CN111000112A - 纳他霉素组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纳他霉素组合物，其制备方法包括以下步骤：步骤一、称取2～5重量份的纳他霉素与20～30重量份的玉米醇溶蛋白，制得纳他霉素‑醇溶蛋白的分散体系；步骤二、称取0.5～1重量份的β‑环糊精，制备置换后的环糊精凝胶体；步骤三、将置换后得环糊精凝胶体加入至纳他霉素‑醇溶蛋白的分散体系中，制得纳他霉素组合物。本发明将纳他霉素与玉米醇溶蛋白结合，并用环糊精进一步包覆，解决了纳他霉素的水溶性差和光稳定性差的现有技术问题，进而达到提高纳他霉素的利用率和抑制活性的目的。
Description
技术领域
本发明涉及食品防腐剂技术领域。更具体地说，本发明涉及一种纳他霉素组合物及其应用。
背景技术
黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种常见的曲霉属真菌，主要污染粮食，坚果，奶制品和食用油等，黄曲霉污染可以通过食物链对家畜、动物和人类健康造成极大的潜在危害，造成了巨大的经济损失。黄曲霉毒素是黄曲霉寄生曲霉产生的次级代谢产物，目前，已经分离鉴定出十几种黄曲霉素，最常见的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15ug/kg。
表1中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量
因此，寻找一种能够高效抑制黄曲霉生长和毒素产生的安全、无毒的天然活性物质，用于防控食品受到黄曲霉及黄曲霉毒素的污染，提升食品安全水平，具有十分重要的经济价值和社会意义。
纳他霉素：英文名，Natamycin，是一种无臭无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂，是由纳他链霉菌受控发酵制得一种白色至乳白色的结晶粉末，通常以烯醇式结构存在。
分子结构：多烯烃大环内酯，四烯系统是全顺式，内酯环上C3～C9部位是半缩醛结构，含有一个糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖。
分子式为：C33H47NO13，分子量：665.73，结构式如下所示:
纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌、霉菌、丝状真菌抑制剂,纳他霉素能够高效抑制黄曲霉的生长，可用于食品表面的防腐技术；现有技术中纳他霉素由于其水溶性差、光稳定性差的缺陷，存在利用率较低的问题，极大地限制了其在食品保鲜技术中的应用空间。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种纳他霉素组合物及其应用，其通过将纳他霉素与玉米醇溶蛋白结合，并用环糊精进一步包覆，解决了纳他霉素的水溶性差和光稳定性差的现有技术问题。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种纳他霉素组合物，其制备方法包括以下步骤：
步骤一、按重量份数计，将2～5重量份的纳他霉素溶解于10～20重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液；在搅拌下向纳他霉素溶液中加入20～30重量份的玉米醇溶蛋白，充分搅拌20～30min后，得混合液一，将混合液一逐滴加入30～40重量份的去离子水中，待混合液一加入完成后，持续搅拌50～80min后，得纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系；
步骤二、将0.5～1重量份的β-环糊精、0.5～1重量份的环氧丙烷依次加入8～10重量份的质量分数为40％的氢氧化钠水溶液中，充分搅拌30～40min后置于38～42℃下静置，得凝胶体；将凝胶体置于80～100重量份的去离子水中浸泡48h，期间每隔12h更换一次去离子水；随后将凝胶体从去离子水中取出并置于40～50重量份的乙酸溶液中浸泡3天后取出得置换后的凝胶体，乙酸溶液浸泡期间每隔10h更换一次乙酸溶液；
步骤三、将步骤二得到的置换后的凝胶体加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，充分搅拌60～70min后得混合物一；向混合物一中加入1～3重量份的植物提取液，充分搅拌30～40min后得混合物二，将混合物二置于旋转蒸发仪中，在100℃水浴下处理20～30min后取出混合物二并喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物。
优选的是，所述的纳他霉素组合物，所述步骤三中的植物提取液包括重量比为1:1:1:2的洋葱提取液、花椰菜提取液以及柠檬皮提取液。
优选的是，所述的纳他霉素组合物，步骤一中的玉米醇溶蛋白经过了预处理，具体为：
步骤S1、将玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70～80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90～110g/L的玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，向玉米醇溶蛋白的乙醇溶液中加入超氧化物歧化酶，使得溶液中超氧化歧化酶的质量浓度为50～70g/L，得混合液二；随后在常温下搅拌混合液二，30～45min后向混合液二中加入等体积的质量浓度为0.5～2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，得到初步改性玉米醇溶蛋白粉；
步骤S2、将初步改性玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70～80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90～110g/L的初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液，向初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的质量浓度为50～70g/L，得混合液三；随后在常温下搅拌混合液三，30～45min后向混合液三中加入等体积的质量浓度为0.5～2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，即得。
优选的是，所述的纳他霉素组合物，所用乙酸溶液的摩尔浓度均为0.05～0.2mol/L，且均为食品级乙酸溶液。
优选的是，所述的纳他霉素组合物，所述步骤三中的喷雾干燥条件为：进风温度为120～140℃，出风温度为80～90℃。
优选的是，所述的纳他霉素组合物，步骤一中混合液一逐滴加入20～30重量份的去离子水中时的加入速度为0.2mL/s，加入过程中保持200rpm的转速对去离子水进行搅拌。
本发明还提供一种所述的纳他霉素组合物在抑制食物中黄曲霉生长中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明将纳他霉素与玉米醇溶蛋白结合，并用环糊精进一步包覆，解决了纳他霉素的水溶性差和光稳定性差的现有技术问题，纳他霉素与环糊精直接进行包埋之前需要将纳他霉素溶于强碱溶液中，强碱溶液极易破坏纳他霉素原本的结构，导致抑菌效果降低，纳他霉素的利用率大大降低，且环糊精对纳他霉素的包埋率较低，水溶性强的环糊精不具备改善纳他霉素光稳定性差的功能；
基于上述分析，本发明首先将纳他霉素与玉米醇溶蛋白结合，玉米醇溶蛋白具有较强的疏水性，利用反溶剂法，玉米醇溶蛋白、纳他霉素均在乙酸和水中的溶解度差异较大，当将溶解有纳他霉素和玉米醇溶蛋白的乙酸溶液逐滴加入至去离子水中时，玉米醇溶蛋白和纳他霉素均会慢慢析出，且玉米醇溶蛋白的析出速度快于纳他霉素的析出速度，在玉米醇溶蛋白析出并形成纳米微球的过程中，纳他霉素在不停的析出并被包埋于玉米醇溶蛋白的纳米微球中，进而制的分散均匀的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系，相较于现有技术中通过加入表面活性剂等其他增效剂提高纳他霉素的分散性，本发明中采用的玉米醇溶蛋白分散介质具有分散体系分散地更加均匀，且更加稳定；
2、进一步地玉米醇溶蛋白可改善纳他霉素的光稳定性差的缺陷，具有为：纳他霉素的大环结构包埋于玉米醇溶蛋白的疏水空腔区，有效防止纳他霉素在紫外光下发生降解，玉米醇溶蛋白中包含具有芳香环或双键结构的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等，以上基团可吸收紫外光从而保护纳他霉素不被降解；
3、再次玉米醇溶蛋白本身也是一种疏水性较差的物质，在将纳他霉素组合物应用于食物表面上时，仍然存在组合物水溶性差的问题，因此本发明在纳他霉素-醇溶蛋白复合物的表面再次进行环糊精的包埋，环糊精具有较好的水溶性，进而达到在保证纳他霉素性能稳定的同时，还能够解决水溶性差的问题，大大提高纳他霉素组合物的水溶性，提高纳他霉素有效物的利用率；
4、对玉米醇溶蛋白进行预处理，超氧化物歧化酶是一种生物抗氧化剂，可提高纳他霉素组合物的抗氧化性能，进一步提高纳他霉素有效物质的活性和稳定性，进而提高纳他霉素有效物质的利用率；在初步改性玉米醇溶蛋白粉进一步用三元酸柠檬酸进行改性，柠檬酸于玉米醇溶蛋白部分交联，将超氧化物歧化酶稳固在玉米醇溶蛋白上，在后续使用过程中，超氧化物歧化酶逐渐缓释，起到对纳他霉素有效物保护的作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物对黄曲霉生长的影响；
图2为本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物对黄曲霉分生孢子萌发的抑制效果；
图3为本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物对黄曲霉毒素B1的抑制效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
<实施例1>
本发明提供一种纳他霉素组合物，其制备方法包括以下步骤：
步骤一、按重量份数计，将2重量份的纳他霉素溶解于10重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液；在搅拌下向纳他霉素溶液中加入20重量份的玉米醇溶蛋白，充分搅拌20min后，得混合液一，将混合液一逐滴加入30重量份的去离子水中，加入速度为0.2mL/s，加入过程中保持200rpm的转速对去离子水进行搅拌；待混合液一加入完成后，持续搅拌50min后，得纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系；
其中，玉米醇溶蛋白经过了预处理，具体为：
步骤S1、将玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90g/L的玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，向玉米醇溶蛋白的乙醇溶液中加入超氧化物歧化酶，使得溶液中超氧化歧化酶的质量浓度为50g/L，得混合液二；随后在常温下搅拌混合液二，30min后向混合液二中加入等体积的质量浓度为0.5％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，得到初步改性玉米醇溶蛋白粉；
步骤S2、将初步改性玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90g/L的初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液，向初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的质量浓度为50g/L，得混合液三；随后在常温下搅拌混合液三，30min后向混合液三中加入等体积的质量浓度为0.5％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，即得；
步骤二、将0.5重量份的β-环糊精、0.5重量份的环氧丙烷依次加入8重量份的质量分数为40％的氢氧化钠水溶液中，充分搅拌30min后置于38℃下静置，得凝胶体；将凝胶体置于80重量份的去离子水中浸泡48h，期间每隔12h更换一次去离子水；随后将凝胶体从去离子水中取出并置于40重量份的乙酸溶液中浸泡3天后取出得置换后的凝胶体，乙酸溶液浸泡期间每隔10h更换一次乙酸溶液；
步骤三、将步骤二得到的置换后的凝胶体加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，充分搅拌60min后得混合物一；向混合物一中加入1重量份的植物提取液，充分搅拌30min后得混合物二，将混合物二置于旋转蒸发仪中，在100℃水浴下处理20min后取出混合物二并喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物；植物提取液包括重量比为1:1:1:2的洋葱提取液、花椰菜提取液以及柠檬皮提取液；喷雾干燥条件为：进风温度为120℃，出风温度为80℃；
以上所用乙酸溶液的摩尔浓度均为0.05mol/L，且均为食品级乙酸溶液。
将以上制备得到的纳他霉素组合物用于抑制食物中黄曲霉生长，将纳他霉素组合物加水溶解，并喷洒于食物表面。
<实施例2>
本发明提供一种纳他霉素组合物，其制备方法包括以下步骤：
步骤一、按重量份数计，将5重量份的纳他霉素溶解于20重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液；在搅拌下向纳他霉素溶液中加入30重量份的玉米醇溶蛋白，充分搅拌30min后，得混合液一，将混合液一逐滴加入40重量份的去离子水中，加入速度为0.2mL/s，加入过程中保持200rpm的转速对去离子水进行搅拌；待混合液一加入完成后，持续搅拌80min后，得纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系；
其中，玉米醇溶蛋白经过了预处理，具体为：
步骤S1、将玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为110g/L的玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，向玉米醇溶蛋白的乙醇溶液中加入超氧化物歧化酶，使得溶液中超氧化歧化酶的质量浓度为70g/L，得混合液二；随后在常温下搅拌混合液二，45min后向混合液二中加入等体积的质量浓度为2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，得到初步改性玉米醇溶蛋白粉；
步骤S2、将初步改性玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为110g/L的初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液，向初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的质量浓度为70g/L，得混合液三；随后在常温下搅拌混合液三，45min后向混合液三中加入等体积的质量浓度为2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，即得；
步骤二、将1重量份的β-环糊精、1重量份的环氧丙烷依次加入10重量份的质量分数为40％的氢氧化钠水溶液中，充分搅拌40min后置于42℃下静置，得凝胶体；将凝胶体置于100重量份的去离子水中浸泡48h，期间每隔12h更换一次去离子水；随后将凝胶体从去离子水中取出并置于50重量份的乙酸溶液中浸泡3天后取出得置换后的凝胶体，乙酸溶液浸泡期间每隔10h更换一次乙酸溶液；
步骤三、将步骤二得到的置换后的凝胶体加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，充分搅拌70min后得混合物一；向混合物一中加入3重量份的植物提取液，充分搅拌40min后得混合物二，将混合物二置于旋转蒸发仪中，在100℃水浴下处理30min后取出混合物二并喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物；植物提取液包括重量比为1:1:1:2的洋葱提取液、花椰菜提取液以及柠檬皮提取液；喷雾干燥条件为：进风温度为140℃，出风温度为90℃；
以上所用乙酸溶液的摩尔浓度均为0.2mol/L，且均为食品级乙酸溶液。
将以上制备得到的纳他霉素组合物用于抑制食物中黄曲霉生长，将纳他霉素组合物加水溶解，并喷洒于食物表面。
<实施例3>
本发明提供一种纳他霉素组合物，其制备方法包括以下步骤：
步骤一、按重量份数计，将4重量份的纳他霉素溶解于15重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液；在搅拌下向纳他霉素溶液中加入25重量份的玉米醇溶蛋白，充分搅拌25min后，得混合液一，将混合液一逐滴加入35重量份的去离子水中，加入速度为0.2mL/s，加入过程中保持200rpm的转速对去离子水进行搅拌；待混合液一加入完成后，持续搅拌65min后，得纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系；
其中，玉米醇溶蛋白经过了预处理，具体为：
步骤S1、将玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为75％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为100g/L的玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，向玉米醇溶蛋白的乙醇溶液中加入超氧化物歧化酶，使得溶液中超氧化歧化酶的质量浓度为60g/L，得混合液二；随后在常温下搅拌混合液二，38min后向混合液二中加入等体积的质量浓度为1.3％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，得到初步改性玉米醇溶蛋白粉；
步骤S2、将初步改性玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为75％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为100g/L的初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液，向初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的质量浓度为60g/L，得混合液三；随后在常温下搅拌混合液三，38min后向混合液三中加入等体积的质量浓度为1.3％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，即得；
步骤二、将0.8重量份的β-环糊精、0.8重量份的环氧丙烷依次加入9重量份的质量分数为40％的氢氧化钠水溶液中，充分搅拌35min后置于40℃下静置，得凝胶体；将凝胶体置于90重量份的去离子水中浸泡48h，期间每隔12h更换一次去离子水；随后将凝胶体从去离子水中取出并置于45重量份的乙酸溶液中浸泡3天后取出得置换后的凝胶体，乙酸溶液浸泡期间每隔10h更换一次乙酸溶液；
步骤三、将步骤二得到的置换后的凝胶体加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，充分搅拌65min后得混合物一；向混合物一中加入2重量份的植物提取液，充分搅拌35min后得混合物二，将混合物二置于旋转蒸发仪中，在100℃水浴下处理25min后取出混合物二并喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物；植物提取液包括重量比为1:1:1:2的洋葱提取液、花椰菜提取液以及柠檬皮提取液；喷雾干燥条件为：进风温度为130℃，出风温度为85℃；
以上所用乙酸溶液的摩尔浓度均为0.13mol/L，且均为食品级乙酸溶液。
将以上制备得到的纳他霉素组合物用于抑制食物中黄曲霉生长，将纳他霉素组合物加水溶解，并喷洒于食物表面。
<实施例4>
一种纳他霉素组合物，其制备方法与实施例3的不同在于，步骤一中按重量份数计，将4重量份的纳他霉素溶解于15重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液，将纳他霉素溶液逐滴加入35重量份的去离子水中，得纳他霉素的分散体系；其余条件和参数同实施例3。
<实施例5>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，玉米醇溶蛋白未经过预处理；其余条件和参数同实施例3。
<实施例6>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，不经过步骤二，将0.8重量份的β-环糊精直接加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，其余条件和参数同实施例3。
<实施例7>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，步骤三中，混合物一中不加入植物提取液；其余条件和参数同实施例3。
<实施例8>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，将步骤一中的乙酸溶液更换为体积分数为75％的乙醇水溶液；其余条件和参数同实施例3。
<实施例9>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，玉米醇溶蛋白在预处理过程中，不经过步骤S1；其余条件和参数同实施例3。
<实施例10>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，玉米醇溶蛋白在预处理过程中，不经过步骤S2；其余条件和参数同实施例3。
<实施例11>
一种纳他霉素组合物，其制备方法，与实施例3的不同在于，将步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系直接进行喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物；其余条件和参数同实施例3。
<试验例1>
对本发明实施例1～11制备得到的纳他霉素组合物的性能进行测试：
的粒径和对纳他霉素的包埋率进行检测，检测结果如表2所示：
包埋率检测：称取两份10mg纳他霉素组合物，向其中一份纳他霉素组合物中加入5mL乙酸乙酯置于离心机上离心处理，10min后取离心上清液，并在真空泵下抽干乙酸乙酯，再用10mL乙醇复溶得到纳他霉素的乙醇溶液，利用紫外分析方法，计算得到纳他霉素的乙醇溶液中的纳他霉素的质量，即为未被包埋的纳他霉素的质量V1；向另外一份纳他霉素组合物种加入10mL乙醇使其溶解，并测试其中纳他霉素的质量V2；纳他霉素的包埋率(％)＝(V2-V1)/V2*100％；测试结果如表2所示。
水中饱和溶解度测试：利用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，取50mg(过量)的本发明制备得到纳他霉素组合物加入2mL水混合，并离心取上清液，利用HPLC测量其峰面积，根据峰面积及预制的纳他霉素标准曲线获得样品中纳他霉素含量。同样条件下以本发明中所用的初始纳他霉素粉末在水中溶解度为对照。溶解度的测试结果如表2所示。
纳他霉素标准曲线的预制过程：精确至0.0001g，分别称取不同量的纳他霉素标准品，向纳他霉素标准品中加入5.0mL的四氢呋喃，超声震荡处理10min，随后加入60mL甲醇，旋转至纳他霉素标准品溶解，然后加入25mL蒸馏水，混匀后加入至100mL容量瓶中，并加入蒸馏水定容至刻度，上下颠倒混匀，制的不同浓度的纳他霉素标准溶液，通过0.45μm的膜过滤器过滤，取滤液并经HPLC测试，记录HPLC测定峰面积值。以上不同量纳他霉素标准品的质量分别为0.015g、0.030g、0.045g、0.060g和0.075g，以纳他霉素标准液中纳他霉素的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备得到纳他霉素标准曲线；
以上HPLC测试的色谱条件：
色谱柱：选用内部填充十八烷基硅胶、尺寸为25cm×4.6mm(内径)的色谱柱，柱温为室温(25～30℃)；
流动相：取乙酸铵3.0g、氯化铵1.0g，一并加入至760ml蒸馏水中，充分混匀，随后向其中加入5.0mL四氢呋喃和240mL乙腈，再次混匀后用0.45μm的膜过滤器过滤；流动相流速为1mL/min；
进样量为20μL。
表2性能测试结果
| 项目 | 包埋率(％) | 饱和溶解度(g/L) |
| 实施例1 | 97.8 | 12.34 |
| 实施例2 | 98.1 | 12.29 |
| 实施例3 | 98.4 | 12.35 |
| 实施例4 | 64.2 | 4.12 |
| 实施例5 | 73.8 | 7.09 |
| 实施例6 | 62.1 | 6.32 |
| 实施例7 | 78.2 | 7.89 |
| 实施例8 | 68.1 | 5.13 |
| 实施例9 | 78.9 | 8.81 |
| 实施例10 | 79.3 | 8.57 |
| 实施例11 | 45.6 | 2.56 |
| 对照组 | -- | 0.031 |
由表2可知，实施例1～3制备得到的纳他霉素组合物具有良好的水溶性，且纳他霉素的包埋率较高，可将纳他霉素保护起来，免受光、氧化剂的破坏，将纳他霉素组合与玉米醇溶蛋白结合能够大大改善纳他霉素的光稳定性、玉米醇溶蛋白进行二次预处理、环糊精经过气凝胶技术处理、植物提取液的加入、纳他霉素粉末用乙酸溶解以及在纳他霉素-醇溶蛋白分散体系外部包裹环糊精(实施例4～11)，均有利于提高纳他霉素有效物质的稳定性。
最小抑菌浓度的测定：将黑曲霉、黄曲霉和青霉素用蒸馏水分别制备成106cfu/mL的菌悬液，取本发明制备得到的纳他霉素组合物用蒸馏水配制成不同浓度(12、15、18、21、24、30ppm)的纳他霉素组合物的水溶液，分别取1mL纳他霉素钠组合物的水溶液加入15mL马铃薯培养基中，形成浓度梯度平板，每个平板涂布0.2mL菌悬液(黑曲霉、黄曲霉及青霉素)，放于28±2℃的霉菌培养箱中培养72h，观察结果，同时设空白对照(纳他霉素标准品)。记录霉菌完全被抑制的最小浓度为最小抑菌浓度(MIC)(ppm)，结果如表3所示；
其中，马铃薯培养基的制备方法：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，加去离子水补足1L，取20ml培养液加入50ml离心管中，121℃，灭菌30min。
表3最小抑菌浓度的测定结果
由表3可知，本发明实施例1～3制备得到的纳他霉素组合物具有较低的抑菌浓度，相较于实施例4～11，降低了纳他霉素的使用量，大大提升了纳特霉素有效物质的利用率。将纳他霉素组合与玉米醇溶蛋白结合能够大大改善纳他霉素的光稳定性、玉米醇溶蛋白进行二次预处理、环糊精经过气凝胶技术处理、植物提取液的加入、纳他霉素粉末用乙酸溶解以及在纳他霉素-醇溶蛋白分散体系外部包裹环糊精(实施例4～11)，均有利于提高纳他霉素有效物质的抑制活性。
光稳定性测试：称取纳他霉素组合物配制成一定浓度的水溶液，放置在紫外光照强度20w，每隔15min测定纳他霉素组合物的水溶液中的纳他霉素的相对含量，取本发明实施例1～10中所用的初始纳他霉素作为对照组；测试结果如表4所示；
纳他霉素的相对含量(％)＝A303(纳他霉素测定值)/A303(纳他霉素初始值)*100％；
表4光稳定性测试结果
由表4可知，将纳他霉素组合与玉米醇溶蛋白结合能够大大改善纳他霉素的光稳定性(实施例4与实施例1～3的数据比较)；玉米醇溶蛋白进行二次预处理、环糊精经过气凝胶技术处理、植物提取液的加入、纳他霉素粉末用乙酸溶解以及在纳他霉素-醇溶蛋白分散体系外部包裹环糊精，均可大大提高纳他霉素的光稳定性(实施例5～11与实施例1～4的数据比较)。
<试验例2>
本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物抑制黄曲霉生长效果的测定：
PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，加去离子水补足1L，取20ml培养液加入50ml离心管中，121℃，灭菌30min；
纳他霉素溶液配制：取100mg纳他霉素组合物溶于20ml甲醇溶液中，配置成5mg/ml溶液，然后用甲醇溶液稀释到2.5mg/ml，4℃放置备用；
YES培养基：酵母提取物(2g/L)、蔗糖(15g/L)、MgSO4·7H2O(0.5g/L)，加去离子水补足1L，121℃高压灭菌20min。
菌种活化：把黄曲霉接种于PDA培养基上，37℃下生长7天，4℃储藏。
黄曲霉孢子液制备：用无菌牙签将平板上的孢子刮下，无菌纱布过滤，使其悬浮于0.01％吐温80中，用无菌水稀释初始孢子液至孢子浓度为1×107cfu/mL。
PDA培养基冷却到55℃时，向培养基中滴加不同浓度的纳他霉素溶液80μl纳他霉素溶液加入离心管中，摇匀。PDA中纳他霉素浓度分别为20ppm和10ppm，并向其他培养基中加入80μl无菌水和甲醇作为空白组和对照组。待培养基凝固之后，把黄曲霉菌悬液10μl(1×107cfu/mL)接种于PDA培养基中央至完全吸收。置于培养箱中28℃培养7天，每2天测量一次菌落直径，采用十字交叉法测定两次，结果取平均值，测定结果如图1所示，结果表明，所有加入纳他霉素组合物的培养基均能显著抑制黄曲霉的生长，抑制效果随着纳他霉素浓度的升高而增强。
<试验例3>
本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物抑制黄曲霉分生孢子的萌发：
纳他霉素溶液和黄曲霉孢子液制备方法同试验例2；
50ml三角瓶中加入18mlYES培养基，向培养基中加入纳他霉素溶液80μl，终浓度为20ppm，10ppm，并设定空白组和对照组，分别加入80μl去离子水和甲醇。然后把黄曲霉菌悬液2ml(1×107cfu/mL)接种于YES培养基中，28℃黑暗培养8h，
每隔两小时取1ml培养液，用显微镜观察孢子萌发情况，如图2所示。由图2可知，8h后空白组和对照组孢子萌发正常，加入纳他霉素组合物之后的孢子萌发受到明显抑制，浓度越高抑制越高。
<试验例4>
本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物抑制黄曲霉毒素产生的测定：
纳他霉素溶液和黄曲霉孢子液制备方法同试验例2；
250ml三角瓶中加入100mlYES培养基，将不同浓度的纳他霉素溶液400μl加入三角瓶中，摇匀。YES中纳他霉素浓度分别为20ppm和10ppm，并向其他培养基中加入400μl无菌水和甲醇作为空白组和对照组，每个浓度三个平行28℃，150r/min培养72h。之后把菌丝过滤烘干，培养液提取毒素进行HPLC检测，计算单位菌丝产毒量及产毒抑制率，结果如图3所示。本发明制备得到的纳他霉素组合物的所有实验浓度对黄曲霉生长和产毒均有抑制效果，并且随着浓度的升高而增强。
<试验例5>
本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物的应用实例：
在水果保鲜中的应用，将本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物用水溶解配制成一定浓度的水溶液一，同时取所用初始纳他霉素配制成一定浓度的水溶液二，以去离子水作为空白对照组的水溶液三，取三份相同品质的草莓，分别浸泡如水溶液一、水溶液二和水溶液三中，浸泡时间相同均为4h，然后将三份经过浸泡的车厘子取出置于恒温恒湿箱内，观察草莓的腐败情况；经过水溶液三浸泡的草莓在第3天出现了霉斑，经过水溶液二浸泡的草莓，在第8天出现了腐败，而经过水溶液一浸泡的草莓在15天时仍未出现霉变；由此说明本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物对草莓具有较好的保鲜效果，从而证明其可应用于水果保鲜技术中。
在烘培食品表面防腐中的应用，将本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物用水溶解配制成一定浓度的水溶液一，同时取所用初始纳他霉素配制成一定浓度的水溶液二，以去离子水作为空白对照组的水溶液三，取3份经相同方法自制的面包，并分别在3份面包表面喷洒相同量的水溶液一、水溶液二以及水溶液三，然后将经喷洒后的三份面包放置恒温恒湿、光照箱中，观察面包腐败情况；在第2天经水溶液三喷洒的面包表面出现了明显的霉斑，在8天经水溶液二喷洒的面包表面开始出现霉斑，经水溶液一喷洒的面包在15天时仍未出现霉变；由此说明本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物对烘培食品有较好的保鲜效果，可以对面包防腐起到积极作用，从而证明本发明实施例3制备得到的纳他霉素组合物在烘培食品中的应用。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (7)
1.纳他霉素组合物，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
步骤一、按重量份数计，将2～5重量份的纳他霉素溶解于10～20重量份的乙酸溶液中，得纳他霉素溶液；在搅拌下向纳他霉素溶液中加入20～30重量份的玉米醇溶蛋白，充分搅拌20～30min后，得混合液一，将混合液一逐滴加入30～40重量份的去离子水中，待混合液一加入完成后，持续搅拌50～80min后，得纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系；
步骤二、将0.5～1重量份的β-环糊精、0.5～1重量份的环氧丙烷依次加入8～10重量份的质量分数为40％的氢氧化钠水溶液中，充分搅拌30～40min后置于38～42℃下静置，得凝胶体；将凝胶体置于80～100重量份的去离子水中浸泡48h，期间每隔12h更换一次去离子水；随后将凝胶体从去离子水中取出并置于40～50重量份的乙酸溶液中浸泡3天后取出得置换后的凝胶体，乙酸溶液浸泡期间每隔10h更换一次乙酸溶液；
步骤三、将步骤二得到的置换后的凝胶体加入至步骤一得到的纳他霉素-醇溶蛋白的分散体系中，充分搅拌60～70min后得混合物一；向混合物一中加入1～3重量份的植物提取液，充分搅拌30～40min后得混合物二，将混合物二置于旋转蒸发仪中，在100℃水浴下处理20～30min后取出混合物二并喷雾干燥、粉碎，即得所述纳他霉素组合物。
2.如权利要求1所述的纳他霉素组合物，其特征在于，所述步骤三中的植物提取液包括重量比为1:1:1:2的洋葱提取液、花椰菜提取液以及柠檬皮提取液。
3.如权利要求2所述的纳他霉素组合物，其特征在于，步骤一中的玉米醇溶蛋白经过了预处理，具体为：
步骤S1、将玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70～80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90～110g/L的玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，向玉米醇溶蛋白的乙醇溶液中加入超氧化物歧化酶，使得溶液中超氧化歧化酶的质量浓度为50～70g/L，得混合液二；随后在常温下搅拌混合液二，30～45min后向混合液二中加入等体积的质量浓度为0.5～2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，得到初步改性玉米醇溶蛋白粉；
步骤S2、将初步改性玉米醇溶蛋白粉溶解于体积分数为70～80％的乙醇水溶液中，制备得到质量浓度为90～110g/L的初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液，向初步改性玉米醇溶蛋白粉的乙醇溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的质量浓度为50～70g/L，得混合液三；随后在常温下搅拌混合液三，30～45min后向混合液三中加入等体积的质量浓度为0.5～2.0％的氯化钠溶液，进行沉降、离心分离，收集沉降物，烘干并粉碎，即得。
4.如权利要求3所述的纳他霉素组合物，其特征在于，所用乙酸溶液的摩尔浓度均为0.05～0.2mol/L，且均为食品级乙酸溶液。
5.如权利要求4所述的纳他霉素组合物，其特征在于，所述步骤三中的喷雾干燥条件为：进风温度为120～140℃，出风温度为80～90℃。
6.如权利要求5所述的纳他霉素组合物，其特征在于，步骤一中混合液一逐滴加入20～30重量份的去离子水中时的加入速度为0.2mL/s，加入过程中保持200rpm的转速对去离子水进行搅拌。
7.如权利要求1～6任一项所述的纳他霉素组合物在抑制食物中黄曲霉生长中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200414 |