CN110615891A - 一类茄呢基硫代水杨酸化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一类茄呢基硫代水杨酸化合物、其制备方法及应用,属于药用高分子材料和生物医药领域,所述化合物的结构式如下:。本申请通过以茄呢醇为基本单元,通过溴化反应并引入硫醚键的两步骤得到最终产物STS,反应操作简单并且安全有效。通过红外光谱法以及核磁、质谱、元素分析的表征,确证了目标化合物的成功合成。然后以茄呢基硫代水杨酸为疏水骨架,通过与聚乙二醇的反应通过酯键和腙键共价结合得到结构不同的两亲性聚合物材料,同时负载DOX,应用于药物传递系统。通过对核磁表征说明成功的制备出两亲性聚合物材料;证明了材料和载药聚合物都有其良好的抗肿瘤效果。

Description

一类茄呢基硫代水杨酸化合物、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于药用高分子材料和生物医药领域,具体涉及一类茄呢基硫代水杨酸化合物、其制备方法及应用。
背景技术
茄呢醇(Solanesol)又称九聚异戊二烯醇,为45个碳原子的萜类烯醇,作为一种天然的化合物广泛存在于烟草﹑马铃薯等茄科植物中。主要用于合成含有异戊二烯结构的复杂化合物,如CoQ10、Vk等。茄呢醇具有抗菌、消炎和治疗溃疡等作用,能有效清除自由基而受到广泛的关注。
Edward P. Serebryakov等人研究表明异戊二烯类似物(SDB)可明显降低肿瘤细胞的多药耐药性,增强药物对癌细胞的杀灭作用,所以可以作为一种天然的增敏剂。结构如下:
聚合物胶束在难溶性药物的传载中展现出优越的性能和应用前景而备受关注。然而,载体的大量使用必将导致体内的蓄积毒性。自身具有药理活性的载体兼具药物载体和治疗双重作用,则能够最大限度地提高癌症治疗的效果且降低系统毒性成为一类新型的药物载体。而选取的茄呢醇拥有更长的碳链,作为胶束的疏水内核能够提供更高的稳定性及载药能力。基于对表面活性剂P-gp作用机理的认识,在茄呢醇衍生物分子上引入一定的质子受体基团(如酯基),能够与带有丰富质子给体的P-gp跨膜片段(Trans-membranceSequence)之间形成氢键连接,当这种亲和力大于P-gp与药物的作用时,该衍生物就能起到抑制P-gp的效果,从而能够提高细胞对药物的吸收,逆转肿瘤细胞的多药耐药性。在前期抗肿瘤试验中,发明人亦发现了茄呢醇衍生物的抗肿瘤活性及与DOX协同作用。然而,由于该体系化学基团结构单一(琥珀酸酯),其抗肿瘤活性十分有限,有必要引入新的化学基团(如硫代水杨酸酯基团)调节其抗肿瘤活性。此外,这种具有药理活性的载体材料构建纳米载药系统输送抗肿瘤药物,类似于肿瘤治疗的药物联用,其中存在的协同的抗肿瘤效果及机制都值得进一步的研究。
聚合物材料中引入pH敏感基团,对于pH刺激-响应或者说pH敏感型胶束更适用于抗癌类药物的传递。相对于正常组织细胞而言,肿瘤细胞外环境呈弱酸性(pH在6.8左右),当pH敏感胶束通过EPR效应选择性富集在肿瘤组织后,肿瘤弱酸性环境能够促发药物的释放。当胶束经细胞内吞作用进入细胞以后,药物释放作用于细胞核,从而杀死肿瘤细胞。
因此,选取具有抗肿瘤活性的茄尼基硫代水杨酸作为疏水段和mPEG作为亲水段,将腙键引入到嵌段聚合物主链,将其作为亲水段和疏水段的连接点,赋予亲水段和疏水段生物相容性和生物可降解性,基于断裂-解离-释放。最终释放出活性基团和化疗药,达到联合协同抗肿瘤作用,降低多要药耐药性的发生,降低毒副作用、提高疗效。故设计两种具有抗肿瘤作用的茄尼醇衍生物的胶束及其制备方法具有十分的必要性、可行性和创新意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一类茄呢基硫代水杨酸化合物、其制备方法及应用。
基于上述目的,本发明采取如下技术方案:
一类茄呢基硫代水杨酸化合物,所述化合物的结构式如下:
上述茄呢基硫代水杨酸化合物的制备方法,包括如下过程:
(1)将茄呢醇溶于无水石油醚中,加热使完全溶解后,冰水浴下加入适量吡啶(每29mmol茄呢醇需要加2.6mL吡啶),搅拌下滴加PBr3的石油醚溶液,TLC监测反应,反应结束后,经后处理后得到化合物1,PBr3和茄呢醇的摩尔比为1:2.2~2.3;所述的后处理是指先向反应液中加入蒸馏水,分出有机相,然后脱除部分溶剂,取上层溶液,按照体积比 1∶1加入饱和 NaHCO3溶液 洗至有机相 pH值为 7~ 8,然后再用饱和食盐水洗涤,无水 MgSO4 干燥,在4℃-5℃下冷却结晶,直至晶体不再增多,减压抽滤、真空干燥,即得。
(2)将化合物1溶于丙酮中,加入碳酸胍、硫代水杨酸室温进行搅拌反应,反应结束后,经后处理得到化合物2,化合物1、碳酸胍和硫代水杨酸的摩尔比为1:(1.1~1.2):1;所述的后处理是指旋蒸除去丙酮后,加入氯仿溶解固体以及2~5滴2M HCl,然后水洗,分离有机相,用硫酸镁干燥后旋蒸除去氯仿,得到黄色油状液体,纯化用氯仿:乙酸乙酯=5:1至1:5(v/v)的流动相体系过硅胶柱,TLC监测产物的流出,旋干流动相,真空干燥,即得。
(3)分别称取化合物2、mPEG溶于二氯甲烷中,然后依次加入EDC、DMAP室温搅拌反应至完全 ,反应结束后,经后处理得到化合物3,其中,化合物2、mPEG、EDC、DMAP的摩尔比为:1:0.7:(3.2~3.3):(1.2~1.3);所述的后处理是指常压过滤除去不溶物,减压旋去部分溶剂,用冰乙醚和冰乙醇分别沉两次,真空抽滤,然后减压旋蒸,产物用适量丙酮溶解,逐滴滴入水中形成胶束并进行透析(8000Da),透析20~30h,-40℃~-50℃冷冻干燥,即得。
(4 )称取mPEG5000于 CH2Cl2 中,然后分别加入对羧基苯甲醛、DCC、DMAP,超声使溶解完全,室温搅拌至反应完全,经后处理得化合物5,mPEG5000、对羧基苯甲醛、DCC和DMAP的摩尔比为1:(9.5~10):(9.5~10):(2.4~2.5);所述的后处理是指将反应后的反应液减压抽滤,收集滤液,旋蒸除去CH2Cl2,浓缩产物用异丙醇溶解后置于4℃,然后分别用异丙醇、乙醚洗涤沉淀,减压抽滤,真空干燥,即得。
(5)将化合物2加入甲醇中加热溶解,再加入水合肼,80±5℃回流反应至完全,反应停止后,冷却至室温,减压旋干,即得化合物4,将化合物4用CH2Cl2溶解,再加入化合物5,80±5℃加热回流反应至完全,经后处理即得化合物6,化合物2与水合肼的摩尔比为1:0.1~0.15,化合物4和化合物5的摩尔比为1:1。所述后处理是指反应液先抽滤,然后旋去部分二氯甲烷,再加入5倍体积量冰乙醚使产物析出,减压抽滤即得。
上述化合物作为载药胶束的应用,所包载药物为阿霉素。
上述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
上述化合物在制备Ras抑制剂中的应用。
本申请利用茄呢醇为基本骨架与硫代水杨酸酯基团通过硫醇键结合,考察其抗肿瘤活性;再者与亲水性聚乙二醇分别通过酯键和腙键共价相连得到两嵌性聚合物,再通过物理包封广谱抗癌药阿霉素,得到mPEG-STS和pH敏感性mPEG-HZ-STS纳米药物载体,同时pH敏感性mPEG-HZ-STS通过腙键断裂游离出的茄呢醇基硫代水杨酸和化疗药DOX,两者联合治疗达到协同抗肿瘤的目的。
本发明中的三种聚合物载体材料都含有具有抗肿瘤活性部位茄尼基硫代水杨酸,其中mPEG-HZ-STS具有pH敏感性的聚合物材料,其中pH敏感基团为含腙键结构基团()。
本发明以三种具有抗肿瘤作用的茄尼醇衍生物作为载药胶束,可以负载难溶性药物从而起到增溶作用,因此选取了化疗药阿霉素作为负载药物。
本发明聚合物材料引入pH敏感基团,对于pH刺激-响应或者说pH敏感型胶束更适用于抗癌类药物的传递。相对于正常组织细胞而言,肿瘤细胞外环境呈弱酸性(pH在6.8左右),当pH敏感胶束通过EPR效应选择性富集在肿瘤组织后,肿瘤弱酸性环境能够促发药物的释放。当胶束经细胞内吞作用进入细胞以后,药物释放作用于细胞核,从而杀死肿瘤细胞。
本发明载药胶束的优势是通过对药物载体的化学结构的精确控制,实现茄呢醇基纳米药物载体对抗肿瘤药物的精确递送以及协同的抗肿瘤作用,建立药物载体的化学结构与递药性能之间的关系。为发展基于天然物质的多功能药物载体和构建合理有效的载药系统。
附图说明
图1为SOL(A)、SOL-Br(B)、STS(C)的1H-NMR图谱;
图2为终产物STS(A)、SOL-Br(B)及SOL(C)的红外扫描图谱;
图3为STS的MS分析图;
图4为STS、FTS和SOL对四种细胞的毒性 (48h) A:HepG-2细胞、B:MCF-7细胞、C:7721细胞及D:A549细胞;
图5为 A : (STS)和 B : (FTS)对四种细胞IC50拟合;
图6为STS的蛋白免疫印迹(a:20 ,b:35, c:75µg/mL);
图7为中间产物及终产物的1H-NMR图谱;a图中:A、中间产物STS,B、终产物mPEG-STS;b图中,A、中间产物mPEG-CHO,B 、STS,C、终产物mPEG-HZ-STS;
图8为空白胶束以及载药胶束的AFM图,A:mPEG-STS、B:mPEG-HZ-STS、 C::mPEG –STS(DOX)和D:mPEG-HZ-STS(DOX)(2D和3D成像);
图9为载药胶束的不同pH条件下的释放曲线:(A)mPEG-STS (DOX)和(B)mPEG-HZ-STS(DOX);
图10为 mPEG-STS 、mPEG-HZ-STS两种空白胶束对HepG-2细胞、MCF-7细胞及正常肝细胞L-02细胞毒性实验,A:48,B:72h;
图11为载阿霉素胶束及阿霉素(DOX)裸药对HepG-2细胞(A:48h 、B :72h)、MCF-7细胞(C:48h 、D :72h)及L-02细胞(E:48h 、F :72h)的活性抑制(n = 3);
图12为不同材料的蛋白免疫印迹(FTS和STS:40µg/mL、mPEG-STS和mPEG-HZ-STS:400µg/mL)(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明,但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
(1)茄呢基溴(SOL-Br)的合成
取20.0 g( 29 mmol)茄呢醇溶于100 mL无水石油醚中,40℃热水浴完全溶解后,在冰水浴下加入 2.6 mL吡啶,搅拌下缓慢滴加 3.6 mL PBr3( 13 mmol)的26mL石油醚溶液。冰水浴反应3h,反应结束后,倒入100mL的蒸馏水,分出有机相,然后脱除部分溶剂,取上层淡黄色溶液,按照体积比 1∶1加入饱和 NaHCO3溶液 洗至有机相 pH值为 7~ 8,然后再用饱和食盐水洗两次,无水 MgSO4 干燥,在4℃-5℃下冷却,有白色晶体析出,直至白色晶体不再增多,减压抽滤后得到白色粉末状固体产物,40 ℃真空干燥,得到白色产物SOL-Br。
(2)茄呢基硫代水杨酸STS的合成
称取4.16g (6mmol) 茄呢基溴溶于75mL的丙酮中,然后依次加入1.3g(7mmol)碳酸胍、0.9g(6mmol)硫代水杨酸,常温反应24h,旋蒸除去丙酮后,加入约10mL氯仿溶解以及几滴2MHCl,然后水洗,分离有机相,用硫酸镁干燥后旋蒸除去氯仿,得到黄色油状液体。纯化用氯仿:乙酸乙酯=5:1至1:5(v/v)的流动相体系过硅胶柱,TLC监测产物的流出,旋干流动相,30℃真空干燥24h,得淡黄色产物STS,产率:87.6 wt%。
图1为合成的STS与原料SOL和SOL-Br核磁图对照。图A、B、C中相同的化学位移是δ=1.6和1.68ppm处的吸收峰属于茄呢基甲基质子吸收峰(CH 3-C=C-),δ= 1.98和2.09ppm处是茄呢基的亚甲基质子吸收峰(C=CCH 2CH 2C=C-)δ = 5.34ppm附近(-CH2C=C-H)和5.12ppm(CH3CH3C=C-H)三重峰是双键相连的亚甲基质子吸收峰。图A、B、C不同之处在于:A图 SOL中羟基旁亚甲基质子峰在δ= 4.15ppm出峰,B图SOL-Br中溴相连的亚甲基质子峰在δ=4.02ppm,C图与巯基相连亚甲基质子峰δ= 3.5ppm附近出峰。由于硫醇的形成,由δ = 4.15ppm向低场移动。δ= 7.2~7.8ppm分别是硫代水杨酸基团中的苯环中的质子吸收峰。说明了由SOL已成功合成了茄呢基硫代水杨酸。
图2为STS(A)、SOL-Br(B)及SOL(C)的红外扫描图谱,由图2可知,A、B、C中:2942、2918、2852 cm-1是烷基C-H伸缩振动,1683是C=C伸缩振动,C图中3320cm-1为羟基(V-OH)伸缩振动吸收峰,与B图相比,B图中羟基(V-OH)伸缩振动吸收峰明显消失,图B和图A相比:图A为STS特征红外图谱中3425cm-1及943 cm-1处分别为羟基(v-OH)伸缩及面外弯曲振动(γ-OH)吸收,由红外表征说明了SOL-Br和STS的成功合成。
实验用AmaZon SL型液相色谱-质谱联用仪对STS进行LC-MS分析,谱图如图3所示。采用电子轰击样品,打掉分子中的价电子,形成带正电荷的离子,根据荷比(m/z)对材料进行分析和相对分子量的测定。图中,最大的离子碎片分子量为766.79,最大离子碎片分子量加上一个电荷得出766.79,而根据Chemdraw计算出的分子质量为: 767.2540,说明制备的STS有较高的纯度,可以用于进一步的研究。
(3)两亲性聚合物mPEG-STS的合成
分别称取0.5g STS(0.65mmol)、约2.23g mPEG(0.45mmol)溶于50mLDCM中,然后依次加入0.4g EDC(2.1mmol)、0.1g DMAP(0.82mmol)室温搅拌反应24h ,反应结束后,常压过滤除去不溶物,减压旋去部分溶剂。用冰乙醚和冰乙醇分别沉两次,真空抽滤,然后减压旋蒸。产物用适量丙酮溶解,逐滴滴入水中形成胶束并进行透析(8000Da),透析24h左右,-40℃~-50℃冷冻干燥24小时即得粉末状白色固体。
(4)聚合物mPEG-CHO的合成
称取mPEG5000 10g(2mmol),溶解于150mLCH2Cl2 中。然后分别加入对羧基苯甲醛3g(19.98mmol),N,N'—二环己基碳二亚胺(DCC)4g(19.42mmol),4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.6g(4.92mmol),超声使溶解完全。室温下搅拌反应24h,减压抽滤,收集滤液,旋蒸除去CH2Cl2,浓缩产物用异丙醇溶解后置于4℃,然后分别用异丙醇、乙醚洗涤沉淀,减压抽滤,40℃真空干燥,得淡黄色固体粉末。
(5)两亲性聚合物mPEG-HZ-STS的合成
将0.5g STS(0.65mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中,加入10mL甲醇加热溶解,最后加入4mL的水合肼(0.078mmol),升温至80℃回流反应8h,反应停止后,冷却至室温,减压旋干。所得产物用10mL的CH2Cl2溶解,再加入0.39g的mPEG-CHO(0.078mmol),80℃加热回流反应6h,反应液先抽滤,然后旋去部分二氯甲烷,再加入5倍体积量冰乙醚使产物析出,减压抽滤即得干燥固体产物。以氘代DMSO为溶剂,对合成产物进行核磁共振氢谱(1H-NMR)测定,结果详见图7。图7a 所示;mPEG-STS核磁与STS相比,茄呢基的特征峰都没有改变,并且δ= 7.2~7.8ppm依旧分别是硫代水杨酸基团中的苯环中的质子吸收峰,A与B的不同在于δ=4.6ppm出现的三重峰说明了(-COOCH 2-)新生成的酯键旁边的亚甲基的出峰位置δ= 3.5ppm的低场向高场移动,以及新出现的δ=3.38-3.82ppm (-CH 2CH 2-O-)范围内为PEG骨架亚甲基质子峰,说明两亲性嵌段聚合物mPEG-STS的成功合成。
图7b可知;图A :mPEG-CHO的特征吸收峰在δ= 7.6-8ppm之间属于苯环上的质子吸收峰,图C:明显出现了酯键旁亚甲基质子峰在δ= 4.3ppm左右;以及mPEG-CHO中的醛基质子吸收峰δ= 10.099ppm明显消失;而在δ= 8.8 ppm附近出现了生成腙键的(-CH=N-)质子吸收峰;δ= 7.0-8ppm则分别归属于两个苯环上的质子吸收峰;同时茄呢基各特征峰正常,说明了已成功合成了mPEG-HZ- STS。
表1 STS的元素分析
通过Chemdraw模拟的理论值Elemental Analysis: C:81.40; H:10.25; O:4.17; S:4.18 以及分子量为767.2540经过计算可以确定误差范围很小,出现这种误差有可能在使用仪器时候出现的系统误差;其次化合物中含有氧元素,如果在样品制作中出现极少氧气都可以造成误差值偏大。
用MTT法来考察STS、FTS、SOL三种材料对细胞的毒性作用。选取了四种肿瘤细胞,HepG-2细胞、MCF-7细胞、7721细胞及A549细胞,作用48h后发现SOL以最大剂量给药时,其对四种肿瘤细胞的存活率均在80%左右,说明其有良好的生物相容性可以用作聚合物材料。而STS和FTS对A549的细胞毒性明显弱于前三者,且对A549基本上没有表现出强的细胞毒性。但是对MCF-7、HepG-2细胞的毒性优于7721细胞。并且从图4中可以明显看出合成出来的STS的细胞毒性要优于FTS,可能是由于较长的疏水链段增强了脂溶性,增强对细胞膜的亲和力,从而更容易进入细胞膜发挥抗肿瘤作用。通过材料对细胞毒性的IC50 拟合,详见图5,可以更直观的看出STS对细胞的毒性优于FTS。
表2所示,STS和 FTS对HepG-2细胞、MCF-7细胞、7721细胞及A549细胞的半数抑制浓度(IC50)
蛋白免疫印迹分析:已经有研究报道FTS是有效的Ras拮抗剂,抑制癌基因激活的Ras和生长因子受体介导的Ras激活,从而抑制了Ras依赖性肿瘤生长。因此根据FTS的相关报道,对STS的抗肿瘤机理进行了初步的探讨,从图6中可以看出随着STS剂量浓度的增加,其对Ras的抑制作用明显增强。随着STS浓度的增加,明显增加了LC3-II/Actin的比例,初步说明STS可以促进LC3-II的累积导致自噬体形成。
临界聚集浓度(CAC)的测定
mPEG-STS、mPEG-HZ-STS两种材料采用芘荧光探针法测定临界胶束浓度(CMC),首先配制芘-丙酮储备液浓度为6.0 ×10-6 mol/L,然后取0.5 mL的芘-丙酮储备液分别加入到不同的容量瓶内,放置于阴暗处自然挥干丙酮;然后向容量瓶内分别加入配制好的5 mL不同浓度mPEG-STS、mPEG-HZ-STS胶束溶液,使芘浓度为6.0 ×10-7 mol/L,然后在室温下超声处理30min后放置于恒温振荡器中40℃孵育24 h,让胶束与芘得到充分的平衡,然后采用稳态荧光光谱仪测试芘的荧光光度值。荧光条件为:激发波长λex:335nm,发射波长扫描范围λem:350-500nm,激发狭缝(Ex slit widths):5nm,发射狭缝(Em slit widths):2.5nm,扫描速度:240nm/min。以芘在384 nm和373 nm的荧光强度的比值(I3/I1)对胶束溶液的浓度对数值LgC作图,由两条拟合直线的交点计算得对应材料浓度即为CAC(mg/L),结果详见图8,由图8可知,随着聚合物胶束达到某一浓度(CMC),聚合物胶束开始形成,两种分子量相差不大的mPEG-STS和mPEG-HZ-STS经拟合计算可以得CMC分别为0.00744和0.00764mg/mL,CMC值越小表示聚合物胶束越稳定;影响聚合物胶束的CMC与聚合物结构、分子量以及疏水段的结构及性质有关;适当的CMC值有利于聚合物在血液循环系统中稳定存在,同时也避免药物在体内出现泄露或突释等问题。
空白胶束的制备及粒径表征
采用自乳化溶剂挥发法制备空白胶束,取聚合物材料35.0 mg溶于1 mL丙酮中,逐滴滴入25 mL去离子水中,常压或减压挥发24 h,经0.45 μm、0.22µm水系滤膜过滤即得空白胶束溶液。然后采用激光粒度仪测定胶束粒径及粒径分布。
盐酸阿霉素脱盐及载阿霉素胶束的制备
精密称取阿霉素盐酸盐100.1mg溶于20 mL去离子水中,加入3倍量的三乙胺72 µL。室温搅拌12 h后,10000 rpm离心5 min,弃去上清,加入新的去离子水,超声混匀后,再次离心。重复上述操作,至上清无明显红色存在后,冷冻干燥得脱盐后的游离阿霉素,保存待用。
精密称取mPEG-STS、mPEG-HZ-STS两种不同材料30.00mg材料分别溶于2 mL丙酮中,分别用2 mL的二甲基亚砜溶解5.0 mg脱盐后的游离阿霉素。温水超声助溶,将两液混合均匀,继续温水超声助溶。逐滴滴加于20 mL去离子水中,滴加完毕后,透析48h(截留分子量8000Da)。经0.45 μm及0.22µm水系滤膜过滤即得载药胶束溶液。取适量胶束溶液采用激光粒度仪测定胶束粒径及粒径分布。
表3聚合物胶束的CMC、粒径、及DLC
由表3明显可以看出,mPEG-STS 、mPEG-HZ-STS在水中形成的胶束粒径为100 nm以内,两种胶束粒径相差不大且均有较小的PDI值,表明其粒径分布较均匀。对于实现避免网状内皮系统的特异性识别,延长体循环时间,实现对肿瘤组织的EPR被动靶向至关重要。与空白胶束相比,载药胶束粒径分别增加20nm左右。一方面原因是由于载药量的增加导致内核面积增大,另一方面原因可能由于空白胶束和载药胶束制备方法的差异导致。用AFM来观察空白胶束以及载药胶束的形貌结构,如图8所示,胶束呈类球形结构,各组粒径与DLS测定的粒径比较略偏小,这可能是由于在干燥的过程中缩水导致PEG层萎缩;而DLS测定粒径稍大是由于湿态下PEG层得到充分伸展,有较厚的水化层。胶束呈均匀分布状态,因此可以用于纳米载药体系。
载药胶束的释放行为考察
载阿霉素药物释放研究的释放介质为磷酸缓冲液(pH = 7.4、6.5,0.01 M)和醋酸盐缓冲液(pH = 5.0,0.01M)。每种取3份(每份3 mL),分别装入透析袋中(截留分子量 8000Da),放入40 mL pH值分别为7.4、6.5、5.0的上述释放介质,放入恒温振荡器(37℃,120 r/min)中进行释放研究。在规定的时间点分别取样3 mL,每次取样后补加3 mL同条件下的新鲜释放介质。样品用荧光分光光度计检测阿霉素的含量(激发波长为481 nm,发射波长为558nm),并用下列公式计算累计释放量:
式中Er为阿霉素的累积释放量(%),V为取样体积(mL),V0为释放介质的总体积(mL),Ci为第i次取样时阿霉素的浓度(μg/mL),Cn为第n次取样时阿霉素的浓度(μg/mL),m为载药纳米凝胶中阿霉素的总量(g),n为取样次数。具体结果详见图9,由图9可知,图B含腙键的材料在10h中累计释放量达到最高,而图A虽然在10h中累计释放量也达到最高,但是过后属于缓慢平稳的上升,但图B在10h之后已经趋于平稳。而图A、B的pH7.4释放分别量为23%和19 % ;pH6.5时释放分别为32% 和40%;pH5.0时释放分别为40% 和58% ;最高释放量分别为45%和63%。因此可以直观的看出合成的含腙键聚合物材料具有良好的pH敏感性。而且后者的累计释放量也明显优于通过酯键形成的mPEG-STS。
聚合物材料的细胞毒性评价
聚合物空白胶束及载阿霉素胶束的细胞毒性测试:采用人肝癌细胞(HepG-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)以及正常肝细胞(HL-7702)用于评价两种聚合物材料的细胞毒性。取处于对数期的HepG-2、MCF-7、HL-7702细胞接种到96孔板上,每孔细胞数为4 ×104个。培养24 h后(37 ℃、5% CO2),分别加入含有浓度梯度:3、30、60、120、240、360、480、600µg/mL。载药胶束所含的最终阿霉素浓度:0.01、0.1、1、5、10、15、20μg/mL每个浓度均设3个复孔,同时设空白对照组。培养48 h(37℃、5% CO2)弃去上清液,然后进行MTT检测:每孔加MTT溶液(5mg/mL,PBS溶解)100 μL。继续孵育4 h后,终止培养。小心吸弃孔内培养上清液,每孔加100 μLDMSO,轻轻振荡5 min,使甲臜结晶物充分溶解。在酶联免疫监测仪上测定各孔570 nm处OD值,利用各吸收值及空白对照组吸光度平均值为基础,根据实验组吸光度平均值计算各浓度下细胞存活率,考察样品材料的细胞毒性大小。空白胶束对HepG-2、MCF-7、HL-7702细胞毒性。两种聚合物材料对HepG-2细胞、MCF-7细胞以及L-02三种细胞,如图10(A):48h 和图10(B):72h 。
由图10可知,48h的mPEG-HZ-STS最大浓度对细胞的致死率30%~40%效果略好于mPEG-STS,但是在72h 明显的展示了对细胞的杀伤作用,可能是由于形成胶束在细胞内要经过一段时间的降解,才能把疏水的活性基团茄呢基硫代水杨酸酯暴露出来,发挥抗肿瘤效果。而且72 h 的mPEG-HZ-STS的含有腙键的抗肿瘤效果要优于形成酯键mPEG-STS ,主要原因是腙键具有pH敏感性,靶向于肿瘤细胞能快速的断裂,释放出活性基团。
而载药胶束对两种细胞产生了不同程度的抑制,腙键的引入、腙键化学环境和胶束核的构建材料对抑制作用均有不同程度影响。载阿霉素胶束及阿霉素裸药对HepG-2细胞(图11(a):48h 、(b):72h)、MCF-7细胞(图11(c):48h 、(d:72h)和L-02细胞(图11(e):48h 、(f):72h)。由图11可知,48h的游离阿霉素的细胞毒性明显大于载药胶束,这可能是因为阿霉素是小分子物质,能快速通过被动扩散依次通过细胞进入细胞核,而做成载药胶束由于分子量较大所以只能通过细胞内吞作用进入细胞并释放DOX;其次是载药的mPEG-HZ-STS稍优于mPEG-STS与预期结果相似,在72h时三者在10、15、20ug/mL三者的对细胞的杀伤作用基本一致,说明药物在72h得到更好的释放,其次可能是由于材料在72h快速的断裂,释放出活性基团和DOX从而达到联合协同杀伤肿瘤细胞。
表4 空白材料及载药胶束的IC50
蛋白免疫印迹操作方法及步骤参考STS。
自噬或细胞自我消化是涉及蛋白质和细胞器的细胞通路退化,与人类疾病和生理学有着惊人的联系。例如,自噬功能障碍与癌症,神经变性,微生物感染有关和老化。自噬与许多蛋白的表达有着密切联系,例如LC3、Beclin1、P62、AMPK 、P53等。如图12所示,合成的两亲性聚合物mPEG-STS和mPEG-HZ-STS明显下调了Ras蛋白的表达。自噬和Ras之间的联系是复杂的。Ras可以调节癌细胞自噬水平,自噬可能影响Ras驱动肿瘤的进展。自噬受mTOR抑制Atg1和Atg13磷酸化的负调控。Ras是I类PI3K / Akt / mTOR1通路的正调控因子,是自噬的负调控因子。自噬也可以被Ras调控的raf1 /MEK1/2/ERK通路激活。图12显示出,与空白对照组相比,合成的两亲性聚合物材料mPEG-STS和mPEG-HZ-STS轻微增加了LC3-II蛋白水平,表明自噬体的形成。自噬体-溶酶体融合受损也会可能会导致LC3-II的累积增加,因此,本申请加入自噬抑制剂氯喹(CQ),结果显示与空白对照组相比,单独CQ处理组中LC3-II的表达水平增加,但是与添加自噬抑制剂CQ的载体材料相比,其LC3-II蛋白水平显著低于载体材料。P62蛋白水平在自噬抑制剂存在下也进一步升高。以上结果表明聚合物载体材料促进了自噬体的合成。

Claims (6)

1.一类茄呢基硫代水杨酸化合物,其特征在于,所述化合物的结构式如下:
2.根据权利要求1所述茄呢基硫代水杨酸化合物的制备方法,其特征在于,包括如下过程:
(1)将茄呢醇溶于石油醚中,加热使完全溶解后,冰水浴下加入适量吡啶,搅拌下滴加PBr3的石油醚溶液,TLC监测反应,反应结束后,经处理后得到化合物1,PBr3和茄呢醇的摩尔比为1:2.2~2.3;
(2)将化合物1溶于丙酮中,加入碳酸胍、硫代水杨酸室温进行搅拌反应,反应结束后,经后处理得到化合物2,化合物1、碳酸胍和硫代水杨酸的摩尔比为1:(1.1~1.2):1;
(3)分别称取化合物2、mPEG溶于二氯甲烷中,然后依次加入EDC、DMAP室温搅拌反应至完全 ,反应结束后,经后处理得到化合物3,其中,化合物2、mPEG、EDC、DMAP的摩尔比为:1:0.7:(3.2~3.3):(1.2~1.3);
(4 ) 称取mPEG5000于 CH2Cl2 中,然后分别加入对羧基苯甲醛、DCC、DMAP,超声使溶解完全,室温搅拌至反应完全,经后处理得化合物5,mPEG5000、对羧基苯甲醛、DCC和DMAP的摩尔比为1:(9.5~10):(9.5~10):(2.4~2.5);
(5)将化合物2加入甲醇中加热溶解,再加入水合肼, 80±5℃回流反应至完全,反应停止后,冷却至室温,减压旋干,即得化合物4,将化合物4用CH2Cl2溶解,再加入化合物5,80±5℃加热回流反应至完全,经后处理即得化合物6,化合物2与水合肼的摩尔比为1:0.1~0.15,化合物4和化合物5的摩尔比为1:1。
3.权利要求1所述化合物作为载药胶束的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所包载药物为阿霉素。
5.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1所述化合物在制备Ras抑制剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114177137A (zh) * 2021-11-18 2022-03-15 浙江大学杭州国际科创中心 一种基于免疫激活的胍基化纳米药物及其制备和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064448A2 (en) * 2005-11-28 2007-06-07 Ramot At Tel Aviv University, Ltd. Cancer treatment using fts and 2-deoxyglucose
CN101104609A (zh) * 2007-03-19 2008-01-16 河南大学 茄呢基多胺衍生物、制备及其应用
CN105017510A (zh) * 2015-07-07 2015-11-04 河南大学 一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用
WO2015167408A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Pehli̇van Sibel Nanoparticle formulation containing farnesylthiosalicylic acid (salirasib)
CN107090082A (zh) * 2017-04-10 2017-08-25 河南大学 一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用
CA3057579A1 (en) * 2016-03-25 2017-09-28 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthetically enveloped virus

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064448A2 (en) * 2005-11-28 2007-06-07 Ramot At Tel Aviv University, Ltd. Cancer treatment using fts and 2-deoxyglucose
CN101104609A (zh) * 2007-03-19 2008-01-16 河南大学 茄呢基多胺衍生物、制备及其应用
WO2015167408A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Pehli̇van Sibel Nanoparticle formulation containing farnesylthiosalicylic acid (salirasib)
CN105017510A (zh) * 2015-07-07 2015-11-04 河南大学 一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用
CA3057579A1 (en) * 2016-03-25 2017-09-28 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthetically enveloped virus
CN107090082A (zh) * 2017-04-10 2017-08-25 河南大学 一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELAD,G: "Targeting of K-Ras 4B by S-trans,trans-farnesyl thiosalicylic acid", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR CELL RESEARCH 》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114177137A (zh) * 2021-11-18 2022-03-15 浙江大学杭州国际科创中心 一种基于免疫激活的胍基化纳米药物及其制备和应用

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