CN106727428A - 一种芦丁‑玉米醇溶蛋白‑酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

一种芦丁‑玉米醇溶蛋白‑酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种芦丁‑玉米醇溶蛋白‑酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法。所述复合纳米粒子以芦丁为抗氧化剂，玉米醇溶蛋白为载体，酪蛋白酸钠为稳定剂，利用反溶剂法制得。本发明采用激光粒度仪、傅氏转换红外线光谱分析仪、扫描电镜等仪器对纳米颗粒表征结构进行分析，并对其得率，包埋率、缓释率以及抗氧化性进行了测定。结果表明，所述复合纳米粒子对芦丁有良好的包埋效果，且具有较小的粒径，在溶液中分布均匀；SEM 图片显示，复合纳米粒子呈球形，颗粒大小分布均匀；傅氏转换红外线光谱分析仪分析表明该纳米粒子分子内的羟基有所增加；且制备的纳米粒子具有一定的缓释比例和较强的抗氧化性。

Description

一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备 方法
技术领域
本发明属于纳米粒子应用技术领域，具体涉及一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法。
背景技术
纳米粒子通常是指粒径小于1μm的固体颗粒。由于重力的原因，微米级颗粒难以分散并悬浮在液体体系中。而纳米粒子具有良好的稳定性，其悬浮液可以在长达三个月的时间内保持稳定。在肠道模型的测试中，100nm的纳米粒子的吸收率是1-10μm的15-250倍，这是因为纳米粒子可以穿透亚黏膜层而微球只能停留在表皮层上。因此，纳米粒子相对于微米级的粒子在稳定性和生理利用率方面具有明显的优势。纳米粒子的应用领域非常广泛，可用于催化反应、电导材料、高色度染料、纺织服装、强化材料以及包埋输送活性物质等等。其中输送活性物质是纳米粒子最重要的用途之一，常用于包埋检测物质、药物、营养物质、食品添加剂等等。
用于制备纳米粒子的材料有很多种。近年来的研究大都倾向于可降解的纳米粒子材料，分为两类：合成可降解材料和天然可降解材料。前者如聚α-氰基丙烯酸烷基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等；后者如蛋白、脂质、多糖等生物大分子物质。而天然可降解材料易于作为食品组分被消费者接受，并且易于大量获得并具有良好的生物相容性，可包埋活性成分后用作新型食品添加剂。
玉米醇溶蛋白是玉米的主要贮藏蛋白是由四个主要部分组成：α-，β-，γ-和δ-玉米醇溶蛋白，其中α-玉米醇溶蛋白占整个蛋白质的近85％。在玉米醇溶蛋白中50％以上的氨基酸残基是疏水的，这使得它是能在60-90％乙醇溶液而不是水中被溶解的少数天然蛋白质之一。这种特性使玉米醇溶蛋白作为天然生物纳米粒子，用来包封，保护和释放疏水性活性物质、药物，营养成分以及天然活性成分如叶黄素和槲皮素等。然而，在食品活性物质递送过程中使用玉米醇溶蛋白纳米粒子可能不是最佳的，由于玉米醇溶蛋白是生物大分子且等电点在约pH 6.2。因此，在接近中性pH的玉米醇溶蛋白纳米粒子失去pH稳定性，从而导致粒子的聚集。
酪蛋白酸钠是由几个不同的酪蛋白(αs1，αs2，β，κ)可溶性混合物组成。酪蛋白酸钠含有不同顺序和比例的亲水性和疏水性基团。酪蛋白酸钠由于营养丰富，因而可当作食品营养强化剂使用。根据我国GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，酪蛋白酸钠可用于各类食品，按生产需要适量添加。目前酪蛋白酸钠大量应用在肉制品、冰淇淋、饼干等食品的生产中。此外酪蛋白酸钠的LD50>400-500g/kg体重(大鼠，经口)，联合国粮农组织和世界卫生组织规定其ADI值不受限制，这表明酪蛋白酸钠的食用安全性很高。
芦丁又名芸香苷，是由槲皮素C3位上的羟基和芸香糖(-Glu-Rha)连接而成的双糖苷，属于黄酮类物质中的葡萄糖糖苷。芦丁具有抗氧化及抗自由基作用，可用于心脑血管疾病、肿瘤、炎症等的治疗。由于芦丁不溶于水，使其在作为一种良好的新型抗自由基的食品添加剂添加至食品中时受到了很大的局限。传统的将芦丁包埋制成复合粒子的技术虽然解决了芦丁的溶解度问题，但仍然存在以下问题：一、微球粒径太大，难以分散并悬浮在液体体系中；二、合成可降解纳米粒子材料不易被消费者接受；三、天然纳米粒子材料中：脂质由于其长链结构不能很好的包埋活性成分；蛋白质由于其较强的亲水性需要添加化学交联剂在蛋白和蛋白之间构建共价键来防止纳米粒子结构的崩解，化学交联剂大多有毒，残留有交联剂的蛋白纳米粒子的安全性大大降低。
发明内容
本发明的目的是提供了一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法，由于芦丁不溶于水，本发明采用反溶剂法，利用玉米醇溶蛋白和芦丁在乙醇与水中的溶解度差异制备芦丁—玉米醇溶蛋白纳米粒子，并对其粒径大小、颗粒形貌、带电性以及复合纳米粒子的抗氧化性等进行了分析，为芦丁—玉米醇溶蛋白综合利用开拓新的思路。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子，所述复合纳米粒子以芦丁为抗氧化剂，玉米醇溶蛋白为载体，酪蛋白酸钠为稳定剂，所述芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比为0.05～0.2:1，所述玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量比为1:0.5～1:1.25。
进一步的：所述复合纳米粒子粒径分布在245nm-255nm之间，PDI在0.09-0.14之间均小于0.3，电位在-21—-28m V之间。
进一步的：所述纳米粒子中芦丁在水中的释放曲线分为两个阶段：在第一阶段的3h内，芦丁释放量迅速增加到10-23％；在第二阶3-12h里，芦丁的释放比例相对缓慢提高到23-40％。
本发明还提供了所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，它包括以下步骤：
(1)将芦丁、玉米醇溶蛋白溶于乙醇-水溶液；
(2)向步骤(1)中混合溶液加入酪蛋白酸钠溶液；
(3)将步骤(2)的混合液旋转蒸发，经离心除去不溶物，之后冷冻干燥，得到粉状物为所述芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子。
进一步的：所述步骤(1)中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为60％～90％。
进一步的：所述步骤(2)中酪蛋白酸钠溶液的质量比浓度为1％～2.5％。
进一步的：所述步骤(3)中混合液在45℃下旋转蒸发10min。
进一步的：所述步骤(3)中经4000rpm离心10min；冷冻干燥24h。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明以芦丁为抗氧化剂，玉米醇溶蛋白为载体，酪蛋白酸钠为稳定剂，利用反溶剂法制备芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合(CN-ZR)纳米粒子。采用激光粒度仪、傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)等仪器对芦丁纳米玉米醇溶蛋白颗粒表征结构进行分析，并对其得率，包埋率、缓释率以及抗氧化性进行了测定。结果表明，玉米醇溶蛋白纳米粒子对芦丁有良好的包埋效果，且具有较小的粒径，在溶液中分布均匀；SEM图片显示，CN-ZR纳米粒子呈球形，颗粒大小分布均匀；傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)分析表明该纳米粒子分子内部羟基作用有所增加；且制备的纳米粒子具有一定的缓释比例和较强的抗氧化性。
附图说明
图1是芦丁标准曲线。
图2是纳米粒子的扫描电镜图片；其中，A和B：玉米醇溶蛋白纳米粒子；C和D：酪蛋白酸钠-玉米醇溶蛋白纳米粒子(二者质量比1:l)；E和F：含有芦丁的酪蛋白酸钠-玉米醇溶蛋白纳米粒子(酪蛋白酸钠与玉米醇溶蛋白质量比为1:l，芦丁与玉米醇溶蛋白质量比0.1:1。
图3为纳米粒子的红外光谱图；其中A：芦丁；B：酪蛋白酸钠-玉米醇溶蛋白纳米粒子；C-F：载有芦丁的酪蛋白酸钠-玉米醇溶蛋白纳米粒子(芦丁与玉米醇溶蛋白质量比分别为C：0.05:1；D：0.1:1，E：0.15:1，F：0.2:1。
图4是芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合(CN-ZR)纳米粒子中芦丁的累积释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。
本发明所用的材料和仪器如下：
1、材料
乙醇、硫酸：莱阳市康德化工有限公司；DPPH、ABTS：美国Sigma-Aldrich公司；磷酸钾、K2S2O8、钼酸铵：天津巴斯夫化工有限公司；所有的试剂均为分析纯。
玉米醇溶蛋白(zein)：食品级，上海瑞勇生物科技有限公司；酪蛋白酸钠(NaCas)：食品级，上海毕得医药科技有限公司；芦丁：食品级，国药集团化学试剂有限公司。
2、实验仪器
AR224CN电子天平：奥豪斯仪器(上海)有限公司；N-1100旋转蒸发器：上海爱朗仪器有限公司；TU-1810DASPC紫外分光光度计：北京普析通用有限公司；CR-400色彩色差计：日本柯尼卡美能达公司；IS10型傅里叶红外变换光谱分析仪：美国Nicolet公司；FD8–3a冻干机：美国SIM；79-1磁力加热搅拌器：上海双捷实验设备有限公司；DD5M低速大容量离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；Nano-ZS电位及纳米粒径仪：英国Malvern公司。实验室常规玻璃仪器若干。
3、数据处理
所有样品至少平行测试三次，取平均值。使用SPSS17.0软件分析实验数据，并表示为平均值±标准差。在95％的显著水平(p＜0.05)范围内分析显著性。
实施例1
一、芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子(CN-ZR纳米粒子)的制备及得率、粒径、Z-电位、PDI与包埋率特性
1、CN-ZR纳米粒子的制备方法
采用反溶剂法制备CN-ZR纳米粒子，步骤如下：
(1)将0.1g芦丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇-水溶液，乙醇-水溶液中乙醇的体积比浓度为60％～90％。
(2)然后向步骤(1)的混合液中快速加入50mL酪蛋白酸钠溶液。酪蛋白酸钠溶液的质量比浓度为1％-2.5％。
(3)将步骤(2)得到的混合液在45℃下旋转蒸发10min，经4000rpm离心10min除去少量不溶物，之后冷冻干燥24h。得到的冻干粉状样品储藏于4℃下待测。
2、得率
溶液经过冷冻干燥后得到粉末状纳米粒子样品称重后用于计算得率。
式中：
m1：是制备中加入样品的质量(g)；
m2：冷冻干燥后收集的样品质量(g)。
3、纳米粒子粒径的测定
用动态光散射测定纳米粒子在溶液状态下的粒径。首先取冻干后的样品，配制质量比0.1～0.5％的溶液并在室温下超声处理5min，用移液枪取1mL溶液，沿比色皿边缘一角缓缓注入后，放入测试台中测试，每个样品分别测试三次，取平均值。
4、纳米粒子Z-电位与PDI的测定
用动态光散射测定纳米粒子在溶液状态下的表面zeta电位。取冻干后的样品，配制质量比0.1～0.5％的溶液并在室温下超声处理5min后，用移液枪取适量溶液，从比色皿一孔迅速注入，放入测试台中测试，每个样品分别测试三次，取平均值。
5、包埋率
由于CN-ZR纳米粒子不溶于无水乙醇，冻干后的样品中游离的芦丁由无水乙醇萃取后测定。准确称取冻干后样品10mg，加入1mL无水乙醇，充分震荡并在10000rpm下离心5min，取出上清。反复三次后将萃取液通过紫外分光光度计法，在芦丁特征吸收峰—波长510nm下测定吸光值，并按照图1的芦丁标准曲线计算得到游离芦丁含量，包埋率＝(加入的芦丁总量-游离芦丁的量)/芦丁总量*100％。
二、复合纳米粒子中酪蛋白酸钠浓度的影响
将1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的80％的乙醇-水溶液，快速加入50mL质量比为0％、1％、1.5％、2％和2.5％的酪蛋白酸钠溶液。将此混合液在45℃下旋转蒸发10min，经4000rpm离心10min除去少量不溶物，之后冷冻干燥24h。得到的冻干粉状样品储藏于4℃下待测。实验结果如表1所示。
将0.1g芦丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL的80％的乙醇-水溶液，快速加入50mL质量比为0％、1％、1.5％、2％和2.5％的酪蛋白酸钠溶液。将此混合液在45℃下旋转蒸发10min，经4000rpm离心10min除去少量不溶物，之后冷冻干燥24h。得到的冻干粉状样品储藏于4℃下待测。实验结果如表1所示。
表1不同浓度的酪蛋白酸钠对纳米粒子的形成及芦丁包埋的影响
同列相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
复溶能力是纳米粒子一项关键性质，在生产、储藏、运输及使用过程中十分重要。未添加NaCas的纳米粒子在冻干后无法复溶。当NaCas溶液浓度为1％时，复溶后的纳米粒子悬浮在溶液中，没有可见的沉淀物且溶液呈现玉米醇溶蛋白的淡黄色。但随着浓度的增加，由于更多的NaCas吸附在zein纳米粒子表面，会逐渐呈现出NaCas的乳白色。
从表1可知，未添加芦丁时，随着NaCas浓度从0％增加到2％，纳米粒子的粒径从285nm下降到252nm，粒径下降明显，有显著性不同(P<0.05)，PDI稳定在0.14-0.17之间，电位稳定在－23mV与－26mV之间，得率从51.23％增加到77.28％。这个结果说明NaCas作为稳定剂，由于其静电稳定作用以及空间位阻作用，在混合液中与玉米醇溶蛋白分子有一定的相互作用，随着NaCas浓度的增加，在反溶剂混合、旋转蒸发以及离心过程中能够减少沉淀的生成，并能抑制纳米粒子粒径的增大。但当NaCas浓度增加到2.5％时纳米粒子性质变化不大，粒径从252nm到248nm，电位－23mV到－25mV，PDI为0.11，得率从77.28％增大至78.75％，除电位有显著性变化，其他指标均无显著性差异(p<0.05)，是由于酪蛋白酸钠浓度继续增加时，酪蛋白酸钠本身带有负电荷，而酪蛋白酸钠与玉米醇溶蛋白之间相互作用接近饱和，因此其他指标变化不大，仅有电位出现显著性差异。曾有文献利用壳聚糖和羧甲基壳聚糖作为稳定剂，通过反溶剂制备玉米醇溶蛋白纳米粒子，复溶后粒径范围分别为211-811nm及205-732nm。与其相比本发明的复合纳米粒子的粒径较小，且在溶液中分散更均匀，从而说明NaCas在控制粒径方面比壳聚糖和羧甲基壳聚糖具有更明显的优势。
纳米粒子的包埋能力是其作为输送系统的一个重要指标。芦丁作为被包埋的活性成分添加到NaCas-zein纳米粒子中，其中芦丁与zein的质量比为0.1:1。由表1可以看出不同NaCas浓度的添加芦丁的复合纳米粒子的性质。粒径、PDI、电位及得率均表现出与未添加芦丁的复合纳米粒子相似的趋势，粒径从267nm下降到246nm，PDI稳定在0.09-0.16，电位维持在－23-－25mV之间。由表1可知，NaCas的浓度对包埋率也有明显的影响，当NaCas浓度从0％增加到2％时，复合纳米粒子对芦丁的包埋率从77.26％增加至88.11％。但当NaCas添加浓度继续增加到2.5％时，复合纳米粒子包埋率为89.52％，并无显著性差异(p<0.05)。因此接下来的实验NaCas添加浓度均为2％。
三、乙醇浓度的影响
将0.1g芦丁和1.0g玉米醇溶蛋白分别溶于20mL的60％、70％、80％和90％的乙醇-水溶液，快速加入50mL 2％的酪蛋白酸钠溶液。将此混合液在45℃下旋转蒸发10min，经4000rpm离心10min除去少量不溶物，之后冷冻干燥24h。得到的冻干粉状样品储藏于4℃下待测。实验结果如表2所示。
表2不同浓度的乙醇对纳米粒子的形成及芦丁包埋的影响
注：同列相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
从表2中可以看出无水乙醇体积分数对复合纳米粒子性质的影响。随着乙醇浓度的增加，复合纳米粒子的粒径逐渐减小，当乙醇浓度增加到80％时，粒径大小从264nm减小到248nm，是由于乙醇浓度越大玉米醇溶蛋白和芦丁溶解越充分，在混合体系中分散越均匀，从而形成纳米粒子的粒径也会相对减小。乙醇浓度从60％增加到80％时，电位稳定在－24mV到－25mV，PDI也相对稳定在0.11-0.12。但当乙醇浓度继续增加到90％时，粒径从248nm减小到245nm，变化不大，并无显著性差异(p<0.05)，PDI也无显著性差异(p<0.05)，仅有电位从-25变化到-28，略有增加并出现显著性差异(p<0.05)，是由于酪蛋白酸钠在高浓度乙醇中充分溶解，并附着在纳米粒子表面，使复合纳米粒子负电荷增加。
从表2中还可以看出，随着乙醇浓度的增加，得率和包埋率均呈现增大趋势，当乙醇浓度增大到80％时，得率从76.70％增大至84.25％，包埋率从80.78％增大至88.11％。是由于乙醇浓度增加使芦丁和玉米醇溶蛋白在混合体系中分散更加均匀，形成纳米粒子更加稳定，因此在反溶剂混合、旋转蒸发和离心过程中损失减少，因此得率增大。而芦丁溶解度增加也使得更多的芦丁和玉米醇溶蛋白—酪蛋白酸钠混合体系之间形成一定的相互作用，从而使包埋率增大。当乙醇浓度继续增加至90％时，得率变化不大，增大至86.61％，并无显著性差异(p<0.05)，但包埋率增加至91.56％，有显著性差异(p<0.05)。因此从粒径，电位，得率等综合考虑，接下来的实验乙醇浓度均为80％。
四、芦丁添加量的影响
分别将0g、0.05g、0.1、0.15和0.2g的芦丁和1.0g玉米醇溶蛋白溶于20mL80％的乙醇-水溶液中，快速加入50mL2％的酪蛋白酸钠溶液。样品分别标记为CN-ZR0、CN-ZR0.5、CN-ZR1、CN-ZR1.5和CN-ZR2。将此混合液在45℃下旋转蒸发10min，经4000rpm离心10min除去少量不溶物，之后冷冻干燥24h。得到的冻干粉状样品储藏于4℃下待测。实验结果如表3所示。
表3芦丁添加量对纳米粒子的形成及芦丁包埋的影响
注：相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
添加不同芦丁含量的纳米粒子CN-ZR0，CN-ZR0.5，CN-ZR1，CN-ZR1.5和CN-ZR2的特征如表3所示。几乎所有的复合纳米粒子均有较小的粒径大小、较均匀的分布和良好的静电稳定性：粒径分布在245nm-255nm之间，PDI在0.09-0.14之间均小于0.3，电位在-21—-28mV之间。如表3所示，CN-ZR0.5相对于CN-ZR0具有较小的粒径，这是由于小分子物质影响了大分子聚集过程中的结晶状态：芦丁分子和NaCas—zein纳米粒子之间具有一定的交联作用，类似大分子间的塑化剂。低添加量的芦丁能使zein纳米粒子的聚集结构更均一稳定，从而形成的复合纳米粒子的粒径相对减小。随着芦丁添加量的增加，CN-ZR纳米粒子的粒径大小从245nm增加到255nm，PDI稳定在0.09-0.14之间。
从表3可以看出在利用反溶剂法制备CN-ZR纳米粒子的过程中，芦丁和NaCas—zein纳米粒子之间发生疏水相互作用并参与了玉米醇溶蛋白纳米粒子的自组装过程中，不仅吸附在纳米粒子的表面，还有一部分的芦丁分子被玉米醇溶蛋白包裹在纳米粒子的内部。从表3可以得出随着芦丁添加量的增加，CN-ZR纳米粒子的得率在77.38-84.42％之间，这说明在通过反溶剂法制备CN-ZR纳米粒子的整个过程中大颗粒分子和沉淀的生成得到了有效的抑制。当芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比从0.05:1增加到0.2:1时，NaCas—zein纳米粒子对芦丁的包埋率从68.37增加至90.63％。而相比芦丁，玉米醇溶蛋白颗粒荷载氟尿嘧啶和芰皂素时包封率分别为6.9－68％和1.8－21％。玉米醇溶蛋白颗粒对维生素D3的包封率可达到52-88％，但仅限于维生素D3与玉米醇溶蛋白比为0.075时，远低于本发明中的荷载量。有文献采用喷雾干燥法制备了荷载百里香酚的玉米醇溶蛋白颗粒，其包封率不到30％。因此本发明中NaCas-zein纳米粒子成功的包埋了芦丁。
实施例2、CN-ZR纳米粒子的SEM扫描电镜、红外谱图、颜色、缓慢释放能力和抗氧化能力测定
一、纳米粒子的外观形态SEM
利用电子扫描显微镜来观察纳米颗粒的外观形态。首先配制质量比0.1～0.5％的纳米粒子溶液，室温下超声处理5min后，将金属箔放入溶液中浸染上后拿出放入载物台上，并迅速冻干以进行观察。结果如图2所示。由图2A、B可见，未添加酪蛋白酸钠和芦丁的玉米醇溶蛋白纳米粒子呈现均匀的球形，粒径均一(左右)，而添加了酪蛋白酸钠后，纳米粒子部分集聚，出现粒径较小的颗粒，粒径均值下降为直径253nm左右(如图2C和D所示)。再进一步添加芦丁后，颗粒聚集加剧，出现更小的粒子，而平均粒径进一步下降为左右(如图2E和F所示)。由前述可知，酪蛋白酸钠附着在玉米醇溶蛋白纳米粒子表面，包埋有芦丁，因而得到了一种带有负电荷，具有复溶能力和稳定性的新型球状纳米粒子。
二、纳米粒子FT-IR分析
纳米颗粒FT-IR的试验步骤如下：将溴化钾放入105℃烘箱中烘烤24h以彻底除去水分，然后按样品和溴化钾1：100(m/m)量压片测试扫描，扫描范围为400～4000cm-1。
实验结果如图3所示。图3中C-F为CN-ZR纳米粒子的红外谱图，在CN-ZR纳米粒子的红外谱图中，3423.73cm-1处的吸收峰应该是属于玉米醇溶蛋白纳米粒子-OH的伸缩振动；添加不同量的芦丁后，O-H…O的伸缩振动吸收峰有向低波移动的趋势，当芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比从0.05:1增加到0.2:1时，-OH伸缩振动吸收峰3442.78cm-1移动至3423.78cm-1，变化19cm-1。由此可知，CN-ZR纳米粒子与玉米淀粉之间存在着较为强烈的分子间氢键等相互作用，这些相互作用使混合组分中各组分之间具有良好的相容性。
三、纳米粒子表面颜色评价
采用色度计进行测量(CR400，大阪，日本)。仪器经自检及零点、白板校正后，将探头垂直的置于呈有CN-ZR纳米粒子的薄膜上进行测量，样品与探头之间不能有空隙，每个样品测定三次。其中，色彩参数范围从L＝0(黑色)至L＝100(白色)，-a(绿色)到+a(红)和-b(蓝色)到+b(黄色)。根据自动比较样板与样品之间的颜色差异计算总色差ΔE。
式中：
L0，Ls：分别为标准和样品的亮度值；
a0，as：分别为标准和样品的红绿值；
b0，bs：分别为标准和样品的黄蓝值。
表4及表5为酪蛋白酸钠添加量及芦丁添加量对纳米粒子颜色值的影响。
表4不同浓度的NaCas对复合纳米粒子颜色值的影响
注：相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
表5芦丁添加量对复合纳米粒子颜色值的影响
注：相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
表4所示的是NaCas浓度对复合纳米粒子的明度差(L*黑白)、色度差(a*红绿色和b*黄蓝色)和总色差(△E*)的影响。由表4可以看出未添加NaCas的zein纳米粒子的色度L*为88.90，色度最小。随着NaCas浓度增加至2.5％时，色度从88.90增加至91.62，说明NaCas的加入增加量复合纳米粒子的亮度。从表4可知，zein纳米粒子中加入NaCas，明显减小了复合粒子的b*值，从16.86减小至12.79，这说明复合粒子的颜色随着NaCas浓度的增加黄色逐渐变淡。而总色差△E*随着NaCas浓度增加至2.5％时，从17.50减小至13.45，有显著性差异(p<0.05)。这可能是由于NaCas浓度的增加使得更多的NaCas分子吸附在zein纳米粒子表面，遮盖了zein的黄色并逐渐呈现出NaCas的乳白色。不同浓度的NaCas对添加芦丁的zein纳米粒子的明度差(L*)、色度差(a*和b*)和总色差(△E*)的影响如表4所示，均表现出与未添加芦丁的zein纳米粒子相似的趋势。
而芦丁本身是一种淡黄色至草黄色粉末，添加量不同会对zein纳米粒子的明度差(L*)、色度差(a*和b*)和总色差(△E*)的产生一定的影响，如表5所示。当芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比从0.05:1增加到0.2:1时，复合纳米粒子的色度L*从90.30减小至83.88，b*值从13.27增加至17.54，总色差△E*从14.00增大至19.85。这可能是由于芦丁添加量的增加，本身呈现黄色的玉米醇溶蛋白纳米粒子的黄色加深，b*值增大，降低了复合纳米粒子的明度L*，总色差△E*也出现显著性差异(p<0.05)。
四、缓慢释放能力的测定
准确称取50mg各CN-ZR纳米粒子粉末样品，并溶于10mL蒸馏水中。将得到的CN-ZR纳米粒子溶液转移至透析袋(截留分子量8—14kDa)中，并将透析袋放入盛有90mL蒸馏水的烧杯中。在25℃下不断搅拌，使得透析袋内外液体能充分的交换。并在0，1，2，3，5，7，9和12小时各取出3mL溶液在510nm下测定吸光值，按图1中芦丁标准曲线计算芦丁含量，并绘制释放曲线。
CN-ZR纳米粒子中芦丁在水中的释放曲线如图4所示。释放曲线可分为两个阶段：初始快速释放阶段以及之后的缓慢释放阶段。在第一阶段的3h内，芦丁释放量迅速增加到10-23％。这可能由于是附着在复合纳米粒子表面的芦丁分子迅速释放到水中。在第二阶3-12h里，芦丁的释放比例相对缓慢提高到23-40％。在这个阶段是由于镶嵌在复合纳米粒子内部的芦丁分子缓慢迁移到表面并释放在水中。
随着芦丁添加量的增多，纳米粒子这在两个释放阶段的释放比例均有所增加。这是由于此时纳米粒子吸水导致纳米粒子表面吸附的部分芦丁迁移并释放后会在纳米粒子结构中出现一定的空隙和路径，使得镶嵌包埋在内部的芦丁有空隙和路径向外迁移并释放出来。从图4同时可以看到在芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比从0.05:1增加到0.2:1时，其之间的差异并不显著。这是由于芦丁添加量的增加导致纳米粒子的粒径变大，导致其与溶液的接触表面积变小。在大豆蛋白微球释放核黄素的研究中，1小时后核黄素释放率达到50％；在酪蛋白酸钠微球缓释研究中，在15min时释放比例已经达到90％，与其相比zein纳米粒子具有相对较强的缓释能力。这是因为zein比大豆蛋白和酪蛋白酸钠具有更强的疏水性，在中性的水溶液中不会发生吸水溶胀的现象，使得zein纳米粒子可以较长时间的保持稳定，且结构不会变得松散或崩塌。与zein纳米粒子包埋的其他活性成分，例如5-氟尿嘧啶相比，芦丁溶解度和亲水性低，因此释放芦丁的时间较为长久。
五、抗氧化能力的测定
(1)DPPH法
DPPH法用于测定DPPH自由基清除能力。DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的以氮为中心的自由基，其孤对电子于波长517nm附近有强吸收(显深紫色)。
准确称取10mg所述纳米粒子粉末样品，加入5mL蒸馏水并在室温下超声处理5min。配置40mg/L的DPPH乙醇溶液，避光搅拌。将1mL样品溶液与2mL DPPH溶液混合并震荡，常温避光储存30min，在517nm处测定吸光度值A1。同时将1mL蒸馏水与2mL DPPH溶液混合并震荡，常温避光储存30min，在517nm处测定吸光度值A0。所有测定均平行进行3次，最终结果取平均值。纳米粒子的自由基清除能力通过如下公式计算：
式中：
A0：蒸馏水与DPPH混合后的吸光度值；
A1：样品与DPPH混合后的吸光度。
(2)ABTS法
ABTS法用于测定ABTS自由基的清除能力。准确称取8mg所述纳米粒子粉末样品，加入10mL蒸馏水并在室温下超声处理5min。ABTS自由基是由7mmol/L ABTS和2.45mmol/L过硫酸钾混合反应生成，在室温、避光条件下静置12h。使用前，用乙醇稀释该溶液，使其在734nm处吸光值为0.700±0.025。清除自由基的活性测定是通过0.2mL的样品溶液与1mLABTS微量工作液混合。准确测量6min后吸光值的减少量。所有测定均平行进行3次，最终结果取平均值。ABTS清除率的计算公式如下
式中：
A0：对照的吸光度；
A1：样品的吸光度。
(3)磷钼法测定样品的总抗氧化活性。
准确称取8mg所述纳米粒子粉末样品，加入10mL蒸馏水并在室温下超声处理5min。磷钼试剂是0.6mol/L的硫酸，28mmol/L磷酸钠，和4mM钼酸铵的混合液。取0.1mL的样品溶液加入1mL磷钼试剂，混匀，混合液于95℃水浴条件下保持90min。冷却至室温，在695nm下测定吸光度值。所有测定均平行进行3次，最终结果取平均值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明将氧化能力越强。实验结果如表6所示。
表6纳米粒子的抗氧化能力
注：同列相同字母表示在p<0.05水平上差异不显著
CN-ZR纳米粒子的抗氧化能力通过DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力和总抗氧化能力表示，见表6。DPPH是一种显色且稳定的自由基，常用于测定样品清除自由基的能力。CN-ZR0的DPPH清除率、ABTS自由基清除率和总抗氧化能力分别为22.29％，24.27％，0.256，这主要是因为玉米醇溶蛋白分子本身具有一定的抗氧化能力。随着芦丁添加量的增加，DPPH清除率、ABTS自由基清除率和总抗氧化能力分别提高到52.77％，71.17％，0.404。由此可以看出，包埋后的芦丁仍具有一定的抗氧化性，是由于附着在纳米粒子表面的芦丁或是镶嵌在纳米粒子内部的芦丁分子缓慢迁移到表面表现出的抗氧化性。由于CN-ZR纳米粒子中的芦丁会缓慢迁移至纳米粒子表面，因此CN-ZR纳米粒子具有长效的抗氧化能力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子，其特征在于：所述复合纳米粒子以芦丁为抗氧化剂，玉米醇溶蛋白为载体，酪蛋白酸钠为稳定剂，所述芦丁与玉米醇溶蛋白的质量比为0.05～0.2:1，所述玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量比为1:0.5～1:1.25。
2.根据权利要求1所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子，其特征在于：所述复合纳米粒子粒径分布在245nm-255nm之间，PDI在0.09-0.14之间均小于0.3，电位在-21—-28m V之间。
3.根据权利要求1所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子中芦丁在水中的释放曲线分为两个阶段：在第一阶段的3h 内，芦丁释放量迅速增加到 10-23%；在第二阶3-12h 里，芦丁的释放比例相对缓慢提高到23-40%。
4.权利要求1所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）将芦丁、玉米醇溶蛋白溶于乙醇-水溶液；
（2）向步骤（1）中混合溶液加入酪蛋白酸钠溶液；
（3）将步骤（2）的混合液旋转蒸发，经离心除去不溶物，之后冷冻干燥，得到粉状物为所述芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为60%～90%。
6.根据权利要求4所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中酪蛋白酸钠溶液的质量比浓度为1%～2.5%。
7.根据权利要求4所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中混合液在 45℃下旋转蒸发 10min。
8.根据权利要求4所述的芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中经4000rpm 离心 10min；冷冻干燥 24h。
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