CN103877022B

CN103877022B - 一种提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束

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Publication number: CN103877022B
Application number: CN201410154697.8A
Authority: CN
Inventors: 邵敬伟; 杨祥; 向利平; 许煜; 陈孝炜; 贾力
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2034-04-17
Also published as: CN103877022A

Abstract

本发明涉及生物功能材料和纳米技术领域，具体涉及一种新型具有适宜粒径分布范围，稳定包封率和载药率，高生物安全性，可提高熊果酸及其衍生物生物利用度的两亲性高分子纳米载药胶束。本发明的技术方案为一种提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束，特征在于其制备方法如下：1.采用“开环聚合”方法合成PLGA-PEG-PLGA；2.将难溶性药物与三嵌段共聚物共同溶于有机溶剂，制成油相；3.将油相逐滴滴入正在高速搅拌的水相中4.搅拌至油相挥发完全，溶液过滤膜，制得含有载药纳米粒的超纯水溶液；冻干后制得所述的载药胶束。

Description

一种提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束

技术领域

本发明涉及生物功能材料和纳米技术领域，具体涉及一种新型具有适宜粒径分布范围，稳定包封率和载药率，高生物安全性，可提高熊果酸及其衍生物生物利用度的两亲性高分子纳米载药胶束。

背景技术

近年来，一种天然来源的五环三萜类化合物熊果酸（Ursolicacid,UA）由于其广泛的生物学活性如抗肿瘤、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等引起了国内外研究者的关注。尤以其显著的抗癌作用和良好的护肝功效受到重视。药理学实验研究已经证明UA具有：1）可抑制恶性肿瘤细胞增殖；2）诱导肿瘤细胞分化和凋亡；3）对多种致癌、促癌物有抵抗作用；4）抗肿瘤血管生成；5）具有增强免疫功能等多样化的抗癌活性。另一方面，UA对多种物质引发的肝损伤都有很好的保护作用，能显著而迅速降低体内丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平，恢复肝功能，并可以预防肝纤维化，从而能够克服常规化疗药对肝损伤较大、毒性大的极限，在治疗的同时也可以起到良好的护肝效果，副作用小，毒性低。

尽管UA以其高效低毒的特点及多样化的抗癌作用机制正日益受到药学领域研究者的重视，但是目前国内外将其作为抗癌药物在临床上开发应用却非常有限。究其原因在于：UA本身在水中的溶解度较小，导致其体内生物利用度低，大大减弱了其实际应用的效果。

纳米载药系统可作为一种优化药效，改善药物生物利用度的有效手段，已成为药剂学以及现代生物医学领域的研究热点。纳米载药系统可改变药物的体内分布、控制药物的释放速度、增加药物的水溶性、降低药物的毒副作用和提高药物的生物利用度等。在药物研发领域，人们主要是利用新型药用纳米材料作为药物载体，克服传统药物选择性差、成药性差、和毒副作用大等问题，提高药物的治疗效果和安全性。

在过去的近十年中，高分子纳米材料传输药物系统已成为一个新的纳米医学领域。用于药物传输的高分子纳米材料有：聚合物胶束，聚合物/药物结合物和聚合物/DNA结合物等。在20世纪80年代，HelmutRingsdorf课题组首次使用聚合物胶束作为药物运输载体。聚合物胶束的形貌多种多样，包括球形，杆状和层状。Letchford和Burt讨论了形成两亲性共聚物纳米粒子的主要特点和研究了形成聚合物纳米粒子的理化性质的影响因素。聚合物胶束作为药物传输系统引起了越来越多研究人员的关注，成为当今研究热点之一。

PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid))具有良好的生物相容性，无免疫原型，可在体内分解和吸收等优点，已经被美国食品和药品管理局（FDA）批准应用于人体内（肌肉注射）；PEG（聚乙二醇polyethyleneglycol）在体内无免疫原性并可降解成无毒的自然代谢产物（H₂O和CO₂），被FDA批准作为药物载体用于人体。

由聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)组成的两亲性嵌段共聚物形成以疏水段为核，以亲水段为壳的的球形核-壳结构将药物包裹在核里，能避免周围环境因素的影响从而提高药物稳定性；对于难溶性药物，可以提高其水溶性；胶束外壳的亲水段为胶束披上了一层“伪装”，不易被吞噬细胞或蛋白质识别，可避免被网状内皮系统（RES）捕获，延长了胶束在血液中的滞留时间，提高药物的生物利用度。

专利CN102516351A公布了一系列具有高抗癌活性熊果酸衍生物的制备方法。虽然这一系列衍生物均能不同程度提高其抗癌活性，但该类衍生物在水中的溶解度尚未得到明显改善，导致其在生物体内利用度低。

专利CN101889983A公开了一种高分子材料载药纳米粒，该种纳米粒采用PEG-PLGA二嵌段聚合物形成胶束，纳米粒径分布范围过广（50-500nm），制备过程繁琐且对仪器设备要求较高。

专利CN103271874A公布了一种高分子材料包载紫杉醇纳米粒，该种纳米粒采用PEG-PLGA-PEG三嵌段聚合物形成胶束，纳米粒径存在分布范围过广（20-500nm），对仪器要求较高的缺点。该专利在制备载药纳米胶束的过程中需要添加表面活性剂且得到的载药胶束平均粒径较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型具有适宜粒径分布范围、稳定包封率和载药量，可提高熊果酸及其衍生物生物利用度的两亲性高分子纳米载药胶束及其制备方法。本发明受到国家自然科学基金项目(No.81201709)、国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金项目（No.J1103303）和中国博士后科学基金项目（No.2012M511441andNo.2013T60638）资助。

本发明是通过以下技术方案实现的：

（1）以聚乙二醇（PEG）为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，丙交脂和乙交脂采用“开环聚合”方法合成PLGA-PEG-PLGA；所述的PEG质量占总生成产物质量约20%-50%；丙交脂：乙交脂的摩尔比为：3:1-5:1；催化剂辛酸亚锡与单体的摩尔比为：1:10000-15000；无氧封管聚合反应后，通过二氯甲烷或三氯甲烷溶解，冷无水乙醚沉淀纯化。

（2）将熊果酸或其衍生物US597，US580与三嵌段共聚物（PLGA-PEG-PLGA）按质量比1:1-6共同溶于有机溶剂（恰好溶解完全即可，或是按照每30mg三嵌段共聚物：10mL有机溶剂的比例），制成油相；所述的有机溶剂须能同时溶解熊果酸或其衍生物和三嵌段共聚物，且较易挥发。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈等。所述的US597如式（I）所示；所述的US580如式（II）所示；

；

（3）将油相逐滴滴入正在高速搅拌的一定体积的水相中。所述水相为超纯水（可经MilliQ得到）；油相和超纯水的体积比例为：1:5-20；高速搅拌的速度>1000转/min，使用普通磁力搅拌仪即可；滴入过程使用恒压漏斗控制每3-5分钟一滴。

（4）搅拌至油相挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，制得含有纳米载药胶束的超纯水溶液。

（5）步骤（4）所得含有纳米载药胶束的超纯水溶液经冻干处理得纳米载药胶束。

本发明的有益效果：

（1）本发明将熊果酸及其衍生物US597、US580作为模型药物与两亲性聚合物纳米胶束结合，制得包裹熊果酸及其衍生物，由亲水壳和疏水核组成的高分子纳米载药胶束，能够明显提升药物在水中的溶解度与稳定性、减少网状内皮细胞的吞噬，增加靶向，提高药物的生物利用度。

（2）本发明制备的载药胶束可用于提高包括其他熊果酸衍生物及齐墩果酸等在内的其他五环三萜类化合物的生物利用度。

（3）本发明制备的载熊果酸及其衍生物的PLGA-PEG-PLGA纳米粒的粒径适宜，不仅可以同微球一样肌肉注射，还适合静脉注射，能更有效的到达肿瘤生长部位。

（4）本发明制备载体具有生物相容性好、无免疫原性、可生物降解、无毒副作用等优点。

（5）本发明载体具有稳定可靠的包封率和载药量。

（6）本发明的制备方法简单，操作步骤少，重复性好，对仪器设备要求低。

附图说明

图1熊果酸（UA）及其衍生物（US597和US580）结构式

图2-8实施例2-8制备得到的载药胶束粒径测试结果（DLS）

图9实施例5扫描电镜（SEM）测试结果

图10-15载药（US597、US580）胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用MTT实验结果

图16载药（UA）胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用MTT实验结果

图17载药胶束体外释放曲线图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

选取熊果酸（简称：UA）和专利CN102516351A公布的一种熊果酸衍生物（N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基己胺，简称：US597）及根据本课题组已授权专利CN101891794A加以改进获得的新型熊果酸哌嗪类衍生物（N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-氨基2-甲基哌嗪，简称：US580）作为被包载药物（结构式如图1所示）。

如说明书前述合成制备PLGA-PEG-PLGA并包载UA、US597、US580，同时做对比实验。见实施例1-8。

利用动态光散射原理（DLS）通过马尔文激光粒度仪对实施例2-8所制备的载药胶束粒径进行测试。（测试结果见图2-图8）。

通过HPLC法测定载药胶束载药量、包封率，实验过程见实施例9（测试结果见表1）；

通过扫描电镜（SEM）观察实施例5所制备得的纳米载药胶束的形貌（观察结果见图9）

通过MTT法检测载药胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用，实验过程见实施例10-11（测试结果见图10-16）。

通过HPLC法测定体外药物释放曲线，实验过程见实施例12（测试结果见图17）。

实验所用的原料：PEG（分子量4000，购自sigma）、丙交脂和乙交脂（购自于济南岱罡生物工程有限公司）、其余化学试剂均为分析纯购自于国药集团。

实施例1

空白组：

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg溶于10mL丙酮构成有机相。逐滴缓慢向50mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使丙酮挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，得到PLGA-PEG-PLGA空载体胶束溶液，冻干制得空白胶束。搅拌速度1200转/min（搅拌48小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每3分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图1。

实施例2

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和30mgUS580溶于10mL丙酮构成有机相。逐滴缓慢向50mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使丙酮挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1100转/min（搅拌36小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每5分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图2。

实施例3

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和5mgUS597溶于10mL丙酮构成有机相。逐滴缓慢向50mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使丙酮挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1000转/min（搅拌48小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每4分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图3。

实施例4

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和10mgUS597溶于10mL丙酮构成有机相。逐滴缓慢向50mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使丙酮挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1100转min（搅拌36小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每5分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图4。

实施例5

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和15mgUS597溶于10mL丙酮构成有机相。逐滴缓慢向70mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使丙酮挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1200转/min（搅拌24小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每3分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图5。

实施例6

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和20mgUS597溶于10mL二氯甲烷构成有机相。逐滴缓慢向100mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使二氯甲烷挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1300转/min（搅拌20小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每5分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图6。

实施例7

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和25mgUS597溶于10mL三氯甲烷构成有机相。逐滴缓慢向160mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使三氯甲烷挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载US597胶束溶液，冻干制得载US597胶束。搅拌速度1400转/min（搅拌11小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每4分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图7。

实施例8

精确称取PLGA-PEG-PLGA30mg和25mgUA溶于8mL乙腈构成有机相。逐滴缓慢向160mL剧烈搅拌超纯水中滴入，室温条件下磁力搅拌，使乙腈挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，得到PLGA-PEG-PLGA载UA胶束溶液，冻干制得载UA胶束。搅拌速度1400转/min（搅拌12小时），滴入速度使用恒压漏斗控制每5分钟1滴。载药胶束粒径测试结果（DLS）见图8。

实施例9：载药量、包封率测定：

配置一定浓度的实施例2-7载药胶束溶液各24mL，溶剂为超纯水，各取出2mL溶液使用超滤离心管离心（15000rpm，20℃，15min），使用HPLC（C18柱，甲醇：水=9:1）测定药物包封率和载药量(见表1)。根据如下公式计算：

表一：载药胶束载药量与包封率数据表

实施例10：MTT法检测载药胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用：

具体实施步骤：

取处于对数生长期状态的肿瘤细胞一瓶，消化后制成1×10⁴个/mL的细胞悬液。

将细胞悬液移入96孔板，每孔100μL，置37℃,5%CO₂培养箱中培养24h。

将实施例2-7得到的载药胶束溶液分为6组，每组设3个浓度梯度，分别为：稀释20倍、稀释50倍、稀释100倍。并分别以实施例1得到的空白胶束溶液和与各实施例载药量相等量的药物作为对照组。

移去培养基，按照分组浓度加入载药胶束溶液，每孔100μL，另设空白对照组。作用24h后，去除含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红培养基90μL，再加入MTT溶液10μL，继续孵育4h。

弃去板内上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡10min，使用酶标仪检测各孔光吸收值(OD值)，并计算细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1-用药组平均OD值÷空白对照组平均OD值）×100%，用GraphPadPrism软件进行数据处理，结果见图10-15（其中实施例2的测试结果见图10，实施例3见图11，实施例4见图12，实施例5见图13，实施例6见图14，实施例7见图15）。实验结果表明载US597和US580胶束在一定程度上可以抑制HepG2细胞增殖活性，并在一定的浓度范围内抑制效果随浓度增加而加强。空白胶束不具备细胞杀伤性，具有良好的生物相容性。

实施例11：MTT法检测载药胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用：

具体实施步骤：

将实施例8得到的载UA胶束溶液设3个浓度梯度，分别为：稀释8倍、稀释16倍、稀释32倍。并以实施例1得到的空白胶束溶液和与实施例7载药量相等量的UA作为对照组。

弃去板内上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡10min，使用酶标仪检测各孔光吸收值(OD值)，并计算细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1-用药组平均OD值÷空白对照组平均OD值）×100%，用GraphPadPrism软件进行数据处理，结果见图16。实验结果表明载UA胶束在一定程度上可以抑制HepG2细胞增殖活性，，并在一定的浓度范围内抑制效果随浓度增加而加强。空白胶束不具备细胞杀伤性，具有良好的生物相容性。

实施例12：体外药物释放：

具体实施步骤：

分别配置一定浓度的载药胶束溶液24mL，溶剂为PBS，放入37℃恒温培养箱中孵育，分别于4h，8h，12h，16h，20h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h取出2mL溶液使用超滤离心管离心（15000rpm，20℃，15min），使用HPLC（C18柱，甲醇：水=9:1）测定药物浓度。实验结果（见图17）表明载药胶束起到了良好的药物缓释作用，延长了药物的作用时间。

Claims

1.一种提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束，特征在于其制备方法如下：

（1）以聚乙二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，丙交脂和乙交脂采用“开环聚合”方法合成PLGA-PEG-PLGA；所述的聚乙二醇质量占总生成产物质量约20%-50%；丙交脂：乙交脂的摩尔比为：3:1-5:1；催化剂辛酸亚锡与单体的摩尔比为：1:10000-15000；无氧封管聚合反应后，通过二氯甲烷或三氯甲烷溶解，冷无水乙醚沉淀纯化；

（2）将待包裹物与PLGA-PEG-PLGA按质量比：1:1-6共同溶于有机溶剂，制成油相；所述的有机溶剂须能同时溶解待包裹物和PLGA-PEG-PLGA，且较易挥发；所述的待包裹物为熊果酸或其衍生物US597、US580；所述的熊果酸衍生物US597如式（I）所示；所述的熊果酸衍生物US580如式（II）所示；

；

（3）将油相逐滴滴入正在高速搅拌的水相中；所述水相为超纯水；油相和超纯水的体积比例为：1:5-20；高速搅拌的速度>1000转/min，滴入速度为每3-5分钟一滴；

（4）搅拌至油相挥发完全，溶液过0.45μm微孔滤膜，除去未包载的药物，制得含有纳米载药胶束的超纯水溶液；

2.如权利要求1所述的提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束，其特征在于步骤（2）中所述的有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷或乙腈。

3.如权利要求1所述的提高熊果酸及其结构修饰物生物利用度的载药胶束，其特征在于步骤（2）中，将待包裹物与PLGA-PEG-PLGA溶于溶剂的程度为恰好完全溶解；或是按照每30mg三嵌段共聚物：10mL有机溶剂的比例。