CN110448549B

CN110448549B - 一种盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料

Info

Publication number: CN110448549B
Application number: CN201910872968.6A
Authority: CN
Inventors: 卢春华; 蔡淑贤; 钟武坤; 江翊凡; 陈梓怡; 杨黄浩
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110448549A

Abstract

本发明公开了一种盐酸二甲双胍和7‑乙基‑10‑羟基喜树碱自组装的纳米材料（MH NPs）及其在肿瘤免疫治疗协同化疗中的应用。本发明纳米材料的粒度均匀、分散性好，且其制备方法具有操作简单、耗时少、能耗低、温和、绿色、易于规模化等优点。细胞实验结果表明，所制备的纳米材料具有免疫和化疗协同治疗功能，比传统的免疫检查点抑制剂，如PD‑L1抑制剂具有更高安全性，且更易保存、更平价，在未来的肿瘤免疫治疗领域具有重要的应用前景。

Description

一种盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料

技术领域

本发明属于纳米材料制备和生物医学领域，具体涉及一种盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装纳米材料MH NPs及其在肿瘤免疫治疗协同化疗中的应用。

背景技术

癌症是细胞生长增殖机制失常引起的一种重大疾病，它会局部侵入到周围的正常组织，甚至会经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其它部位，形成转移灶，导致肿瘤的死亡率逐年攀升。近年来，肿瘤免疫疗法取得了全球瞩目的突破性进展，已成为继化疗、放疗和手术治疗之后的第四大类肿瘤治疗手段，为广大肿瘤患者带来了一线曙光。肿瘤免疫治疗方法主要包括过继细胞法（TIL、CAR-T、TCR-T、CAR-NK）、免疫检查点抑制剂（Immunecheckpoint blockcade inhibitors，ICB）、肿瘤疫苗及细胞因子治疗。相比于其它免疫疗法，免疫检查点抑制剂在临床上的应用最为广泛。

参与抗肿瘤免疫反应的T细胞活化后，其表面多种抑制性调节受体（如PD-1和CTLA-4）表达上调，与肿瘤细胞表面高表达的相应配体（如PDL-1）结合，对免疫反应产生抑制作用，导致肿瘤细胞产生免疫逃逸。这些在免疫反应过程中对免疫调节起到负向调节作用的位点，被称为免疫检查点（Immune checkpoint）。针对这些免疫检查点的单克隆抗体抑制剂可恢复机体免疫细胞对肿瘤的免疫杀伤作用。目前常见的免疫检查点抑制剂主要有PD-1抑制剂（如单克隆抗体Nivolumab和Pembrolizumab）、CTLA-4抑制剂（如单克隆抗体Ipilimumab），PD-L1抑制剂(如单克隆抗体Atezolizumab，Avelumab和Duralumab)。随着这些单克隆抗体在临床使用的逐渐普及，这类抑制剂的不良反应被大量报道，其毒副作用不容忽视。首先，这些传统的免疫检查点抑制剂只能结合细胞膜上的免疫检查点，但是细胞内新合成的免疫检查点会源源不断的补充到细胞膜上，可能再次形成抵抗。其次，这些免疫检查点抑制剂的本质是单克隆抗体，具有抗体药物的常见缺点，如价格高昂、稳定性差、不易保存、批间差异大、产生免疫原性等。最后，免疫检查点抑制剂致死性副作用的评估性研究结果表明，免疫相关致死性副作用主要包括免疫性肠炎、免疫性心肌炎、免疫性肝炎、免疫性肺炎，占2017年所有死亡原因的比例高达65%。免疫相关致死性副作用的严重性警示我们迫切需要新的、更有效、更安全的免疫疗法。

盐酸二甲双胍是目前全球应用最广泛的口服降糖药之一，应用于临床已有50多年的历史，具有安全性高、副作用小等特点。近来研究发现，盐酸二甲双胍有直接抗癌的潜能，可以抑制肿瘤细胞的增殖。此外，有文献报道盐酸二甲双胍可以通过AMPK通路使免疫检查点PD-L1发生错误折叠，使PD-L1被内质网清除，即盐酸二甲双胍可通过下调PD-L1发挥免疫治疗作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料MH NPs及其在肿瘤免疫与化疗协同治疗中的应用。其是通过一种操作简单、耗时少、能耗低、温和、绿色、易于规模化的方法制备盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料MH NPs，该方法所制成的纳米材料能成为肿瘤免疫和化疗协同治疗的一种新的纳米制剂，与传统免疫检查点抑制剂相比，其具有更高安全性、更易保存、更平价等特征，在未来的肿瘤免疫治疗领域具有重要的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料MH NPs，其为直径约100-120 nm的球状颗粒。

所述盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料MH NPs的制备方法包括以下步骤：

（1）将盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱按摩尔比为1:1溶解在溶剂中，经超声波处理使其混合均匀；

（2）将步骤（1）所得混合物加入到二次水中，在25℃条件下、以250 rpm的速度搅拌反应15-30 min；

（3）反应结束后，对产物进行离心分离，所得沉淀用二次水洗涤3次，得所述纳米材料MH NPs，重新分散在水中保存。

步骤（1）所述溶剂可以包括，但不限于乙醇、二甲基亚砜（DMSO）。

本发明所得盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料具有免疫和化疗协同治疗功能，可用于乳腺癌的免疫和化疗协同治疗。同时，其中所用盐酸二甲双胍还可替换为环磷酰胺等其他免疫调节剂；所用7-乙基-10-羟基喜树碱还可替换为其他喜树碱衍生物。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明纳米材料的制备过程简单、耗时少、能耗低、温和、绿色、易于规模化，并且该制备方法具有很好的普适性，为其它自组装纳米材料的制备提供了很好的参考。

（2）7-乙基-10-羟基喜树碱是疏水性药物，盐酸二甲双胍是高亲水性药物，二者通过氢键和静电作用，形成的纳米材料具有良好的水溶解性，即通过将盐酸二甲双胍与7-乙基-10-羟基喜树碱结合可以提高7-乙基-10-羟基喜树碱的水溶解性，这为7-乙基-10-羟基喜树碱在临床的广泛使用提供了可能性。

（3）本发明可通过简单的改变投料比来改变材料的尺寸。

（4）本发明方法所制成的盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装纳米材料MH NPs可作为肿瘤免疫和化疗协同治疗的一种新的纳米制剂，与传统的免疫检查点抑制剂相比，其具有更高安全性、更易保存、更平价等特征，在未来的肿瘤免疫治疗领域具有重要的应用前景。

附图说明

图1是实施例1按照不同投料比所制备纳米材料的TEM图，a、b、c、d依次是摩尔比为5:7、1:10、1:15、1:1。

图2是实施例1按照1:1所制备纳米材料MH NPs的粒径结果。

图3是不同浓度纳米材料MH NPs对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤效果情况图，其中(a) 40 µM MH NPs；(b) 15 µM MH NPs；(c)10 µM MH NPs；(d)空白对照组。

图4是纳米材料MH NPs下调乳腺癌细胞MDA-MB-231的PD-L1表达的western blot。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装纳米材料的制备

将0.0051g（0.03mmol）盐酸二甲双胍充分溶解在12 mL DMSO中，将0.0120 g（0.03mmol）7-乙基-10-羟基喜树碱充分溶解在12 mL的DMSO中，然后将这两种溶液按照物料摩尔比5:7、1:10、1:15、1:1的比例混合，室温下经过超声波处理，使其混合均匀。然后将混合溶液加入到含有100 mL二次水的烧杯中，在室温条件下，以250 rpm的速度搅拌反应15min-30min。反应结束后，将溶液通过20000 rpm离心20分钟，用二次水洗涤3次，即得到二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料。

采用日立HT7700透射电子显微镜对所得纳米材料进行形貌表征，结果如图1所示。由图1可以看出，合成的纳米材料尺寸均匀，平均直径约为100 nm。用粒度仪测定纳米材料的水合半径，平均粒径约为140 nm，与电镜结果基本一致。

实施例2 纳米材料MH NPs的稳定性及对乳腺癌细胞的杀伤效果

将乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于96孔板中，24 h后将培养液分散的按摩尔比1:1制得的不同浓度MH NPs加入到孔板中与细胞共孵育48 h。去除96孔板中的溶液，并用PBS洗3次，加入CCK8孵育1 h，置于摇床上低速振荡10 min。最后用酶标仪测定各个孔在450nm的OD值，结果如图3所示。由图3可见，低浓度的MH NPs就表现出对乳腺癌细胞MDA-MB-231明显的杀伤作用，且呈现浓度依赖性，表明二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装纳米材料MH NPs可以作为乳腺癌的一种新型的抗癌制剂。

实施例3

将乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于6孔板中，24 h后将培养液分散的不同浓度的MHNPs加入到孔板中与细胞共孵育48 h。48 h后裂解细胞，提取蛋白，并用BCA法定量蛋白总浓度，再变性蛋白，最后进行western blot。结果表明，MH NPs可以显著下调乳腺癌细胞MDA-MB-231中的PD-L1，即MH NPs可以发挥免疫疗效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种具有免疫和化疗协同功效的盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料，其特征在于：将亲水性的盐酸二甲双胍和疏水性的7-乙基-10-羟基喜树碱通过氢键和静电作用自组装形成所述纳米材料；

其中，所用盐酸二甲双胍与7-乙基-10-羟基喜树碱的摩尔比为1:1；所述纳米材料为直径100-120 nm的球状颗粒。

2.根据权利要求1所述的盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装纳米材料，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

（1）将盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱按比例溶解在溶剂中，经超声波处理使其混合均匀；

（3）反应结束后，离心分离，洗涤3次，得所述纳米材料。

3.根据权利要求2所述的盐酸二甲双胍和7-乙基-10-羟基喜树碱自组装的纳米材料，其特征在于：步骤（1）中所述溶剂包括乙醇、二甲基亚砜中的任意一种。