CN109498559B - 一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂及其制备方法。其以醇溶蛋白为主要载体、负载糖尿病治疗多肽药物、包含稳定剂、肠道黏附剂和肠道吸收促进剂的纳米粒子。醇溶蛋白纳米粒子可以保护所负载的多肽在胃部不被降解以及增加纳米粒子在肠道的黏附性；多肽/吸收促进剂复合物可以增加多肽在肠道的吸收，增加多肽表面的疏水性，从而增加亲水的多肽在醇溶蛋白纳米粒子中的负载率；吸收促进剂提高纳米粒子在消化过程不同阶段被吸收的机会；肠道黏附剂增加醇溶蛋白纳米粒子在肠道的黏附性、在水溶液中的稳定性、以及抵抗蛋白酶解的能力。本发明提供的口服制剂，大幅提高多肽药物的口服生物利用率，提高糖尿病治疗效果。

Description

一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的代谢性疾病，患者需终身用药。在这种长期性疾病的治疗过程中，药物的安全性、有效性和顺应性均至关重要。
胰岛素是1型糖尿病和2型糖尿病中晚期患者的主要治疗药物。自上世纪以来，研究者们发现肠道分泌的肠促胰岛素可以促使胰岛β-细胞血糖依赖性地分泌胰岛素【TheLancet, 1987, 330(8571): 1300-1304.】。胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)类似物是目前临床上用于糖尿病治疗的主要肠促胰岛素，该类药物在降低患者血糖的同时较少出现低血糖症状，并且对胰岛β-细胞有一定的保护作用【Advanced drugdelivery reviews, 2016, 106: 196-222.】。胰岛素和GLP-1类似物均为多肽类药物，口服生物利用度极低，目前只能通过注射方式给药。对胰岛素而言，若能通过口服方式给药，胰岛素经肝门静脉吸收的方式与胰腺分泌胰岛素的方式更为相似，可以缓解皮下注射时因外周组织低血糖而导致的体重增加和脂肪代谢障碍问题【Journal of diabetes scienceand technology, 2009, 3(3): 562-567.；Nature Reviews Drug Discovery, 2002, 1(7): 529.】。同样，对GLP-1类似物而言，若能通过口服方式给药，使其通过胃肠道经肝门静脉吸收，则与生理状态下GLP-1的分泌方式更为相似，从而可以降低全身循环的药量，增加用药安全性【Advanced drug delivery reviews, 2016, 106: 193-195.】。对于需要终身用药的糖尿病患者来说，口服是最方便、经济的用药方式，也可以避免因长期注射而带来的炎症、组织坏死等问题【Diabetes care, 2002, 25(3): 593-598.】。蛋白/多肽类药物的口服制剂一直是药物研究领域的一个热点问题【Advanced drug delivery reviews, 2016,106: 196-222.】，需要解决的问题主要有三个：一是消化道中剧烈的pH变化会影响蛋白/多肽药物的稳定性；二是消化道中大量存在的蛋白酶使得蛋白/多肽药物快速降解；三是蛋白/多肽自身的分子量较大并且具有较强的表面亲水性导致蛋白/多肽药物很难穿过肠壁细胞膜进入血液循环【Advanced drug delivery reviews, 2016, 106: 256-276.】。
醇溶蛋白是一类不溶于水、但溶于乙醇或者乙醇-水混合溶剂的蛋白。玉米蛋白是一种从玉米谷物中提取的醇溶蛋白，主要由α、β、γ和δ-玉米蛋白组成【Industrial cropsand products, 2001, 13(3): 171-192.】，具有良好的生物相容性和生物可降解性，已被FDA批准用于食品中【Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2014, 19(5): 450-458.】。玉米蛋白富含疏水性氨基酸残基，缺乏碱性和酸性氨基酸残基，因此玉米蛋白能溶于40%~95%的乙醇溶液而不溶于水【Soft Matter, 2013, 9(25): 5933-5941.】，可用于制备包载亲脂性药物的纳米粒子【Molecular pharmaceutics, 2017, 14(3): 757-769.】。由于疏水性的玉米蛋白纳米粒子在水溶液中容易发生聚集【Food Hydrocolloids,2015, 49: 127-134.】，在体系中添加稳定剂，如酪蛋白、泊洛沙姆、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯等两亲性大分子可以增加玉米蛋白纳米粒子在水溶液中的稳定性【Journal ofagricultural and food chemistry, 2010, 58(23): 12497-12503.;AapsPharmscitech, 2012, 13(3): 919-927;Molecular pharmaceutics, 2013, 10(5):2062-2070.】。玉米蛋白对胃蛋白酶具有一定的抵抗能力，可以增加所负载的药物在胃部的稳定性【Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2014, 19(5): 450-458.】。麦醇溶蛋白是存在于小麦、黑麦、大麦等籽粒中的主要蛋白之一，是小麦面筋蛋白的主要成分之一，主要分为α、β、γ、ω四种醇溶蛋白，溶于60%~80%乙醇溶液而不溶于水。麦醇溶蛋白具有胃肠黏膜黏附性，可以负载疏水药物和增加所负载药物的口服生物利用度【Pharmaceutical Research, 2001, 18(11): 1521-1527.】。
胆酸是一种由肝脏产生的两亲性小分子，其常见的衍生物有脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸等。作为肠道吸收促进剂，胆酸及其衍生物被广泛地用于口服递送多肽的配方中【Advanced drug delivery reviews, 2016, 106: 277-319.】【美国授权专利US7196059】。研究表明，在负载胰岛素的脂质体中加入胆酸或胆酸衍生物能增加胰岛素的抗酶解能力和增加上皮细胞对脂质体的内吞【European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics, 2012, 81(2): 265-272.】。小肠中的胆酸转运受体能够转运表面带有胆酸基团的纳米粒子，促使纳米粒子跨过小肠细胞膜进入循环系统【DrugDelivery, 2018,25(1): 1224–123】。负载胰岛素的纳米粒子经胆酸受体转运入细胞后具有溶酶体逃逸能力，可以避免胰岛素在细胞内的降解【Biomaterials, 2018, 151: 13-23.】。
磷脂是一种两亲性的小分子，是细胞膜的主要组成成分之一，具有良好的生物相容性【Drug Delivery, 2006, 13(1): 19-24.】。具有亲水头部和两条疏水链的磷脂具有稳定界面膜的能力【Biochemistry, 1971, 10(7): 1111-1120.; Progress in lipidresearch, 2002, 41(1): 66-97.】、形成双分子层负载药物的能力、与药物形成磷脂复合物从而增加药物的疏水性并保护药物的作用【Biomaterials, 2012, 33(5): 1583-1588.;Food Chemistry, 2009, 116(4): 923-928.】。由磷脂构建的乳液、脂质体、磷脂复合物等均表现出良好的促口服吸收作用【Drug Deliv. 13 (2006) 19–24.; European Journalof Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2012, 81(2): 265-272.; InternationalJournal of Nanomedicine, 2016, 11: 761.】。
肠道黏附剂可以通过氢键、静电作用、疏水作用和范德华力与肠道黏液层的多糖或蛋白结合，从而可以增加药物制剂在肠道的驻留时间，提高药物在肠道的浓度，增加药物在肠道的吸收效率，达到提高药物口服生物利用度的目的【Advanced drug deliveryreviews, 2012, 64(6): 557-570.; Advanced drug delivery reviews, 2016, 106:320-336.】。常见的肠道黏附剂有壳聚糖及其衍生物、海藻酸钠、卡波姆、聚丙烯酸、果胶、PEG、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯以及它们的巯基衍生物和半胱氨酸衍生物【EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2015, 93: 118-126.; Advanceddrug delivery reviews, 2018, 124: 82-97. ; Biomaterials, 2015, 59: 144~159】。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂及其制备方法。
本发明提供的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，是一种以醇溶蛋白为主要载体，负载有糖尿病治疗多肽药物、且包含稳定剂、肠道黏附剂和肠道吸收促进剂的纳米粒子体系。
本发明中，所述负载有糖尿病治疗多肽药物，包括负载糖尿病治疗多肽/吸收促进剂复合物以及负载糖尿病治疗多肽两种情形。
本发明利用醇溶蛋白为主要载体，可制备得到负载多肽/吸收促进剂复合物的醇溶蛋白纳米粒子。醇溶蛋白纳米粒子可以保护所负载的多肽在胃部不被降解以及增加纳米粒子在肠道的黏附性；多肽/吸收促进剂复合物不仅可以增加多肽在肠道的吸收，还可以增加多肽表面的疏水性，从而增加亲水的多肽在醇溶蛋白纳米粒子中的负载率。此外，本发明还通过共混的方式进一步增加吸收促进剂在纳米粒子中的分布，以保证未降解的纳米粒子表面、部分降解的纳米粒子表面和释放出的复合物表面都有吸收促进剂，从而提高纳米粒子在消化过程的不同阶段被吸收的机会。
本发明中，肠黏附材料，例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HP）被加入到了醇溶蛋白纳米粒子中，用以增加醇溶蛋白纳米粒子在肠道的黏附性、在水溶液中的稳定性、以及抵抗蛋白酶解的能力；两亲性的大分子，例如酪蛋白被加入到醇溶蛋白纳米粒子中用于抑制纳米粒子在水溶液中的聚集。
本发明中，除了提供负载多肽/吸收促进剂复合物、包含稳定剂、肠道黏附剂和肠道吸收促进剂的醇溶蛋白纳米粒子以外，还提供更为简单的负载多肽、包含稳定剂、肠道黏附剂和肠道吸收促进剂的醇溶蛋白纳米粒子。
本发明中，所述多肽药物是治疗糖尿病的多肽，可选自胰岛素、胰岛素衍生物、赖脯胰岛素、PEG赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、利拉鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽-4、索马鲁肽、GLP-1激动剂、利西拉肽、他司鲁肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、普兰林肽、胰高血糖素样肽-1类似物等。
本发明中，所述醇溶蛋白，是不溶于水但溶于乙醇或者乙醇-水混合溶剂的蛋白，例如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白等。
本发明中，所述的稳定剂，是能够增加纳米粒子稳定性的两亲性大分子，包括但不局限于羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、酪蛋白、泊洛沙姆、卡波姆、聚维酮、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、羧甲基化淀粉等。
本发明中，所述的肠道黏附剂，是一类和肠道黏液层有亲和力、能够增加纳米粒子在肠道驻留时间的高分子聚合物，选自卡波姆、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙二醇、聚丙烯酸、果胶、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等聚合物以及其衍生物。
本发明中，所述的肠道吸收促进剂，是能够促进纳米粒子在肠道吸收的两亲性分子。选自胆酸、胆酸衍生物、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、去氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、甘氨去氢胆酸、牛磺去氢胆酸、上述胆酸和胆酸衍生物的钠盐和钾盐、油酸、亚油酸、癸酸、辛酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、鼠李糖脂、癸基葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷、十二烷基葡萄糖苷、癸基麦芽糖苷、辛基麦芽糖苷、十二烷基麦芽糖苷、大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、合成磷脂、氯化棕榈酰肉碱、氯化月桂酰肉碱、PEG辛酸甘油酯、PEG癸酸甘油酯、PEG辛酸癸酸甘油酯、吐温类、司盘类等。
本发明还提供上述负载糖尿病治疗多肽的口服制剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）将多肽和肠道吸收促进剂分别溶解于水溶液中，然后将两种溶液混合，得到多肽/吸收促进剂混合溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（2）将多肽和肠道吸收促进剂溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发将溶剂抽干，然后将抽干的多肽/吸收促进剂复合物溶解或者分散在吸收促进剂乙醇溶液中，得到多肽/吸收促进剂复合物乙醇溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（3）将醇溶蛋白溶于乙醇-水混合溶剂中，醇溶蛋白的浓度为5~500 mg/mL；
（4）将肠道黏附剂溶于乙醇或乙醇-水混合溶剂中，浓度为1~300 mg/mL；
（5）将稳定剂溶于水中，浓度为1~300 mg/mL；
（6）将步骤（1）或（2）所制备的溶液与步骤（3）和（4）所制备的溶液相混合，混合后的溶液中乙醇与水的体积比为1:2到9:1之间；
（7）将步骤（6）所制备的混合溶液与（5）所制备的稳定剂水溶液以2:1~1:20体积比混合，搅拌，即得到载多肽或者载多肽/吸收促进剂复合物的醇溶蛋白纳米粒子溶液。
本发明提供的口服制剂，可大幅提高多肽药物的生物利用率，从而提高糖尿病治疗效果。
具体实施方式
实施例1直接分散法制备负载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子
分别配制以下溶液：
将利拉鲁肽（Lira）溶于10 mmol/L pH 9.0的NaCO3-NaHCO3缓冲溶液中，浓度为3.6~16.8mg/mL；
将胆酸（CA）加入去离子水中，浓度为12~40 mg/mL，加NaOH调节溶液pH至7.4；
将玉米蛋白（Zein）溶于80%的乙醇中，浓度为50~100 mg/mL；
将羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HP）加入去离子水中，浓度为0.38 mg/mL，加NaOH调节溶液pH至7.4；
将酪蛋白（CN）加入去离子水中，浓度为2mg/mL，加NaOH调节溶液pH至7.4；
将鼠李糖脂（RLs）溶于10 mmol/L PB（pH7.4磷酸盐缓冲液）中，浓度为0.3~1.25mg/mL。
将上述利拉鲁肽溶液、胆酸溶液、乙醇、玉米蛋白溶液按照体积比1:1:2:4混合均匀后作为有机相溶液。取1mL有机相溶液滴加到4 mL快速搅拌的水相溶液中。水相溶液分别为：1）10 mmol/L PB溶液；2）0.38 mg/mL HP溶液；3）2 mg/mL 酪蛋白溶液；4）0.3mg/mL或者1.25 mg/mL鼠李糖脂溶液。将有机相和水相混合溶液在室温敞口条件进行搅拌，在搅拌的过程中部分乙醇挥发，搅拌3h后加水定容至5mL，得到载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子。
制备荧光探针异硫氰酸荧光素（FITC）标记的利拉鲁肽（F-Lira），用上述方法制备载F-Lira的纳米粒子，然后用超滤方法分离溶液中未包埋的F-Lira，利用多功能微孔板测定仪测定超滤液中F-Lira的浓度，用下式计算利拉鲁肽的包埋效率：
包埋效率（%）=（（总利拉鲁肽质量-未包埋利拉鲁肽质量）/总利拉鲁肽质量）×100%。
通过光散射粒径分析仪测定纳米粒子的粒径（水合直径Dh）和多分散系数（PDI）。
表1列出了各种条件下制备的纳米粒子的粒径和利拉鲁肽的包埋效率。
表1.直接分散法制备的载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子的组成、性质及包埋效率
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2直接分散法制备负载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子
按照实施例1配制20mg/mL利拉鲁肽溶液、40mg/mL胆酸溶液、100mg/mL玉米蛋白溶液和1.25 mg/mL鼠李糖脂溶液。将HP溶于80%乙醇，浓度为20mg/mL。将上述利拉鲁肽溶液、胆酸溶液、乙醇、HP溶液和玉米蛋白溶液按照体积比1:1:2:2:2混合，磁力搅拌均匀后作为有机相溶液。取出1 mL有机相溶液，在1 mL有机相溶液中加入4 mL水相溶液。水相溶液分别为1）10 mmol/L PB溶液；2）1.25 mg/mL鼠李糖脂溶液。将有机相和水相混合溶液在室温敞口条件下进行搅拌，在搅拌的过程中部分乙醇挥发，搅拌3 h后加水定容至5 mL，得到载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子。结果见表2。
表2. 直接分散法制备的载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子的组成、性质及包埋效率
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
实施例3直接分散法制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子
将艾塞那肽（EXE）溶于水中，浓度为0.6~3.2 mg/mL。将泊洛沙姆188（P188）溶于水中，浓度为5~10mg/mL。将HP溶于二甲基亚砜（DMSO）中，依次在10mmol/L氢氧化钠溶液和去离子水中透析各3次进行纯化，然后冷冻干燥密封保存；将纯化后的HP溶于80%乙醇中，浓度为10~20 mg/mL。按照实施例1配制4~20 mg/mL胆酸溶液，50~100 mg/mL玉米蛋白溶液，2.5mg/mL酪蛋白溶液。
将上述艾塞那肽溶液、胆酸溶液、乙醇、HP溶液和玉米蛋白溶液按照体积比1:1:2:2:2混合，磁力搅拌均匀后作为有机相溶液，取出1 mL有机相溶液，在1 mL有机相溶液中加入4 mL水相溶液。水相溶液分别为1）2.5 mg/mL酪蛋白溶液；2）10 mg/mL P188溶液；3）2.5mg/mL酪蛋白和5 mg/mL P188混合溶液。将有机相和水相混合溶液在室温敞口条件下搅拌3h后加水定容至5 mL，得到载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子。结果见表3。
表 3.直接分散法制备的载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子的性质及包埋效率
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
实施例4 直接分散法制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子
将艾塞那肽溶于水中，浓度为0.6~20 mg/mL。将蛋黄卵磷脂（PC）溶于乙醇中，浓度为20mg/mL。按照实施例1配制4~20 mg/mL胆酸溶液、50~100 mg/mL玉米蛋白溶液和2.5 mg/mL酪蛋白溶液。按照实施例3配制20 mg/mL HP溶液。
将上述艾塞那肽溶液、胆酸溶液、蛋黄卵磷脂溶液、HP溶液和玉米蛋白溶液按照体积比1:1:2:2:2混合，磁力搅拌均匀后作为有机相溶液。取出1 mL有机相溶液，在1 mL有机相溶液中加入4 mL水相溶液。水相溶液为2.5 mg/mL酪蛋白溶液。将有机相和水相混合溶液在室温敞口条件下搅拌3 h后加水定容至5 mL，得到载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子。结果见表4。
表 4. 直接分散法制备的负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子的性质及包埋效率
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
实施例5 艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物制备和载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子制备
将艾塞那肽溶于甲醇中，浓度为1.6 mg/mL。将胆酸溶于甲醇中，浓度为5 mg/mL。将蛋黄卵磷脂溶于二氯甲烷中，浓度为10mg/mL。将胆酸溶于乙醇中，浓度为2.5 mg/mL。按照实施例1配制100mg/mL玉米蛋白溶液和2.5~5 mg/mL酪蛋白溶液。按照实施例3配制20mg/mL HP溶液。
将上述艾塞那肽甲醇溶液、胆酸甲醇溶液和磷脂二氯甲烷溶液按照体积比1:1:2搅拌混合后，于30℃下经真空旋转蒸发除去溶剂。将胆酸乙醇溶液加至抽干的艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物中，超声1min，得到艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物（COM-EXE/PC/CA）溶液。用同样的方法制备不含胆酸的艾塞那肽/磷脂复合物（COM-EXE/PC）溶液。
将复合物溶液与HP溶液和玉米蛋白溶液按照体积比2:1:1混合，磁力搅拌均匀后作为有机相溶液。取出1 mL有机相溶液，在1 mL有机相溶液中加入4 mL水相溶液。水相溶液分别为1）10 mmol/L PB溶液；2）2.5或者5 mg/mL酪蛋白溶液。将有机相和水相混合溶液在室温敞口条件下搅拌3 h后加水定容至5 mL，得到载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物或者载艾塞那肽/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子。结果见表5。
表5.艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物和载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物、艾塞那肽/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子的性质及艾塞那肽包埋效率（n = 3）
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
实施例6 载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子制备
按照实施例5制备负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，其中的胆酸（CA）依次更换为甘氨胆酸（GCA）和脱氧胆酸（DCA），其余的制备条件相同。结果见表6。
表6. 载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子性质及艾塞那肽包埋效率（n = 3）
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
实施例7直接分散法制备负载胰岛素的玉米蛋白纳米粒子
将胰岛素（INS）溶于pH 2.0的70%乙醇溶液中，浓度为4 mg/mL。将蛋黄卵磷脂溶于乙醇中，浓度为40 mg/mL。将玉米蛋白溶于80%乙醇溶液中，浓度为50 mg/mL。将HP溶于DMSO中，依次对pH 9.0的氢氧化钠溶液和去离子水进行透析后冷冻抽干；将纯化后的HP溶于80%乙醇溶液中，浓度为20 mg/mL。将胆酸溶于乙醇中，浓度为10 mg/mL。
将0.1mL胰岛素溶液和0.2mL胆酸溶液与不同体积的磷脂溶液、HP溶液和玉米蛋白溶液混合，然后加乙醇定容至1mL作为有机相溶液。将有机相溶液滴加入4mL 10mmol/L PB中，室温敞口搅拌4h，得到负载胰岛素的玉米蛋白纳米粒子。结果见表7。
表7. 载胰岛素的玉米蛋白纳米粒子的性质（n = 3）
Figure DEST_PATH_IMAGE014
。
实施例8 载胰岛素/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子制备
将胰岛素溶于含1%三氟乙酸的乙醇溶液中，胰岛素浓度为2 mg/mL。按照实施例7配制20 mg/mL蛋黄卵磷脂溶液、50 mg/mL玉米蛋白溶液和20 mg/mL HP溶液。将胆酸加入乙醇中得到40 mg/mL混悬液。
将胰岛素溶液、磷脂溶液和胆酸混悬液以体积比20:20:1混合，搅拌至胆酸溶解，接着在37℃水浴中震荡2h，旋转蒸发除去部分溶剂后冷冻抽干，得到胰岛素/磷脂/胆酸复合物。同法制备不含胆酸的胰岛素/磷脂复合物。
将上述复合物溶于乙醇中，然后和玉米蛋白溶液、HP溶液、胆酸混悬液及80%乙醇按照一定比例混合，取混合液1mL缓慢滴加入4mL 10mmol/L PB中，室温敞口搅拌至少4h，得到负载胰岛素/磷脂/胆酸复合物或者胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子。结果见表8。
表8. 载胰岛素/磷脂/胆酸复合物或者胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子的性质及胰岛素包埋效率（n =3）
Figure DEST_PATH_IMAGE016
。
实施例9艾塞那肽的体外释放
制备荧光探针FITC标记的艾塞那肽（F-EXE），按照实施例4表4中序号2的配方，采用直接分散法（DIS）制备负载F-EXE的纳米粒子，标记为DIS-F-EXE/CA/PC/Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号3的配方制备负载F-EXE/磷脂/胆酸复合物（COM-F-EXE/PC/CA）的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2。
将0.5 mL上述纳米粒子溶液置于透析管中，将透析管置于5 mL透析液中，0~2 h时透析液为pH 2.0HCl溶液，2~24 h时透析液为pH 7.4PBS溶液（0.01 mol/L pH7.4磷酸缓冲液含0.15 mol/L NaCl），将透析管置于37℃水浴振荡器中，转速为100转/分钟。在预定时间点取出0.5 mL透析液，补加0.5 mL新鲜透析液，利用多功能微孔板测定仪测定透析液中F-EXE浓度。表9中的结果显示，在胃酸环境下，两种纳米粒子溶液释放出的艾塞纳肽均低于10%，表明两种纳米粒子都具有较好的抵抗胃酸环境的性质。
表9. 负载艾塞纳肽的玉米蛋白纳米粒子体外累积释放艾塞纳肽结果（n = 3）
Figure DEST_PATH_IMAGE018
。
实施例10小鼠小肠表观渗透系数测定
按照实施例9中的方法制备DIS-F-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2两种纳米粒子溶液用于下述实验。
将体重为20 g左右的雄性ICR小鼠于动物房饲养一周以适应环境（条件：21±1℃，湿度60±5%，光照12 h，黑暗12 h）。实验前，小鼠禁食12h（可自由饮水），按照400 mg/kg剂量腹腔注射4% 水合氯醛麻醉小鼠，手术取出小鼠十二指肠、空场、回肠各一段，每段3cm，然后立即将小鼠处死。将取出的小肠两端结扎后注入 0.1 mL F-EXE 溶液、DIS-F-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2溶液或者COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2溶液，然后将小肠浸泡于 3 mLKrebs-Ringer 缓冲液中置于37℃ 孵育，于1h时间点取出0.2 mL小肠外侧缓冲液并补充同体积的新鲜 Krebs-Ringer 缓冲液，利用多功能微孔板测定仪测定外侧缓冲液中F-EXE含量。通过下面公式计算1h时F-EXE 溶液和两种纳米粒子溶液在小肠不同部位的表观渗透系数（Papp）值。
Figure DEST_PATH_IMAGE020
其中，dQ/dt (ng/s)是自由F-EXE或者负载在纳米粒子中的F-EXE从小肠内侧通过肠膜渗透到外侧的渗透效率，
Figure DEST_PATH_IMAGE022
(ng/mL)是小肠内侧F-EXE的初始浓度，A是肠段内侧表面积。
表10的结果表明，在十二指肠、空肠和回肠处，两个纳米粒子组的Papp值均高于F-EXE 溶液组，COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2组在小肠三个部位的渗透系数都是F-EXE溶液组的3倍以上，表明COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2纳米粒子具有很好地帮助所负载的艾塞纳肽穿过小肠上皮细胞的能力。
表10.小鼠小肠灌注F-EXE 溶液、DIS-F-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-F-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2纳米粒子溶液后的F-EXE表观渗透系数（n=3）
Figure DEST_PATH_IMAGE024
。
实施例11负载利拉鲁肽的纳米粒子降血糖效果
用直接分散法分别按照实施例2表2中序号1和2的配方制备负载利拉鲁肽的玉米蛋白纳米粒子，标记为DIS-Lira/CA/Zein/HP和DIS-Lira/CA/Zein/HP/RLs。
采用2型糖尿病小鼠Db/Db鼠，6~12周龄，于动物房饲养一周以适应环境。将血糖大于360 mg/dL的Db/Db小鼠随机分为4组，每组6只，分别为口服生理盐水组、皮下注射利拉鲁肽组、口服DIS-Lira/CA/Zein/HP组和口服DIS-Lira/CA/Zein/HP/RLs组。皮下注射组的利拉鲁肽剂量为0.75 mg/kg, 口服组的利拉鲁肽剂量为7.5 mg/kg。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。小鼠在实验前和实验过程中自由进食进水。根据给药组给药后0~48h区间血糖降低曲线上方的面积（AAC0~48），通过下面公式计算口服组的药效生物利用度（PA）：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
。
表11的结果表明，口服这两种配方的纳米粒子溶液都有较好的降血糖效果。
表11. Db/Db小鼠分别口服灌胃生理盐水、DIS-Lira/CA/Zein/HP、DIS-Lira/CA/Zein/HP/RLs纳米粒子溶液和皮下注射利拉鲁肽溶液的药理动力学数据（n = 6）
Figure DEST_PATH_IMAGE028
。
实施例12负载艾塞那肽的纳米粒子降血糖效果
按照实施例11对Db/Db小鼠进行饲养、选择和实验。
用直接分散法按照实施例4表4中序号2的配方制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子，标记为DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号1的配方制备艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物，标记为COM-EXE/PC/CA。
按照实施例5表5中序号3的配方制备负载COM-EXE/PC/CA复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2。
将Db/Db鼠分为5组，每组6只，分别为口服生理盐水组、皮下注射艾塞那肽组、口服COM-EXE/PC/CA组、口服DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2组和口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2组。皮下注射组的艾塞那肽剂量为60μg/kg，口服组的艾塞那肽剂量为600μg/kg。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表12的结果表明，两种玉米蛋白纳米粒子溶液都可以显著提高艾塞那肽的口服生物利用度，而没有玉米蛋白的艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的生物利用度显著低于两种玉米蛋白纳米粒子的生物利用度，证明了玉米蛋白作为载体的重要性。其中，COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2，即负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子的口服生物利用度可以达到18.6%，高于用直接分散法制备的组成相同的DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2的口服生物利用度（13.1%），表明COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2是更有效的艾塞那肽口服递送体系。
表12. Db/Db小鼠分别口服灌胃生理盐水、COM-EXE/PC/CA、DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2纳米粒子溶液和皮下注射艾塞那肽溶液的药理动力学数据（n = 6）
Figure DEST_PATH_IMAGE030
。
实施例13负载艾塞那肽的纳米粒子降血糖效果
按照实施例11对Db/Db小鼠进行饲养、选择和实验。
分别按照实施例5表5中序号2、3和4的配方制备三种负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，其中酪蛋白的含量分别为0、2和4 mg/mL，所制备的纳米粒子分别标记为：COM-EXE/PC/CA@Zein/HP、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN4。
将Db/Db鼠分为5组，每组6只，分别为口服生理盐水组、皮下注射艾塞那肽组、口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP组、口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2组和口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN4组。皮下注射组的艾塞那肽剂量为60μg/kg，口服组的艾塞那肽剂量为600μg/kg。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表13的结果表明，三种负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子均可以显著提高艾塞那肽的口服生物利用度，其中COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2的效果尤为突出，生物利用度达到了20.2%。
表13. Db/Db小鼠分别口服灌胃生理盐水、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN4纳米粒子溶液和皮下注射艾塞那肽溶液的药理动力学数据（n = 6）
Figure DEST_PATH_IMAGE032
。
实施例14负载艾塞那肽的纳米粒子降血糖效果
按照实施例11对Db/Db小鼠进行饲养、选择和实验。
用直接分散法按照实施例4表4中序号2的配方制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子，标记为DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号3的配方制备负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号5的配方制备不含胆酸、负载艾塞那肽/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC@Zein/HP/CN2。
将Db/Db鼠分为5组，每组6只，分别为口服生理盐水组、皮下注射艾塞那肽组、口服DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2组、口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2组和口服COM-EXE/PC@Zein/HP/CN2组。皮下注射组的艾塞那肽剂量为78μg/kg，口服组的艾塞那肽剂量为780μg/kg。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表14的数据表明，纳米粒子中的胆酸对提高艾塞那肽口服生物利用度有明显的帮助。还有，同实施例12中的结果一样，虽然DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2的组成相同，但是负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子比直接分散法制备的负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子有更好的降血糖效果。
表14. Db/Db小鼠分别口服灌胃生理盐水、DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2、COM-EXE/PC@Zein/HP/CN2纳米粒子溶液和皮下注射艾塞那肽溶液的药理动力学数据（n = 6）
Figure DEST_PATH_IMAGE034
。
实施例15负载艾塞那肽的纳米粒子降血糖效果
按照实施例11对Db/Db小鼠进行饲养、选择和实验。
用直接分散法按照实施例4表4中序号2的配方制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子，标记为DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号3的配方制备负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2。
按照实施例6表6中序号2的配方制备负载艾塞那肽/磷脂/甘氨胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/GCA@Zein/HP/CN2。
将Db/Db鼠分为4组，每组6只，分别为口服生理盐水组、口服DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2组、口服COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2组和口服COM-EXE/PC/GCA@Zein/HP/CN2组。口服艾塞那肽剂量为每天600 μg/kg。每日给药一次，共给药3天，在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表15中的结果显示，将纳米粒子中的胆酸替换为甘氨胆酸后，艾塞那肽的口服生物利用度变化不大，表明甘氨胆酸和胆酸的作用效果相似，也可以提高艾塞那肽口服生物利用度。此外，与实施例12和实施例14中的结果一样，虽然DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2的组成相同，但是负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子比直接分散法制备的负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子有更好的降血糖效果。
表15. Db/Db小鼠分别口服灌胃生理盐水、DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2、COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/GCA@Zein/HP/CN2纳米粒子溶液的药理动力学数据（n = 6）
Figure DEST_PATH_IMAGE036
。
实施例16负载胰岛素的纳米粒子降血糖效果
按照实施例8表8中序号3的配方制备负载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-INS/PC@Zein/HP。
按照实施例8表8中序号4的配方制备负载胰岛素/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-INS/PC/CA@Zein/HP。
雄性ICR小鼠（约25 g）禁食12 h（期间可自由进水）后以200 mg/kg的剂量腹腔注射浓度为25 mg/mL的四氧嘧啶溶液，三天后测试小鼠空腹血糖，筛选出血糖大于450 mg/dL的糖尿病小鼠进行下述实验。
随机将血糖符合要求的糖尿病小鼠分为4组，每组5只，分别为口服生理盐水组、皮下注射胰岛素组、口服COM-INS/PC@Zein/HP组和口服COM-INS/PC/CA@Zein/HP组。空腹给药，皮下注射组的胰岛素剂量为2IU/kg，口服组的胰岛素剂量为50IU/kg。给药10 h后每只小鼠给食约1.5 g，进食约6 h。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表16的结果表明，纳米粒子中的胆酸对提高胰岛素口服生物利用度有明显的效果。
表16.糖尿病小鼠口服灌胃生理盐水、COM-INS/PC@Zein/HP、COM-INS/PC/CA@Zein/HP纳米粒子溶液和皮下注射胰岛素溶液的药理动力学数据（n = 5）
Figure DEST_PATH_IMAGE038
。
实施例17载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白/胆酸纳米粒子制备
将胰岛素溶于0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，胰岛素浓度为2.5 mg/mL。按照实施例7配制6.25 mg/mL蛋黄卵磷脂溶液、20 mg/mL玉米蛋白溶液和20 mg/mL HP溶液。将胆酸加入乙醇中得到40 mg/mL混悬液。
将4mL胰岛素溶液缓慢滴加入16mL磷脂溶液中，于37 ℃水浴中搅拌2h，旋蒸除去大部分溶剂后冷冻干燥，得到胰岛素/磷脂复合物（COM-INS/PC）。将复合物溶于乙醇中，然后按一定比例与玉米蛋白溶液、HP溶液和胆酸溶液相混合，于室温密闭条件下搅拌2h后取出1mL混合溶液，将其缓慢滴加入4mL 0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐溶液中，于室温敞口条件下搅拌2h后得到负载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白/胆酸纳米粒子。结果见表17。
表17. 载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白和玉米蛋白/胆酸纳米粒子的性质及胰岛素包埋效率（n =3）
Figure DEST_PATH_IMAGE040
。
实施例18载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白/胆酸纳米粒子的降血糖效果
按照实施例17表17中序号1的配方制备负载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白/胆酸纳米粒子，标记为COM-INS/PC@Zein/HP/CA。
按照实施例17表17中序号2的配方制备负载胰岛素/磷脂复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-INS/PC@Zein/HP。
按照实施例16进行小鼠饲养、糖尿病小鼠造模、选择和实验。
随机将血糖符合要求的糖尿病小鼠分为5组，每组4~5只，分别为口服生理盐水组、皮下注射胰岛素组、口服PC/Zein/HP（空白载体）组、口服COM-INS/PC@Zein/HP组和口服COM-INS/PC@Zein/HP/CA组。空腹给药，皮下注射组的胰岛素剂量为2IU/kg，口服组的胰岛素剂量为44IU/kg。给药10 h后每只小鼠给食约1.5 g，进食约6 h。在预设时间点采尾静脉血测定小鼠血糖。表18的结果表明，纳米粒子中的胆酸对提高胰岛素口服生物利用度有明显的效果。
表18.糖尿病小鼠口服灌胃PC/Zein/HP、COM-INS/PC@Zein/HP、COM-INS/PC@Zein/HP/CA纳米粒子溶液和皮下注射胰岛素溶液的药理动力学数据（n = 4~5）
Figure DEST_PATH_IMAGE042
。
实施例19负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子的长期保存方法
用直接分散法按照实施例4表4中序号2的配方制备负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子，标记为DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号3的配方制备负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2。
按照实施例5表5中序号2的配方制备负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子，标记为COM-EXE/PC/CA@Zein/HP。
将新鲜制备的纳米粒子溶液冷冻干燥，然后加入去离子水至冻干前的溶液体积，摇匀使纳米粒子重新分散后测定溶液的粒径、
Figure DEST_PATH_IMAGE044
-电位和艾塞那肽包封率。由表19的结果可知，与冻干前的溶液相比，经冻干和重新分散后，含有酪蛋白的COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2样品的溶液性质没有发生明显变化，而没有酪蛋白的COM-EXE/PC/CA@Zein/HP样品则出现了聚集，表明酪蛋白能有效抑制纳米粒子在冻干/再分散过程中的聚集。负载艾塞那肽/磷脂/胆酸复合物的玉米蛋白纳米粒子比直接分散法制备的负载艾塞那肽的玉米蛋白纳米粒子具有更好的冻干/再分散稳定性。
将冻干后的粉末样品密闭包装后分别置于-20℃、2~8℃和25℃环境中保存，于0月、1月和3月后取出，在水中重新分散后测定纳米粒子的粒径。表20的结果表明，两种纳米粒子DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2的冻干粉末在低温密闭环境中都有很好的长期稳定性。
表19.三种纳米粒子在冻干前和冻干后重新分散在水中的溶液性质（n = 3）
Figure DEST_PATH_IMAGE046
。
表20.DIS-EXE/PC/CA/Zein/HP/CN2和COM-EXE/PC/CA@Zein/HP/CN2冻干样品在不同温度下贮存不同时间后重新分散在水中的溶液性质（n=3）
Figure DEST_PATH_IMAGE048
。

Claims (6)

1.一种负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，其特征在于，是一种以醇溶蛋白为主要载体，负载有糖尿病治疗多肽药物，且包含稳定剂、肠道黏附剂和肠道吸收促进剂的纳米粒子体系；并由如下制备步骤得到：
（1）将多肽和肠道吸收促进剂分别溶解于水溶液中，然后将两种溶液混合，得到多肽/吸收促进剂混合溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（2）将多肽和肠道吸收促进剂溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发将溶剂抽干，然后将抽干的多肽/吸收促进剂复合物溶解或者分散在吸收促进剂乙醇溶液中，得到多肽/吸收促进剂复合物乙醇溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（3）将醇溶蛋白溶于乙醇-水混合溶剂中，醇溶蛋白的浓度为5~500 mg/mL；
（4）将肠道黏附剂溶于乙醇或乙醇-水混合溶剂中，浓度为1~300 mg/mL；
（5）将稳定剂溶于水中，浓度为1~300 mg/mL；
（6）将步骤（1）或（2）所制备的溶液与步骤（3）和（4）所制备的溶液相混合，混合后的溶液中乙醇与水的体积比为1:2到9:1之间；
（7）将步骤（6）所制备的混合溶液与步骤（5）所制备的稳定剂水溶液以2:1~1:20体积比混合，搅拌，即得到载多肽或者载多肽/吸收促进剂复合物的醇溶蛋白纳米粒子溶液；
其中，所述醇溶蛋白选自玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白；所述肠道吸收促进剂选自胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、石胆酸、去氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、甘氨去氢胆酸、牛磺去氢胆酸、胆酸的钠盐和钾盐。
2.根据权利要求1所述的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，其特征在于，所述负载有糖尿病治疗多肽药物包括：负载糖尿病治疗多肽/吸收促进剂复合物，以及负载糖尿病治疗多肽两种情形。
3.根据权利要求1所述的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，其特征在于，所述多肽药物，选自胰岛素、赖脯胰岛素、PEG赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、利拉鲁肽、艾塞那肽、索马鲁肽、利西拉肽、他司鲁肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、普兰林肽。
4.根据权利要求3所述的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，其特征在于，所述稳定剂是能够增加纳米粒子稳定性的两亲性大分子，选自羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、酪蛋白、泊洛沙姆、卡波姆、聚维酮、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、羧甲基化淀粉。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂，其特征在于，所述肠道黏附剂选自卡波姆、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙二醇、聚丙烯酸、果胶、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。
6.如权利要求1-5之一所述的负载糖尿病治疗多肽的口服制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将多肽和肠道吸收促进剂分别溶解于水溶液中，然后将两种溶液混合，得到多肽/吸收促进剂混合溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（2）将多肽和肠道吸收促进剂溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发将溶剂抽干，然后将抽干的多肽/吸收促进剂复合物溶解或者分散在吸收促进剂乙醇溶液中，得到多肽/吸收促进剂复合物乙醇溶液；其中，多肽浓度为0.1~100 mg/mL，吸收促进剂浓度为1~1000 mg/mL；
（3）将醇溶蛋白溶于乙醇-水混合溶剂中，醇溶蛋白的浓度为5~500 mg/mL；
（4）将肠道黏附剂溶于乙醇或乙醇-水混合溶剂中，浓度为1~300 mg/mL；
（5）将稳定剂溶于水中，浓度为1~300 mg/mL；
（6）将步骤（1）或（2）所制备的溶液与步骤（3）和（4）所制备的溶液相混合，混合后的溶液中乙醇与水的体积比为1:2到9:1之间；
（7）将步骤（6）所制备的混合溶液与步骤（5）所制备的稳定剂水溶液以2:1~1:20体积比混合，搅拌，即得到载多肽或者载多肽/吸收促进剂复合物的醇溶蛋白纳米粒子溶液。
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