CN104761732B - 一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶及其制备方法以及一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：A)将带有苯硼酸基团的引发剂与L‑谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚‑N‑环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液；B)将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与步骤A)得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液；C)将步骤B)得到的反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶；采用本发明提供的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒对人体无毒副作用，并且具有良好的水溶性、稳定性以及生物相容性。
Description
技术领域
本发明属于高分子药物载体技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶及其制备方法以及一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段有手术治疗、放射治疗和化学治疗等。
其中，手术治疗是早期癌症的首选治疗方法。手术治疗癌症是对癌症组织进行全部或局部的切除，作用效果直接迅速。但手术无法做到彻底清除癌细胞，不能消灭微小病灶，且对于已经发生转移的癌症患者仅能做姑息性的局部切除。另外，由于手术给机体带来的损伤，会使患者的免疫力降低，术后容易出现一系列并发症。
放射治疗是用各种不同能量的射线照射肿瘤，以抑制和杀灭癌细胞。它主要是通过放射线使癌细胞核内的核糖核酸长链遭受致命性的破坏，最后致其死亡。但是，放疗不能杀死所有的癌细胞，并且会降低人体免疫力，对于癌症已经转移、扩散的患者，只能够起到姑息性治疗的作用。
因此，化学治疗是肿瘤治疗最常用的治疗途径。化学治疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式。抗癌药物进入体内后很快分布到全身，既可杀灭局部的肿瘤也可杀灭远处转移的肿瘤。对于一些有全身播散倾向的肿瘤以及中晚期肿瘤，化学治疗是主要的、也是唯一可选择的治疗方法。但临床上化学治疗所用的抗肿瘤药物在杀伤癌细胞的同时，也对正常组织细胞无选择性杀伤，因此，药物毒副作用大，并且，抗肿瘤药物在应用过程中存在水溶性及稳定性差，生物相容性差等缺陷，从而限制了肿瘤药物在治疗癌症中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶及其制备方法以及一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒，采用本发明提供的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒对人体无毒副作用，并且具有良好的水溶性、稳定性以及生物相容性。
本发明提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
A)将带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液；
B)将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与步骤A)得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液；
C)将步骤B)得到的反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶；
优选的，所述带有苯硼酸基团的引发剂选自式(101)～(104)所示化合物中的一种，
优选的，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐具有式(III)结构，
其中n为聚合度，1≤n≤5。
优选的，步骤A)中所述有机溶剂选自N’N-二甲基甲酰胺、二氧六环或氯仿，步骤B)中所述有机溶剂为乙醚。
优选的，所述带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的摩尔比为1：(5～50)；所述带有苯硼酸基团的引发剂与具有式(I)结构的化合物的摩尔比为1：(2～20)；所述带有苯硼酸基团的引发剂与具有式(II)结构的化合物的摩尔比为1：(2～20)。
优选的，步骤A)所述反应的温度为15～50℃，所述反应的时间为48小时～168小时。
优选的，步骤B)所述反应的温度为15～50℃，所述反应的时间为48小时～168小时。
本发明还提供了一种上述权利要求所述的制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。
本发明还提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒，由抗肿瘤药物与上述权利要求所述的制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶组成。
优选的，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱或紫草素。
与现有技术相比，本发明提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：A)将带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液；B)将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与步骤A)得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液；C)将所述反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶；
本发明提供的纳米凝胶表面带有苯硼酸基团，苯硼酸基团可以与肿瘤细胞表面的过度表达的糖蛋白中的唾液酸基团进行特异性的结合，从而达到靶向识别肿瘤细胞的效果。该纳米凝胶颗粒通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，载药后得到纳米凝胶载药颗粒，所述载药颗粒在肿瘤部位靶向富集并被肿瘤细胞内吞，二硫键在肿瘤细胞内的高谷胱甘肽浓度下能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部的药物智能释放，达到抑制肿瘤的效果。此外，该纳米凝胶载药颗粒具有寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间，具有良好的水溶性及稳定性。该纳米颗粒均以生物可降解的聚氨基酸，寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。
附图说明
图1为实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的核磁共振氢谱谱图；
图2为实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的透射电镜图；
图3为实施例31中所制备的载药纳米凝胶的累积释放曲线；
图4为实施例31中所述的载药纳米凝胶的对B16F10细胞的细胞毒性实验结果；
图5为实施例31中所述的载药纳米凝胶的肿瘤抑制曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
A)将带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液；
B)将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与步骤A)得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液；
C)将步骤B)得到的反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶；
本发明首先将带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液。
其中，所述引发剂带有苯硼酸基团，优选为式(101)～(104)所示化合物中的一种，
本发明以带有苯硼酸基团的引发剂制备肿瘤细胞靶向的纳米凝胶，使得纳米凝胶表面带有苯硼酸基团，苯硼酸可以与肿瘤细胞表面的过度表达的糖蛋白中的唾液酸基团进行特异性的结合，从而达到靶向识别肿瘤细胞的效果。
在本发明中，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐具有式(III)结构，
其中n为聚合度，所述n的取值范围优选为1≤n≤5。
本发明对所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的来源没有特殊限制，可以为市售产品，也可以按照本领域技术人员熟知的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的制备方法自行制备。
在本发明中，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐优选按照以下方法制备：
将L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯；
将所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐。
首先，在无水条件下，将L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚进行缩合反应，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。
其中，所述寡聚乙二醇单甲醚具有式(IV)结构：
其中n为聚合度，所述n的取值范围优选为1≤n≤5。
具体的，本发明将L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚搅拌混合，得到混合液，向所述混合液中滴加浓硫酸，边搅拌边进行反应。反应结束后调节溶液至中性，离心得到固体。将所述固体用甲醇溶解后，倾倒入异丙醇中，离心得到固体，真空干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。其中所述的L-谷氨酸与寡聚乙二醇单甲醚的摩尔比优选为1：1～10，更优选为1：2～5，最优选为1：5。其中反应时间优选为12～36h，更优选为12～24h，最优选为24h。其中反应温度优选为20～30℃，最优选为25℃。
在无水条件下，得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯在有机溶剂中混合，进行缩合反应。
所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃。所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述反应温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，更优选为0.2小时～2小时。
缩合反应结束后，将得到的反应液优选用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，得到分离产物。将所述分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐。本发明对所述分离产物的洗涤、重结晶和干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员熟知的方法即可。
将得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐与所述引发剂溶解于有机溶剂中，在氮气的气氛下搅拌反应。所述引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的摩尔比优选为1：(5～50)，更优选为1：(5～25)，最优选的为1：10。所述有机溶剂优选为N’N-二甲基甲酰胺、二氧六环或氯仿，更优选为N’N-二甲基甲酰胺或二氧六环，最优选为N’N-二甲基甲酰胺。所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的质量与有机溶剂的体积比优选为1g:(1～20)mL，更优选为1g:(3～15)mL，最优选为1g:(5～10)mL。所述反应温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应时间选为48小时～168小时，更优选为72小时～120小时，最优选为48d。
反应结束后，得到混合溶液。本发明将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与上述得到的混合溶液混合，进行反应。
其中，具有式(I)结构的化合物为L-胱氨酸-N-环内酸酐，其分子结构中含有二硫键，所述纳米凝胶颗粒通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，在肿瘤部位靶向富集并被肿瘤细胞内吞，二硫键在肿瘤细胞内的高谷胱甘肽浓度下能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部的药物智能释放，达到抑制肿瘤的效果，
本发明对所述具有式(I)结构的化合物的来源并没有特殊限制，可以为市售产品，也可以为本领域技术人员树脂的制备方法自行制备。在本发明中，所述具有式(I)结构的化合物优选按照如下方式进行制备：
将L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。
具体的，在无水条件下，用有机溶剂溶解所述L-胱氨酸，在有机溶剂中，L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。所述L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)，所述有机溶剂优选为四氢呋喃，所述L-胱氨酸-N-环内酸酐与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述反应温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，更优选为0.2小时～2小时。
缩合反应结束后，将得到的反应液优选用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。本发明对所述分离产物的洗涤、重结晶和干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员熟知的方法即可。
在本发明中，具有式(II)结构的化合物为L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。
本发明对所述具有式(II)结构的化合物的来源并没有特殊限制，可以为市售产品，也可以为本领域技术人员树脂的制备方法自行制备。在本发明中，所述具有式(II)结构的化合物优选按照如下方式进行制备：
将L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。
具体的，在无水条件下，用有机溶剂溶解所述L-苯丙氨酸，在有机溶剂中，L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到具有式(II)结构的化合物，即L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)，所述有机溶剂优选为四氢呋喃，所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述反应温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，更优选为0.2小时～2小时。
缩合反应结束后，得到的反应液优选用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。本发明对所述分离产物的洗涤、重结晶和干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员熟知的方法即可。
将上述制备得到的具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液。
具体的，将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与得到的混合溶液混和，在氮气气氛下搅拌反应。
其中，所述引发剂与具有式(I)结构的化合物的摩尔比优选为1：(2～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。所述引发剂与具有式(II)结构的化合物的摩尔比优选为1：(2～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。所述的反应温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述的反应时间优选为48小时～168小时，更优选为72小时～120小时，最优选为48d。
反应结束后，得到反应液。将所述反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。所述有机溶剂优选为乙醇，所述反应液与乙醇混合后，形成沉淀物，将所述沉淀物过滤后，进行真空干燥，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。本发明对所述过滤以及真空干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的过滤以及真空干燥的方法即可。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。本发明提供的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶表面带有苯硼酸基团并且具有还原响应性，可以与抗肿瘤药物制备得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒。
本发明还提供了一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒，该纳米凝胶载药颗粒由抗肿瘤药物与上述制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶组成。本发明对所述肿瘤靶向的纳米凝胶载药颗粒的制备方法并没有特殊限制，在本发明中，所述肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒优选按照如下方法进行制备
将上述制备得到的肿瘤靶向的纳米凝胶与抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中，混合均匀。加入等体积的去离子水，搅拌，透析，冷冻干燥，得到肿瘤靶向的纳米凝胶载药颗粒。所述有机溶剂优选为N’N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，更优选为二甲基亚砜。本发明对所述搅拌和透析的方式并没有特殊限制，本领域技术人员公知的搅拌和透析的方式即可。所述搅拌的时间优选为8～24h，更优选的为8～16h，最优选的为8h。其中，所述透析的温度优选为4～20℃，更优选为4～8℃，最优选为4℃。所述透析的时间优选为4～12h，更优选为4～8h，最优选为8h。所述肿瘤靶向的纳米凝胶与抗肿瘤药物的质量比为10：(10～1)，优选为10：(8～3),最优选为10：(6～4)。所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱或紫草素。
本发明提供的纳米凝胶表面带有苯硼酸基团，苯硼酸基团可以与肿瘤细胞表面的过度表达的糖蛋白中的唾液酸基团进行特异性的结合，从而达到靶向识别肿瘤细胞的效果。该纳米凝胶颗粒通过二硫键交联形成纳米凝胶结构，载药后得到纳米凝胶载药颗粒，所述载药颗粒在肿瘤部位靶向富集并被肿瘤细胞内吞，二硫键在肿瘤细胞内的高谷胱甘肽浓度下能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部的药物智能释放，达到抑制肿瘤的效果。此外，该纳米凝胶载药颗粒具有寡聚乙二醇的外壳，可以抗血液蛋白吸附，从而延长血液循环时间，具有良好的水溶性及稳定性。该纳米颗粒均以生物可降解的聚氨基酸，寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶及其制备方法以及一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1～5L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯的制备
将20mL的乙二醇单甲醚，40mL的二乙二醇单甲醚，60mL的三乙二醇单甲醚，80mL的四乙二醇单甲醚和100mL的五乙二醇单甲醚分别与10g L-谷氨酸搅拌混合，滴加浓硫酸，边搅拌边进行反应。反应结束后，调节溶液至中性，离心得到固体，所述固体用甲醇溶解后，再倾倒入异丙醇中，离心得到固体，真空干燥，得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯。具体得率见表1，表1为实施例1～5制备得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯的得率。
表1实施例1～5制备得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯的得率(请补充得率)
| 产物 | 得率/％ | |
| 实施例1 | L-谷氨酸乙二醇单甲醚酯 | 88.7 |
| 实施例2 | L-谷氨酸二乙二醇单甲醚酯 | 87.3 |
| 实施例3 | L-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯 | 88.4 |
| 实施例4 | L-谷氨酸四乙二醇单甲醚酯 | 86.5 |
| 实施例5 | L-谷氨酸五乙二醇单甲醚酯 | 87.1 |
实施例6～10L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的制备
将1g实施例1～5中所述的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯分别与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量的石油醚中沉降、分离、洗涤、重结晶以及干燥后得到L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐。具体得率见表2，表2为实施例6～10制备得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的得率。
表2实施例6～10制备得到的L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐的得率(请补充表2中的得率)
| 产物 | 得率/％ |
| 实施例6 | L-谷氨酸乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐 | 89.4 |
| 实施例7 | L-谷氨酸二乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐 | 91.3 |
| 实施例8 | L-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐 | 85.6 |
| 实施例9 | L-谷氨酸四乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐 | 90.2 |
| 实施例10 | L-谷氨酸五乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐 | 88.7 |
实施例11～15不同分子量的聚(L-谷氨酸乙二醇单甲醚酯)的制备
称取1g式(101)所示的对氨基苯硼酸，再分别称取3.8g，7.6g，15.2g，30.4g，38gL-谷氨酸乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，加入到反应瓶中，氮气气氛保护，加入100mL N’N-二甲基甲酰胺，反应72小时，得到聚(L-谷氨酸乙二醇单甲醚酯)的溶液。
实施例16～19不同L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐链节的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的制备
称取1g式(101)所示的对氨基苯硼酸，再分别称取9g的L-谷氨酸二乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，10.4g的L-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，14.2g的L-谷氨酸四乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，15.8g的L-谷氨酸五乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，加入到反应瓶中，氮气气氛保护，加入100mL N’N-二甲基甲酰胺，反应72小时，得到不同的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的溶液。
实施例20～22不同引发剂引发的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)
将1g式(102)所示的引发剂、1.1g式(103)所示的引发剂以及1.1g式(104)所示的引发剂分别与10.4gL-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯-N-环内酸酐，加入到反应瓶中，氮气气氛保护，加入100mL N’N-二甲基甲酰胺，反应72小时，得到不同的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的溶液。
实施例23～26不同交联度的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备
将0.57g的L-苯丙氨酸-N-环内酸酐分别与0.48g，0.95g，1.43g，1.90g的L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例21所述的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的溶液中，氮气氛下搅拌反应3天。将反应后的溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。具体表征见表3，表3为实施例23～26制备的肿瘤靶向纳米凝胶的表征。
表3实施例23～26制备的肿瘤靶向纳米凝胶的表征
| 实施例 | N(Phe) | N(Cys) | 分子量 | 产率(％) | |
| 23 | 10 | 2.5 | 2.5 | 3640 | 99.2 |
| 24 | 10 | 2.5 | 5 | 4160 | 95.3 |
| 25 | 10 | 2.5 | 7.5 | 4690 | 98.2 |
| 26 | 10 | 2.5 | 10 | 5220 | 97.4 |
表3中，N(Glu-OEG3)，N(Phe)，N(Cys)分别表示聚(L-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯)链节数与引发剂摩尔数之比；分子量为纳米凝胶分子量与引发剂个数之比。
将实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶进行元素分析，结果见表4，表4为实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的元素分析表。
表4实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的元素分析表
| N(％) | C(％) | H(％) | S(％) |
| 7.85 | 49.61 | 6.287 | 7.898 |
由表4可知，该纳米凝胶中包含所需元素,产物成功合成。
将实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶进行核磁共振分析，结果见图1，图1为实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的核磁共振氢谱谱图。
将实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶进行透射电镜试验，结果见图1，图2为实施例23制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的透射电镜图。
实施例27～30不同聚苯丙氨酸链节的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备
分别将将0.57g，1.14g，1.71g，2.28g的L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g的L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例21所述的聚(L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚酯)的溶液中，但其气氛下搅拌反应3天。将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。具体表征见表5，表5为实施例27～30制备的肿瘤细胞靶向纳米凝胶的表征。
表5实施例27～30制备的肿瘤细胞靶向纳米凝胶的表征
| 实施例 | N(Phe) | N(Cys) | 分子量 | 产率(％) | |
| 27 | 10 | 2.5 | 10 | 5220 | 96.4 |
| 28 | 10 | 5 | 10 | 5580 | 98.1 |
| 29 | 10 | 7.5 | 10 | 5950 | 97.5 |
| 30 | 10 | 10 | 10 | 6310 | 98.4 |
表5中，N(Glu-OEG3)，N(Phe)，N(Cys)分别表示聚(L-谷氨酸三乙二醇单甲醚酯)链节数与式(103)所示的引发剂摩尔数之比；分子量为纳米凝胶分子量与式(103)所示的引发剂个数之比。
实施例31～35不同载药量的载药纳米凝胶的制备
称取5份100mg实施例23中制备的纳米凝胶分别与10mg，20mg，40mg，60mg，80mg阿霉素溶解于10mL二甲基亚砜中，搅拌12h。加入10mL去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒。
将实施例31制备的载药纳米凝胶进行阿霉素积累释放试验，具体的，将载药纳米凝胶分别在pH5.5、pH6.8、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液以及10mM谷胱甘肽的磷酸盐缓冲溶液的条件下，测试1h、2h、4h、6h、10h、12h、24h、36h、48h和72h阿霉素的积累释放量，具体结果见图3，图3为实施例31中所制备的载药纳米凝胶的累积释放曲线。图3中，为载药纳米凝胶在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中的积累释放曲线，-●-为载药纳米凝胶在pH6.8的磷酸盐缓冲溶液中的积累释放曲线，为载药纳米凝胶在pH5.5的磷酸盐缓冲溶液中的积累释放曲线，为载药纳米凝胶在10mM谷胱甘肽溶液中的积累释放曲线。
实施例36～45负载不同药物的纳米凝胶内核的制备
称取10份100mg实施例23中制备的纳米凝胶分别与20mg表阿霉素，吡喃阿霉素，紫杉醇，多西紫杉醇，顺铂，卡铂，奥沙利铂，硼替佐米，喜树碱，紫草素溶解于10mL二甲基亚砜中，搅拌12h。分别加入10mL去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到载药内核。
实施例46肿瘤细胞抑制率表征:
将B16F10细胞均匀种在96孔板中，分为6组，每组7孔，每孔细胞数约为7000，分别用3组pH7.4的DMEM培养基、一组pH＝6.5的DMEM培养基、一组含有谷胱甘肽的DMEM培养基、一组含有丁酰亚环酰亚胺的DMEM培养基培养，培养基体积为200μL。
然后将一组浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1562mg mL-1的阿霉素加入到其中一组pH＝7.4的DMEM培养基孔板中。再将实施例31制备得到的载药阿霉素纳米凝胶颗粒分为成4组,每组浓度依次稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1562mg mL-1,分别加入到pH＝6.5的DMEM培养基，pH＝7.4的DMEM培养基，含有谷胱甘肽的DMEM培养基，含有丁酰亚环酰亚胺培养基的孔板中，一组pH7.4的DMEM培养基不加载阿霉素纳米凝胶以及游离阿霉素作为对照组，再次培养24小时。
培养结束后吸去培养基，用含有噻唑蓝的溶液处理，测试其在490纳米处的吸收值。细胞存活率使用以下公式计算：
具体结果见图4，图4为实施例31中所述的载药纳米凝胶的对B16F10细胞的细胞毒性实验结果。图4中，-■-为载药纳米凝胶在含有谷胱甘肽的条件下对B16F10细胞的细胞毒性实验结果，-●-为载药纳米凝胶在pH6.5的条件下对B16F10细胞的细胞毒性实验结果，-▲-为载药纳米凝胶在含有丁酰亚环酰亚胺的条件下对B16F10细胞的细胞毒性实验结果，为载药纳米凝胶在pH7.4的条件下对B16F10细胞的细胞毒性实验结果，-◆-为游离阿霉素在pH 7.4的条件下对B16F10细胞的细胞毒性实验结果。
实施例47体内抑瘤实验
选取负载B16F10移植瘤、体重为20g左右的雄性C57鼠18只，分为三组，每组6只，分别通过尾静脉注射生理盐水，阿霉素，载药纳米颗粒，其注射的阿霉素剂量为5mg kg-1。其中所述注射生理盐水的组为对照组。
骨钉时间测量其肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积使用以下公式计算：
肿瘤体积＝长径×短径×短径/2。
测量15天后，处死。结果见图5，图5为实施例31中所述的载药纳米凝胶的肿瘤抑制曲线。图5中，为载药纳米凝胶的肿瘤抑制曲线，-◆-为游离阿霉素的肿瘤抑制曲线，为对照组的肿瘤抑制曲线。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐溶解于有机溶剂中进行反应，得到混合溶液；
B)将具有式(I)结构的化合物、具有式(II)结构的化合物与步骤A)得到的混合溶液混合，进行反应，得到反应液；
C)将步骤B)得到的反应液与有机溶剂混合，过滤，得到肿瘤细胞靶向的纳米凝胶；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述带有苯硼酸基团的引发剂选自式(101)～(104)所示化合物中的一种，
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐具有式(III)结构，
其中n为聚合度，1≤n≤5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中所述有机溶剂选自N’N-二甲基甲酰胺、二氧六环或氯仿，步骤C)中所述有机溶剂为乙醚。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述带有苯硼酸基团的引发剂与L-谷氨酸寡聚乙二醇单甲醚-N-环内酸酐的摩尔比为1：(5～50)；所述带有苯硼酸基团的引发剂与具有式(I)结构的化合物的摩尔比为1：(2～20)；所述带有苯硼酸基团的引发剂与具有式(II)结构的化合物的摩尔比为1：(2～20)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述反应的温度为15～50℃，所述反应的时间为48小时～168小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述反应的温度为15～50℃，所述反应的时间为48小时～168小时。
8.一种如权利要求1～7任意一项权利要求所述的制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶。
9.一种肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒，其特征在于，由抗肿瘤药物与如权利要求1～7任意一项权利要求所述的制备方法制备得到的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶组成。
10.根据权利要求9所述的肿瘤细胞靶向的纳米凝胶载药颗粒，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱或紫草素。
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