CN110840876A - 圆孢蘑菇中的没食子酸在cdc25磷酸蛋白酶上应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，通过该分离提取方法，快速分离圆孢蘑菇各组分，分离提取工艺简单稳定、适合工业化连续生产、产品收率较高、生产成本低，从圆孢蘑菇中获取的活性成分，其中没食子酸具有抑制CDC25磷酸蛋白酶活性作用，因此没食子酸可以应用于抑制CDC25磷酸蛋白酶有关的疾病中。

Description

圆孢蘑菇中的没食子酸在CDC25磷酸蛋白酶上应用
技术领域：
本发明涉及天然产物的应用技术领域，一种从自然产品中提取活性成分没食子酸的应用，更具体涉及圆孢蘑菇中提取没食子酸及其没食子酸在CDC25磷酸蛋白酶上的应用。
背景技术：
蘑菇科(Agaricaceae)系真菌伞菌目的一科，种类多，分布广泛，大多数可以食用，全世界均有分布。蘑菇科有包括蘑菇属在内的28个属。蘑菇科蘑菇属(Agaricus)中常见种有圆孢蘑菇Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton、双孢蘑菇Agaricus bisporus(Large)Sing.、姬松茸Agaricus blazei murrill、紫蘑菇Agaricus rubellus(Gill.)Sacc.、褐蘑菇Agaricus crocopeluspeck等。目前，该属的化学成分以及药理活性研究相关研究主要集中在双孢蘑菇和姬松茸两种。
蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇属(Agaricus)的化学成分研究从上个世纪九十年代开始，发现本属真菌的化学成分主要有挥发油、Agariblazeispirol类、甾醇类、固醇类、A-1(吡咯烷酮羧酸钠)、黄酮等。可能含有神经酰胺类成分、胡萝卜苷、二萜类、三萜类、大黄素甲醚，洋芹素-7-4’-二甲醚和愈创木基丙三醇、丁烯羟酸内酯类等。
圆孢蘑菇Agaricus gennadii属伞菌目蘑菇科蘑菇属(Agaricus)，别名“圆孢托柄蘑菇”。圆孢蘑菇呈伞形，有浓郁的蘑菇香味。菌褶幼时乳白色，后渐变为粉红色至黑褐色，单个重58-350g，最大可达2-5kg。夏秋季生长于灌丛沙地、湖边芦苇丛下20-70cm 的土中，在地下能开伞，单生、散生或丛生，多生长在新疆西部及西南部地区。从上世纪九十年代以来，人们已经发现同属中姬松茸的活性成分以及它的多种活性。但同属中的圆孢蘑菇Agaricus gennadii的化学成分以及相关活性尚处在空白中。为开发利用这一资源，在青海省自然科学基金2018-ZL-919的资助下，对圆孢蘑菇的小分子化学成分进行了较系统的研究，对其乙醇提取物抗肿瘤活性做了初步的研究。
没食子酸(英语：Gallic acid)亦称五倍子酸或棓酸，是一种有机酸，可见于五倍子、漆树、茶等植物中。化学式C6H2(OH)3COOH。没食子酸易溶于水、醇和醚；具有酚(易被氧化和三氯化铁水溶液生成蓝黑色沉淀)及羧酸(加热时失去二氧化碳成焦性没食子酸)的性质。没食子酸可用作显影剂，它的碱性铋盐用作防腐剂，也用于制药工业上。
研究发现没食子酸具有抗菌,抗病毒,抗肿瘤作用。没食子酸在抗菌抗病毒方面:体外对金黄色葡萄球菌、八叠球菌、α－型键球菌、奈瑟氏球菌、绿脓杆菌、弗氏痢疾杆菌、伤寒杆菌Hd、副伤寒杆菌A等有抑制作用,其抑菌浓度为5mg/ml。体外,在3％的浓度下对17种真菌有抑菌作用,对流感病毒亦有一定抑制作用。在抗肿瘤方面:对吗啉加亚硝钠所致的小鼠肺腺瘤有强抑制作用。
CDC25磷酸蛋白酶是调节正常细胞分裂和细胞应对DNA损伤的重要调控子。研究表明CDC25C磷酸酶亚型对细胞周期进行协同调控。CDC25磷酸酶在许多肿瘤中过度表达，表明特异性的CDC25磷酸酶抑制剂可能成为有前途的癌症治疗药物。
细胞分裂周期的进程是通过CDC25磷酸酶激活一组特殊的细胞周期依赖蛋白酶进行调控的。CDC25蛋白能特异性的脱去CDKs络氨酸/苏氨酸残基上的磷酸基团。
很多种肿瘤中CDC25A和CDC25B的表达都会上调，通常恶化程度越高/侵袭能力越强和预后不良，肿瘤中的CDC25的表达越高。研究证实CDC25参与了DNA损伤激活的 G2/M期阻滞过程，从该结果可以推断出CDC25磷酸酶可能还参与了肿瘤生成，所以这些细胞周期调控因子可能成为癌症治疗的潜在靶点。制药公司和研究实验室正在努力研制开发抑制CDC25活性的化合物，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。
发明内容
针对上述所述问题，本发明提出了一种圆孢蘑菇中活性成分的分离提纯方法及提取活性成分的应用，通过该分离提取方法，快速分离圆孢蘑菇各组分，分离提取工艺简单稳定、适合工业化连续生产、产品收率较高、生产成本低的从圆孢蘑菇中提取各活性组分的方法，对于各种活性成分可以高效、简便的分离；获取的活性成分中，其中没食子酸具有抑制CDC25磷酸蛋白酶活性作用，因此没食子酸可以应用于抑制CDC25磷酸蛋白酶有关的疾病中。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
取新鲜、无毁坏的圆孢蘑菇子实体，切片后用90-95％乙醇浸泡一周圆孢蘑菇子实体，过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入90-95％乙醇超声提取3-5次，每次提取1-5h，减压浓缩得90-95％乙醇浸膏；用60-65％乙醇同法操作，减压浓缩得60-65％乙醇浸膏；醇提取后的圆孢蘑菇滤渣，加入蒸馏水超声提取三次，每次提取1-3h，减压浓缩得水提浸膏。
其中，上述圆孢蘑菇子实体与乙醇比例为0.5-1:1-5，使乙醇完全浸泡圆孢蘑菇子实体。
其中，上述减压回收条件为0.1-0.5MPA，温度25-40℃；上述超声提取条件为 200-800HZ，超声30-45min，温度30-50℃。
将两部分醇提浸膏合并，将合并后的浸膏捏溶分散于纯水中，在分液漏斗中加入石油醚(水与石油醚比例为1:1-0.5)，再将浸膏分散液加入分液漏斗中，萃取5次，萃取液合并浓缩，得石油醚部位。之后向分液漏斗中加入乙酸乙酯(水与乙酸乙酯比例为 0.5-1:1)，萃取6次，萃取液合并浓缩，得乙酸乙酯部位。再向分液漏斗中加入正丁醇(水与正丁醇比例为0.4-1:1)，萃取5次，萃取液合并浓缩，得正丁醇部位。
其中，上述萃取条件为：萃取压力为20MPa～40MPa，萃取温度30℃～50℃，萃取时间为0.8h～2.5h。
将上述获得的石油醚部位经中压硅胶柱快速色谱分离，石油醚-乙酸乙酯体系(100:0～0:100)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似馏分，回收溶剂得到A～I共 9个组分。组分D经中压硅胶色谱分离后，得D1和D2。D1重结晶得针状化合物3。D2 经多次中压硅胶色谱与Sephadex LH-20柱色谱联合分离，得白色固体化合物2。组分E 经多次中压硅胶色谱与Sephadex LH-20柱色谱联合分离，得黄绿色油状固体化合物1。
其中，上述石油醚部位中压硅胶柱快速色谱分离条件为：以120-160μm层析硅胶为硅胶柱硅胶径高比为1:5-1:10，流速为30-90ml/min。
其中，Sephadex LH-20柱色谱分离条件为：以酸化甲醇为洗脱液，浓度20-40％(Ph调解在3-4)，流速为0.2-1.0ml/min。
将上述获得的乙酸乙酯部位经中压反相C18柱快速色谱分离，水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱，洗脱液按同一梯度合并，回收溶剂得到Ⅰ～Ⅵ共6个组分。经高效液相色谱检验后，发现Ⅰ～Ⅳ组分为正丁醇相中的共有组分，故合并到正丁醇相部位。Ⅴ组分经中压反相C18分离后，又使用C18半制备柱分离)后得化合物4、5和24。化合物4 为黄色颗粒状固体；化合物24为黄色颗粒状固体；化合物5为红色颗粒状固体。
其中，上述反相C18柱色谱分离的条件为：水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱；流速：1.0-3.5ml/min，柱温：25-30℃。
其中，上述C18半制备柱分离条件为流动相A：1ml/L磷酸水溶液(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.0ml/min，柱温：30℃。
将上述获得的正丁醇部位加入乙醇，沉淀时在容器壁上析出结晶，反复多次操作，多次重结晶得化合物23。正丁醇部位经中压反相C18分离，用水-甲醇溶液(5％～100％) 梯度洗脱，洗脱液按同一梯度合并，减压回收溶剂得到Z-Ⅰ～Z-Ⅵ共6个组分。Z-Ⅱ组分经由MCI树脂分离，用水-甲醇溶液(0％～100％)梯度洗脱，并用C18半制备柱分离纯化得化合物7、化合物8、化合物9、化合物10。Z-Ⅳ组分经C18半制备柱分离纯化后得化合物6。Z-Ⅰ组分即MCI树脂纯水洗脱部位，经Agilent Zorbax SB-CN全制备柱分离切段，用水-甲醇溶液(5％)等度洗脱，得Z-A～Z-D共4个组分。
其中，上述反相C18柱色谱分离的条件为：水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱；流速：1.0-3.5ml/min，柱温：25-30℃。
其中，上述MCI树脂分离条件为水-甲醇溶剂系统(0％～100％)梯度洗脱；流速：1.0-3.5ml/min，柱温：25-30℃。
其中，上述C18半制备柱分离纯化条件为：流动相A：1ml/L磷酸水溶液(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.0-3.5ml/min，柱温：20-30℃。
Z-A组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得化合物13、化合物14、化合物16、化合物17、化合物19、化合物20和21。化合物14、16、17、20和21均为白色颗粒，化合物13为白色胶状物；化合物19为纯化后结晶所得，透明针状结晶。 Z-B组分经AgilentZorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得化合物11、12，化合物11、 12为白色颗粒。Z-C组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得化合物18和化合物22，化合物18、22均为白色粉末。Z-D组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得化合物15，化合物15为白色粉末。
其中，上述Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化条件为：流动相A：以10-30mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液作为洗脱液A(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.0-3.5ml/min，柱温：20-30℃。
由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：
1、通过该分离提取方法，快速分离圆孢蘑菇各组分，分离提取工艺简单稳定、适合工业化连续生产、产品收率较高、生产成本低的从圆孢蘑菇中提取各活性组分的方法，对于各种活性成分可以高效、简便的分离。
2、获取的活性成分没食子酸具有抑制CDC25磷酸蛋白酶活性作用，因此没食子酸可以应用于抑制CDC25磷酸蛋白酶有关的疾病中。
附图说明：
图1为圆孢蘑菇中活性成分的分离提纯流程图。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1圆孢蘑菇中各活性组分粗提物制备
取新鲜、无毁坏的圆孢蘑菇子实体10kg，切片后用30L 95％乙醇浸泡7天(其中圆孢蘑菇子实体与乙醇比例为1:3，使乙醇完全浸泡圆孢蘑菇子实体)，过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入30L 95％乙醇超声提取3次，每次提取2h。减压浓缩得95％乙醇浸膏。用65％乙醇同法操作，减压浓缩得65％乙醇浸膏。醇提取后的圆孢蘑菇滤渣，加入蒸馏水30L并1800HZ超声提取三次，每次提取2h。减压浓缩得水提浸膏538g。
其中，上述减压回收条件为0.25MPA，温度30℃；上述超声提取条件为800HZ，超声45min，温度30℃。
将两部分醇提浸膏合并得84.5g，将合并后的浸膏84.5g捏溶分散于500ml纯水中，在2000ml分液漏斗中加入石油醚(水与石油醚比例为1:1)，再将浸膏分散液加入分液漏斗中，萃取5次，萃取液合并浓缩，得石油醚部位10.0g。后向上述分液漏斗中加入乙酸乙酯(水与乙酸乙酯比例为1:1)，萃取6次，萃取液合并浓缩，得乙酸乙酯部位6.0g。再向上述分液漏斗中加入正丁醇(水与正丁醇比例为1:1)，萃取5次，萃取液合并浓缩，得正丁醇部位60.0g。
其中，上述萃取条件为：萃取压力为40MPa，萃取温度35℃，萃取时间为2h。
所述圆孢蘑菇中活性成分的分离提纯流程图见图1。
实施例2石油醚相部位组分分离纯化
将上述实施例1获得的石油醚部位10.0g经中压硅胶柱快速色谱分离，石油醚-乙酸乙酯体系(100:0～0:100)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似馏分，回收溶剂得到A～I共9个组分。组分D经中压硅胶色谱分离后，得D1和D2。D1重结晶得20mg的针状化合物3。D2经多次中压硅胶色谱与Sephadex LH-20柱色谱联合分离，得10mg的白色固体化合物2。组分E经多次中压硅胶色谱与Sephadex LH-20柱色谱联合分离，得 5mg的黄绿色油状固体化合物1。
其中，上述石油醚部位中压硅胶柱快速色谱分离条件为：以120-130μm层析硅胶为硅胶柱硅胶径高比为1:8，流速为40ml/min。
其中，Sephadex LH-20柱色谱分离条件为：以酸化甲醇为洗脱液，浓度25％(Ph调解在4)，流速为0.5ml/min。
将分离纯化的化合物组分进行理化性质鉴定，通过常规物理检测方法：其检测方法有：EIS-MS、H-NMR、C-NMR。其检测方法同药典2015版检测方法。检测结果如下：
化合物1对苯二甲酸二丁酯(dibutyl terephthalate)
Figure BDA0002276626150000061
黄色固体，EIS-MS(negative)m/z:277[M-H]-,EIS-MS(positive)m/z:279[M+H]+,确定其分子量为278。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.62(4H,ddd,J＝4.9,5.6,3.3Hz,H-2,3,5,6), 4.30(4H,t,J＝6.7Hz,H-9.9′),1.77～1.65(4H,m,H-10,10′),1.43(4H,td,J＝14.9,7.4Hz,H-11,11′),0. 95(4H,t,J＝7.4Hz.H-12,12′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:132.3(C-1,4),130.9(C-2,6),128.8(C -3,5),167.7(C-7,7′),65.6(C-9,9′),30.6(C-10,10′),19.2(C-11,11′),13.7(C-12,12′)。以上数据与对苯二甲酸二丁酯对照一致，故鉴定化合物1为对苯二甲酸二丁酯(dibutyl terephthalate)。
化合物2酒酵母甾醇(Cerevisterol)
Figure BDA0002276626150000062
白色粉末。
Figure BDA0002276626150000071
C28H46O3,mp＝246-284℃。1H-NMR(600MHz,DMSO)δ:5.23(1H,dd,J＝15.3,7.3Hz,H-23),5.17(1H,dd,J＝15.3,8.3Hz,H-22),5.08(1H,s,H-7),3.77 (1H,m,H-3),3.58(1H,s,H-6),0.99(3H,d,J＝6.6Hz,H-21),0.91(3H,s,H-19),0.88(3H,d,J＝6.8Hz, H-28),0.81(3H,d,J＝7.4Hz,H-27),0.80(3H,d,J＝7.2Hz,H-26),0.54(3H,s,H-18)；13C-NMR(150 MHz,DMSO)δ:139.7(C-8),135.4(C-22),131.4(C-23),119.4(C-7),74.5(C-5),72.2(C-6),66.0(C -3),55.3(C-17),54.2(C-14),43.0(C-13),42.3(C-9),42.0(C-24),40.2(C-4),40.1(C-20),39.0(C-1 2),36.7(C-10),32.5(C-2,25),31.2(C-1),27.7(C-16),22.6(C-15),21.3(C-11),21.0(C-21),19.8(C- 26),19.5(C-27),17.7(C-19),17.3(C-28),12.1(C-18)。检测数据与酒酵母甾醇数据基本一致，故鉴定化合物2为酒酵母甾醇。
化合物3β-谷固醇(Stigmast-5-en-3-ol)
Figure BDA0002276626150000072
白色针晶，熔点136～137,C29H50O。EI-MS m/z:414[M]+,396,381,329.1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:5.29(1H,brd,J＝5.2Hz,H-6),3.46(1H,m,H-3),1.02(3H,s,H-19),0.91(3H,d,J＝8.2 Hz,H-21),0.85(3H,d,J＝7.4Hz,H-27),0.82(3H,d,J＝7.4Hz,H-26),0.81(3H,t,J＝8.1Hz,H-29),0.6 5(3H,s,H-18)；13C-NMR(CDCl3):δ:36.6(C-1),29.7(C-2),71.8(C-3),46.0(C-4),140.8(c-5),121. 7(C-6),31.7(c-7),32.0(C-8),50.3(c-9),36.2(C-10),28.3(C-11),39.9(c-12),42.(C-13),56.9(C-1 4),26.3(C-15)29.3(C-16),56.2(C-17),11.9(C-18),19.8(C-19),32.0(C-20),19.4(C-21),34.1(C-2 2)24.3(C-23)37.3(C-24),19.1(C-25),12.0(C-26),23.2(C-27),21.1(C-28),18.8(C-29)。以上数据与β-谷固醇的数据对照基本一致，故鉴定化合物3为β-谷固醇。
实施例3乙酸乙酯部位组分分离纯化
将上述实施例1获得的乙酸乙酯部位6.0g经中压反相C18柱快速色谱分离，水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱，洗脱液按同一梯度合并，回收溶剂得到Ⅰ～Ⅵ共6个组分。经高效液相色谱检验后，发现Ⅰ～Ⅳ组分为正丁醇相中的共有组分，故合并到正丁醇相部位。Ⅴ组分经中压反相C18分离后，又使用C18半制备柱分离后得化合物4共计4mg、5化合物共计4mg和化合物24共计3mg。化合物4为黄色颗粒状固体；化合物24为黄色颗粒状固体；化合物5为红色颗粒状固体。
其中，上述反相C18柱色谱分离的条件为：水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱；流速：1.5ml/min，柱温：30℃。
其中，上述C18半制备柱分离条件为流动相A：1ml/L磷酸水溶液(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.0ml/min，柱温：30℃。
将分离纯化的化合物组分进行理化性质鉴定，通过常规物理检测方法：其检测方法有：EIS-MS、H-NMR、C-NMR。其检测方法同药典2015版检测方法。检测结果如下：
化合物41-吩嗪甲酸(1-Carboxyphenazine)
黄色粉末,FAB-MS m/z:225[M+1]+；1H-NMR(CDCl3):8.93(1H,d,J＝7.3Hz),8.50(1 H,d,J＝8.7Hz),8.31(1H,d,J＝9.4Hz),8.23(1H,d,J＝8.4Hz),8.02～7.93(3H,m)；13C-NMR:165.7 (s),143.7(s),143.0(s),139.7(s),139.6(s),136.8(s),134.7(d),132.8(d),131.4(d),129.9(d),129.7 (d),127.7(d),124.9(s)。以上数据与1-吩嗪甲酸的数据对照基本一致，鉴定化合物4为1 -吩嗪羧(1-phena zinecarboxylic acid)。
化合物57-Acetyl-4-methylazulene-1-carboxylic acid
Figure BDA0002276626150000082
红色粉末。–HR-ESI-MS:251.0688(C14H12O3),[M+Na]+；228.0684).–MS(EI,70eV):m/z (％)＝228(90)[M]+,213(100)[M-Me]+,211(19)[M-OH]+,185(17)[M-MeCO]+,183(6)[M-HCOO]+,1H-NMR(400MHz,CD3OD),13C-NMR(125MHz,CD3OD):169(13),149(7),129(64),128(63),115(29),57(60)。以上数据与7-Acetyl-4-methylazulene-1-carboxylic acid的数据基本一致，故鉴定化合物5为7-Acetyl-4-methylazulene-1-carboxylic acid。
化合物241，8-二羟基蒽醌(1，8-Dihydroxyanthraquinone)
黄色晶体，FAB-MS m/z:240[M]+(100),223[M-OH](9),212[M-CO](24),184(27),15 5(13),138(20),128(15)；1H-NMR(CDCl3):12.07(2H,s,OH-1和8),7.83(2H,d,J＝7.2Hz,H-4和 5),7.69(2H,t,J＝7.2,8.4Hz,H-3和6),7.30(2H,d,J＝8.4Hz,H-2和7)；13C-NMR:193.1(s,C-9), 181.5(s,C-10),162.5(s,C-1和8),137.3(s,C-3和6),133.6(s,C-4a和5a),124.6(s,C-2和7), 120.1(s,C-4和5),115.9(s,C-1a和8a)。以上数据与1,8-二羟基蒽醌数据基本一致，故鉴定化合物24为1,8-二羟基蒽醌。
实施例4正丁醇部位组分分离纯化
将上述实施例1获得的正丁醇部位60.0g加入乙醇，沉淀时在容器壁上析出结晶，反复多次操作，多次重结晶得30mg的化合物23。正丁醇部位经中压反相C18分离用水- 甲醇溶液(5％～100％)梯度洗脱，洗脱液按同一梯度合并，减压回收溶剂得到Z-Ⅰ～Z-Ⅵ共6个组分。Z-Ⅱ组分经由MCI树脂分离，用水-甲醇溶液(0％～100％)梯度洗脱，并用 C18半制备柱分离纯化得4mg的化合物7、5mg的化合物8、4mg的化合物9、5mg的化合物10。Z-Ⅳ组分经C18半制备柱分离纯化后得5mg的化合物6。Z-Ⅰ组分即MCI树脂纯水洗脱部位，经AgilentZorbax SB-CN全制备柱分离切段，用水-甲醇溶液(5％)等度洗脱，得Z-A～Z-D共4个组分。
其中，上述反相C18柱色谱分离的条件为：水-甲醇溶剂系统(5％～100％)梯度洗脱；流速：1.5ml/min，柱温：30℃。
其中，上述MCI树脂分离条件为水-甲醇溶剂系统(0％～100％)梯度洗脱；流速：1.5ml/min，柱温：30℃。
其中，上述C18半制备柱分离纯化条件为：流动相A：1ml/L磷酸水溶液(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.5ml/min，柱温：30℃。
AA-A组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得化合物4mg的13、100mg的化合物14、5mg的化合物16、4mg的化合物17、15mg的化合物19、4mg的化合物 20和3mg的21。化合物14、16、17、20和21均为白色颗粒，化合物13为白色胶状物；化合物19为纯化后结晶所得，透明针状结晶。Z-B组分经Agilent Zorbax SB-CN 半制备柱分离纯化，得化合物4mg的11、5mg的12，化合物11、12为白色颗粒。Z-C 组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得5mg的化合物18和4mg的化合物 22，化合物18、22均为白色粉末。Z-D组分经Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化，得4mg的化合物15，化合物15为白色粉末。
其中，上述Agilent Zorbax SB-CN半制备柱分离纯化条件为：流动相A：以15mM 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液作为洗脱液A(0.2％三乙胺，磷酸调PH2.0)，流动相B：乙腈；流动相A、B均需抽滤，超声10min；流动相比例：流动相A：流动相B＝90:10；流速：1.5ml/min，柱温：30℃。
将分离纯化的化合物组分进行理化性质鉴定，通过常规物理检测方法：其检测方法有：EIS-MS、H-NMR、C-NMR。其检测方法同药典2015版检测方法。检测结果如下：
化合物6麦角甾醇(Ergosterol)
Figure BDA0002276626150000101
白色粉末；EI-MS m/z＝428[M-H2O],410[M-2H20],382[M-2H2O-CO].1H-NMR(CD3OD,500MHz):5.21(2Hm,H-22,23),5.05(1H,brs,H-7),3.88(2H,m,H-3,6)，1.05(3H,S,H-19),1.0 3(3H,d,J＝6.7Hz,H-21),0.93(3H,d,J＝6.9Hz,H-28),0.86(3H,d,J＝6.8Hz,H-27),0.84(3H,d,J＝6.8 Hz,H-26),0.61(3H,S,H-18)。13C-NMR(DEPT)谱给出了28个碳的信号，分别为6个甲基、7个亚甲基、10个次甲基和5个季碳。其中四个碳信号在δc78.6，75.8，71.2，67.9，表明它们与氧连接。在δc143.3,137.0,133.3,122.0的四个碳信号表明有两个双键。以上数据与麦角甾醇的数据基本一致，故鉴定化合物6为麦角甾醇。
化合物7过氧麦角甾醇(peroxy-ergosterol)
Figure BDA0002276626150000111
白色粉末。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:6.50(1H,d,J＝8.5Hz,H-7),6.24(1H,d,J＝8.5Hz,H -6),5.22(1H,dd,J＝7.6,15.3Hz,H-23),5.14(1H,dd,J＝8.3,15.5Hz,H-22),3.92(1H,m,H-3),1.25(3 H,s,Me-19),1.00(3H,d,J＝6.7,Me-21),0.91(3H,d,J＝6.9Hz,Me-28),0.88(3H,s,Me-18),0.83(3H, d,J＝6.8Hz,Me-26),0.82(3H,d,J＝6.8Hz,Me-27)。13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:34.7(t,C-1),30. 1(t,C-2),66.4(d,C-3),36.9(t,C-4),82.2(s,C-5),135.4(d,C-6),130.7(d,C-7),79.4(s,C-8),51.1(d,C -9),36.9(s,C-10),23.4(t,C-11),39.4(t,C-12),44.6(s,C-13),51.8(d,C-14),20.6(t,C-15),28.6(t,C- 16),56.2(d,C-17),12.9(q,C-18),18.2(q,C-19),39.4(d,C-20),20.9(q,C-21),135.2(d,C-22),132.3 (d,C-23),42.8(d,C-24),33.1(d,C-25),20.0(q,C-26),19.6(q,C-27),17.6(q,C-28)；以上数据与过氧麦角甾醇的数据一致，故鉴定化合物7为过氧麦角甾醇。
化合物8Macrosphelide A
白色粉末,ESI-MS m/z:365.2[M+Na]+,341.2[M-H]-,由此推断相对分子质量为342, 结合氢谱和碳谱,可以推得分子式为C16H22O8,1H-NMR(CDCl3):6.88(1H,dd,J＝15.6,1.5Hz, H-7),6.83(1H,dd,J＝15.6,1.5Hz,H-13),6.02(1H,dd,J＝15.6,1.5Hz,H-12),6.01(1H,dd,J＝15.6,1. 5Hz,H-6),5.35(1H,m,H-3),4.93(1H,q,J＝6.3Hz,H-9),4.82(1H,q,J＝6.3Hz,H-15),4.18(1H,m,H- 8),4.09(1H,m,H-14),3.57(2H,brs,8-OH,14-OH),2.58(2H,dd,J＝7.2,2.4Hz,2-H2),1.40(3H,d,J＝ 6.6Hz,9-CH3),1.33(3H,d,J＝6.3Hz,15-CH3),1.29(3H,d,J＝6.6Hz,3-CH3)；13C-NMR(CDCl3),1 70.1(C-1),165.7(C-11),164.9(C-5),146.4(13-CH),145.6(7-CH),122.5(6-CH),122.1(12-CH),7 4.5(9-CH),74.4(8-CH),73.6(15-CH),72.8(14-CH),67.7(3-CH),40.9(2-CH2),19.6(3-CH3),1 7.8(9-CH3),17.7(15-CH3)；以上数据与Macrosphelide A的数据一致，故鉴定化合物8为Macrosphelide A。
化合物9腺苷(a-denosine)
Figure BDA0002276626150000121
白色粉末,mp.230～232℃；1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:3.58(1H,d,J＝10.8Hz,H-5′), 3.67(1H,d,J＝11.4Hz,H-5′),5.88(1H,d,J＝9.6Hz,H-1′),7-33(2H,brs,J＝1.0Hz,NH2),8.14(1H,s,H -8),8.34(1H,s,H-2)；13CNMR(DMSO-d6,125MHz)δ:152.3(C-2),149.0(C-4),119.3(C-5),156.1 (C-6),139.9(C-8),87.9(C-1′),73.4(C-2′),70.6(C-3′),85,8(C-4′),61.6(C-5′),156.1(C-6′),以上波谱数据及理化特征与腺苷一致，故鉴定该化合物9为腺苷(a-denosine)。
化合物10对羟基苯甲酸乙酯(4-hydroxy ethylbenzoate)
Figure BDA0002276626150000122
无色油状物；易溶于丙酮、氯仿和甲醇，难溶于水。ESIMS m/z＝167[M+H]+；1H- NMR(Me2CO-d,6,500Hz)δ:7.87(2H,d,J＝9.0Hz,H-2,6),6.90(2H,d,J＝9.0Hz,H-3,5),4.22(2H, q,J＝7.0Hz,H2-1′),1.31(3H,t,J＝7.0Hz,H3-2′)。以上数据与对羟基苯甲酸乙酯的数据一致，故鉴定化合物10为对羟基苯甲酸乙酯。
化合物12对羟基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)
Figure BDA0002276626150000131
无色油状物；易溶于丙酮、氯仿和甲醇，难溶于水；ESIMS m/z＝123[M+H]+；1H- NMR(Me2CO-d6,500Hz,)δ:9.84(1H,s,H-7),7.79(2H,d,J＝9.0Hz,H-2,6),7.00(2H,d,J＝8.5Hz, H-3,5)。以上数据与对羟基苯甲醛的数据一致，故鉴定化合物12为对羟基苯甲醛。
化合物134-羟基-3-甲氧基-苄醇(4-hydroxy-3-methoxy-benzyl alcohol)
Figure BDA0002276626150000132
白色固体。易溶于丙酮、氯仿和甲醇，不溶于水；ESIMS m/z＝155[M+H]+；1H-NM R(Me2CO-,d,6,500Hz)δ:7.53(1H,s,4-OH),6.84(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),6.85(1H,d,J＝8.0Hz,H- 5),6.75(1H,dd,J＝1.5,8.0Hz,H-6),4.47(2H,d,J＝6.5Hz,H2-7),4.03(1H,t,J＝6.5Hz,7-OH),3.80(3 H,s,-OMe)；13C-NMR(Me2CO-,d,6,125Hz)δ:136.1(C-1),112.2(C-2),147.3(C-或C-4),147.0 (C-或C-4),114.7(C-5),118.5(C-6),64.4(C-7),56.3(-OMe)。以上数据与4-羟基-3-甲氧基- 苄醇的数据一致，故鉴定化合物13为4-羟基-3-甲氧基-苄醇。
化合物145α,6α-Epoxy-(22E,24R)-ergosta-8(14),22-diene-3β,7α-diol
Figure BDA0002276626150000133
白色粉末；
Figure BDA0002276626150000134
HRESIMS:m/z＝451.3167[M+Na]+(calcdfor C28H44NaO3,451.3183)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:5.21(2H,m,H-22,23),4.42(1H,d,J＝6.3H z,H-7),3.91(1H,m,H-3),3.14(1H,d,J＝3.5Hz,H-6),1.02(3H,d,J＝6.7Hz,H-21),0.92(3H,d,J＝6. 8Hz,H-28),0.87(6H,s,H-18,19),0.84(3H,d,J＝6.8Hz,H-27),0.82(3H,d,J＝6.8Hz,H-26)；13C-NM R(150MHz,CDCl3)δ:152.75(C-14),135.41(C-22),132.44(C-23),125.38(C-8),68.87(C-3),67. 92(C-5),65.25(C-7),61.49(C-6),57.02(C-17),43.15(C-13),43.01(C-24)39.78(C-20),39.39(C- 4),38.92(C-9),36.78(C-12),36.01(C-10),33.27(C-25),32.38(C-1),31.31(C-2),27.31(C-16),25. 13(C-15),21.40(C-21),19.82(C-27),19.17(C-26),18.24(C-11),17.77(C-18,28),16.70(C-19)。以上数据与5α,6α-Epoxy-(22E,24R)-ergosta-8(14),22-diene-3β,7α-diol的数据一致，故鉴定化合物14为5α,6α-Epoxy-(22E,24R)-ergosta-8(14),22-diene-3β,7α-diol。
化合物15对羟基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol)
Figure BDA0002276626150000141
白色针晶(甲醇)；易溶于丙酮、氯仿和甲醇，不溶于水；(-)-ESIMS m/z＝283[M-H]-；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.31(1H,s,OH),7.25(2H,d,J＝8.0Hz,H-2,6),6.89(2H,d,J＝ 8.0Hz,H-3,5),4.76(1H,s,OH),4.36(2H,s,H-7)。以上数据与对羟基苯甲醇的数据对照基本一致，故鉴定化合物15为对羟基苯甲醇。
化合物16对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)
Figure BDA0002276626150000142
白色片状结晶(丙酮)，易溶于氯仿和甲醇，不溶于水(-)-ESIMS m/z＝137[M-H]-；1H-NMR(500MHz,Me2CO-d6)δ:7.68(2H,d,J＝9.0Hz,H-2,6),6.79(2H,d,J＝9.0Hz,H-3,5)。13C-NMR(125MHz,Me2CO-d6)δ:168.3(COOH),162.1(C-4),132.1(C-2,6),122.2(C-1),114.9(C-3,5)。以上数据与对羟基苯甲酸的数据一致，故鉴定化合物16为对羟基苯甲酸。
化合物17对羟基苄基甲基醚(p-hydroxybenzyl methyl ether)
Figure BDA0002276626150000143
白色片状结晶(丙酮)，易溶于氯仿和甲醇，不溶于水。(-)-ESIMS m/z＝137[M-H]-；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.25(1H,OH),7.17(2H,d,J＝8.0Hz,H-2,6),6.69(2H,d,J＝8.0 Hz,H-3,5),4.19(2H,s,H-7),3.18(3H,s,OMe)。以上数据与对羟基苄基甲基醚的数据一致，故鉴定化合物17为对羟基苄基甲基醚。
化合物18对羟基苄基乙基醚(p-hydroxybenzyl ethyl ether)
Figure BDA0002276626150000151
白色片状结晶(丙酮)，易溶于氯仿和甲醇，不溶于水；(+)-ESIMS m/z＝153[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.29(1H,OH),7.09(2H,d,J＝8.4Hz,H-2,6),6.80(2H,d,J＝8. 4Hz,H-3,5),4.31(2H,s,H-7),3.39(2H,q,J＝6.9Hz,OCH2CH3),1.11(3H,t,J＝6.9Hz,OCH2CH 3)。以上数据与对羟基苄基乙基醚的数据一致，故鉴定化合物18为对羟基苄基乙基醚。
化合物19对甲氧基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)
Figure BDA0002276626150000152
白色片状结晶(丙酮)，易溶于氯仿和甲醇，难溶于水。(-)-ESIMS m/z＝151[M-H]-；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.87(2H,d,J＝8.5Hz,H-2,6),6.77(2H,d,J＝8.5Hz,H-3,5),3.74 (3H,s,OMe)。以上数据与对甲氧基苯甲酸的数据一致，故鉴定化合物19为对甲氧基苯甲酸。
化合物208-甲氧基-1-萘酚(8-Methoxynaphthalene-1-ol)
Figure BDA0002276626150000153
白色粉末，ESI-MS m/z＝175[M+H]+.1H-NMR(CDC13,500MHz)δ:9.31(1H,s,1-OH),7. 41(1H,d,J＝8.3Hz,H-4),7.36～7.28(3H,m,H-3,H-5,H-6)6.87(1H,d,J＝7.5Hz,,H-7),6.78(1H,d, J＝7.7Hz,H-2)4.06(3H,s,8-OCH3)；13C-NMR(CDCl3,125MHz)δ:156.2(C-8)154.5(C-1)136.8 (C-4a)127.7(C-3)125.6(C-6),121.9(C-5)118.8(C-4)115.1(C-8a)110.4(C-2)103.9(C-7),56.1(8 -OCH3)。以上数据与8-甲氧基-1-萘酚基本一致，故鉴定化合物20为8-甲氧基-1-萘酚。
化合物22没食子酸(gallic acid)
Figure BDA0002276626150000161
白色针晶；EI-MS m/z(％):171[M+H]+；1H-NMR(500MHz,CDCl3):7.15(2H,s,H-2,6),7.60(2H,s,3,5-OH),7.28(1H,s,4-OH),12.10(1H,s,1-COOH)；13C-NMR(100MHz,CDCl3): 123.1(s,C-1),114.3(d,C-2,6),146.0(s,C-3,5),139.4(s,C-4),170.6(s,COOH)。数据与没食子酸的基本一致，故鉴定化合物22为没食子酸。
化合物233,4,5-三羟基-苯甲醛(3,4,5-trihydroxybenzaldehyde)
Figure BDA0002276626150000162
白色无定型粉末(甲醇)。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ(ppm):9.55(1H，s,-CHO), 7.27(2H,s,H-2,6)；13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ(ppm):192.8(-CHO),149.9(C-3,5),145.2(C-4),128.0(C-1),108.3(C-2,6)。以上数据与3,4,5-三羟基-苯甲醛一致，故鉴定化合物23为3,4,5-三羟基-苯甲醛。
实施例5没食子酸抑制CDC25磷酸蛋白酶活性
实验方法：抑制组蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B活性测试实验：
实验组反应在18μL体系进行，成分包括2.7μL 330μmol/L FDP、1.8μmol/L 100μmol/L没食子酸测试物、2μL 0.1μmol/L CDC25A/CDC25B、11.5μL FDP buffer；对照组1反应在18μL体系进行，成分包括2.7μL 330μmol/L FDP、2μL 0.1μmol/L CDC 25A/CDC25B、13.3μL FDP buffer；对照组2反应在18μL体系进行，成分包括2.7μL 330μmol/L FDP、1.8μL 100μmol/L测试物、13.5μL FDP buffer；将需要加CDC25A /CDC25B酶的体系于37℃条件下孵育60min，之后加酶，于同样条件下反应60min，待反应完全，检测在485nm激发光作用下底物与酶作用生成的反应产物于530nm处的荧光强度。对照组在不加入测试物在同样条件下进行。酶活性存活效率采用下列公式计算：计算公式如下：
酶活性存活效率＝实验组测定值÷对照组1测定值
其中酶活性存活效率越低，说明测试样品对组蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B的抑制效果越强。
2、实验结果
初步筛选结果(见表1)所示，圆孢蘑菇乙醇提取物表现出较好的抑制蛋白磷酸化酶 CDC25A/CDC25B活性，表明了圆孢蘑菇子实体没食子酸提取物中可抑制CDC25A/C DC25B活性。
表1圆孢蘑菇没食子酸提取物对CDC25磷酸蛋白酶抑制结果
项目 酶活性存活效率
CDC25A 35.6％
CDC25B 22.9％
实施例6没食子酸在乳腺增生上应用
实验材料：
动物：健康未育成年Vistar雌性大鼠72只，体重180-220g，由青海大学实验动物中心提供，常规饲养方法饲养一周，适应环境后开始试验。
实验样品及阳性对照药品：圆孢蘑菇没食子酸提取物(高/低浓度)；阳性对照药品：乳安片，0.3g/片，研末后制成水溶液，4℃保存备用。
实验方法：分组及给药
(1)正常对照组：灌服蒸馏水10ml/kg/d；
(2)病模型组：大鼠腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇0.25mg/kg/d，连续25天，然后肌注黄体酮2mg/kg/d，连续5天，同时灌服蒸馏水10ml/kg/d；
(3)病证结合造模组：在(2)组造模基础上添加夹尾方式激怒大鼠，每天半小时，隔日给予饲养喂养；
(4)阳性药对照组(乳安片)：在(3)组造模的基础上灌服乳安片0.16g/kg/d；
(5)实验组低剂量组：在(3)组造模的基础上灌服没食子酸溶液0.08g/kg/d；
(6)实验组高剂量组：在(3)组造模的基础上灌服没食子酸溶液0.16g/kg/d。
实验步骤：
以上6组大鼠分别于实验前/试验后称重，造模及灌药30天后脱臼法处死，用精密游标卡尺测量右前腋上下两个乳房直径，取大鼠上/下两个乳房，用10％福尔马林固定，石蜡包埋切片，常规HE染色在光镜下进行组织学观察其增生程度；PCNA，bcl-2， VEGF，MVD采用免疫组化SABC法测定，操作步骤如下：
(1)切片，常规脱蜡，梯度酒精脱水至蒸馏水；(2)3％过氧化氢孵育5Min消除内源性氧化酶活性；(3)蒸馏水选PBS浸泡5min；(4)染F-VⅢPAg的切片0.1％胰酶消化，室温10min；(5)PCNA抗原热修复，将切片置于0.01mol，PH6.0柠檬酸缓冲盐水95℃， 30Min，冷却后入上述缓冲液中；(6)PBS洗5min3次；(7)5％正常山羊血清封闭室温 10min；(8)倾去血清加入一抗，FaVⅢAg1:100，bcl-21:100，PCNA1：50，VEGF1:100， 4℃过夜；(9)PBS冲洗5min3次；(10)滴加生物素标记的二抗，37℃，30min；(11)PBS 冲洗5min3次；(12)辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37℃30min；(13)PBS冲洗5min3 次；(14)DAB显色，室温10min；(15)自来水冲洗；(16)复染，脱水，透明，封固。
三：实验结果
(1)大鼠实验前后体重比较：表2
Figure BDA0002276626150000191
由上表2可见，病模组2和病证结合造模组3的大鼠体重增加不多，正常组1和给药组4、5、6的大鼠体重均增加，且正常组和给药组4、5、6体重增加程度相差不大。
(2)大鼠乳腺直径的变化：表3
Figure BDA0002276626150000192
由上表3可见：2和3组乳腺直径最大，实验前后乳房变化最大，与其他组相比有显著性差异；3组比2组增大更明显；4、5、6组对乳腺增大均有抵抗作用，且实验用药高剂量组和阳性药4组抵抗效果更接近，低剂量组抵抗效果有，但是比高剂量组和阳性用药组疗效差。
(3)光镜下大鼠乳腺组织学变化
根据有无乳腺增生病症及病症轻重程度分为四类：无增生、轻度增生、中度增生、重度增生。无增生：乳腺小叶不增生，腺体数量极少，腺泡不扩张，处于静止期状态；轻度增生：个别腺泡有轻度增生，无扩张，腺泡及导管内有分泌物；中度增生：乳腺小叶大部分增生，少数腺泡有轻度扩张，腺上皮增生层次增多，腺泡及导管内有分泌物；重度增生：乳腺小叶大部分增生，多数腺泡有明显扩张，腺上皮增生层次增多，腺泡及导管内有较多分泌物。
将光镜下各乳腺组织增生程度按上述标准统计如下：表4
Figure BDA0002276626150000201
由上表4可见：2组和3组大鼠增生显著，与1组相比。且3组增生程度比2组严重，用药后各组均有所改善，其中实验用药高剂量6组和阳性用药4组相当，实验用药低剂量5组也起到疗效作用。
(4)大鼠乳腺组织内PCNA、BCL-2表达水平：表5
采用前面所述的免疫组化法测定大鼠的PCNA、BCL-2，结果判定标准：胞浆内有棕黄色颗粒＞20％为阳性。
组别 组织例数 PCNA阳性率(％) BCL-2阳性率(％)
1 10 8 20
2 10 43 90
3 10 55 90
4 10 18 40
5 10 25 55
6 10 16 42
由上述表5可见：PCNA表达在乳腺导管上皮和腺上皮的细胞核内，模型组2、3 表达率显著高于1对照组，且3病症组结合造模组高于2组单纯病模组。各治疗组均有抑制PCNA表达的作用，其中6组高剂量组显著，同4组阳性药对照组相差不大，低剂量5组也要降低PCNA的效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：没食子酸应用于与CDC25磷酸蛋白酶有关的相关疾病，没食子酸抑制CDC25磷酸蛋白酶活性。
2.根据权利要求1所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：CDC25磷酸蛋白酶有关的相关疾病包括癌症、乳腺增生等增生性疾病及其他。
3.根据权利要求1所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：所述没食子酸的提取方法为：取新鲜、无毁坏的圆孢蘑菇子实体，切片后用90-95％乙醇浸泡一周圆孢蘑菇子实体，过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入90-95％乙醇超声提取3-5次，每次提取1-5h，减压浓缩得90-95％乙醇浸膏；用60-65％乙醇同法操作，减压浓缩得60-65％乙醇浸膏；醇提取后的圆孢蘑菇滤渣，加入蒸馏水超声提取三次，每次提取1-3h，减压浓缩得水提浸膏；
将两部分醇提浸膏合并，将合并后的浸膏捏溶分散于纯水中，在分液漏斗中加入石油醚，再将浸膏分散液加入分液漏斗中，萃取5次，萃取液合并浓缩，得石油醚部位；再向分液漏斗中加入乙酸乙酯，萃取6次，萃取液合并浓缩，得乙酸乙酯部位；再次向分液漏斗中加入正丁醇，萃取5次，萃取液合并浓缩，得正丁醇部位。
4.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：上述圆孢蘑菇子实体与乙醇比例为0.5-1:1-5，使乙醇完全浸泡圆孢蘑菇子实体。
5.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：上述减压回收条件为0.1-0.5MPA，温度25-40℃；上述超声提取条件为200-800HZ，超声30-45min，温度30-50℃。
6.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：分液漏斗中加入石油醚，水与石油醚比例为1:1-0.5。
7.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：分液漏斗中加入乙酸乙酯，水与乙酸乙酯比例为0.5-1:1。
8.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：分液漏斗中加入正丁醇，水与正丁醇比例为0.4-1:1。
9.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：上述浸膏萃取条件为：萃取压力为20MPa～40MPa，萃取温度30℃～50℃，萃取时间为0.8h～2.5h。
10.根据权利要求3所述圆孢蘑菇中活性成分没食子酸的应用，其特征在于：圆孢蘑菇子实体与乙醇比例为1:3。
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