CN110105562B - 含多巴胺配体的两嵌段聚合物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含多巴胺配体的两嵌段聚合物及其合成方法和应用，该聚合物以聚乙二醇为亲水端，以苯硼酸修饰聚乙二醇作为靶向配体，以谷氨酸和谷氨酸多巴胺为重复单元作为疏水端。本发明制备的含多巴胺配体的两嵌段聚合物可以用于包裹阿霉素形成载药纳米胶束，再加入铁离子通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，形成核交联的载阿霉素纳米胶束。本发明制备的核交联胶束制备方法简便，而且药物包封率高，胶束能够在血液循环过程中保持稳定，能在肿瘤细胞溶酶体内实现pH敏感的药物释放。

Description

含多巴胺配体的两嵌段聚合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及含多巴胺配体的两嵌段聚合物的合成以及应用于增强肿瘤细胞摄取及肿瘤细胞溶酶体pH控制的药物释放的智能纳米胶束载体。
背景技术
传统化疗药物虽然在肿瘤治疗上取得很大成功，但其很多局限性限制了临床疗效的进一步提高，如严重的毒副作用、选择性差、肿瘤细胞易对其产生耐药性等。智能纳米药物传递系统为实现化疗药物精准治疗和减少毒副作用提供了一个有效途径。利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(EPR效应)，智能纳米药物传递系统能够在肿瘤组织富集，同时利用肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，在肿瘤微环境作用下快速解体，迅速释放出抗肿瘤药物，实现药物的定点控制释放，抑制肿瘤细胞增殖。
然而，非交联的纳米药物传递系统在血液长循环过程中稳定性较差，受到血液的稀释作用和高剪切力，容易解体，不能够有效在肿瘤组织富集，同时容易提前渗出药物，产生毒副作用，降低治疗效果。因此通过核交联策略稳定纳米胶束，可以提高纳米药物传递系统在血液循环过程中的稳定性及药物传递能力。
此外，传统的纳米药物传递系统通常以聚乙二醇(PEG)作为亲水链段以提高纳米系统的长循环能力，但PEG壳层的存在同时也不利于肿瘤细胞内吞，抗肿瘤药物难以足剂量到达位于细胞内的作用靶点。苯硼酸可以特异性识别肿瘤细胞表面高表达的唾液酸(SA)，利用苯硼酸修饰PEG端可以实现苯硼酸介导的增强的细胞内吞。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提出的一种含多巴胺配体的两嵌段聚合物，该聚合物构筑的核交联载药胶束包封率高，不仅在体内实现长效循环，抵抗血液的稀释作用，而且在肿瘤部位累积后可通过胶束表面的苯硼酸增强细胞内吞，之后在肿瘤细胞溶酶体内通过pH响应实现药物的定点快速释放。因此，本发明制备的两嵌段聚合物可以用于构筑核交联纳米胶束，具有较好的释药性，较低的细胞毒性和良好的细胞吞噬性，实现了“长效循环、增强细胞内吞及定点释放”的新途径。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种含多巴胺配休的两嵌段聚合物，具有式I结构：
Figure BDA0002036446830000021
式I；
其中，x＝10，y＝5。
一种所述含多巴胺配体的两嵌段聚合物的合成方法，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：将间氨基苯硼酸和丁二酸酐以1∶(1.5-3)的摩尔比溶于吡啶，室温条件下反应，反应4h后旋干溶剂，加入1M的NaOH水溶液溶解固体，再加入1M的盐酸调节pH至3.0，有固体逐渐析出；过滤，将得到的固体与EDCI和NHS以1∶(1.25-2)∶(1.25-2)的摩尔比溶于二氯甲烷，加入1当量的双氨基聚乙二醇室温搅拌反应12h；反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG为大分子引发剂；
步骤2：将大分子引发剂PBA-PEG和聚合单体5-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐以1∶15的摩尔比溶于DMF，室温反应48h，反应液用冰乙醚沉淀三次，得到白色固体PBA-PEG-PBLG；将PBA-PEG-PBLG和甲基苯基硫醚以1∶(10-100)的摩尔比溶于三氟乙酸，冰浴下滴加三氟甲磺酸，PBA-PEG-PBLG和三氟甲磺酸的摩尔比为1∶(10-100)，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG-PGlu；将PBA-PEG-PGlu与多巴胺和EDCI以1∶(5-20)∶(18-30)的摩尔比溶于DMSO，反应24h，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到淡黄色固体含多巴胺配体的两嵌段聚合物PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)，具有式I结构：
Figure BDA0002036446830000022
式I；
其中，x＝10，y＝5。
一种所述含多巴胺配体的两嵌段聚合物用于制备药物载体的应用。
所述药物为脂溶性药物。
所述载体为核交联纳米胶束。优选为pH敏感型核交联纳米胶束载体。
所述脂溶性药物为阿霉素、SN38或紫杉醇。
所述核交联纳米胶束以聚乙二醇为亲水层，表面带有苯硼酸为靶向配体，表面的苯硼酸能够特异性识别肿瘤细胞表面高表达的唾液酸，实现苯硼酸介导的增强的细胞内吞；其内部是以谷氨酸和谷氨酸多巴胺为重复单元的疏水核，疏水内核在加入铁离子后通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，该配位键能够响应肿瘤细胞溶酶体内酸性微环境，实现溶酶体pH敏感释药。
其中，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞等；优选地，为肝癌细胞。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种含多巴胺配体的两嵌段聚合物及其合成方法和应用，该聚合物以聚乙二醇为亲水端，端基修饰了苯硼酸作为靶向配体，以谷氨酸和谷氨酸多巴胺为重复单元作为疏水端。本发明制备的含多巴胺配体的两嵌段聚合物可以用于包裹阿霉素形成载药纳米胶束，再加入铁离子通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，形成核交联的载阿霉素纳米胶束。本发明制备的核交联胶束制备方法简便，而且药物包封率高；核交联策略能够抵抗血液的无限稀释效应，在血液循环中保持稳定，有利于其在肿瘤组织富集；该pH敏感核交联胶束表面的苯硼酸可以特异性识别肿瘤细胞表面高表达的唾液酸，实现苯硼酸介导的增强的细胞内吞；能在肿瘤细胞溶酶休内实现pH敏感的药物释放，同时对肿瘤细胞较强的抑制活性。
附图说明
图1为本发明所述含多巴胺配体的两嵌段聚合物PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)的1HNMR谱图；
图2为核交联载阿霉素纳米胶束的结构示意图；
图3为核交联空胶束的粒径分布(DLS)图；
图4为核交联空胶束的形貌(TEM)图；
图5为核交联空胶束在DMSO中的形貌(TEM)图；
图6为未交联空胶束在DMSO中的形貌(TEM)图；
图7为核交联载阿霉素纳米胶束的粒径分布(DLS)图；
图8为核交联载阿霉素纳米胶束的形貌(TEM)图；
图9为核交联载阿霉素纳米胶束在不同pH条件下的累积药物释放曲线图；
图10为HepG2细胞和HL7702细胞对核交联载阿霉素纳米胶束的细胞吞噬行为荧光强度统计图；
图11为核交联空白胶束对HepG2的细胞毒性图(A)和核交联载阿霉素胶束及盐酸阿霉素对HepG2的细胞毒性图(B)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
大分子引发剂PBA-PEG的合成
(1)PBA-COOH靶向基团的合成
将2.5g间氨基苯硼酸(18mmol)和5g丁二酸酐(50mmol)溶于15mL吡啶，室温条件下反应，反应4h后旋干溶剂，加入1M的NaOH水溶液溶解固体，再加入1M的盐酸调节pH至3.0，有固体逐渐析出。过滤，得到棕色固体PBA-COOH 3.6g，产率84％。
所述PBA-COOH结构如式(1)所示。
Figure BDA0002036446830000031
式(1)。
(2)PBA-PEG大分子引发剂的合成
将PBA-COOH(237mg，1mmol)与EDCI(288mg，1.5mmol)和NHS(173mg，1.5mmol)溶于二氯甲烷，加入4g双氨基聚乙二醇室温搅拌反应12h。反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG 3.6g，产率85％。
所述PBA-PEG结构如式(2)所示
Figure BDA0002036446830000041
式(2)。
实施例2
含多巴胺配体的两嵌段聚合物PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)的合成
(1)PBA-PEG-PBLG的合成
将大分子引发剂PBA-PEG(2g，0.5mmol)和(2g，7.5mmol)聚合单体5-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐溶于DMF，室温反应48h，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，得到白色固体PBA-PEG-PBLG，产率81％。
所述PBA-PEG-PBLG结构如式(3)所示
Figure BDA0002036446830000042
式(3)，其中m＝15。
(2)将1g PBA-PEG-PBLG和1.4mL甲基苯基硫醚溶于12mL三氟乙酸，冰浴下滴加1.2mL三氟甲磺酸，搅拌反应1h后升至室温继续反应1.5h，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG-PGlu，产率86％。
所述PBA-PEG-PGlu结构如式(4)所示
Figure BDA0002036446830000043
式(4)，其中m＝15。
(3)将100mg PBA-PEG-PGlu与多巴胺(34.8mg，0.227mmol)和EDCI(57.6mg，0.3mmol)溶于10mL DMSO，反应24h，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到淡黄色固体含多巴胺配体的两嵌段聚合物PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)，产率80％。
所述PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)结构如式I所示
Figure BDA0002036446830000051
式I，
其中x＝10，y＝5。
实施例3
核交联空胶束的制备
(1)未交联空胶束的制备：称取10mg具有式(I)结构的PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)(其中，式I中，x＝10，y＝5)，溶于1mL分析纯二甲亚砜，滴加入搅拌速度为500r/min的10mL超纯水中，继续搅拌0.5h，将得到的混合溶液用0.45Bm的针式过滤器过滤，然后透析48h每6h换一次超纯水)以除去有机溶剂。
(2)空胶束的交联：向未交联纳米胶束溶液加入111μL浓度为40mM的氯化铁水溶液，继续室温下搅拌1h，然后调节pH至7.4。随后透析除去未络合的铁离子。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到核交联空胶束。
如图3所示，DLS测得核交联空胶束平均粒径为54nm，图4所示TEM结果与DLS测试结果吻合，观察到其形貌为球形。
实施例4
核交联空胶束抗稀释能力
利用TEM直接观察在DMSO中核交联空胶束和未交联空胶束的形貌变化。
核交联载阿霉素纳米胶束抗稀释能力的TEM结果如图5所示，虽然粒径增大，但依然能够观察到形貌为类球形的纳米粒子。而未交联载药胶束的粒径如图6所示，在DMSO中呈现逐渐溶解的状态，已经不具备完整的球性胶束形貌。由此证明了制备的核交联载阿霉素纳米胶束与未交联载药胶束相比，具有抵抗无限稀释的能力，在血液循环中更加稳定，能够保持形貌的完整性。
实施例5
核交联载阿霉素纳米胶束的制备
称取10mg具有式I结构的PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)(其中，式I中，x＝10，y＝5)，溶于1mL分析纯二甲亚砜。称取2mg的盐酸阿霉素加入适量三乙胺脱盐，将脱盐后的阿霉素和溶于二甲亚砜的PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)搅拌混匀，滴加入搅拌速度为500r/min的10mL超纯水。继续搅拌0.5h，将得到的混合溶液用0.45μm的针式过滤器过滤，然后透析48h(每4h换一次超纯水)以除去有机溶剂，得到未交联的载阿霉素纳米胶束溶液。向未交联的载阿霉素纳米胶束溶液加入111μL浓度为40mM的氯化铁水溶液，继续室温下搅拌1h，然后调节pH至7.4。随后透析除去未络合的铁离子。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到所述的核交联载阿霉素纳米胶束。
用紫外分光光度法测定载药胶束的载药量(DLC)和包封率(DLE)。
取5mL未交联的载阿霉素纳米胶束溶液，冷冻干燥并称重，用DMSO充分溶解并定容至10mL。之后测定待溶液在480nm的吸光度值，代入预先绘制的标准曲线计算得到待测DMSO溶液中的阿霉素的浓度，进而计算载药胶束的载药量(DLC)和包封率(DLE)。
载药量(DLC)＝(胶束中阿霉素质量/载药胶束质量)×100％
包封率(DLE)＝(胶束中阿霉素质量/阿霉素投料量)×100％
测得载药胶束的DLC为15.63±0.25％，DLE为92.65±1.77％。由此可见本发明制备的含多巴胺配休的两嵌段聚合物作为药物载休具有较高的药物包封率。
实施例6
核交联载阿霉素纳米胶束的表征
所述核交联载阿霉素纳米胶束结构如图2所示，以聚乙二醇为亲水层，表而带有苯硼酸为靶向配休，内部是以谷氨酸多巴胺为重复单元的疏水核，疏水内核在加入铁离子后通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联。
实验结果如图7所示，DLS测得纳米粒径及具分布与图8所示TEM结果极具吻合，且大多数分布在200nm附近，符合纳米胶束具有被动靶向所需的特质，即纳米粒径范围在5-500nm的纳米胶束，能够通过被动靶向聚集在肿瘤组织。
实施例7
核交联载阿霉素纳米胶束在不同pH条件下的释药行为
利用荧光分光光度法测定核交联载阿霉素纳米胶束在不同pH条件下的阿霉素累积释放量。分别取1mL核交联载阿霉素纳米胶束(1mg/mL)置于pH 5.0和pH 7.4的磷酸缓冲液中透析72h(MWCO500)，荧光分光光度法测定透析后各组的阿霉素含量，与测得阿霉素的标准曲线对照，计算出各组释药量。
实验结果如图9所示，核交联载阿霉素纳米胶束的释药量pH呈现出一定的依赖关系。在pH 5.0的磷酸缓冲液介质中，72h后累计释药量已高达74.5±4.96％，且前12h内释药速率很快，在随后时间里释药速率相对减缓。而核交联载阿霉素纳米胶束在pH 7.4条件下72h累计释药量仅为5.5±0.28％。在pH5.0条件下的累积释药量为pH 7.4条件下累积释药量的13倍。该实验证明了核交联载阿霉素纳米胶束的pH触发释药性能以及血液循环条件下纳米胶束的稳定性。
实施例8
核交联载阿霉素纳米胶束的细胞吞噬行为
将HepG2细胞和HL7702细胞在六孔板(Greiner)上预培养24h(2.5×105cells/孔)后，分别加入2mL培养基，以阿霉素含量为标准，其中每组核交联载阿霉素纳米胶束的阿霉素浓度为1μg/mL，继续培养1，2和4h后，PBS(pH 7.4)清洗数次，消化后离心收集，转移至96孔板，用流式细胞仪对各组细胞荧光强度进行测定。
实验结果如图10所示，在不同培育时间下，用核交联载阿霉素纳米胶束培养后的HepG2细胞的荧光强度始终明显高于培养后的HL7702细胞的荧光强度。这是因为HepG2细胞表面的SA含量高，核交联载阿霉素纳米胶束表面的苯硼酸与细胞表面的SA结合，增强了细胞的内吞，细胞的荧光强度增加；而HL7702细胞表面的SA含量低，其荧光强度则低于HepG2细胞。
实施例9
核交联载阿霉素纳米胶束抑制HepG2的IC50
将处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板上，每孔7×103个细胞，恒温培养箱培养12h后，分别加入20μL培养基，各组含有一系列浓度梯度的核交联载阿霉素纳米胶束和盐酸阿霉素，最终浓度均以阿霉素含量为标准，分别为0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5和10μg/mL；继续培养72h之后，吸去80μL培养基，加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)后继续培养4h，加入50μL三联液，溶解甲瓒晶体，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度。细胞存活率计算如下：
细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)×100％
如图11(A)所示，由本发明所述含多巴胺配体的两嵌段聚合物制备的核交联空胶束对HepG2细胞表现出低毒性，证明其良好的生物相容性。本发明中，如图11(B)所示，核交联载阿霉素胶束对HepG2的细胞毒性在不同阿霉素浓度下优于盐酸阿霉素。所述核交联载阿霉素纳米胶束和盐酸阿霉素对于HepG2的IC50分别为0.11±0.03μg/m和0.36±0.10μg/mL。与图10结合分析可知，本法制备的纳米胶束增强了细胞对纳米胶束的吞噬，而且结合图9可知制备的纳米胶束在溶酶体pH条件下能够快速释放阿霉素，因此核交联载阿霉素纳米胶束能够快速被HepG2细胞内吞并且快速释放阿霉素，进而抑制肿瘤细胞增殖。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (6)

1.一种含多巴胺配体的两嵌段聚合物的合成方法，其特征在于，所述两嵌段聚合物具有式I结构：
Figure FDA0003117441310000011
其中，x＝10，y＝5；合成方法包括以下具体步骤：
步骤1：将间氨基苯硼酸和丁二酸酐以1∶(1.5-3)的摩尔比溶于吡啶，室温条件下反应，反应4h后旋干溶剂，加入1M的NaOH水溶液溶解固体，再加入1M的盐酸调节pH至3.0，有固体逐渐析出；过滤，将得到的固体与EDCI和NHS以1∶(1.25-2)∶(1.25-2)的摩尔比溶于二氯甲烷，加入1当量的双氨基聚乙二醇室温搅拌反应12h；反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG为大分子引发剂；
步骤2：将大分子引发剂PBA-PEG和聚合单体5-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐以1∶15的摩尔比溶于DMF，室温反应48h，反应液用冰乙醚沉淀三次，得到白色固体PBA-PEG-PBLG；将PBA-PEG-PBLG和甲基苯基硫醚以1∶(10-100)的摩尔比溶于三氟乙酸，冰浴下滴加三氟甲磺酸，PBA-PEG-PBLG和三氟甲磺酸的摩尔比为1∶(10-100)，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到白色固体PBA-PEG-PGlu；将PBA-PEG-PGlu与多巴胺和EDCI以1∶(5-20)∶(18-30)的摩尔比溶于DMSO，反应24h，反应液用冰乙醚沉淀三次，过滤得到的固体用去离子水透析24h，冷冻干燥得到淡黄色固体即所述含多巴胺配体的两嵌段聚合物PBA-PEG-P(Glu-co-GluDA)。
2.一种权利要求1所述方法制备的含多巴胺配体的两嵌段聚合物用于制备药物载体的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为脂溶性药物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为核交联纳米胶束。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脂溶性药物为阿霉素、SN38或紫杉醇。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核交联纳米胶束以聚乙二醇为亲水层，表面带有苯硼酸为靶向配体，表面的苯硼酸能够特异性识别肿瘤细胞表面高表达的唾液酸，实现苯硼酸介导的增强的细胞内吞；其内部是以谷氨酸和谷氨酸多巴胺为重复单元的疏水核，疏水内核在加入铁离子后通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，该配位键能够响应肿瘤细胞溶酶体内酸性微环境，实现溶酶体pH敏感释药。
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