CN114702608A - 一种酯酶响应聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酯酶响应聚合物及其应用。所述酯酶响应聚合物以壳聚糖亲水主链为骨架，在亲水主链的氨基上连接苄基修饰的熊脱氧胆酸作为疏水基团，形成壳聚糖接枝熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的两亲性聚合物。该聚合物可用于制备酯酶响应空白聚合物纳米载体或者酯酶响应聚合物纳米药物载体。该聚合物通过自组装形成聚合物纳米载体。该聚合物纳米载体可以装载各种类型的小分子和大分子药物成为酯酶响应聚合物纳米药物载体，尤其适合装载水溶性的多肽、蛋白、受体激动剂以及用于疫苗或基因治疗的核酸类药物。所述的酯酶响应聚合物纳米药物载体可以采用静脉注射和皮下局部注射等多种途径给药，具有广泛的临床适用性。

Description

一种酯酶响应聚合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医用聚合物材料及药剂学领域，具体涉及一种酯酶响应聚合物及其应用。
背景技术
近年来多肽蛋白及核酸类大分子药物被越来越多的应用于临床，尤其是在治疗糖尿病、慢性肝病、遗传疾病以及对抗新冠病毒方面发挥着至关重要的作用。但是多肽蛋白及核酸类大分子药物在生物体内极不稳定，易被生物酶破坏，因此在临床应用中被严重限制，尤其是像mRNA这样的核酸类药物，在运输保存中都存在稳定性问题。例如辉瑞的新冠疫苗即便在特制的-70℃冰箱中的保存期也只有6个月。
近年来，纳米药物载体广泛应用于各种疾病的治疗和诊断。已报道的纳米药物载体主要包括聚合物、脂质体和无机材料，可通过包载、吸附、键合等多种方式负载药物，构成药物控制系统。纳米药物载体具有提高药物溶解性、控制药物释放、促进口服吸收、延长体内循环时间、被动靶向细胞、降低药物毒性和提高治疗效果等作用。其中聚合物纳米载体由于其良好的化学稳定性，可调控的化学结构以及能同时包载亲水药物和疏水药物等优点，正在药物递送中发挥越来越重要的作用，聚合物自组装形成的胶束、纳米粒和囊泡载体的研究得到了越来越多的关注。使用聚合物囊泡作为载体一定程度上能够解决多肽、蛋白及核酸类大分子药物的体内外稳定性难题。聚合物囊泡与脂质体相比具有类似的结构却有更好的稳定性和结构调整性，脂质体的膜厚度限制为3-5nm，而聚合物囊泡的膜厚度可达50nm。因此，与脂质体和胶束等载体相比，聚合物囊泡对药物的装载能力更强，其亲水性内腔也可以更好地保护多肽蛋白及核酸类大分子药物。此外，聚合物囊泡的亲水性外壳能有效避免网状内皮系统的吞噬，借助增强渗透与滞留效应使药物被动富集于病变部位，且其亲水性外壳与细胞之间有良好相容性和渗透性，使其不容易像脂质体一样被氧化和水解，能够使药物更好地被细胞摄取，从而提高药物疗效，降低毒性。
但是聚合物纳米载体的高稳定性也对其在体内的药物受控释放构成了挑战，为了解决这个问题，引入适当的环境响应功能可以更好实现对药物递送的精准调控。壳聚糖是一种天然碱性多糖，其糖环上的游离伯氨和羟基便于化学修饰，可人工赋予其多种特性。不仅如此，壳聚糖分子链带正电，其自组装形成的纳米载体可以通过静电作用复合多肽蛋白及核酸类药物。因此，壳聚糖受到了材料领域的广泛关注，以壳聚糖为主体设计合成的具有环境响应性能的聚合物在药物递送领域有巨大的应用前景。但是壳聚糖形成的聚合物囊泡结构却鲜有报道，主要是由于多糖材料本身含有羟基，容易形成内氢键而在溶剂中无法自由伸展，这在材料合成和制剂制备工艺上构成了技术挑战。
现有的羟乙基或羧甲基壳聚糖修饰5β胆甾烷酸、胆固醇、亚麻酸等疏水化合物的聚合物材料通常只能形成胶束或纳米粒结构，核酸类药物容易负载在载体表面而导致失活。中国专利CN107638388A公开了一种积雪草酸壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束及制备方法；该专利所涉及的壳聚糖去氧胆酸嫁接物聚合物只能形成胶束结构，所形成的胶束负载口服生物利用度极低的积雪草酸得到积雪草酸壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束口服制剂，可提高积雪草酸的口服生物利用度；积雪草酸壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束粒径小于100nm，载药量在3.9％-11.7％，并且包封率在60.2％-82.1％，大部分情况下小于83％。中国专利申请CN111184701A公开了一种靶向的pH/酯酶双重响应的双药超分子纳米组装体及其制备方法，其使用单-6-脱氧-6-乙二胺-β-环糊精修饰的透明质酸聚合物和酯基键合的姜黄素-顺铂为原料，利用β-环糊精和姜黄素之间的主客体包合作用形成超分子聚合物；以超分子聚合物为原料，利用所述超分子聚合物的两亲性自组装形成亲水性透明质酸为壳层、疏水性姜黄素-顺铂为内核的超分子纳米组装体，但其只能装载疏水药物，无法递送多肽、蛋白及核酸及其他水溶性大分子药物。
发明内容
本发明提供了一种酯酶响应聚合物，以壳聚糖亲水主链为骨架，在亲水主链的氨基上连接苄基修饰的熊脱氧胆酸作为疏水基团，形成壳聚糖接枝熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的两亲性聚合物。
所述聚合物能构建酯酶响应的聚合物纳米载体，利用酯酶响应的聚合物纳米载体可以装载各种小分子及大分子药物得到酯酶响应的载药聚合物纳米载体，该载药聚合物纳米载体稳定性好，可将药物稳定递送到靶点位置后响应酯酶浓度的变化而释放药物。所形成的酯酶响应聚合物纳米囊泡包载多肽蛋白、核酸类大分子药物等后，由于囊泡的包裹可避免负载药物的纳米药物囊泡在体内递送药物时体内酶与药物的直接接触，保护药物的生物活性。
本发明通过熊脱氧胆酸苄基衍生物基团上足够长的碳链将羟基分隔以破坏形成内氢键的空间条件，通过简单调节聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的比例即接枝率能得到多糖囊泡或者多糖胶束，适应不同药物的装载需求、不同剂型的制剂需求等，应用范围广。
一种酯酶响应聚合物，为在壳聚糖的氨基上接枝有式Ⅰ所示基团的聚合物，所述式Ⅰ所示基团如下：
Figure BDA0003554880460000031
所述酯酶响应聚合物在壳聚糖主链上接枝了熊脱氧胆酸苄基衍生物基团(即式Ⅰ所示基团)，这一化学基团的修饰不仅使得聚合物能够自组装成为包括聚合物胶束或聚合物囊泡等多种聚合物纳米载体，而且还起到酯酶响应开关的作用，赋予聚合物及其制备的空白聚合物纳米载体、载药聚合物纳米载体以酯酶响应性能。此外，熊脱氧胆酸本身也是具有生理活性的药物，具有调节胆汁酸循环、调控免疫反应、改变细胞信号、改善肝脏脂质代谢和调控脂肪变性等作用。因此，当该聚合物纳米载体在细胞内高酯酶浓度部位水解释放出的熊脱氧胆酸分子可以与聚合物纳米载体装载的艾塞那肽等药物发挥协同作用，提高治疗效果。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述式Ⅰ所示基团的接枝率在0.1％-20％，利于酯酶响应聚合物自组装成纳米载体。本发明酯酶响应聚合物为两亲性接枝聚合物，其自组装体的形态在很大程度上取决于聚合物的化学组成，调节聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的比例即接枝率能得到多糖囊泡或者多糖胶束，一般当接枝率控制在1％-4％形成囊泡结构，当接枝率在大于等于0.1％至小于1％、或者大于4％至小于等于20％时形成胶束结构。目前囊泡结构的载体研究集中在两亲性嵌段聚合物，一般亲水链段含量较高的两亲性嵌段聚合物倾向于自组装成胶束，随疏水链段含量的逐渐增加，会产生囊泡结构。
本发明接枝率按下式计算：
接枝率(％)＝(1-接枝反应完成后壳聚糖的氨基浓度/接枝反应前壳聚糖的氨基浓度)×100％。
可选地，所述壳聚糖的脱乙酰度在75％及以上，可保证壳聚糖溶于水。
在所述接枝率范围，所述酯酶响应聚合物的分子量对其自组装体的形成影响不大，考虑自组装体的稳定性、可调控性等，可选地，所述酯酶响应聚合物的数均分子量为500Da-50000Da，进一步优选2500Da-45000Da。分子量过小则失去聚合物的特点组装体稳定性差，分子量过高则粘度过大分子构象调整困难，不利于自组装调控。
所述酯酶响应聚合物的结构式可如式Ⅱ所示：
Figure BDA0003554880460000051
式Ⅱ中，主链为壳聚糖结构，在壳聚糖主链的氨基上接枝有熊脱氧胆酸苄基衍生物基团；m、n、x表示聚合度即各个重复单元的数量，其取值可根据壳聚糖的分子量、脱乙酰度和式Ⅰ所示基团的接枝率确定。
所述酯酶响应聚合物的制备方法，包括如下步骤：
1)合成熊脱氧胆酸苄基衍生物(UB)：将碳酸氢钾加入溶有熊脱氧胆酸的第一有机溶剂溶液中，在惰性气体保护下混合均匀，缓慢加入2-(4-溴甲基苯基)丙酸，混合物于20℃-35℃搅拌反应至少48h；然后将反应混合物在搅拌下缓慢加入水中，过滤、洗涤并收集白色固体，冻干残留的水分后得到白色粉末UB；
2)合成壳聚糖接枝熊脱氧胆酸两亲性聚合物：将壳聚糖溶于水，得到壳聚糖溶液；将UB和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于第二有机溶剂，得到UB溶液；将壳聚糖溶液、UB溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向澄清溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，在45℃-65℃搅拌反应至少12h，所得溶液去除有机溶剂和残留杂质，冻干得到酯酶响应聚合物(UBC)。
步骤1)中，可选地，所述碳酸氢钾作为脱酸剂，其用量没有严格的要求，一般与熊脱氧胆酸按摩尔比1:1使用或者相对于熊脱氧胆酸过量。
由于熊脱氧胆酸与2-(4-溴甲基苯基)丙酸反应时是由熊脱氧胆酸上的羧基与2-(4-溴甲基苯基)丙酸上的溴甲基发生取代反应形成酯键，所述熊脱氧胆酸与2-(4-溴甲基苯基)丙酸的用量对反应产物UB的合成影响不大，因此对用量没有严格的要求，一般2-(4-溴甲基苯基)丙酸与熊脱氧胆酸按摩尔比1:1使用或者2-(4-溴甲基苯基)丙酸相对于熊脱氧胆酸过量(例如按摩尔比1.2-1.3:1)。
所述反应时间保持48h以上，可保证反应完成。
可选地，所述惰性气体可选用氮气、氩气等常用惰性气体中的一种。
可选地，所述第一有机溶剂可选用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中的一种。
步骤2)中，所述NHS用于与UB上的羧基反应生成活性酯，活性酯再与壳聚糖上伯氨基反应生成酰胺键实现熊脱氧胆酸苄基衍生物基团在伯氨基上的接枝，其用量没有严格的要求，一般NHS与UB按摩尔比1:1使用或者NHS相对于UB大大过量(例如NHS与UB按摩尔比1.5-15:1使用)。
所述EDC·HCl作为反应的催化剂，其用量没有严格的要求，一般与NHS按摩尔比1:1使用。
可选地，所述壳聚糖与UB的用量对反应产物UBC的合成影响不大，可根据聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率选择合适的投入量。
可选地，所述UB和NHS溶于第二有机溶剂后在搅拌下孵育至少2h，得到UB溶液。让UB上的羧基与NHS充分接触形成活性酯，更利于后续反应的进行。
可选地，所述第二有机溶剂可选用DMF、DMSO等有机溶剂中的一种。
所得溶液去除有机溶剂和残留杂质的方法可采用透析法、超滤法或中性硅胶层析柱法等现有方法。
所述酯酶响应聚合物可用于制备用于负载药物的纳米载体。例如：所述酯酶响应聚合物自组装形成酯酶响应空白聚合物纳米载体。所述自组装在水环境中进行。
所述酯酶响应空白聚合物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
将酯酶响应聚合物于第三有机溶剂中溶解，得到聚合物溶液；在搅拌下，向聚合物溶液中缓慢加入水，加完后除去有机溶剂，溶液经过滤和冻干得到酯酶响应空白聚合物纳米载体。
所述酯酶响应空白聚合物纳米载体的形态结构类型包括聚合物胶束或者聚合物囊泡。
所述酯酶响应空白聚合物纳米载体的平均粒径在100nm-600nm，多分散指数(PDI)小于0.3。
所述酯酶响应聚合物可用于制备纳米药物载体。例如：所述酯酶响应聚合物自组装并装载药物形成酯酶响应聚合物纳米药物载体。所述自组装在水环境中进行。
所述酯酶响应聚合物纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将药物用溶剂溶解，得到药物溶液；将酯酶响应聚合物于第三有机溶剂中溶解，得到聚合物溶液；所述溶剂可选用水、第四有机溶剂中的一种或多种。当药物为疏水性药物可选择适用的第四有机溶剂中的一种或多种溶解，当药物为亲水性药物可选择用水溶解或者采用适用的第四有机溶剂和水溶解；所述第四有机溶剂可根据药物的种类选择适用于该药物的常规的用于溶解该药物的有机溶剂中的一种或多种；
b)在搅拌下，向聚合物溶液中缓慢加入药物溶液，加完后继续缓慢加入水，除去有机溶剂和游离药物，溶液经过滤和冻干得到酯酶响应聚合物纳米药物载体。
所述酯酶响应聚合物纳米药物载体的形态结构类型包括载药聚合物胶束或者载药聚合物囊泡。
所述酯酶响应聚合物纳米药物载体的平均粒径在100nm-600nm，多分散指数(PDI)小于0.3。
所述药物可选用各种类型的小分子药物、大分子药物中的一种或两种以上；包括但不限于多肽、蛋白、受体激动剂、核酸类药物等中的一种或两种以上。优选地，所述药物选用水溶性的多肽、水溶性的蛋白、水溶性的受体激动剂、水溶性的核酸类药物等中的一种或两种以上。例如，所述核酸类药物可选用用于疫苗或基因治疗的核酸类药物。所述药物可选用胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽、重组人生长激素、法尼醇受体激动剂、miR-34a拮抗剂、DNA药物(例如白介素12质粒)、信使RNA(mRNA)药物、小干扰RNA(siRNA)药物、微小RNA(miRNA)药物等中的一种或两种以上。本发明囊泡结构最适合核酸类药物装载，但其它接枝率条件下的胶束也可以装载核酸类药物。
可选地，所述酯酶响应聚合物纳米药物载体中药物与构成纳米载体的酯酶响应聚合物的重量比为1:1.2-500，进一步优选1:3-500。
所述第三有机溶剂可选用DMF、DMSO等有机溶剂中的一种。
所述酯酶响应聚合物纳米药物载体可作为用于药物递送的酯酶响应聚合物纳米药物载体。例如，所述酯酶响应聚合物纳米药物载体中装载艾塞那肽和/或miR-34a拮抗剂药物时可作为或用于制备肝靶向治疗非酒精性脂肪肝病的制剂。
所述除去有机溶剂和游离药物的方法可采用透析法或葡聚糖凝胶柱法与超滤法相结合的方法等现有方法。
所述酯酶响应聚合物纳米药物载体可以采用静脉注射或皮下局部注射等多种途径给药，具有广泛的临床适用性。
本发明具有如下优点：
本发明利用疏水性的熊脱氧胆酸苄基衍生物基团修饰壳聚糖，由于这一化学基团含有苯环，苯环的π-π相互作用有利于自组装过程的自发进行，通过调节熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝比率即接枝率，可以调控酯酶响应聚合物能在水溶液中自组装成为包括聚合物胶束和囊泡在内的多种聚合物纳米载体，从而适应各种不同的药物递送应用场景。同时壳聚糖和熊脱氧胆酸苄基衍生物修饰基团都具有良好的生物相容性和可生物降解/代谢性能，这赋予酯酶响应聚合物及其载药纳米载体良好的安全性。
本发明熊脱氧胆酸苄基衍生物修饰基团中含有的酯键，该酯键易被生物细胞内丰富的酯酶水解从而起到酯酶开关的作用，因此本发明提供的酯酶响应聚合物纳米药物载体能响应不同酯酶浓度环境，在酯酶浓度较高的靶点处释放药物。
本发明酯酶响应聚合物在被酯酶降解后脱落的熊脱氧胆酸分子可以改善肝脏脂质代谢从而与部分药物形成协同效应，增强治疗效果。
本发明酯酶响应聚合物形成的纳米载体带正电荷，粒径范围广，适用于多种药物的装载，尤其适合装载水溶性的多肽、蛋白以及用于疫苗或基因治疗的核酸类药物等，且对多肽、蛋白、受体激动剂、核酸类药物的装载量可调，装载量可达40％，包封率维持在82％以上。
附图说明
图1为本申请实施例一、实施例二、实施例三和实施例五所制备的酯酶响应聚合物的典型核磁共振谱图；
图2a为实施例一中酯酶响应空白聚合物囊泡的电镜照片；图2b为实施例二中酯酶响应空白聚合物囊泡的电镜照片；图2c为实施例三中酯酶响应空白聚合物胶束的电镜照片；图2d为实施例五中酯酶响应空白聚合物胶束的电镜照片；
图3a为实施例一酯酶响应空白聚合物囊泡中含有的熊脱氧胆酸在不同释放介质中的体外水解释放曲线；图3b为装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡中装载的艾塞那肽在不同释放介质中的释放曲线；其中，横坐标Time(h)是时间(小时)，纵坐标Accumulative Release Ratio是累积释放百分数(％)，esterase是酯酶；
图4a为实施例七中酯酶响应聚合物UBC01的细胞毒性评价MTT结果图；图4b为实施例七中酯酶响应聚合物UBC02的细胞毒性评价MTT结果图；图4c为实施例七中酯酶响应聚合物UBC03的细胞毒性评价MTT结果图；图4d为实施例七中酯酶响应聚合物UBC04的细胞毒性评价MTT结果图；其中，横坐标Concentration of UBC/UBC concentration是UBC的浓度，纵坐标Cell viability是细胞存活率；
图5为实施例八、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠体重变化曲线图；其中，横坐标Days是天数，纵坐标Body weight是体重；
图6为实施例八、实施例九、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠肝脏样品图片；
图7为实施例八、实施例九、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠肝组织切片油红染色图。
具体实施方式
以下结合附图与所示具体实施例对本发明作进一步的说明，以使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，但不作为对本发明范围的限制。
实施例一
1)酯酶响应聚合物的合成
将碳酸氢钾(2.5g，25mmol)加入溶有熊脱氧胆酸(8g，20.4mmol)的DMF(60mL)溶液中，在氮气保护下搅拌20min混合均匀后，缓慢加入2-(4-溴甲基苯基)丙酸(6.12g，25.2mmol)，混合物于室温搅拌48h。然后将反应混合物在搅拌下缓慢加入水中，过滤、洗涤并收集白色固体，冻干残留的水分后得到白色粉末即为熊脱氧胆酸苄基衍生物(UB)。
将壳聚糖(脱乙酰度91％，数均分子量1620，0.81g，0.5mmol，)溶于20mL水，得到壳聚糖溶液；同时将UB(0.28g，0.5mmol)和NHS(0.86g，7.5mmol)溶于30mLDMF溶液在搅拌下孵育2h后，得到UB溶液；将壳聚糖溶液、UB溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向溶液中加入EDC·HCl(1.44g，7.5mmol)，于60℃搅拌12h，反应后所得溶液分别经过DMF透析、去离子水透析，冻干得到终产物：酯酶响应聚合物(UBC01)，其中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率为2.1％，UBC01数均分子量为3000Da。
2)酯酶响应聚合物空白纳米载体(聚合物囊泡形态)的制备
在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC01，溶解，再逐滴加入0.8mL水，然后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得酯酶响应空白聚合物囊泡，继续冻干可以得到粉末。
3)装载艾塞那肽的酯酶响应聚合物纳米药物载体(囊泡)的制备
精密称取3.0mg艾塞那肽，用0.8mL去离子水溶解得到艾塞那肽水溶液；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC01，溶解，逐滴加入艾塞那肽水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得装载艾塞那肽的酯酶响应纳米载药聚合物囊泡，继续冻干可以得到粉末。本发明酯酶响应聚合物纳米药物载体通过调节艾塞那肽的加入量，可以获得载药量为1％-40％范围的一系列载药聚合物囊泡。
实施例二
与实施例一相比本实施例中壳聚糖和UB的投料比进行了调整，制备的聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率有所提高，适合核酸类药物的装载应用。制备方法包括如下步骤：
1)酯酶响应聚合物的合成
将壳聚糖(脱乙酰度85％，数均分子量1300，0.26g，0.2mmol)溶于20mL水，得到壳聚糖溶液；同时将UB(166.4mg，0.3mmol)和NHS(241.7mg，2.1mmol)溶于30mLDMF溶液在搅拌下孵育2h后，得到UB溶液；将壳聚糖溶液、UB溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向溶液中加入EDC·HCl(402.57mg，2.1mmol)，于60℃搅拌12h，反应后所得溶液分别经过DMF透析、去离子水透析，冻干得到终产物：酯酶响应聚合物(UBC02)，其中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率为4.0％，UBC02数均分子量为2500Da。
2)酯酶响应聚合物空白纳米载体(聚合物囊泡形态)的制备
在磁力搅拌下，向0.2mLDMSO溶液中加入10mgUBC02，溶解，再逐滴加入0.8mL水，然后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得酯酶响应空白聚合物囊泡，继续冻干可以得到粉末。
2)装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应载药聚合物囊泡的制备
精密量取0.8mLmiR-34a拮抗剂水溶液(含miR-34a拮抗剂0.23mg)；在磁力搅拌下，向0.2mLDMSO溶液中加入10mgUBC02，溶解，逐滴加入miR-34a拮抗剂水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应载药聚合物囊泡，继续冻干可以得到粉末。
实施例三
与实施例一相比本实施例中壳聚糖和UB的投料比进行了调整，制备的聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率有所降低，从而可以制备胶束形态的酯酶响应聚合物纳米药物载体。制备方法包括如下步骤：
1)酯酶响应聚合物的合成
将壳聚糖(脱乙酰度91％，数均分子量12KDa，0.81g，0.068mmol)溶于20mL水，得到壳聚糖溶液；同时将UB(0.14g，0.25mmol)和NHS(0.43g，3.7mmol)溶于30mLDMF溶液在搅拌下孵育2h后，得到UB溶液；将壳聚糖溶液、UB溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向溶液中加入EDC·HCl(0.72g，3.7mmol)，于60℃搅拌12h，反应后所得溶液分别经过DMF透析、去离子水透析，冻干得到终产物：酯酶响应聚合物(UBC03)，其中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率为0.75％，UBC03数均分子量为15000Da。
2)酯酶响应聚合物空白纳米载体(聚合物胶束形态)的制备
在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC03，溶解，再逐滴加入0.8mL水，然后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得酯酶响应空白聚合物胶束，继续冻干可以得到粉末。
3)装载胰岛素的酯酶响应载药聚合物胶束的制备
精密称取1.0mg胰岛素，用0.8mL去离子溶解得到胰岛素水溶液；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC03，溶解，逐滴加入胰岛素水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得装载胰岛素的酯酶响应载药聚合物胶束，继续冻干可以得到粉末。
实施例四
与实施例三相比本实施例中采用实施例三制备的酯酶响应聚合物UBC03，装载重组人生长激素。制备方法包括如下步骤：
装载重组人生长激素的酯酶响应载药聚合物胶束的制备
精密称取1.5mg重组人生长激素，用0.8mL去离子溶解得到重组人生长激素水溶液；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC03，溶解，逐滴加入重组人生长激素水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得装载重组人生长激素的酯酶响应载药聚合物胶束，继续冻干可以得到粉末。
实施例五
与实施例一相比本实施例中壳聚糖和UB的投料比进行了调整，制备的聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率有所提高，从而可以制备胶束形态的酯酶响应聚合物纳米药物载体。制备方法包括如下步骤：
1)酯酶响应聚合物的合成
将壳聚糖(脱乙酰度75％，数均分子量40KDa，0.81g，0.02mmol)溶于20mL水，得到壳聚糖溶液；同时将UB(1.68g，3.0mmol)和NHS(3.44g，30.0mmol)溶于30mLDMF溶液在搅拌下孵育2h后，得到UB溶液；将壳聚糖溶液、UB溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向溶液中加入EDC·HCl(5.76g，30.0mmol)，于60℃搅拌12h，反应后所得溶液分别经过DMF透析、去离子水透析，冻干得到终产物：酯酶响应聚合物(UBC04)，其中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率为16.5％，UBC04数均分子量为45000Da。
2)酯酶响应聚合物空白纳米载体(聚合物胶束形态)的制备
在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC04，溶解，再逐滴加入0.8mL水，然后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得酯酶响应空白聚合物胶束，继续冻干可以得到粉末。
3)装载白介素12质粒的酯酶响应载药聚合物胶束的制备
精密量取白介素12质粒水溶液(0.8mL，含白介素12质粒0.22mg)；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mgUBC04，溶解，逐滴加入白介素12质粒溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得装载白介素12质粒的酯酶响应载药聚合物胶束，继续冻干可以得到粉末。
表1汇总了实施例一至实施例五所制备的酯酶响应聚合物纳米药物载体的基本参数。可以看到本发明酯酶响应聚合物纳米药物载体能有效装载多肽、蛋白、miRNA等药物，特别是酯酶响应聚合物囊泡的载药性能更加优秀，可实现对大分子药物的高载药量且包封率在80％以上。
表1
Figure BDA0003554880460000141
图1为本发明酯酶响应聚合物的典型核磁共振谱图(1H-NMR)以及各峰的归属，δ＝3.5-4.0ppm处为壳聚糖主链上的亚甲基质子峰，δ＝7.9-8.2ppm处的酰胺键的质子峰，δ＝7.2ppm处的苯环质子峰，δ＝5.0-5.2ppm处苯环与酯键之间亚甲基的质子峰，以及δ＝0.8-2.2ppm处出现的一系列亚甲基质子峰证明了熊脱氧胆酸苄基衍生物基团成功接枝到壳聚糖主链的氨基上，壳聚糖接枝熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的两亲性聚合物成功合成。
图2是实施例一、实施例二、实施例三及实施例五所制备的酯酶响应聚合物空白纳米载体的电镜照片。可见，通过调节酯酶响应聚合物中熊脱氧胆酸苄基衍生物基团的接枝率，可以调控聚合物自组装分别形成聚合物囊泡和聚合物胶束。
实施例六
酯酶响应聚合物纳米药物载体的酯酶响应型药物释放行为体外评价。
1)空白聚合物囊泡的酯酶响应型熊脱氧胆酸水解释放体外评价。
称取适量实施例一制备的酯酶响应空白聚合物囊泡溶于1mLpH＝7.4磷酸缓冲液(PBS)置于透析袋(MWCO＝8000Da-14000Da)，然后将透析液分别置于10mL pH＝7.4酯酶(脂肪酶即甘油酯水解酶)浓度为1304ng/mL、pH＝7.4酯酶浓度为30ng/mL、pH＝5.5酯酶浓度为1304ng/mL和pH＝5.5酯酶浓度为30ng/mL的释放介质中进行熊脱氧胆酸释放实验。释放体系置于37℃恒温箱中，然后以120rpm/min的速度震荡，分别于10、30、60、120、240、480、720、960、1440min后取出1mL释放样品待测，补加1mL释放介质继续震荡。最后，按照《中国药典》中熊脱氧胆酸的定量测定方法进行测定，即向各时间点取出的释放样品的不溶物中加入混合溶液(中性乙醇：水＝1:2，体积比)进行溶解，加入酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定，接近终点时，加新沸并放冷的水继续滴定至终点，每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于39.26mg的熊脱氧胆酸。通过该方法计算酶解后不溶物中熊脱氧胆酸的含量，以时间(h)为横坐标，累积释放UDCA的百分数(％)为纵坐标，得到4种不同释放环境下熊脱氧胆酸的释放曲线，见图3a。图3a显示：空白聚合物囊泡中聚合物上接枝的熊脱氧胆酸在pH＝7.4酯酶浓度为1304ng/mL的释放介质中的释放速率较其它三种释放介质快，累计释放量最大；在pH＝5.5酯酶浓度为1304ng/mL释放介质中的释放速率和累计释放量略低于pH＝7.4酯酶浓度为1304ng/mL的释放介质但明显高于酯酶浓度为30ng/mL的两种释放介质；在酯酶浓度为30ng/mL的两种释放介质中的释放速率和累计释放量基本相当；可见熊脱氧胆酸从本申请酯酶响应聚合物链上被水解释放出来的速率具有显著的酯酶响应特征，在高酯酶浓度下熊脱氧胆酸释放速率显著加快。图3a中**表示1304ng/mL组与30ng/mL组对比P＜0.01具有显著差异。
2)装载艾塞那肽的酯酶响应聚合物纳米药物载体的药物释放行为体外评价
将实施例一制备的装载艾塞那肽的酯酶响应聚合物纳米药物载体(囊泡)溶于1mLpH＝7.4磷酸缓冲液(PBS)并加入透析袋(MWCO＝5000Da)中，将透析液分别置于含有10mLpH＝7.4酯酶(脂肪酶即甘油酯水解酶)为1304ng/mL、pH＝7.4酯酶浓度为30ng/mL、pH＝5.5酯酶浓度为1304ng/mL和pH＝5.5酯酶浓度为30ng/mL释放介质的离心管中，进行艾塞那肽的释放实验。释放体系置于37℃恒温箱中，然后以120rpm/min的速度震荡，分别于10、30、60、120、240、480、720、960、1440min后取出1mL释放样品并补充1mL释放介质继续震荡。根据Micro-BCA试剂盒的检测方法，检测562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算不同时间下取样液(即释放样品)的药物含量，计算得到药物释放量，并绘制释放曲线，见图3b。图3b显示：装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡在酯酶浓度为1304ng/mL的两种释放介质中的释放速率和累计释放量相当，在酯酶浓度为30ng/mL的两种释放介质中的释放速率和累计释放量相当，在酯酶浓度为1304ng/mL的两种释放介质中的释放速率和累计释放量较在酯酶浓度为30ng/mL的两种释放介质中的释放速率和累计释放量明显增大；可见本发明酯酶响应聚合物纳米药物载体具有显著的酯酶响应特征，在高酯酶浓度下药物释放速率显著加快。图3b中**表示1304ng/mL组与30ng/mL组对比P＜0.01具有显著差异。
装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡中熊脱氧胆酸的释放曲线与空白聚合物囊泡中熊脱氧胆酸的释放曲线基本相同。
实施例七
酯酶响应聚合物细胞毒性评价
采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法评估本发明UBC材料在HepG2细胞上的毒性。将处于对数生长期的HepG2细胞按照每孔2.0×103个细胞的均匀密度种植于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，培养基为RPMI-1640培养液，边缘孔用无菌水填充，将板置于孵化箱中孵育24小时，孵育条件为：37℃，5％(体积百分比)CO2。按照一定的浓度梯度向每孔加入25μL不同UBC浓度的UBC-PBS溶液，空白培养液作为对照组，每个浓度设置6个平行孔，继续孵育24小时。孵育24h后向每孔加入31.5μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵育4小时。孵育结束后移除上清液，每孔各添加200μL二甲亚砜，置振荡器上匀速震荡5分钟使蓝色结晶物充分溶解，通过酶标仪测量各孔溶液在570nm处的吸光值(A)。以UBC浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘图，得到图4a、图4b、图4c和图4d。本发明酯酶响应聚合物UBC01的浓度达到200μg/mL时，HepG2细胞的存活率仍然高于90％；本发明酯酶响应聚合物UBC02的浓度达到200μg/mL时，HepG2细胞的存活率仍然高于78％；本发明酯酶响应聚合物UBC03和UBC04的浓度达到200μg/mL时，HepG2细胞的存活率仍然高于84％；表明本发明酯酶响应聚合物材料具有良好的生物相容性。
实施例八
装载艾塞那肽的酯酶响应聚合物纳米药物载体治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
八至十周大的C57BL/6雄性小鼠，在标准环境中保持12小时黑暗/12小时光明周期，适应性饲喂一周后取12只喂食普通小鼠维持期饲料(TP23302，中国南通Trophic)作为正常饮食组对照，其余喂食含60％(质量百分比)脂肪的高脂饮食(HFD)并持续8周。8周后根据小鼠体重及肝指数指标，剔除体重及指标不达标小鼠，选取高脂饮食小鼠12只，给予静脉注射实施例一中装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡注射用水溶液，以40μg艾塞那肽/kg体重/次剂量浓度每两天给药一次，持续4周。
实施例九
装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应聚合物纳米药物载体治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
选取实施例八中高脂饮食小鼠12只，给予静脉注射实施例二中装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应载药聚合物囊泡注射用水溶液，以0.5mg miR-34a拮抗剂/kg体重/次剂量浓度每周给药两次，持续4周。
实施例十
酯酶响应空白聚合物纳米载体(囊泡)治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
选取实施例八中高脂饮食小鼠12只，给予静脉注射实施例一中酯酶响应空白聚合物囊泡注射用水溶液，每只以0.1mg/mL空白聚合物囊泡浓度每两天给药0.1mL，持续4周。
对比例一
生理盐水治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
选取实施例八中高脂饮食小鼠12只，每只给予静脉注射0.1mL生理盐水每两天给药一次，持续4周。
对比例二
皮下注射游离艾塞那肽治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
选取实施例八中高脂饮食小鼠12只，给予皮下注射游离艾塞那肽注射用水溶液，以40μg艾塞那肽/kg体重/次剂量浓度每两天给药一次，持续4周。
对比例三
静脉注射游离艾塞那肽治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价
选取实施例八中高脂饮食小鼠12只，给予静脉注射游离艾塞那肽注射用水溶液，以40μg艾塞那肽/kg体重/次剂量浓度每两天给药一次，持续4周。
对比例四
壳聚糖接枝去氧胆酸(非苄基衍生物)嫁接物的合成
称取0.3g去氧胆酸和0.45g碳二亚胺溶于20mL有机溶剂(乙醇：丙酮＝3:7，体积比)，磁力搅拌下60℃活化1h，得到有机溶液。将数均分子量为1620Da(脱乙酰度91％)的壳聚糖1.68g，加100mL去离子水搅拌溶解得到壳聚糖水溶液，将上述有机溶液加入到壳聚糖水溶液中，60℃搅拌反应8h。反应液置于透析袋中，去离子水透析24h，透析液冷冻干燥，得壳聚糖去氧胆酸嫁接物(CS-DCA-01)，去氧胆酸的接枝率是2.2％，数均分子量2900Da；Zeta电位为(47.4±1.0)mV。
在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mg CS-DCA-01，溶解，再逐滴加入0.8mL水，然后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤。所得聚合物空白纳米载体不能形成囊泡，而呈胶束形态，平均粒径小于100nm。可见对熊脱氧胆酸进行苄基化之后再接枝到壳聚糖主链上对于形成聚合物囊泡具有关键作用。
对比例五
壳聚糖去氧胆酸(非苄基衍生物)嫁接物的合成
称取0.9g去氧胆酸和1.325g碳二亚胺溶于50mL有机溶剂(乙醇：丙酮＝3:7，体积比)，磁力搅拌下60℃活化1h，得到有机溶液。将分子量为50KDa(脱乙酰度79.3％)壳聚糖1.68g，加100mL去离子水搅拌溶解得到壳聚糖水溶液，将上述有机溶液加入到壳聚糖水溶液中，60℃搅拌反应8h。反应液置透析袋中，去离子水透析24h，透析液冷冻干燥，得壳聚糖去氧胆酸嫁接物(CS-DCA)。线性电位滴定法测得合成的CS-DCA接枝率是(6.83±0.10)％；CS-DCA在水中能形成自组装胶束，通过芘荧光法测定其临界胶束浓度为0.074mg/mL，粒径为(34.2±4.3)nm，Zeta电位为(43.7±1.0)mV。
精密称取3.0mg艾塞那肽，用0.8mL去离子溶解得到艾塞那肽水溶液；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mg壳聚糖去氧胆酸嫁接物，溶解，逐滴加入艾塞那肽水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得艾塞那肽壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束，继续冻干可以得到粉末。经测定所得载药胶束包封率为41％，载药量为4.8％，粒径95nm，Zata电位35.1mV。评价载药体系需结合包封率与载药量，包封率低于80％则不具有实用价值，包封率还反映了载药体系的稳定性，包封率差则稳定性也差。虽然该载药胶束中多肽大分子药物的载药量可维持在4.8％，由于其依赖静电吸附载药，包封率为41％远低于具有实际应用价值制剂包封率大于或等于80％的要求，表明该载药胶束体系的稳定性差，不具有实际应用价值。可见，壳聚糖去氧胆酸(非苄基衍生物)嫁接物不适合负载多肽、蛋白、核酸大分子药物。
对比例六
精密称取1.0mg胰岛素，用0.8mL去离子溶解得到胰岛素水溶液；在磁力搅拌下，向0.2mLDMF溶液中加入10mg对比例四中的壳聚糖去氧胆酸嫁接物，溶解，逐滴加入胰岛素水溶液，再逐滴加入0.8mL去离子水后将其转入透析袋(MWCO＝1000Da)并置于去离子水中透析24h，透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后冻干即得胰岛素壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束，继续冻干可以得到粉末。经测定所得载药胶束包封率为69％，载药量为3.9％，粒径65nm，Zata电位37.6mV。虽然该载药胶束中蛋白质大分子药物的载药量可维持在3.9％，由于其依赖静电吸附载药，包封率为69％远低于具有实际应用价值制剂包封率大于或等于80％的要求，表明该载药胶束体系的稳定性差，不具有实际应用价值。可见，壳聚糖去氧胆酸(非苄基衍生物)嫁接物不适合负载多肽、蛋白、核酸大分子药物。
上述实施例八、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠体重变化曲线见图5。图5显示：注射生理盐水的高脂饮食对比例一实验组小鼠的体重明显高于正常饮食对照组；实验组中实施例十酯酶响应空白聚合物纳米载体(UBC)表现出一定的减重效果，这是由于UBC在细胞的高酯酶浓度下发生水解，熊脱氧胆酸分子释放出来影响了体内的胆酸代谢，从而导致体重增加变缓；皮下和静脉注射游离艾塞那肽的对比例二和对比例三实验组小鼠的体重增长得到显著抑制，这是由于艾塞那肽能影响机体糖代谢和脂质代谢，对体重增加有较为明显的抑制作用。而实施例八装载艾塞那肽的酯酶响应聚合物纳米药物载体(囊泡)不仅抑制了高脂饮食小鼠体重增长还进一步降低了高脂饮食小鼠的体重，显示出了远超游离艾塞那肽的治疗效果；这一结果表明本发明酯酶响应聚合物纳米药物载体能够高效递送艾塞那肽靶向至高酯酶含量的肝脏部位，在释放出药物的同时水解释放熊脱氧胆酸分子，发挥药物协同作用，从而产生远优于常规治疗手段的药效。
上述实施例八、实施例九、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠肝脏样品图片见图6。如图6所示，正常饮食对照组小鼠的肝脏颜色鲜红，边缘清晰锐利；高脂组小鼠肝脏(对比例一)已出现脂肪肝的病理学改变：体积增大、边缘变钝、略发黄、纵切面有油腻感。与正常饮食组相比，本发明装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡治疗组(实施例八)以及装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应聚合物囊泡治疗组(实施例九)中小鼠的肝组织颜色最接近正常饮食组，显示出优异的治疗效果。
为了进一步的评价小鼠肝脏脂肪性病变情况，将上述实施例八、实施例九、实施例十、对比例一、对比例二以及对比例三所实施的不同种类制剂治疗非酒精性脂肪肝的体内药效学评价研究的小鼠在给药四周后取样肝组织切片，使用油红染色以观察其病理情况。油红染色图片见图7。如图7所示，与正常饮食对照组相比，注射生理盐水的高脂饮食对比例一实验组小鼠肝细胞内存在大量脂滴且脂滴之间大量融合。给药治疗后，皮下和静脉注射游离艾塞那肽的对比例二和对比例三实验组小鼠细胞内的脂滴均有减少，而本发明装载艾塞那肽的酯酶响应载药聚合物囊泡治疗组(实施例八)以及装载miR-34a拮抗剂的酯酶响应聚合物囊泡治疗组(实施例九)中小鼠肝组织内的脂滴含量与正常饮食组基本没有差异。这一实验结果进一步表明本发明酯酶响应聚合物作为药物载体能够协同增效所负载药物的药效。
本发明中，由于熊脱氧胆酸与2-(4-溴甲基苯基)丙酸反应时是由熊脱氧胆酸上的羧基与2-(4-溴甲基苯基)丙酸上的溴甲基发生取代反应形成酯键，在本发明所述的任意反应条件内均不会影响该反应的进行，因此本发明所述的任意反应条件均可按照本发明所述的方法合成本发明所述结构的熊脱氧胆酸苄基衍生物；由于壳聚糖与本发明所述结构的熊脱氧胆酸苄基衍生物反应时是由壳聚糖上的氨基与本发明所述结构的熊脱氧胆酸苄基衍生物上的羧基发生反应，在本发明所述的任意反应条件内均不会影响该反应的进行，因此本发明所述的任意反应条件均可按照本发明所述的方法合成本发明所述结构的酯酶响应聚合物。本发明制备方法中参数的变化并不影响酯酶响应聚合物的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现酯酶响应聚合物的制备。在此不再赘述。
上述实施例的描述是为了便于本技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在本发明的原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酯酶响应聚合物，其特征在于，所述聚合物为在壳聚糖的氨基上接枝有式Ⅰ所示基团的聚合物，所述式Ⅰ所示基团如下：
Figure FDA0003554880450000011
2.根据权利要求1所述的酯酶响应聚合物，其特征在于，所述酯酶响应聚合物中式Ⅰ所示基团的接枝率在0.1％-20％。
3.根据权利要求1或2所述的酯酶响应聚合物，其特征在于，所述酯酶响应聚合物的数均分子量为500Da-50000Da。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酯酶响应聚合物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成熊脱氧胆酸苄基衍生物：将碳酸氢钾加入溶有熊脱氧胆酸的第一有机溶剂溶液中，在惰性气体保护下混合均匀，缓慢加入2-(4-溴甲基苯基)丙酸，混合物于20℃-35℃搅拌反应至少48h；然后将反应混合物在搅拌下缓慢加入水中，过滤、洗涤并收集白色固体，冻干得到白色粉末即熊脱氧胆酸苄基衍生物；
2)合成壳聚糖接枝熊脱氧胆酸两亲性聚合物：将壳聚糖溶于水，得到壳聚糖溶液；将熊脱氧胆酸苄基衍生物和N-羟基丁二酰亚胺溶于第二有机溶剂，得到熊脱氧胆酸苄基衍生物溶液；将壳聚糖溶液、熊脱氧胆酸苄基衍生物溶液两种溶液混合得到澄清溶液，再向澄清溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在45℃-65℃搅拌反应至少12h，所得溶液去除有机溶剂和残留杂质，冻干得到酯酶响应聚合物。
5.根据权利要求1-3任一项所述的酯酶响应聚合物在制备用于负载药物的纳米载体或者在制备负载药物的纳米药物载体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用所述酯酶响应聚合物自组装形成酯酶响应空白聚合物纳米载体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酯酶响应空白聚合物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
将酯酶响应聚合物于第三有机溶剂中溶解，得到聚合物溶液；在搅拌下，向聚合物溶液中缓慢加入水，加完后除去有机溶剂，溶液经过滤和冻干得到酯酶响应空白聚合物纳米载体。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酯酶响应聚合物自组装并装载药物形成酯酶响应聚合物纳米药物载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酯酶响应聚合物纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将药物用溶剂溶解，得到药物溶液；将酯酶响应聚合物于第三有机溶剂中溶解，得到聚合物溶液；
b)在搅拌下，向聚合物溶液中缓慢加入药物溶液，加完后继续缓慢加入水，除去有机溶剂和游离药物，溶液经过滤和冻干得到酯酶响应聚合物纳米药物载体。
10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，所述用于负载药物的纳米载体包括聚合物胶束或者聚合物囊泡；所述负载药物的纳米药物载体包括载药聚合物胶束或者载药聚合物囊泡。
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