CN102293749B

CN102293749B - 一种马钱子碱免疫纳米微粒

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Publication number: CN102293749B
Application number: CN2011102101361A
Authority: CN
Inventors: 秦建民; 盛霞; 杨林; 撒忠秋; 黄涛; 李琦; 殷佩浩; 张敏; 高科攀; 陈庆华; 马经纬; 沈鹤柏
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Shanghai Normal University; Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Shanghai Normal University; Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2031-07-26
Also published as: CN102293749A; CN102266291A; CN102293750A; CN102293750B; CN102266291B

Abstract

本发明涉及一种马钱子碱免疫纳米微粒，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP单克隆抗体制成的免疫靶向纳米微粒。本发明提供的马钱子碱免疫纳米微粒，制备工艺简便，包封率高，药物释放稳定，成球性好，可用于制备抗肿瘤免疫靶向药物，该药物能用于抗肝癌治疗，通过外周静脉给药后，抗人AFPMcAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米载体能够增加马钱子碱在肝癌细胞聚集，使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，提高局部药物浓度，降低马钱子碱全身毒性；具有精准靶向肿瘤组织细胞药物聚集、药物释放稳定，抗癌效果好，安全等优势。

Description

一种马钱子碱免疫纳米微粒

技术领域

本发明涉及一种马钱子碱免疫纳米微粒，具体地，涉及一种肝癌特异性靶向治疗药物—抗人AFP McAb（即抗人甲胎蛋白单克隆抗体）-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒。

背景技术

马钱子碱（Brucine）是马钱子主要成分之一，其化学结构如下：

该马钱子碱是一种弱碱性生物碱，水溶性差，作为活血通络和 “以毒攻毒”代表药物，对T淋巴细胞增殖有促进作用，对小鼠淋巴细胞功能有剂量依赖性的功能调节作用，具有明显的抑瘤作用和很强的镇痛作用，邓旭坤等评价马钱子碱对移植性肿瘤模型荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用和生存时间的影响,结果发现马钱子碱在1.61-6.46 mg 对实体瘤Heps 模型小鼠和S180模型小鼠的抑瘤率均不低于30% ,马钱子碱还能提高小鼠的免疫器官的重量及其指数,但其对腹水瘤模型(EAC、Heps) 荷瘤小鼠的生存时间无明显延长作用，从而证实了马钱子碱能一定程度地抑制实体瘤模型小鼠体内肿瘤生长。短期应用对动物的造血、免疫系统以及肝肾没有明显的毒性,还能刺激和促进造血系统和免疫系统的功能,恢复小鼠因接种肝癌Heps 瘤株而造成的肝肾功能的损伤, 马钱子碱可能成为新的有发展前景的抗肿瘤药物。

已有技术研究：（1）制备马钱子碱脂质体，与马钱子碱溶液对比，用大白兔进行药代动力学研究发现，马钱子碱溶液给药2小时后血中已经测不出Brucine，慢分布半衰期7.5分钟，而将马钱子碱包封于脂质体后，给药12小时后血中仍然保持一定的浓度分布，消除半衰期比前者延长了6.6，但药物释放仍然过快，而且肝脏靶向性不强，难以在局部达到有效的药物浓度；（2）马钱子碱及其脂质体对小鼠移植性肝癌(Heps)和小鼠移植性实体瘤肉瘤S180细胞的生长均表现出明显的抑制作用，但两者对腹水瘤模型( EAC和Heps)荷瘤小鼠的生存时间无延长作用；（3）马钱子碱聚乳酸纳米粒(Bru-PLA-NPs) 静脉注射给药用于家兔体内的药动学观察，结果发现单剂量静脉注射Bru-PLA-NPs(4 mg/ kg) 后马钱子碱在兔体内的药动力学数据符合三室模型，单剂量静注马钱子碱溶液(4 mg/ kg) 后符合二室模型，与马钱子碱溶液相比，Bru-PLA-NPs 给药后,马钱子碱的消除半衰期( t1/ 2β) 提高6.6 倍；生物利用度提高8.7倍。与马钱子碱溶液相比，Bru-PLA-NPs静脉注射给药后马钱子碱在家兔体内的药动学行为发生了显著变化，将马钱子碱制成纳米粒可延长药物在动物体内的循环和作用时间,提高生物利用度；（4）腹腔应用马钱子碱溶液、马钱子碱普通脂质体和马钱子碱隐形脂质体治疗移植性肝癌H22小鼠，马钱子碱剂量均为3.23mg·kg-1, 连用8d，结果发现同剂量的马钱子碱溶液、马钱子碱普通脂质体、马钱子碱隐形脂质体的抑瘤率分别为28.64%、57.96%和71.36%，马钱子碱普通脂质体和隐形脂质体对荷瘤小鼠均无免疫抑制作用，与普通脂质体相比, 隐形脂质体作为马钱子碱的载体能够进一步增强其抗肿瘤效果。

我们近期研究发现马钱子碱与马钱子碱-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞从S期进入G2、M期，诱导肝癌细胞凋亡，而且马钱子碱纳米微粒抑制肿瘤细胞增殖效果显著优于马钱子碱单体，马钱子碱能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的基质黏附，随着药物剂量的增长，对基质黏附抑制作用逐渐增强，马钱子碱用量为320μg/ml时观察细胞运动迁徙率为17.46%，侵袭率为2.52% ，与40μg/ml相比迁徙率和侵袭率均存在显著差异。表明马钱子碱能够有效抑制肝癌细胞粘附，阻止肝癌细胞运动和侵袭，为马钱子碱用于靶向治疗肝细胞肝癌的深入研究奠定了理论基础。

但马钱子碱是剧毒中药，其治疗量与中毒量非常接近，全身用药剂量大，毒副作用强。如何进一步改善马钱子碱的靶向性和肿瘤局部药物聚集、持续发挥抗肿瘤效应，降低全身毒副反应，是提高马钱子碱抗肝癌效应的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝脏肿瘤免疫靶向纳米药物—抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，用于肝脏肿瘤靶向治疗，能增加马钱子碱在肝癌细胞聚集，使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，提高局部药物浓度，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，极大发挥马钱子碱抗肿瘤作用，最大限度地降低马钱子碱的毒性作用。

为实现以上目的，本发明提供了一种马钱子碱免疫纳米微粒，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP McAb（即抗人甲胎蛋白单克隆抗体）制成的免疫靶向纳米微粒。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱纳米微粒的粒径为274.5±64.3 nm，其Zeta 电位为-4.73±4.73 mV。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量为5~7%，包封率为70~85%。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量5.6 ±0.2%，包封率为76.0 ±2.3%。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式为PLA-PEG-CH2-CH2-COOH，其分子量的范围为40-50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1：1.5~3的比例共聚形成的。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1.5：2.5的比例共聚形成的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:15~30。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:20。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度范围为10~20μg抗体/mg纳米微粒。

上述的马钱子碱免疫纳米微粒，其中，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度是15μg抗体/mg纳米微粒。

本发明提供的马钱子碱免疫纳米微粒的制备方法包含以下具体步骤：

步骤1，将羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物和马钱子碱溶解于有机溶剂中，再与聚乙烯醇水溶液混合形成初乳；

步骤2，除去有机溶剂，离心除去聚集体，超滤除去游离马钱子碱，制得纳米微粒浓缩液；

步骤3，加入羧基活化试剂碳二亚胺盐，使得聚乙二醇羧基与抗人AFP McAb的氨基通过化学偶联链接，超滤离心分离得到马钱子碱免疫纳米微粒浓缩液。

本发明提供的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒可用于制备抗肿瘤免疫靶向药物，该药物用于肝癌的治疗具有很好的临床应用前景。

本发明利用羧基化的聚乙二醇与聚乳酸形成嵌段共聚物，共聚物末端含有水溶性聚合物聚乙二醇镶嵌，显著提高体内长循环时间，避免马钱子碱免疫纳米微粒体内释药速度过快，难以在局部达到有效抗癌药物浓度等缺陷。进一步地，利用聚乙二醇外露羧基，与抗人AFP McAb的氨基通过化学偶联技术成功链接，显著提高了抗人AFP McAb与羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒的链接效率。本发明制备的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，用于肝细胞癌治疗，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，极大发挥马钱子碱抗肿瘤作用，最大限度地降低马钱子碱的毒性作用。

本发明以马钱子碱为活性成分，以生物降解材料羧基化聚乙二醇（carboxylation polyethylene glycol ，CPEG）和聚乳酸(polylactic acid , PLA) 作为药物辅料，通过化学改性技术研制羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物，采用超声乳化-化学交联法制备工艺技术，制备马钱子碱-羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米微粒（Brucine /CPEG/PLA Nanoparticles， BCPNS），通过化学偶联法将抗人AFP McAb 与羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒链接，成功研制抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒（Anti-hAFP McAb-Brucine /CPEG/PLA Nanoparticles， AHMBCPNS）。粒径274.5±64.3 nm，Zeta 电位为-4.73±4.73 mV，载药率：5.6±0.2%，包封率：76±2.3%，携载马钱子碱浓度为800μg/ml，抗人AFP McAb在马钱子碱纳米微粒上的浓度是15μg抗体/mg纳米微粒。体外药物释放结果：马钱子碱24小时累积释放超过80%，48小时释放完全。

本发明抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒体内代谢、组织分布与抗肿瘤作用：

大鼠体内马钱子碱在马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组与马钱子碱免疫纳米微粒组的半衰期（t_1/2）分别为6.98±0.65 h、16.88±5.67 h与15.69±3.76 h。马钱子碱纳米微粒组与马钱子碱免疫纳米微粒组半衰期明显长于马钱子碱组，且两者在体内代谢过程相接近，即初始是一个快速代谢的过程，到后期消除缓慢，表现出明显的缓释性。而马钱子碱体内呈现一个快速代谢过程。

给药3d后马钱子碱组荷瘤裸鼠体内各组织中均未测出马钱子碱，马钱子碱纳米微粒组在脾、肺、肾、肌肉、肝癌和癌旁肝组织中马钱子碱浓度分别为341.00 ng/ mg、9.09 ng/mg、7.90 ng/ mg、14.41 ng/ mg、24.00 ng/ mg和246.50 ng/ mg，其余组织未测出；马钱子碱免疫纳米微粒组仅在脾、肝癌和癌旁肝组织中马钱子碱浓度分别为341.50 ng/ mg、57.13 ng/ mg和135.93 ng/ mg。马钱子碱免疫纳米微粒组马钱子碱在肝癌组织中的药物浓度高于马钱子碱纳米微粒组，癌旁肝组织中马钱子碱药物浓度明显低于马钱子碱纳米微粒组，差异具有统计学意义（F=445.85，P<0.05）。

马钱子碱免疫纳米微粒组给药7d、14d、21d与30d时抑瘤率分别为36.73%、54.77%、69.48%、75.96%,显著高于其他阳性给药组。5-Fu（5-氟尿嘧啶）组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组荷瘤动物生存期（d）分别为63.60±16.26、50.10±11.19%、60.50±12.54、81.50±14.25，尤以马钱子碱免疫纳米微粒组生存时间最长，与其他实验组相比差异显著（F=9.010，P<0.05）；5-Fu组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组生命延长率分别为25.20%、-1.38%、19.09%和60.43%，其中马钱子碱免疫纳米微粒组荷瘤动物生存时间明显延长。

本发明提供的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，具有以下突出的优点：

1. 制备工艺简便，包封率高，药物释放稳定，成球性好，所制备的免疫靶向纳米药物微粒在理化性质等方面符合肿瘤靶向治疗的需要。

2．利用羧基化聚乙二醇和聚乳酸的释药性质，以马钱子碱、羧基化聚乙二醇和聚乳酸嵌段交联为骨架结构制备纳米微粒，避免了单独用聚乙二醇释药速度过快，体内滞留时间短，难以在肿瘤局部达到有效抗癌药物浓度等缺陷。

3.成功用羧基化聚乙二醇和聚乳酸形成嵌段共聚物与抗人AFP McAb链接，显著提高了链接效率，不仅能够控制纳米药物在体内释放和降解速度，而且达到精准靶向，提高药物疗效，极大降低了马钱子碱药物毒性。

4.免疫靶向纳米药物材料选择生物相容性好、可降解的聚合物聚乳酸作为骨架载体，聚合物末端由含有水溶性聚合物PEG镶嵌，达到体内长循环的控释效果。

附图说明

图1是羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物（PLA-PEG-CH2-CH2-COOH）

的¹H -NMR测定图谱。

图2a是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米

微粒透射电镜图，透射电镜×10,000。

图2b是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米

微粒扫描电镜图，扫描电镜×50,000。

图3是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒粒径分布图。

图4是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒体外药物释放。

图5是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒靶向性测定。

图6是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对人肝癌细胞生长抑制作用。

图7是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒药代动力学。

图8是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒在荷瘤裸鼠体内组织分布。

图9是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒抗肿瘤作用。

图10是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对荷瘤动物生存期影响。

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。

实施例1

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒的制备方法

原料配方如下：

其中，聚合物材料（PLA-PEG-CH2-CH2-COOH）是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1：1.5~3的比例（优选1.5：2.5）共聚形成的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；其通式为PLA-PEG-CH2-CH2-COOH，其分子量的范围为40-50kD，其结构片段及¹H -NMR测定图谱如图1所示。

将上述油相和水相混合，用高剪切乳匀机分散，12000rpm转速下剪切5min得分散液，再将该分散液在300w功率超声条件下继续乳化，超声5次，每次30s，得初乳液。将初乳液倒入处方量的稀释液中，边加边搅拌，搅拌速度700rpm，在常温条件下持续搅拌6-8h进行液中干燥，挥去CH₂Cl₂，将液中干燥后的乳液于5000rpm转速下离心10min，去除可能的聚集体（包括羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙烯醇），收集上清液即得马钱子碱纳米乳液。将马钱子碱纳米乳液装入超滤离心管中（Millipore Amicon100,000），在离心力3,000g条件下离心30min，进行浓缩并除去游离马钱子碱，浓缩后用纯化水洗涤浓缩液，再超滤离心一次，获得马钱子碱纳米粒子浓缩液，⁶⁰Co辐照灭菌，4℃冰箱保存备用。

将30ml马钱子碱载药纳米粒子浓缩液均分为10份，即每份3ml，在每份载药纳米粒子浓缩液中加入5mg EDAC（碳二亚胺盐酸盐），摇床振荡15min（200rpm/min），然后加入AFP抗体（1mg/ml）后，4℃摇床振荡3h（200rpm/min），再离心5分钟10000 rpm，0.01M PBS（pH 7.4）洗涤粒子3次。通过离心力的分离作用，纳米粒子和抗体连接后在离心力的作用下聚沉在管底，而未连接的抗体在10000rpm的转速下不会沉下来悬浮在上层。经超滤离心分离得到马钱子碱免疫纳米微粒浓缩液，于4℃冰箱中保存备用。

马钱子碱免疫纳米微粒检测结果表明，微粒大小均匀，外形圆整，粒径274.5±64.3 nm，如图2a、图2b及图3所示，Zeta 电位为-4.73±4.73 mV，载药率：5.6±0.2%，包封率：76±2.3%，携载马钱子碱浓度为800μg/ml，抗人AFP McAb在马钱子碱纳米微粒上的浓度是15μg抗体/mg纳米微粒。体外药物释放结果：马钱子碱24小时累积释放超过80%，48小时释放完全。体外抗肿瘤实验：马钱子碱免疫纳米微粒对肝癌细胞SMMC-7721生长具有明显抑制作用，且随药物浓度的增加抑制作用呈递增趋势，具有浓度依赖性。与马钱子碱和马钱子碱纳米微粒相比，马钱子碱免疫纳米微粒对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用与5-FU接近，IC₅₀相差最小（5-FU组IC₅₀ 为16.7μg/ml；马钱子碱免疫纳米微粒组IC₅₀为 28.2μg/ml）。

实施例2

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒体外药物释放试验

精密移取马钱子碱免疫纳米微粒浓缩液2.0ml，置于截留分子量为3，000道尔顿的透析袋中，两端扎紧，平行操作3份，投入到50ml pH7.4的PBS介质中，于37℃，100rpm转速条件下进行体外释放，释放开始后第0.5、1、2、4、8、12、16、18、24、36、48h取样4ml，补液4ml，样品在263nm波长下测定UV吸收值，计算释放介质中Bru（马钱子碱）的浓度和累积释放百分率。

另配制浓度为0.427mg/mlBru-PBS溶液，精密移取该溶液2.0ml，置于截留分子量为3，000道尔顿的透析袋中，两端扎紧，平行操作3份，投入到50mlpH7.4的PBS介质中，于37℃，120rpm转速条件下进行体外释放，释放开始后第10、20、30、60、120、210、300min分别取样4ml，补液4ml，样品在263nm波长下测定UV吸收值，计算释放介质中马钱子碱的浓度和累积释放百分率，用于考察透析袋对马钱子碱释放的阻滞作用。

体外释放结果表明：马钱子碱24小时累积释放超过80%，48小时释放完全，如图4所示。

实施例3

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒靶向性测定

将抗人AFP McAb马钱子碱免疫纳米粒子与肝癌细胞SMMC-7721孵育4h，用0.01M PBS洗涤细胞3次；将FITC标记的二抗加入，继续孵育2h，用PBS洗涤3次后；在共聚焦显微镜下观察补充免疫荧光方法。200倍共聚焦显微镜下显示，马钱子碱免疫纳米微粒较为均匀的分布在肝癌细胞膜附近，呈现近似“指戒”形，表现出良好的靶向定位，如图5所示（共聚焦显微镜下照片×200倍）。

实施例4

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对肝癌细胞生长抑制作用

依据实验需要分为1640培养液组、5-FU组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组、PLA-PEG-CH2-CH2-COOH嵌段共聚物纳米微粒组、抗人AFP McAb组、抗人AFP McAb空白免疫纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组。马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组分别选取10、20、40、80、160、240μg/ml 不同马钱子碱浓度，空白纳米微粒对照组用量与对应含马钱子碱的纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量，5-FU 分别选取10、20、40μg/ml。体外分别作用于SMMC-7721 肝癌细胞72h 后，采用MTT法测定各组对肝癌细胞SMMC-7721生长抑制率。结果表明：（1）阴性对照组（1640培养液组、PLA-PEG-CH2-CH2-COOH嵌段共聚物纳米微粒组、抗人AFP McAb组、抗人AFP McAb-PEG-PLA嵌段共聚物组）不同浓度的药物作用72小时对人肝癌SMMC-7721细胞均无明显抑制作用，随着药物浓度的增加，各组药物对人肝癌SMMC-7721细胞的生长均无明显抑制作用，均无统计学意义（P>0.05）。（2）5-FU组与实验各组（马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组、马钱子碱免疫纳米微粒组）不同浓度的药物对人肝癌SMMC-7721细胞均有明显抑制作用，药物作用相同时间，随着药物浓度的增加，各组药物对人肝癌SMMC-7721细胞的生长均有明显抑制作用，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05），如图6所示。

实施例5

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒药代动力学

选取健康雄性Wistar大鼠6只，以3.23mg/kg的剂量经尾静脉注入马钱子碱、马钱子碱纳米微粒和马钱子碱免疫纳米微粒，注入后5min、10min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h分别尾静脉取血0.5ml置于抗凝试管中，1500rpm×5min，吸取血浆于冻存管4℃备用。采用3200Q-Trap串联质谱仪测定个时间点血浆马钱子碱浓度。马钱子碱t1/2为6.98±0.65 h，马钱子碱纳米微粒t_1/2为16.88±5.67 h，马钱子碱免疫纳米微粒t_1/2为15.69±3.76 h，结果表明，相对马钱子碱，马钱子碱免疫纳米微粒显著延长马钱子碱在体内循环时间（见表1，图7）。

表1: 马钱子碱免疫纳米微粒静脉给药后药代动力学 (n=6)

实施例6

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒在荷肝癌裸鼠体内组织分布

建立裸鼠原位移植肝癌模型，造模后2周，通过裸鼠尾静脉给药，以3.23mg/kg的剂量经尾静脉注入马钱子碱、马钱子碱纳米微粒和马钱子碱免疫纳米微粒，给药后72hr，留取荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肌肉、脂肪、癌组织，按重量体积比1:2加蒸馏水，组织匀浆，取匀浆液100μl，加10μl内标（氯雷他定100ng/ml），加400μl乙腈，涡旋振荡，15000rpm离心3min，取上清液100μl转移至进样管中进样，采用3200Q-Trap串联质谱仪测定马钱子碱纳米微粒在体内组织分布。结果表明给药后72hr, 马钱子碱在上述各组织浓度均未测出，而马钱子碱纳米微粒组在肝脏、脾脏和肿瘤中的浓度均高于肺、肾、肌肉，其余组织均未测出，肿瘤组织中的药物浓度为23.96ng/ml，肝脏246.5 ng/ml，脾脏341 ng/ml，肺9.09 ng/ml，肾7.89 ng/ml，肌肉14.4 ng/ml。给药后72hr肝肿瘤靶向指数为71.42；肾、肺、肌肉等组织中药物浓度明显降低，药物在体内代谢时间延长，肿瘤靶组织浓度较高。马钱子碱免疫纳米微粒组仅在脾、肿瘤和癌旁肝组织中马钱子碱浓度分别为341.50 ng/ mg、57.13 ng/ mg和135.93 ng/ mg。马钱子碱在肝癌组织中的药物浓度高于马钱子碱纳米微粒组，癌旁肝组织中马钱子碱药物浓度明显低于马钱子碱纳米微粒组，差异具有统计学意义（F=445.85，P<0.05），如图8所示。

实施例7

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒治疗裸鼠肝癌作用

建立裸鼠原位移植肝癌模型，随机分为生理盐水组（NS）、空白纳米微粒组（即PLA-PEG-CH2-CH2-COOH嵌段共聚物纳米微粒组）、抗人AFP McAb组、抗人AFP McAb空白免疫纳米微粒组、5-FU组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组。分别经尾静脉注入生理盐水、5-FU（用量为20mg/kg）、马钱子碱（用量为3.23mg/kg），空白纳米微粒用量为对应含马钱子碱纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量。各组治疗30d后处死裸鼠，比较各组肿瘤体积、肿瘤坏死程度；采用TUNEL标记法检测细胞凋亡率，免疫组化SP法检测Ki-67的表达。结果显示: 与5-FU组（肿瘤抑制率为58.87±1.67%）、马钱子碱组（肿瘤抑制率为47.08 ±2.69%）相比，马钱子碱纳米微粒组（肿瘤抑制率为51.38±3.18%）抑制肿瘤作用与5-FU相似，差异具有统计学意义（P＜0.05）；马钱子碱免疫纳米微粒组给药7d、14d、21d与30d时抑瘤率分别为36.73%、54.77%、69.48%、75.96%，显著高于5-Fu组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组，如图9所示。

实施例8

抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒对荷瘤动物生存期影响

建立裸鼠原位移植肝癌模型，随机分为生理盐水组、空白纳米微粒组、抗人AFP McAb组、抗人AFP McAb空白免疫纳米微粒组、5-FU组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组。分别经尾静脉注入生理盐水、5-FU（用量为20mg/kg）、马钱子碱（用量为3.23mg/kg），空白纳米微粒用量为对应含马钱子碱纳米微粒同等药物浓度下所含空白纳米微粒的摩尔剂量。治疗结果显示，5-Fu组、马钱子碱组、马钱子碱纳米微粒组和马钱子碱免疫纳米微粒组荷瘤动物生存期（d）分别为63.60±16.26、50.10±11.19、60.50±12.54、81.50±14.25，尤以马钱子碱免疫纳米微粒组生存时间最长，与其他实验组相比差异显著（F=9.010，P<0.05），表明马钱子碱免疫纳米微粒具有很好的靶向性，显著提高马钱子碱抗肿瘤效应，延长荷瘤动物生存期，如图10所示。

本发明利用阴离子聚合和化学改性技术制备羧基化的聚乙二醇和聚乳酸嵌段共聚物材料，通过超声乳化和化学交联技术研制羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱纳米微粒，通过化学偶联法制备抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物马钱子碱免疫纳米微粒，用于肝细胞癌治疗，使其载药更加“精确”地积聚在肿瘤组织，极大发挥马钱子碱抗肿瘤作用，最大限度地降低马钱子碱的毒性作用，具有精准靶向肿瘤组织细胞药物聚集、药物释放稳定，抗癌效果好，安全等优势。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，该马钱子碱免疫纳米微粒是以马钱子碱为活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作为药物包被辅料，外链接抗人AFP 单克隆抗体制成的免疫靶向纳米微粒；所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式为PLA-PEG-CH2-CH2-COOH，其分子量的范围为40-50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1：1.5~3的比例共聚形成的；所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:15~30；所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度范围为10~20μg抗体/mg纳米微粒。

2.如权利要求1所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的马钱子碱纳米微粒的粒径为274.5±64.3 nm，其Zeta 电位为-4.73±4.73 mV。

3.如权利要求1或2所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量为5~7%，包封率为70~85%。

4.如权利要求3所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒携载马钱子碱含量5.6 ±0.2%，包封率为76.0 ±2.3%。

5.如权利要求4所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例为1.5：2.5的比例共聚形成的。

6.如权利要求5所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，马钱子碱与羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比为 1:20。

7.如权利要求6所述的马钱子碱免疫纳米微粒，其特征在于，所述的马钱子碱免疫纳米微粒中，抗人AFP单克隆抗体的浓度是15μg抗体/mg纳米微粒。