:1～50，更优选为1:1～25，进一步优选为1:1～10。
在本发明中，所述第一开环聚合反应的温度优选为0～150℃，更优选为50～130℃，所述第一开环聚合反应的时间优选为1～72h，更优选为10～48h，进一步优选为24～36h；所述第一聚合反应优选在氮气保护条件下进行。
在本发明的具体实施例中，优选先将聚乙二醇单甲醚和溶剂混合，然后加热除水，再向所得混合料中加入D,L-丙交酯，然后补充溶剂并再次除水，之后加入催化剂，并在氮气保护条件下进行反应。
在本发明中，所述第一聚合反应的反应式如下式所示：
Figure BDA0003253990580000051
第一聚合反应完成后，本发明优选将所得产物料液降至室温，然后加入冷无水乙醚进行沉淀，将沉淀体系过滤并将所得固体产物真空干燥，得到所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物。
在本发明中，所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物的制备方法包括以下步骤：将聚乙二醇单甲醚、ε-己内酯、第二催化剂和溶剂混合进行第二开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚己内酯共聚物。在本发明中，所述第二催化剂的可选种类和第一催化剂一致，但是相互独立，在此不再赘述；所述聚乙二醇单甲醚和ε-己内酯的质量比优选为1:1～50，更优选为1:1～25，进一步优选为1:1～10；所述溶剂和制备聚乙二醇-聚丙交酯共聚物时使用的溶剂种类一致，在此不再赘述；所述第二开环聚合反应的具体条件以及操作方法均和第一聚合反应一致，仅将其中的D,L-丙交酯替换为ε-己内酯即可。
在本发明中，所述第二聚合反应的反应式如下式所示：
Figure BDA0003253990580000061
本发明以聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物为载体材料，采用薄膜水化法对大麻二酚进行包载，得到负载大麻二酚的纳米胶束。在本发明中，所述载体材料和大麻二酚的质量比优选为5～20:1，更优选为10～15:1；所述薄膜水化法使用的有机溶剂优选为醇类溶剂或酮类溶剂，更优选为甲醇或丙酮。
在本发明中，所述薄膜水化法优选包括：
将载体材料和大麻二酚溶于有机溶剂中，得到混合溶液；
将所述混合溶液中的溶剂蒸干，得到复合物薄膜；
将所述薄膜溶于无菌水中，过滤后得到负载大麻二酚的纳米胶束的溶液。
在本发明中，所述载体材料和大麻二酚的总质量和有机溶液的体积之比优选为1～4mg：20mL，更优选为2～3mg：20mL；所述蒸干的温度优选为30～80℃，更优选为40～60℃，进一步优选为50℃，所述无菌水的温度优选为50℃；所述过滤优选使用0.22μm的微孔过滤器进行。
在本发明的实验室实施例中，优选将大麻二酚、载体材料和有机溶剂加入茄形瓶中，然后在旋转蒸发仪50℃条件下除去溶剂，然后抽真空30min，在瓶壁上形成一层复合薄膜，之后向茄形瓶中加入预热到50℃的无菌水，通过涡旋使复合薄膜溶解，将溶解液过滤后，得到负载大麻二酚的纳米胶束的澄清液。
得到负载大麻二酚的纳米胶束的溶液后，本发明优选还包括将所述负载大麻二酚的纳米胶束的溶液进行冷冻干燥，得到负载大麻二酚的纳米胶束粉末。本发明对所述冷冻干燥的具体条件没有特殊要求，能够将溶液中的溶剂完全去除，得到粉末状固体即可；所述负载大麻二酚的纳米胶束粉末水溶性好，在使用时，使用水进行复溶即可，复溶时，所述负载大麻二酚的纳米胶束粉末和水的用量比优选为1～50mg:1～200mL，更优选为1～50mg:1～100mL，进一步优选为1～50mg:1～10mL。
本发明还提供了上述方案所述的负载大麻二酚的纳米胶束或上述方案所述制备方法制备的负载大麻二酚的纳米胶束在制备抗肿瘤药物的中的应用。在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为抗乳腺癌药物；本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法，将所述负载大麻二酚的纳米胶束制备成各种剂型的药物即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
制备聚乙二醇-聚己内酯及聚乙二醇-聚丙交酯共聚物(mPEG-PCL和mPEG-PLA)，制备步骤为：
聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的制备：在圆底烧瓶中加入5g的聚乙二醇单甲醚(分子量分别为2000和5000)，加入25mL无水甲苯，油浴加热至130℃以除水，再向其中加入5g的D,L-丙交酯，添加适量无水甲苯，共沸除水后，加入50μL辛酸亚锡作为催化剂，在N2保护下于130℃油浴中反应24h；反应结束后将反应体系降至室温，得到未处理的粗产物；使用过量的冷无水乙醚沉淀上述粗产物，抽滤后将滤出的沉淀放在真空干燥器中室温抽真空4h，即得，将所得产物分别记为mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k。
聚乙二醇-聚己内酯共聚物的制备：其他条件均和制备聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的条件相同，仅将其中的D,L-丙交酯替换为ε-己内酯，所得产物分别记为mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k。
实施例2
理化性质表征
(1)核磁共振氢谱图测试
将实施例1制备的聚合物材料10mg分别溶解于0.5mL氘代氯仿中，采用1H-NMR测定各产物的核磁共振氢谱图。
聚合物材料的核磁共振氢谱图如图1所示，图1中A和B分别为mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k的谱图，其中a(3.35ppm或3.38ppm)为mPEG中甲氧基(-OCH3)质子峰，b(3.61ppm或3.64ppm)为mPEG重复单元亚甲基(-O-CH2-CH2-O-)质子峰，c(5.16ppm或5.12ppm)为聚丙交酯重复单元次甲基(-COO-CH-O-)质子峰，d(1.56ppm或1.52ppm)为聚乳酸甲基(-CH3)质子峰。
图1中C和D分别为mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k的谱图，其中a(3.38ppm)和b(3.65ppm)与mPEG-PLA相同，是mPEG重复单元质子峰，e(2.30ppm)聚己内酯重复单元亚甲基(-COO-CH2-)质子峰，f、g和h(1.25～1.65ppm)分别为聚己内酯重复单元中两端均连接烷基的亚甲基(-CH2-CH2-CH2-)质子峰，i(4.06ppm)为聚己内酯重复单元亚甲基(-CH2-O-)的质子峰。
聚合物的聚合度和分子量可以通过重复单元和甲氧基的质子峰积分面积的比值来确定。mPEG-PLA聚合物中，Ac/Aa＝n/3(n为PLA的聚合度)，mPEG-PCL聚合物中，Ae/Aa＝2n/3(n为PCL的聚合度)。根据积分面积求得mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k中PLA聚合度n分别约为30和71，PLA分子量分别为2160和5112；mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k中PCL的聚合度分别为17和45，PCL分子量分别为1938和5130。
(2)临界胶束浓度测试
采用芘荧光探针法测定各聚合物的临界胶束浓度(CMC)，具体步骤如下：精密称取各聚合物材料10.0mg，去离子水溶解后定容，配成100μg·mL-1的聚合物储备液，并用去离子水分别稀释至0.01～100μg·mL-1。精密称取芘2.0mg，置于100mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解，并定容至刻度，再稀释为1.0×10-8mol·L-1的芘溶液工作液，备用。移取10μL芘溶液工作液于10mL棕色容量瓶中，室温避光放置过夜，以挥干丙酮；向其中加入不同浓度的各聚合物溶液，50℃超声2h，使芘进入聚合物材料在水中自组装形成的胶束“核”中，避光条件下室温静置过夜，待测。
使用荧光分光光度计，固定发射波长390nm，激发光扫描波长范围为300～360nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，获得各溶液的激发光谱。计算336nm和334nm处荧光强度的比值I336/I334，以聚合物浓度的对数为横坐标，I336/I334为纵坐标，作图并进行线性拟合，确定各聚合物的CMC值。
图2为mPEG2k-PLA2k的荧光谱图，图3为mPEG2k-PLA2k的CMC值拟合结果；图4为mPEG5k-PLA5k的荧光谱图，图5为mPEG5k-PLA5k的CMC值拟合结果；图6为mPEG2k-PCL2k的荧光谱图，图7为mPEG2k-PCL2k的CMC值拟合结果；图8为mPEG5k-PCL5k的荧光谱图，图9为mPEG5k-PCL5k的CMC值拟合结果。
根据图2～9可以看出，mPEG2k-PLA2k、mPEG5k-PLA5k、mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k的CMC分别为1.12μg·mL-1、1.27μg·mL-1、1.95μg·mL-1、0.87μg·mL-1，表明各个聚合物材料均具有较低的CMC值，具有较好的自组装能力，能形成稳定性良好的胶束。
实施例3
制备负载大麻二酚的纳米胶束：
分别精密称取大麻二酚(≥98％)0mg、10mg和15mg，称取实施例1制备的mPEG2k-PLA2k100mg，投入茄形瓶混合，向瓶中加入5mL甲醇，旋转蒸发仪50℃条件下抽去溶剂，并抽真空30min，瓶壁上形成一层大麻二酚与载体材料的均匀复合薄膜。取下茄形瓶向其中加入5mL事先预热到50℃的灭菌水，快速涡旋使薄膜溶解，再用0.22μm微孔滤器过滤该溶液，得到空白胶束(即大麻二酚添加量为0时所得胶束)及负载大麻二酚的纳米胶束溶液。使用冷冻干燥机将纳米胶束溶液冻干成白色的固体粉末，并将其放入干燥器中保存，即得空白胶束和负载大麻二酚的纳米胶束，空白胶束记为mPEG2k-PLA2k、负载大麻二酚的纳米胶束分别记为mPEG2k-PLA2k-CBD-10mg、mPEG2k-PLA2k-CBD-15mg。
按照相同的方法，改变载体材料的种类，分别以实施例1制备的mPEG5k-PLA5k、mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k为载体材料，制备得到空白胶束mPEG5k-PLA5k、mPEG2k-PCL2k、mPEG5k-PCL5k，以及负载大麻二酚的纳米胶束mPEG5k-PLA5k-CBD10mg、mPEG5k-PLA5k-CBD15mg、mPEG2k-PCL2k-CBD10mg、mPEG2k-PCL2k-CBD15mg、mPEG5k-PCL5k-CBD10mg和mPEG5k-PCL5k-CBD15mg。
性能表征及检测：
制得空白胶束和负载大麻二酚的纳米胶束后，分析其表观形貌、粒径以及Zeta电位，具体方法为：
取10mg纳米胶束冻干粉，复溶于0.5mL去离子水中，将一滴样品滴落在铜网上并用2.0％磷钨酸溶液负染，再通过透射电镜来观察纳米胶束的形貌。
取适量纳米胶束溶液，通过MalvernNanozs90激光粒度分析仪测定平均粒径及Zeta电位。
通过超高效液相色谱法(UPLC)测定负载大麻二酚的纳米胶束的载药量和包封率，测定方法如下：
用电子天平称取纳米胶束适量，用甲醇溶解，超声5min，使纳米胶束的“核-壳”结构完全被破坏，大麻二酚从纳米胶束中释放出来，再将上述溶液用超高效液相色谱仪测量其中释放的实际大麻二酚含量。本发明所选用的检测紫外波长为203nm，流动相为乙腈：水＝65：35(v/v)的混合溶液，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，进样量为5μL。载药量(DL％)与包封率(EE％)计算方法如下：
DL％＝胶束中药物的重量/载药胶束的重量×100％；
EE％＝胶束中药物的重量/药物的添加量×100％；
检测结果：
空白胶束的形貌如图10所示，图10中：A为mPEG2k-PLA2k，B为mPEG5k-PLA5k，C为mPEG2k-PCL2k，D为mPEG5k-PCL5k，标尺均为100nm。
负载大麻二酚的纳米胶束的形貌如图11所示，图11中：A为mPEG2k-PLA2k-CBD10mg，B为mPEG5k-PLA5k-CBD10mg，C为mPEG2k-PCL2k-CBD10mg，D为mPEG5k-PCL5k-CBD10mg，标尺均为100nm。根据图10～11可以看出，聚合物载体均形成了纳米胶束。
负载大麻二酚的纳米胶束的粒径、电位、载药量和包封率如表1所示。
表1负载大麻二酚的纳米胶束的粒径、PDI、电位、载药量和包封率
Figure BDA0003253990580000091
Figure BDA0003253990580000101
根据表1中的数据可以看出，本发明提供的负载大麻二酚的纳米胶束粒径小，粒径分布均匀，包封率高，能够实现大麻二酚的有效负载。
采用实施例3中制备的mPEG2k-PLA2k-CBD10mg、mPEG5k-PLA5k-CBD10mg、mPEG2k-PCL2k-CBD10mg和mPEG5k-PCL5k-CBD10mg进行后续的实验，后续实验中，将mPEG2k-PLA2k-CBD10mg、mPEG5k-PLA5k-CBD10mg、mPEG2k-PCL2k-CBD10mg和mPEG5k-PCL5k-CBD10mg记为mPEG2k-PLA2k-CBD、mPEG5k-PLA5k-CBD、mPEG2k-PCL2k-CBD和mPEG5k-PCL5k-CBD。
实施例4负载大麻二酚的纳米胶束的稳定性
本实施例测定实施例3制备的负载大麻二酚的纳米胶束7天内在室温及37℃条件下的粒径变化，考察其稳定性。
分别精密称取实施例3制备的mPEG2k-PLA2k-CBD、mPEG5k-PLA5k-CBD、mPEG2k-PCL2k-CBD、mPEG5k-PCL5k-CBD纳米胶束冻干粉200mg加水定容至25mL量瓶中，分别置于室温和37℃条件下，利用激光粒度仪测量各载药胶束7天内的粒径分布记录并绘制粒径随时间的变化曲线，见图12，图12中上侧为室温条件下的实验结果，下侧为37℃条件下的实验结果。
由图12可看出，室温及37℃条件下各载药胶束粒径在7天内几乎没有变化，比较稳定，说明本发明制得的负载大麻二酚的纳米胶束具有良好的稳定性。
实施例5负载大麻二酚的纳米胶束的体外释放
采用透析法分别考察实施例3制得大麻二酚纳米胶束在37℃下的药物释放行为，具体步骤如下：
将冻干后的4种载药胶束(mPEG2k-PLA2k-CBD、mPEG5k-PLA5k-CBD、mPEG2k-PCL2k-CBD、mPEG5k-PCL5k-CBD)分别用1mL的去离子水溶解，并封装在透析袋中(截留分子量3500Da)，放入具塞三角瓶中。分别向瓶中加入20mL含0.5％(w/v)Tween80的pH7.4的PBS溶液，放入37℃恒温培养振荡器中，振荡速率100rpm。在0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72，96，120，144，168h取样，并用新的透析介质替换原有透析介质。通过UPLC检测4种载药胶束中大麻二酚的释放量，计算不同时间点药物的累积释放率，以大麻二酚累积释放率为纵坐标，时间为横坐标绘制释放曲线，结果见图13。
由图13可以看出，负载大麻二酚的纳米胶束mPEG2k-PLA2k-CBD和mPEG5k-PLA5k-CBD相比mPEG2k-PCL2k-CBD和mPEG5k-PCL5k-CBD来说，具有更好的释放行为，一周内累计释放率分别为35.53％和40.54％。并且四种负载大麻二酚的纳米胶束均表现出较好的缓释性能，说明本发明制得的大麻二酚纳米胶束有延长大麻二酚在体循环时间的潜力。
实施例6药代动力学研究
通过尾静脉注射不同大麻二酚制剂后在各时间点取血，测定血药浓度，绘制药时曲线，采用DAS3.2.8软件分析各药代动力学参数。具体步骤如下：
1、样品：大麻二酚游离药购自源植生物，负载大麻二酚的纳米胶束mPEG2k-PLA2k-CBD和mPEG5k-PLA5k-CBD。
2、药物配制：大麻二酚游离药用聚氧乙烯蓖麻油：乙醇：生理盐水＝1：1:18溶解，大麻二酚纳米胶束用生理盐水溶解。
3、动物：SD大鼠，购自北京大学医学部(实验动物科学部)，体重200±10g，雄性，常规饲养，自由饮食。
4、给药：大麻二酚及载药纳米胶束样品溶液，按每只大鼠1.0mL尾静脉给药，剂量按大麻二酚计算为30mg/kg，分别于15min，30min，1h，2h，4h，8h，24h眼眶取血，液质联用法测定血清中大麻二酚浓度，结果如图14所示，采用DAS3.2.8软件中非房室模型分析各药代动力学参数，结果如表2所示。
表2大麻二酚及其纳米胶束的药代动力学参数
Figure BDA0003253990580000111
由表2和图14的数据可知，相比于游离大麻二酚，负载大麻二酚的纳米胶束药时曲线下面积(AUC(0-t))增加，平均驻留时间(MRT)增加，清除率(CLz)降低，说明负载大麻二酚的纳米胶束能够延长大麻二酚的在体循环时间，减慢清除速率。
实施例7体外肿瘤增殖抑制试验：
采用MTT法评价空白胶束、游离大麻二酚及各负载大麻二酚的纳米胶束对乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞的抑制作用。具体步骤如下：
1.样品：游离大麻二酚用二甲基亚砜溶解后用完全培养基稀释；实施例3制得的空白胶束及大麻二酚的纳米胶束(mPEG2k-PLA2k-CBD、mPEG5k-PLA5k-CBD、mPEG2k-PCL2k-CBD和mPEG5k-PCL5k-CBD)用PBS溶解后用完全培养基稀释。
2.实验方法：取对数生长期的细胞，胰酶消化，终止消化后离心收集细胞，加入适量培养基稀释，计算细胞数目。将100μL的细胞悬液加入96孔板中，每孔6000个细胞，置于37℃，含5％的CO2培养箱中，使细胞贴壁后，加入100μL不同浓度(2～200μM)的游离药物及载药胶束溶液进行处理(每个浓度设置6个复孔检测)，同时设置空白胶束的对比实验，空白胶束的添加量为62.5～1000μg/mL，药物分别处理的试剂添加到每个孔，37℃孵育4h。然后，小心吸去孔内液体，用100μL二甲基亚砜溶解孔内结晶紫，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm处测量各孔的吸光值。同时设置对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。以对照孔细胞活性为100％，计算加药孔的相对细胞活力，以Means±SD表示，应用Graphpadprism5.0软件进行统计分析，计算细胞半数抑制浓度IC50。
空白胶束作用48h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如图15所示；
空白胶束作用72h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如图16所示；
载药胶束及游离药作用24h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如图17所示；
载药胶束及游离药作用48h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如图18所示；
载药胶束及游离药作用72h后对MCF-7(上)及MDA-MB-231(下)细胞活性的影响如图19所示；
IC50值如表3和表4所示。
表3负载大麻二酚纳米胶束处理MCF-7细胞不同时间的IC50值
Figure BDA0003253990580000121
表4载大麻二酚纳米胶束处理MDA-MB-231细胞不同时间的IC50值
Figure BDA0003253990580000131
图15～19中的结果表明，在250μg·mL-1的浓度下，各空白胶束处理对细胞活力均无显著性影响，mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k在1000μg·mL-1的浓度下对各种细胞活力无显著性影响，说明聚合物材料的生物相容性良好，对细胞活性几乎没有影响，mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k安全性高于mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k。
表3～4中的结果显示，聚合物材料mPEG2k-PLA2k在任何时间点均能够降低CBD对MCF-7细胞的IC50值，在72h也能将CBD对MDA-MB-231细胞的IC50值降低了2.25倍，在24h和48h没有显著性差异；mPEG5k-PLA5k在48h降低了CBD对两种乳腺癌细胞的IC50值。mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k不能降低CBD对MCF-7的IC50值；对MDA-MB-231细胞，mPEG2k-PCL2k和mPEG5k-PCL5k在72h后降低CBD的IC50值。
实施例8体内抑瘤实验
实验动物：雌性BALB/c-nu小鼠，12只，体重18g左右，随机分为4组，每组3只。按照实施例7中的方法培养MDA-MB-231乳腺癌细胞，收集细胞，将其制成细胞悬液，调整细胞浓度为每毫升1.0×107个，注射至小鼠乳腺脂肪垫部位，每只0.2mL。待小鼠肿瘤长至300mm3时开始给药。
肿瘤体积计算公式：
V(mm3)＝(W2×L)/2(W、L分别为肿瘤的短径长和长径长)
给药方式及剂量：大麻二酚游离药用聚氧乙烯蓖麻油:乙醇:生理盐水(1:1:18)溶解，载大麻二酚纳米胶束mPEG2k-PLA2k-CBD和mPEG5k-PLA5k-CBD用生理盐水溶解。每天腹腔注射给药，给药剂量为10mg·kg-1，给药体积约0.2mL。隔天用游标卡尺测量肿瘤体积和小鼠体重，并计算小鼠肿瘤体积(V)和第一天肿瘤体积(V0)的比值。利用Graph Pad绘制小鼠肿瘤体积变化及体重变化，并对其进行two-wayAnova分析。
图20为负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚对荷瘤小鼠肿瘤体积(左)和体重(右)的影响。根据图20可以看出，mPEG2k-PLA2k-CBD纳米胶束组与对照组有显著差异，表明大麻二酚纳米胶束增强了CBD的抗肿瘤效果。在各CBD制剂中未观察到小鼠体重的显著差异，表明其聚合物材料具有很好的生物相容性，没有对小鼠产生显著性的毒性。
实施例9细胞线粒体膜电位的变化：
取对数生生长的人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞，分别加20μM的游离大麻二酚、载药纳米胶束mPEG2k-PLA2k-CBD和mPEG5k-PLA5k-CBD处理12h和24h后，消化、离心、去上清，加入0.5mLJC-1染色工作液，颠倒数次混匀后37℃孵育20min，600g离心3min，沉淀细胞，弃上清后用JC-1染色缓冲液洗涤两次，离心弃上清后用100μL染色缓冲液重悬，用酶标仪检测其荧光强度。JC-1单体显红色荧光，激发光为490nm，发射光为530nm；JC-1聚合物显绿色荧光，激发光设置为525nm，发射光为590nm。以红色荧光和绿色荧光的比值来衡量线粒体膜电位的变化。
图21为负载大麻二酚的纳米胶束和游离大麻二酚作用MCF-7细胞12h和24h后，细胞线粒体膜电位的影响，根据图21可以看出，负载大麻二酚的纳米胶束较游离药物组膜电位下降，造成线粒体通透性增加、结构发生变化。说明负载大麻二酚的纳米胶束较游离药物组对人乳腺癌MCF-7细胞有更好的促进凋亡或诱导自噬的作用。
实施例10细胞自噬相关蛋白检测：
按照实例6所示方法处理细胞24h后，收集细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞后离心，收集蛋白，利用BCA法进行蛋白定量。将30μg蛋白样品加入凝胶孔道中(3.9％浓缩胶和10％分离胶)，待蛋白分离后，转膜，孵育抗体，曝光，得到如图22所示的条带。
图22为游离大麻二酚及负载大麻二酚的纳米胶束作用细胞24h后，通过WesternBlot检测细胞自噬相关蛋白的表达水平。Bcl-2蛋白在75％的乳腺癌中过表达，是细胞凋亡负调节因子，在促进肿瘤发生中的起重要作用，已成为ER阳性和三阴性乳腺肿瘤的重要预后标志物。Bcl-2在抑制细胞自噬方面也起到重要作用，它能与自噬关键分子Beclin-1结合，形成Bcl-2/Beclin-1复合物，当Beclin-1与Bcl-2分离时，Beclin-1的激活会导致mTOR的抑制，从而诱导自噬。自噬体中LC3的存在，以及转化成向下迁移的LC3-II，是自噬发生的标志，LC3-II的含量与自噬体的形成程度有关。
根据图22可以看出，相比空白对照组，CBD游离药及载药胶束处理MCF-7细胞24h后，Bcl-2表达水平降低，LC3B-II含量增加，Beclin-1表达水平升高，mTOR水平降低，说明CBD能够诱导乳腺癌细胞自噬，且载药胶束具有更强的效果。
由以上实施例可以看出，本发明提供的负载大麻二酚纳米胶束具有良好的水溶性、稳定性及释药性能，且具有良好的缓释性，对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞有更强的细胞毒性以及更显著的诱导自噬的作用，生物利用度显著优于游离大麻二酚。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种负载大麻二酚的纳米胶束，其特征在于，包括载体和包载在载体中的大麻二酚；所述载体为聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物形成的纳米胶束；所述负载大麻二酚的纳米胶束中载体的质量分数为70％～99％，大麻二酚的质量分数为1％～30％。
2.根据权利要求1所述的负载大麻二酚的纳米胶束，其特征在于，所述负载大麻二酚的纳米胶束的粒径为20～120nm，电位为-(1.63～10.6)mV，包封率为74.50％～99.23％，载药量为5％～12％。
3.根据权利要求1所述的负载大麻二酚的纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的结构式如式I所示：
Figure FDA0003253990570000011
式I中：m为10～500的整数，n为10～500的整数；
所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物的结构式如式II所示：
Figure FDA0003253990570000012
式II中：p为10～500的整数，q为10～500的整数。
4.权利要求1～3任意一项所述负载大麻二酚的纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以聚乙二醇-聚丙交酯共聚物或聚乙二醇-聚己内酯共聚物为载体材料，采用薄膜水化法对大麻二酚进行包载，得到负载大麻二酚的纳米胶束。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述薄膜水化法包括：
将载体材料和大麻二酚溶于有机溶剂中，得到混合溶液；
将所述混合溶液中的溶剂蒸干，得到复合物薄膜；
将所述薄膜溶于无菌水中，过滤后得到负载大麻二酚的纳米胶束的溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇类溶剂或酮类溶剂；所述蒸干的温度为30～80℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，过滤后，还包括将所得负载大麻二酚的纳米胶束的溶液冷冻干燥，得到负载大麻二酚的纳米胶束粉末。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇-聚丙交酯共聚物的制备方法包括以下步骤：将聚乙二醇单甲醚、D,L-丙交酯、第一催化剂和溶剂混合进行第一开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚丙交酯共聚物；
所述聚乙二醇-聚己内酯共聚物的制备方法包括以下步骤：将聚乙二醇单甲醚、ε-己内酯、第二催化剂和溶剂混合进行第二开环聚合反应，得到聚乙二醇-聚己内酯共聚物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一催化剂和第二催化剂独立地包括二甲氨基吡啶、吡啶、辛酸亚锡和咪唑中的一种或几种；
所述第一开环聚合反应和第二开环聚合反应的温度独立地为0～150℃，时间独立地为1～72h。
10.权利要求1～3任意一项所述的负载大麻二酚的纳米胶束或权利要求4～9任意一项所述制备方法制备的负载大麻二酚的纳米胶束在制备抗肿瘤药物的中的应用。
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