CN105963708A - 一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用 - Google Patents

一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用。所述磷脂酰纳米前药由含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物和磷脂类化合物在磷脂酶D的催化作用下通过磷氧键键合形成。本发明还提供了一种该酶促响应释放的磷脂酰纳米前药将抗肿瘤药物靶向释放到肿瘤组织中的应用。本发明创造性地利用肿瘤组织中高表达的磷脂酶D的水解/转脂双向反应特性，在体外利用磷脂酶D生物催化合成双亲性的磷脂酰纳米前药，当前药靶向积累到肿瘤中响应磷脂酶D触发水解，特异性释放抗肿瘤药物，同时解决了靶向药物安全稳定性和有效释放的问题。

Description

一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药学领域，更具体地涉及一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用。
背景技术
化疗药物通常是一类具有显著细胞毒性的化合物，随着血液循环分布到全身后，这类药物不仅作用于肿瘤细胞，也同时作用于正常细胞，因而引起很大的严重的毒副作用，降低患者的生存质量，这也是癌症化疗的困境所在，如何降低化疗药物的毒副作用是化疗药物研究的一个重要问题。为了解决这一瓶颈问题，人们致力于研究能靶向病变组织的药物传递系统研究，让化疗药物长上“眼睛”，定位到肿瘤组织，起到定点杀伤的作用，靶向药物传递成为肿瘤药物研究的一个重要途径。随着纳米药物在抗肿瘤领域显现出明显的优势，越来越多的国家、制药公司、高校和科研院所将目光投向纳米药物这一领域，大量生物相容性高、免疫原性低、生物可降解的纳米药物载体被开发和应用。特别是两亲聚合物，由于其独特的表面性能，一定条件时在水溶液中可高度分散形成有序聚集体而受到了越来越多科研人员的重视。但大多载体材料由于其靶向性及其降解速率的不同，可浓集于某种细胞中，从而会产生难以预料的潜在毒性和免疫源性。基于上述安全性和稳定性问题，药质体理论(Pharmacosomes)被提出，即将含有羧基的药物和甘油酯、磷脂的羟基共价键合成两亲性前药，自组装形成纳米前药。纳米前药形式解决了储存和体内运输时安全、稳定的要求，但达到效应部位后，前药必须及时释放活性药物并达到有效生物活性浓度，才有临床应用意义。目前已报到的肿瘤纳米药物响应释放模式有两类：一类为外源触释，利用热、光、磁性、超声波等物理方法刺激药物在效应部位释放。另一类为肿瘤组织内源性触释，即利用肿瘤组织内源性生理病理特性触发药物释放。研究已报道的内源性响应释放技术包括：pH响应释放，缺氧介导的释放，酶触发响应释放等。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用，从而解决现有技术中靶向药物安全稳定性和有效释放的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药，所述磷脂酰纳米前药是由含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物和磷脂类化合物在磷脂酶D的催化作用下通过磷氧键键合形成。
本发明针对纳米前药的酶触发响应释放进行研究，选择了肿瘤组织内特异性高表达的磷脂酶D(phospholipase D，PLD)作为研究的切入点，利用它催化磷脂类化合物转脂合成和水解的双向特征，作为磷脂酰纳米前药中载体和药物键和的“钥匙”，通过磷脂酰的“开关”，解决靶向药物安全稳定性和有效释放的问题。
根据本发明提供的磷脂酰纳米前药以前药的形式在体内转运，靶向积累到肿瘤部位，再通过肿瘤组织中高表达的磷脂酶D的水解释放出原药，特异性杀灭肿瘤细胞。
所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物不限分子结构，作为举例而非限制地，可包括盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌，实际上只要是含有伯醇，同时具有亲水性的抗肿瘤药物均可适用于本发明。
所述磷脂类化合物可选自：二癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC)，二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)，二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)，1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(MSPC)，1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)，1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(SMPC)，1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)，1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)，1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(MOPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)，1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(SOPC)，即碳链长度不一，不同饱和度的磷脂类化合物均可适用于本发明。
如图7所示，为根据本发明的一个优选实施提供的磷脂酰阿霉素纳米前 药的合成示意图。
亲水性抗肿瘤药物与磷脂类化合物的摩尔比为1:1，相比现有技术降低了载体材料的使用量；此外，磷脂为生物细胞膜的组成部分，对动物体无副作用，生物相容性好；抗肿瘤药物与磷脂类化合物为化学键合，稳定性高。
所述磷脂酰纳米前药由于具有两亲性，在水相中发生分子自组装形成胶束，当所述胶束通过肿瘤的增强渗透与滞留效应(EPR effect)被动靶向性的进入肿瘤组织后，所述胶束在磷脂酶D的催化作用下水解释放出所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物。
磷脂酰纳米前药在生理条件下以前药形式稳定存在，在磷脂酶D存在的情况下，胶束能迅速被水解并释放出活性原药。表明磷脂酰纳米前药给药系统具有磷脂酶D可控释放的特点，可解决抗肿瘤靶向药物的稳定性和响应触发释放问题。
根据本发明的第二方面，还提供一种如上所述的酶促响应释放的磷脂酰纳米前药的制备方法，所述制备方法包括：将含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物和磷脂类化合物分别溶解，然后混合，向其中加入磷脂酶D，30～50℃下反应4～24h，所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物与磷脂类化合物通过磷氧键结合生成一种双亲性的磷脂酰纳米前药。
所述制备方法具体包括：以乙酸-乙酸钠缓冲液和异丙醇的混合液为溶剂溶解所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物，以及通过有机溶液溶解所述磷脂类化合物。
所述有机溶剂包括正己烷，正庚烷，二氯甲烷，三氯甲烷，乙酸乙酯。
所述制备方法更具体地包括以下步骤：1)药物溶液的配置：以乙酸-乙酸钠缓冲液和异丙醇为溶剂，配置抗肿瘤药物溶液，超声溶解；2)磷脂酰胆碱溶液的配置：以正庚烷为溶剂，配置磷脂酰胆碱溶液，超声溶解；3)混合步骤1)和2)的溶液，加入磷脂酶D酶液，在30～50℃下，摇床中反应4～24h；4)溶剂萃取：将步骤3)中获得的反应液用正己烷萃取；5)分离纯化：用柱层析法将步骤4)获得的混合溶液进行分离，流动相为氯仿：无水乙醇：三乙胺：水＝10:11.3:11.7:2.7，固定相为硅胶粉；6)旋转蒸发：将步骤5)中分离后的溶液进行旋转蒸发，条件为25～35℃，2～5小时；7)溶剂除盐：用无水乙醇将步骤(6)中少量的无机盐除去，挥干；8)冷冻干燥：将步骤 7)所获得的固体进行冷冻干燥。
所述制备方法还优选包括：9)胶束的制备，其中，磷脂酰阿霉素胶束的制备采用透析法，包括以下步骤：a.将磷脂酰阿霉素(DMSO)慢慢滴入有磁力搅拌的水中，滴入速度0.5～1.5ml/min，最终最优选地达到磷脂酰阿霉素浓度为0.02mg/ml；b.上述溶液搅拌半个小时后，将其装入透析袋中进行透析。透析过程中，刚开始每隔2h换水一次，反复3次，最后透析一天，取出获得的目的溶液；c.透析后的溶液超声10分钟，0.45μm过滤器过滤去除杂质，即得所需要的磷脂酰阿霉素胶束溶液。
磷脂酰米托蒽醌胶束的制备采用滴入法，包括以下步骤：a.取1mg的磷脂酰米托蒽醌，溶于少量的四氢呋喃中，慢慢滴入到有磁力搅拌的水中，最终达到1mg/ml；b.在26～28℃，搅拌2～3小时，即得所需要的磷脂酰米托蒽醌胶束溶液。
磷脂酰纳米前药组分中还可配比合适的PEG化成分或透明质酸(HA)，制备成长循环胶束，如甲氧基聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇单甲醚-胆固醇琥珀酸酯，磷脂酰聚乙二醇单甲醚等，长亲水链的分子量范围可从500到2000，减少胶束和血液中蛋白的吸附，降低网状内皮系统(RES)的识别和吞噬概率，提高体内循环时间。
磷脂酰纳米前药以磷脂类化合物为骨架，自组装成类似于生物膜的胶束，具备脂质体样多功能修饰特性，还可进行肿瘤表面特异性配体或抗体(叶酸、转铁蛋白、Sigma受体、RGD多肽，单克隆抗体MAb或HER2等)修饰，实现胶束的主动靶向转运。
磷脂酰纳米前药的制备可参考脂质体制备处方和工艺，配比合适的脂膜稳定性、流动性和电荷分布的组分，包括胆固醇、磷脂酰乙醇胺、去氧胆酸、胆固醇硫酸酯等，提高胶束的质膜稳定性和流动性。
根据本发明的第三方面，还提供一种如上所述的酶促响应释放的磷脂酰纳米前药将抗肿瘤药物靶向释放到肿瘤组织中的应用。
所述磷脂酰纳米前药由于具有两亲性，在水相中发生分子自组装形成胶束，当所述胶束靶向性的进入肿瘤组织后，所述胶束在肿瘤组织中高表达的磷脂酶D的催化作用下水解释放出所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物。
所述胶束的粒径一般小于1μm，优选为20nm～150nm。
如图8所示，为根据本发明的一个优选实施提供的磷脂酰阿霉素纳米前药自组装成胶束以及在磷脂酶D的作用下水解释放阿霉素的示意图。
优选地，该胶束表面电位在-30mV～-50mV，适合静脉注射，稳定性得到提高，通过EPR效应被动靶向积累于肿瘤部位。
该应用还包括将所述磷脂酰纳米前药本身作为药物载体进一步装载具有协同作用的其他抗肿瘤药物或相关基因，并靶向到肿瘤组织中进行酶促响应释放，如：紫杉醇，维拉帕米或抗肿瘤基因等，从而产生“鸡尾酒”疗法。
本发明中，所得的双亲性的磷脂酰纳米前药分子可以通过NMR、FTIR、MS等手段进行结构和性质的确证，得到的胶束可以通过TEM、粒径、电位的研究来探讨其聚集行为和形貌特征，所得产品的体内外释放情况可以通过HPLC确定。
本发明开创性地利用肿瘤组织特殊的生理病理机制造成的磷脂酶D过量表达、活性升高这一自然生理现象，由这种特异性地、高浓度地存在的磷脂酶D触发纳米药物响应性释放，保障肿瘤内的有效药物浓度，减少对其他组织的毒副作用。一方面利用磷脂酶D具有的转脂功能，合成了双亲性的磷脂酰纳米前药；另一方面利用磷脂酶D具有的水解功能，当磷脂酰纳米前药靶向性的进入肿瘤组织中，即可被磷脂酶D水解释放出抗肿瘤药物，从而达到抑制肿瘤的作用。根据本发明提供的磷脂酰纳米前药分子提高肿瘤靶向性，为肿瘤纳米药物设计和开发提供一种新的思路。
附图说明
图1A、图1B分别是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的红外图；
图2A、图2B分别是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的质谱图；
图3A、图3B分别是用透射电镜法观察到的磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的胶束形貌；
图4A、图4B分别是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌响应磷脂酶D水解释放原药的结果；
图5A是磷脂酰阿霉素分别对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性结果，其中，DOX代表游离阿霉素，PX代表磷脂酰阿霉素；
图5B是磷脂酰米托蒽醌分别对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性结 果，其中，MA代表游离米托蒽醌，PMA代表磷脂酰米托蒽醌；
图6A、图6B分别是激光共聚焦检测MCF-7/ADR分别对游离药物(阿霉素、米托蒽醌)和磷脂酰纳米前药(磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌)的摄入结果；
图7是根据本发明的一个优选实施提供的磷脂酰阿霉素纳米前药的合成示意图；
图8是根据本发明的一个优选实施提供的磷脂酰阿霉素纳米前药自组装成胶束以及在磷脂酶D的作用下水解释放阿霉素的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
根据本发明，所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物不限分子结构，实际上，只要是含有伯醇并且具有亲水性的抗肿瘤药物均可适用于本发明。作为举例而非限制地，本发明分别以盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌作为抗肿瘤药物进行示例。
实施例1磷脂酰纳米前药的制备
1.1磷脂酰阿霉素及其胶束的制备
(1)取0.3g阿霉素溶于7ml乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M)和1ml异丙醇中；0.2g磷脂酰胆碱溶于5ml正庚烷中；然后将上述溶液混合，超声溶解后，加入100U磷脂酶D酶液；
(2)在45℃，220rmp摇床中反应8小时；
(3)用氯仿对步骤(2)获得的反应液进行反复萃取；
(4)用柱层析法对步骤(3)中的混合溶液进行分离纯化，流动相为氯仿：无水乙醇：三乙胺：水(10:11.3:11.7:2.7)，固定相为硅胶粉(300-400目)；
(5)旋转蒸发：将步骤(4)中分离后的溶液进行旋转蒸发，条件为30℃，2～5小时；
(6)溶剂除盐：用少量的无水乙醇将步骤(5)获得的产物中的无机盐去除；
(7)冷冻干燥：将步骤(6)所获得的磷脂酰阿霉素固体进行冷冻干燥， -80℃预冻24小时，冷冻干燥24-48小时，即获得磷脂酰阿霉素；
(8)制备胶束：
a.将0.2mg/ml的磷脂酰阿霉素(DMSO)慢慢滴入有磁力搅拌的水中，滴入速度1ml/min，最终达到磷脂酰阿霉素浓度为0.02mg/ml；
b.上述溶液搅拌半个小时后，将其装入透析袋中进行透析，透析过程中，刚开始每隔2h换水一次，反复3次，最后透析一天，取出获得的目的溶液；
c.透析后的溶液超声10分钟，0.45μm过滤器过滤去除杂质，即得所需要的胶束溶液。
1.2磷脂酰米托蒽醌及其胶束的制备
(1)取0.7g米托蒽醌溶于7ml乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M)和1ml异丙醇；取0.2g磷脂酰胆碱溶于5ml正庚烷；然后将上述溶液混合，超声溶解后，加入100U磷脂酶D酶液；
(2)在45℃，220rmp摇床中反应8小时；
(3)用正己烷对步骤(2)获得的反应液进行反复萃取；
(4)用柱层析法对步骤(3)中的混合溶液进行分离纯化，流动相为氯仿：无水乙醇：三乙胺：水(10:11.3:11.7:2.7)，固定相为硅胶粉(300-400目)；
(5)旋转蒸发：将步骤(4)中分离后的溶液进行，条件为30℃，2～5小时；
(6)溶剂除盐：用少量的无水乙醇将步骤(5)获得的产物中的无机盐去除；
(7)冷冻干燥：将步骤(6)所获得的磷脂酰米托蒽醌固体进行冷冻干燥，-80℃预冻24小时，冷冻干燥24-48小时，即获得磷脂酰米托蒽醌纯品；
(8)制备胶束：
a.取1mg的磷脂酰米托蒽醌，溶于少量的四氢呋喃中，慢慢滴入到有磁力搅拌的水中，最终达到1mg/ml；
b.28℃，搅拌2小时，即得所需要的胶束溶液。
实施例2对磷脂酰纳米前药进行结构鉴定和胶束性质鉴定
2.1采用红外的方法分别对实施例1制备得到的磷脂酰阿霉素和磷脂酰 米托蒽醌的化学组成进行确证，结果分别如图1A和图1B所示：PC的特征峰(1)2924cm-1，长链上CH2伸展振动(2)1736.1cm-1，-CO＝O的-C＝O的伸缩峰；阿霉素的特征峰图(A)a：(1)1617.1cm-1，苯环上-C＝O的峰(2)1582.6cm-1，C＝C的伸缩峰。由磷脂酰阿霉素的红外谱图(A)c可找到PC和阿霉素的特征峰(1)2924cm-1(2)1736.1cm-1(3)1617.1cm-1(4)1582.6cm-1。同样对于磷脂酰米托蒽醌，也可以找到PC和米托蒽醌的特征峰。
2.2采用质谱分析方法分别对磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的分子量进行确证，结果如图2A和图2B所示，磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的理论分子量分别为1225和1126，与图2结果一致，证明新物质的形成。
2.3采用透射电镜法分别对磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌形成的胶束形貌进行观察。用镊子夹住铜网插入到制样系统内，用移液枪移取约5μL样品溶液滴到铜网上，通过两侧的滤纸拍打几秒吸去多余的溶液制得一层薄膜，透射电镜中(JEOLJEM一1400TEM)观察，操作电压为120kV。结果如图3A和图3B所示，说明形成的胶束。
2.4磷脂酰阿霉素胶束和磷脂酰米托蒽醌胶束分别在模拟生理环境下和适量的PLD条件(10nm CaCl2)进行水解反应。反应条件：pH：7.2，温度：37℃，转速：220rpm。在反应的不同时间间隔点取水解后的反应液0.2ml，HPLC定量水解后原药的量，计算水解率。
水解率＝水解后溶液中原药摩尔量×100％/水解前溶液中前药摩尔量
结果如图4A和图4B所示，前药磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌在生理条件下稳定存在；在PLD存在的条件下，随着时间的延长，前药被逐渐水解释放出原药，具有酶促响应释放特性。
2.5采用CCK-8法分别检测磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌对MCF-7/ADR耐药株的逆转耐药作用，其中，MCF-7和MCF-7/ADR细胞均购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心，设置游离的阿霉素和磷脂酰阿霉素的终浓度(等当量的阿霉素浓度)分别为0.5、1、2、4、6、8、10、15μg/ml培养基，设置游离的米托蒽醌和磷脂酰米托蒽醌的终浓度(等当量的米托蒽醌浓度)分别为1.25、2.5、5、10、20μg/ml，同时留有不加药的空白对照组，每个药物浓度3个复孔，然后去除96孔板孔中培养基，加含药培养基培养48h。每孔加10μlCCK-8，4小时后，在酶联免疫检测仪 OD450nm处测量各孔的吸光值，计算各药物浓度对细胞的抑制作用效果。结果如图5A和图5B所示，由此计算出，逆转耐药系数分别为4.87和10.12，说明磷脂酰纳米药物对耐药株存在逆转效果。
2.6采用激光共聚焦检测MCF-7/ADR分别对磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的摄取情况，阿霉素和磷脂酰阿霉素的检测条件：激发488nm波长发射光谱610～620nm；米托蒽醌和磷脂酰米托蒽醌的检测条件：激发488nm，发射光谱650nm～700nm，步骤如下：
(1)将MCF-7和MCF-7/ADR细胞分别栽至玻璃底直径为40mm的培养皿中，细胞密度在30万左右，37℃，5％二氧化碳的培养箱中贴壁过夜培养。
(2)游离阿霉素(米托蒽醌)和磷脂酰阿霉素(磷脂酰米若蒽醌)分别设置3组实验，一组为仅加药培养两小时的对照组，第二组和第三组实验组为先加药培养2h，然后分别在不含药的EBSS缓冲液(主要由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠等组成，不含钙镁，不含酚红，pH值7.2)中继续培养2h、4h用于细胞泵出药物的实验组。
(3)对照组加药培养2h后，立即用缓冲液洗涤三遍，最后用共聚焦显微镜观察拍摄。而后面两组泵出药物实验组加药培养2h后，去除上清培养液，用冰PBS(pH＝7.2)洗涤三遍，加不含药的新鲜EBSS缓冲液500ul，37℃细胞培养箱中培养2h或者4h，用于细胞泵出药物实验组。2h或4h后两组用冰PBS洗涤两遍，共聚焦显微镜进行观察。
结果如图6A和图6B所示，第一行：MCF-7敏感株细胞添加阿霉素(或米托蒽醌)的实验组；第二行：MCF-7/ADR耐阿霉素细胞株中添加阿霉素(或米托蒽醌)实验组；第三行：MCF-7/ADR耐阿霉素细胞株中添加等当量的磷脂酰阿霉素(或磷脂酰米托蒽醌)实验组；第一列：癌细胞在含药的EBSS中培养2h；第二列：在含药的EBSS中培养2h后，然后在不含药的EBSS缓冲液中继续培养2h；第三列：在含药的EBSS中培养2h后，然后在不含药的EBSS缓冲液中继续培养4h。上述结果表明，MCF-7/ADR对游离药物阿霉素和米托蒽醌有泵出现象，可以提高并随时间的延长，泵出量增加；MCF-7/ADR对磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌无明显泵出现象，且比游离药物的荧光强度强。由此说明，磷脂酰纳米药物能提高MCF-7/ADR耐 药株细胞对药物的摄取，同时能躲避MCF-7/ADR的药物泵出作用。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药，其特征在于，所述磷脂酰纳米前药由含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物和磷脂类化合物在磷脂酶D的催化作用下通过磷氧键键合形成。
2.根据权利要求1所述的磷脂酰纳米前药，其特征在于，所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物选自：盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌。
3.根据权利要求1所述的磷脂酰纳米前药，其特征在于，所述磷脂类化合物选自二癸酰基磷脂酰胆碱，二月桂酰基磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰基磷脂酰胆碱，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，二油酰基磷脂酰胆碱，二芥酰基磷脂酰胆碱，1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱，1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱，1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱，1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱，1-肉豆蔻酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱，1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱，1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱。
4.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的酶促响应释放的磷脂酰纳米前药的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物和磷脂类化合物分别进行溶解，然后混合，向其中加入磷脂酶D，30～50℃下反应4～24h，所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物与磷脂类化合物在磷脂酶D的催化下通过磷氧键结合生成一种双亲性的磷脂酰纳米前药。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：以乙酸-乙酸钠缓冲液和异丙醇的混合液为溶剂溶解所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物，以及通过有机溶液溶解所述磷脂类化合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法更具体地包括以下步骤：1)药物溶液的配置：以乙酸-乙酸钠缓冲液和异丙醇为溶剂，配置抗肿瘤药物溶液，超声溶解；2)磷脂酰胆碱溶液的配置：以正庚烷为溶剂，配置磷脂酰胆碱溶液，超声溶解；3)混合步骤1)和2)的溶液，加入磷脂酶D酶液，在30～50℃下，摇床中反应4～24h；4)溶剂萃取：将步骤3)中获得的反应液用正己烷萃取；5)分离纯化：用柱层析法将步骤4)获得的混合溶液进行分离，流动相为氯仿：无水乙醇：三乙胺：水＝10:11.3:11.7:2.7，固定相为硅胶粉；6)旋转蒸发：将步骤5)中分离后的溶液进行旋转蒸发，条件为25～35℃，2～5小时；7)溶剂除盐：用无水乙醇将步骤(6)中少量的无机盐除去，挥干；8)冷冻干燥：将步骤7)所获得的固体进行冷冻干燥。
7.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的酶促响应释放的磷脂酰纳米前药将抗肿瘤药物靶向释放到肿瘤组织中的应用。
8.根据权利要求7所述的磷脂酰纳米前药，其特征在于，所述磷脂酰纳米前药在水相中发生分子自组装形成胶束，当所述胶束靶向性的进入肿瘤组织后，所述胶束在肿瘤组织中高表达的磷脂酶D的催化作用下水解释放出所述含有伯醇的亲水性抗肿瘤药物。
9.根据权利要求8所述的磷脂酰纳米前药，其特征在于，所述胶束的粒径为20nm～150nm。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：将所述磷脂酰纳米前药本身作为药物载体进一步装载具有协同作用的其他抗肿瘤药物或相关基因，被动靶向到肿瘤组织中响应酶促水解释放。
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