CN114698685A - 柑橘保鲜剂 - Google Patents

柑橘保鲜剂 Download PDF

Info

Publication number
CN114698685A
CN114698685A CN202210240699.3A CN202210240699A CN114698685A CN 114698685 A CN114698685 A CN 114698685A CN 202210240699 A CN202210240699 A CN 202210240699A CN 114698685 A CN114698685 A CN 114698685A
Authority
CN
China
Prior art keywords
citrus
sanxia
peptide
preservative
chitosan
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210240699.3A
Other languages
English (en)
Inventor
薛艳红
刘静
权雯婧
刘超
李奥
刘士平
罗卉
刘呈雄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Three Gorges University CTGU
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Three Gorges University CTGU filed Critical China Three Gorges University CTGU
Publication of CN114698685A publication Critical patent/CN114698685A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
    • A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
    • A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

本发明公开了一种新型柑橘保鲜剂，该保鲜剂主要由五肽—三峡肽素（Sanxiapeptin）、表面活性剂吐温‑80、壳聚糖、维生素C四种物质组成。三峡肽素来源于草酸青霉(Penicillum oxalicum)SG‑4发酵液中，通过无水乙醇浸提、旋转蒸发浓缩、冻干、高效液相色谱富集等步骤分离出来。本发明所公布的柑橘保鲜剂，对柑橘采后的主要致腐菌指状青霉（Penicillium digitatum）具有强抑制作用，效果优于市面上常用的柑橘保鲜剂百可得、咪鲜胺锰盐等农药，同时具有安全、高效、稳定的效果。

Description

柑橘保鲜剂
技术领域
本发明涉及一种对指状青霉(P.digitatum)具有抑制作用的抗菌肽的分离及鉴定，以及与表面活性剂吐温-80、壳聚糖、维生素C的协同作用，主要可以应用于柑橘采后致腐菌指状青霉的抑制及柑橘的采后保鲜。
背景技术
柑橘是我国南方地区农村经济的支柱产业之一，但是由于其储藏期很短，每年都有大量柑橘因指状青霉(P.digitatum)等采后真菌的影响而发生腐败，造成巨大经济损失。果农主要依靠喷水、低温储藏、气调等方法来抑制柑橘储藏过程中的生理失调问题，并通过打蜡的方法来防止柑橘水分的流失以及阻隔柑橘与致腐菌的接触。由于食品蜡成本昂贵，且无法用水清洗干净，它会通过柑橘的表皮渗进内部果肉，影响柑橘品质，危害人体健康。而传统的气调、喷水等方法延长柑橘储藏的能力有限，还不仅影响果品质量，更是消耗过多的资源，所以这些方法正在被市场逐步淘汰。
化学杀菌剂百可得、咪鲜胺等虽对柑橘的防腐有一定的效果，但是这些农药严重影响人类健康，同时污染环境，长期使用化学保鲜剂还会致使病原菌对保鲜剂产生抗药性，所以开发出一种绿色健康的生物保鲜剂显得极为紧迫。
生物保鲜剂利用对人体健康无害或有利的生防菌、或其天然的次级代谢产物，来抑制致腐菌的生长，可有效减轻果品的采后病害，避免柑橘致腐菌的生长。同时还可以提高植物抗逆性的作用，延缓水果组织衰老，提高柑橘的品质，从而达到保持果实风味和延长保质期的目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全、高效、稳定柑橘保鲜剂，可对采摘后的柑橘进行储存、保鲜。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种柑橘保鲜剂，该保鲜剂主要作用成分为三峡肽素，其具体的氨基酸组成为：Amoba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，C23H43N5O10，HR-ESI-MS(negative)：m/z 548.2931[M-1]-(计算值：548.2932)，结构如下：
Figure BDA0003541465360000021
其中Amoba是β-氨基α-甲氧基丁酸。
本发明的又一技术方案是以三峡肽素为活性组分的柑橘保鲜剂，三峡肽素的质量含量为10％-20％。该柑橘保鲜剂由三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C混合后形成的乳状剂。
三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C的质量百分数分别为10％-20％、1％-5％、40％-50％、1％-5％，加水20％-30％。
所述的三峡肽素是从草酸青霉SG-4发酵液中分离得到。具体从草酸青霉SG-4发酵液的水相提取物中分离得到。
所述的草酸青霉SG-4是从疏花水柏枝的根中获得的内生真菌，于2015年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2015270，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
所述的柑橘保鲜剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：
将保藏的草酸青霉SG-4原始菌株接种在PDA平板上，28℃条件下培养3-5d，活化备用；
(2)发酵培养：
挑取活化后的菌丝，放入PDA液体培养基中，28℃下120r/min条件下培养5-7d；
(3)三峡肽素提取物的分离
发酵完成后，进行真空抽滤，弃掉菌丝体，收集发酵液，加入等体积的无水乙醇进行沉淀后，除去无活性的杂质沉淀，将余液进行旋蒸浓缩，粗提物冻干后加水溶解稀释后进行液相分析制备，找到三峡肽素的出峰时间，收集足量的活性成分进行核磁打谱得到三峡肽素的结构。
本发明的又一技术方案是提供一种柑橘保鲜剂的使用方法，步骤如下：
(1)按含量百分比，将三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C混合后制成乳状剂，再将该乳状剂加水搅拌后制成柑橘保鲜剂悬乳液；三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C、水的质量百分数分别为10％-20％、1％-5％、40％-55％、1％-5％、20％-30％。
(2)将已成熟的柑橘直接浸泡在步骤(1)的悬乳液中，30-60s后取出即可对成熟后的柑橘进行保鲜。
作为本发明的技术构思，本发明将所述的柑橘保鲜剂作为果蔬保鲜上的应用。
或者将所述的柑橘保鲜剂在作为柑橘采后致腐菌的抑制剂上的应用，所述的致腐菌为包括指状青霉在内的病菌。
或者将所述的柑橘保鲜剂在作为防治农作物真菌性病害的药物上的应用。本发明还将所述的柑橘保鲜剂在果蔬的采前应用，具体是将三峡肽素与吐温-80、壳聚糖、维生素C、水的质量百分数分别以10％-20％、1％-5％、40％-55％、1％-5％、20％-30％混合后喷涂到果蔬表面，用以防治真菌等病害。本发明所述的抗菌肽用于制备安全、高效、稳定柑橘生物保鲜剂，同时为开发微生物源抗真菌剂提供了新方向。
本发明从草酸青霉SG-4发酵液中分离出三峡肽素，其具体的氨基酸组成为：Amoba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C23H43N5O10；分子量：548.2931[M-1]-，该类型化合物的结构和功能在国际上还未见相关详细报道。实验结果表明该物质对指状青霉具有强抑制作用，对柑橘采后的生物保鲜和开发安全、高效、稳定抗真菌剂具有重要的意义。
保鲜剂主要组分作用：
所述的三峡肽素化合物为主要抑菌物质，其具体的氨基酸组成为：Amoba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C23H43N5O10；分子量：548.2931[M-1]-。
所述的表面活性剂吐温-80，其分子式为C24H44O6，分子量为428.60，可降低界面的表面张力和自由能，可增益三峡肽素对致病菌的效果。
所述的壳聚糖，分子内存在游离羟基和氨基，其分子中的NH4 +带正电荷，可与带负电的细胞壁接触发生库仑作用，疏水性的长烷基链和磷脂发生疏水亲和作用，从而吸附在细胞表面，并形成高分子膜，阻碍采后致腐菌营养物质的运输。
所述的维生素C，又名抗坏血酸，是一种重要的水溶性维生素，具有抗氧化作用，能捕捉游离的氧自由基，可抑制柑橘自身氧化及微型伤口腐败，在柑橘采后进行处理可以起到提高果实光泽度和营养强化的作用。
附图说明
图1为三峡肽素的13C核磁分析图。
图2为三峡肽素的1H核磁分析图。
图3为实施例1的配方在培养基中的抑菌效果图。
图4为实施例2的配方在培养基中的抑菌效果图。
图5为实施例3的配方在培养基中的抑菌效果图。
图6为实施例4的配方在培养基中的抑菌效果图。
图7为不同处理对柑橘的保护作用效果图，A：接种指状青霉7天后柑橘的腐烂程度，B：涂抹百可得并接种指状青霉7天后柑橘的腐烂程度，C：涂抹柑橘保鲜剂并接种指状青霉7天后柑橘的腐烂程度，D：空白对照。
图8为三峡肽素对柑橘的保护作用，In指：接种指状青霉；In+0.1mg/mL；B指：接种指状青霉后用0.1mg/mL百可得处理；In+1mg/mL B指：接种指状青霉后用1mg/mL百可得处理；In+0.1mg/mL S：接种指状青霉后用0.1mg/mL三峡肽素处理；In+1mg/mL S：接种指状青霉后用1mg/mL三峡肽素处理，Initial lesion time：柑橘保藏中病变发生的时间，“*”：当使用统计检验(t检验)时，P＜0.05时差异显著，n＝20。
图9为柑橘保鲜剂与百可得的效果对比图。
图10为三峡肽素的抑菌机理，A为正常组在40×光镜下的孢子，bar＝400μm；B为实验组在40×光镜下的孢子，bar＝400μm；C为对照组在40×光镜下的孢子，bar＝400μm；D为正常组在180×扫描电镜图，bar＝100μm；E为实验组在180×扫描电镜图，bar＝100μm；F为对照组在180×扫描电镜图，bar＝100μm；G为正常组在1200X倍率下的透射电镜图，H为实验组在1200X倍率下的透射电镜图，I为对照组在1200X倍率下的透射电镜图，J为正常组在6000X倍率下的透射电镜图，K为实验组在6000X倍率下的透射电镜图，L为对照组在6000X倍率下的透射电镜图。
图11为添加山梨醇或麦角固醇的补偿试验，其中，A为添加不同浓度的山梨醇后的抑菌圈直径，B为添加不同浓度的麦角固醇后的抑菌圈直径，C为添加相同浓度的山梨醇及麦角固体的抑菌圈直径，**表示P<0.01差异显著，***表示P<0.001的差异，n＝5。
图12细胞毒活性检测，A：添加三峡肽素作用后小鼠红细胞；B：小鼠正常红细胞；C：添加Triton试剂(红细胞裂解试剂)作用后小鼠红细胞。
图13为CASKI细胞毒活性实验结果。
图14为OVCAR-3细胞毒活性实验结果。
图15三峡肽素的活性及稳定性A:物质在0.1mg/mL浓度下对指状青霉的抑制能力。以P<0.05,n＝5时进行单因素t检验及多重比较，分析差异有统计学意义。Sp:合成肽。B:不同条件下物质的相对抗真菌能力。*和**分别表示P<0.05和P<0.01显著性差异，n＝5。
图16柑橘保鲜剂的稳定性分析。相对抑制率％＝处理组抑菌圈平均直径/未处理组抑菌圈直径×100；*：显著性差异分析中P＜0.05,n＝3。
具体实施方式
实施例1
本发明的试验过程中主要培养基及分离设备：
PDA液(固)体培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、(琼脂20g/L)、pH自然、121℃高压灭菌20min后备用。
实验过程：
①菌株活化：
将保藏的SG-4原始菌株在PDA平板上活化，28℃条件下培养3-5d后，平板上菌落大小合适表型单一、菌丝白色丝状较短、产生大量灰绿色孢子的时候备用。
②发酵培养：
挑取活化好的菌丝，接种于200ml(500ml锥形瓶)PDA液体培养基中，，28℃120r/min条件下培养7d。
③主要活性物质的分离：
发酵完成后，进行真空抽滤，弃掉菌丝体，收集发酵液，加入等体积的无水乙醇进行沉淀后，除去无活性的杂质沉淀，将余液进行旋蒸浓缩，粗提物冻干保存备用。采用日本岛津高效液相色谱仪紫外-可见光检测器(SPD-16)，液相柱选用YMC-Triart C8 250mm×4.6mm、粒径5μm色谱柱进行RP-HPLC。将粗提物用纯水溶解，配制成质量浓度为5mg/mL，经10000r/min离心5min去除沉淀后备用；流动相A为乙腈，流动相B为纯水，超声脱气20min后使用；检测波长为210nm；进样体积为：100μL；洗脱梯度为：10％流动相A-100％流动相A变梯度洗脱；分析时间为30min。经鉴定，三峡肽素在C8柱中滞留时间为7.5分钟。
三峡肽素，其具体的氨基酸组成为：Amoba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C23H43N5O10，分子量：548.2931；结构如下：
Figure BDA0003541465360000051
其中Amoba是β-氨基α-甲氧基丁酸。
图1为三峡肽素的13C核磁分析图，图2为三峡肽素的1H核磁分析图。
实施例2
一种柑橘保鲜剂的使用方法，步骤如下：
(1)按含量百分比，将三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C混合后形成悬乳液，将该悬乳液与水以质量比4：1混合后制备得到柑橘保鲜剂。
(2)将指状青霉接种于土豆培养基中，于28摄氏度、相对湿度80&生长两天后，采用牛津杯法将不同配比的实施例添加于牛津杯中，共培养三天后观察其抑菌结果。每皿设置三个重复，数据以平均值±标准差呈现。
(3)将已成熟的柑橘用CAD软件计算其表面积，然后在其赤道面上接种106孢子悬液的指状青霉，在28摄氏度、相对湿度80％下培养2天。在该柑橘保鲜剂中直接浸泡30-60s后取出晾干。在28摄氏度、相对湿度80％下放置5天，统计柑橘的腐烂情况。
三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C的配方如下：
表一 各配方实例及抗腐烂程度
Figure BDA0003541465360000061
抑制率(％)＝[(对照菌落直径-处理后菌落直径)/对照菌落直径]*100％。
防治率(％)＝[(柑橘表面积-菌斑表面积)/柑橘表面积]*100％。
Figure BDA0003541465360000062
Figure BDA0003541465360000071
柑橘实验中测定的柑橘表面积和菌斑表面积都是9个一组，测定的是总面积。
柑橘表面积粗略估算为球体表面积，即S＝4ΠR2
图3-6是柑橘在进行实施例2-1、2-2、2-3、2-4配方的柑橘保鲜剂浸泡后的抑菌效果，均是平行试验，从图中可以看出三峡肽素和壳聚糖含量最高时，抑菌效果最好。综合抑制率和对柑橘的防治率，说明实施例2-13是最佳配方。
实施例3
取湖北宜昌本地秭归的采摘时间相同(2020年10月29日)、以柑橘成橙色为基本相同的成熟度、大小控制为7-10cm的柑橘为试验对象，A组：接种指状青霉(Penicilliumdigitatum)7天后柑橘的腐烂程度；B组：涂抹百可得并接种指状青霉(Penicilliumdigitatum)7天后柑橘的腐烂程度(按照1000倍稀释)；C组：涂抹柑橘保鲜剂并接种指状青霉(Penicillium digitatum)7天后柑橘的腐烂程度(按照1000倍稀释，按照上述配方2-13实施例)；D组：空白对照。
接种方法为：在无菌条件下，取一次性针头吸取300μL，浓度为106cfu/mL的指状青霉菌液注射到柑橘约3cm深处。
涂抹方法为：将配好的保鲜剂倒在容器中(百可得及三峡肽素配置的柑橘保鲜剂分别稀释1000倍)，并用手滚动上述采摘的柑橘，使其均匀分布在柑橘表面。
上述不同的处理方法的柑橘在温度为20-25℃、湿度为80％下放置7天，观察柑橘的腐烂程度。
图7是柑橘在进行不同处理的柑橘保鲜剂浸泡后的抑菌图，从图中可以看出三峡肽素能够显著抑制柑橘保藏中病变的时间。
实施例4
在无菌条件下，取一次性针头吸取300μL，浓度为106cfu/mL的指状青霉菌液注射到柑橘(柑橘的采摘采用实施例15的柑橘)约3cm深处。接种完成后，在28摄氏度、相对湿度80％下培养2天，分别涂抹0.1mg/mL或1mg/mL的百可得，或分别涂抹0.1mg/mL或1mg/mL三峡肽素，然后在28摄氏度、相对湿度80％下放置5天，观察各处理对柑橘病变发生时间的影响。结果如图8所示，图8中，In指：接种指状青霉；In+0.1mg/mL B指：接种指状青霉后用0.1mg/mL百可得处理；In+1mg/mL B指：接种指状青霉后用1mg/mL百可得处理；In+0.1mg/mL S：接种指状青霉后用0.1mg/mL三峡肽素处理；In+1mg/mL S：接种指状青霉后用1mg/mL三峡肽素处理。从图8中可以看出三峡肽素可以有效提高柑橘的采后防腐。
在分析对维生素C对柑橘抑菌效果的分析时，选取取湖北宜昌本地的采摘时间相同、以柑橘成橙色为基本相同的成熟度、大小控制为7-10cm的柑橘为试验对象，分为三组。涂抹0.1mg/mL的百可得溶液为第一组，涂抹0.1mg/mL三峡肽素和0.1mg/mL的维生素C的为第二组，不做任何处理为空白对照组即为第三组，放在室温条件下(温度约25℃，湿度为80％)，在0D、30D、60D、108D天分别观察结果，从图9中发现涂抹了三峡肽素和Vc的第二组效果最好，果实的腐烂程度最低，而且表面还能保持水果的光泽，说明三峡肽素的抑菌效果可以和维生素C的抗氧化效果协同使用，从而提高柑橘的保鲜期。。
实施例5
为了探究三峡肽素对指状青霉菌丝形态影响，在100mL的PDA中接种指状青霉培养28℃、120r/min培养3d，添加不同的样品后在28℃、120r/min摇床培养12h，设置正对照(添加百可得15μg/mL)、实验组(添加三峡肽素10μg/mL)和正常生长组(不添加任何物质)。分别在光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜下进行观察。具体操作步骤为(在无菌条件下，用无菌吸管吸取融化的培养真菌的固体培养基，快速地滴一滴于无菌的载玻片上，待其冷却以后，用接种环沾取少许孢子或者挑取一点菌丝段于凝固的培养基上，上面放上无菌的盖玻片。然后，将此片子放入干净的培养皿中，培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸，或者将培养皿底放入一些水，中间用玻璃棒隆起，将做好的培养片子搭放在上面，合适温度下培养。将培养好的片子取出，用小镊子轻轻地取下上面的盖玻片，把盖玻片转放于另一干净的载玻片上，待自然干燥后，两边用透明胶固定，用棉蓝染色液染色，染色之后进行显微观察)
本发明对指状青霉处理后的菌丝用插片法进行了显微观察，结果表明：在光学显微镜下，可以看到用三峡肽素处理后的指状青霉菌丝变得透明弯曲，而百可得处理后的菌丝发生了凝结皱缩，如图10中的A、B、C所示。在扫描电镜下，可以观察到用三峡肽素处理后的菌丝体发生了弯曲现象，而百可得处理的结果从形态上看则没有较为明显的差异(图10中的D、E、F所示)，该结果光学显微结果一致。
为了进一步观察处理后指状青霉细胞内部变化情况，对该菌丝进行了透射电镜观察，如图10中的所示G、H、I、J、K、L所示，结果显示，三峡肽素处理后的指状青霉细胞内部出现了空腔，同时可以明显观察到细胞边缘破裂、不完整，而百可得处理后则显示细胞内部并没有出现空腔，细胞边缘较为完整的，该结果表明，三峡肽素和百可得作用机制不一样。由于百可得作用靶点是细胞膜，而显微结果表明，三峡肽素处理后的细胞壁呈现不完整，内部出现空腔，暗示三峡肽素作用靶点极有可能为细胞壁，通过破坏细胞壁，造成渗透压紊乱，使得胞内物质外流，形成空腔。但是细胞膜与细胞壁又相互影响，因此细胞膜为其作用靶点的可能性也不可忽视。
由于山梨醇和麦角固醇分别为细胞壁和细胞膜的保护剂，因此外源添加会导致抑菌情况发生变化，为了进一步分析三峡肽素对指状青霉的作用靶点，在PDA固体培养基中分别添加不同浓度的山梨醇和麦角固醇，分析抑菌情况，以此来反映三峡肽素和细胞壁以及细胞膜之间的作用程度。实验结果表明：高浓度的山梨醇(1000μg/mL)会促进三峡肽素的抑菌能力，但高浓度的麦角固醇(1000μg/mL)则相反，抑制三峡肽素的抑菌能力(图11B)，相比正对照百可得，在同浓度下，山梨醇和麦角固醇均未对百可得的抑菌能力造成影响。该结果说明，三峡肽素对细胞膜的的作用程度更大，且与百可得作用细胞膜靶点不一致。由此推断，三峡肽素作用靶点更可能为细胞膜(图11)。
实施例6
柑橘保鲜剂的安全性检测：
溶血性实验过程：选用生长状况良好的新鲜大鼠，取用心脏血液5ml，经低温离心机5000r/min离心5min后，血液明显分层，去除上清液，取下层红细胞用PBS溶液清洗3遍。将最后一遍清洗得到的红细胞用PBS溶液分散，配制成体积分数约为5％的红细胞溶液。取0.5mL红细胞溶液加入不同浓度的三峡肽素溶液(1000，500,250,100,50μg/ml)，1％Triton溶液处理为阳性对照组，PBS溶液处理为阴性对照组，其他操作均相同，将混液放在10000r/min离心5min操作后，分别取不同组的上清液100μL，加入96孔板内，用酶标仪检测570nm处OD值，并计算溶血率；另分别取不同组的细胞沉淀10μL，在光学显微镜下观察并记录红细胞形态。
溶血性实验结果：利用大鼠新鲜血液完成溶血实验，分别设置实验组、正常生长组和阳性组。将反应后的混液分别加入96孔板中，在酶标仪下测定OD570，然后根据公式：溶血率％＝(实验组OD值－正常组OD值)/(阳性组OD值－正常组OD值)×100；计算出实验组的溶血率均在15％以下，图10上)结果表明三峡肽素溶液(使用浓度：0-1000μg/mL)与血液相容性良好。并且在显微镜(40×)下观察细胞形态，发现实验组和正常生长组的血细胞均形态完整，而在阳性组中未发现完整血细胞存在，也进一步证实了三峡肽素溶液对血细胞并无副作用影响(图12下)。
细胞毒活性检测过程：将Caski细胞(人宫颈癌上皮细胞)和OVCAR-3细胞(人卵巢癌复苏形式细胞)贴壁培养12h后分别加入三峡肽素溶液(6.25,12.5,25,50,100μM)，然后继续培养48h后，使用MTT试剂盒法分别测定两种肿瘤细胞不同浓度组的细胞活性，比较细胞毒活性大小，细胞毒活性实验结果：结果显示，三峡肽素同样未对其产生明显的细胞毒活性作用；结合这两类肿瘤细胞的细胞毒活性和溶血性实验结果，可判断三峡肽素是一种相对于人体比较安全的物质，如图13、14所示。
实施例7
柑橘保鲜剂的稳定性检测：
该柑橘保鲜剂的稳定性实验过程：采用体外牛津杯实验，测定三峡肽素样品溶液(100μg/ml)对于高温、酸碱和蛋白酶的耐受性。首先将三峡肽素溶液(100μg/ml)经过不同的处理后使用：第一组是将三峡肽素溶液分别经90℃、115℃和121℃分别处理20min后备用；第二组是使用盐酸溶液(1N，当量浓度，即：1mol/L)和氢氧化钠溶液(1M，即：1mol/L)调节三峡肽素溶液的pH值到2.5和10.5；第三组是配制1mg/mL蛋白酶K溶液等体积加入到三峡肽素溶液中，温水浴37℃处理3h后备用。采用牛津杯法测定每一个处理组的抑菌圈大小，同未处理组的三峡肽素抑菌圈相比较，计算相对抑制率如图15所示，从图15中可以看出说明三峡肽素溶液对一定范围的高温、酸碱度和蛋白酶K的耐受能力。
该柑橘保鲜剂的稳定性分析：采用牛津杯法测定抑菌圈，每个处理组平行测定3组数据，计算每组的相对抑制率后采用SPSS软件进行显著性差异分析(P＜0.05)，根据图16显示，三峡肽素溶液对极端酸碱度(pH 2.5和pH 10.5)、蛋白酶K的处理具有良好的耐受能力，相对抑制率均达到90％以上，基本与未经处理组的抑菌圈直径相同。此外，三峡肽素溶液对高温有一定的敏感性，但在最高温度121℃处理后的相对抑制率也近60％，说明三峡肽素溶液可以承受一定时间的高温处理。确认三峡肽素溶液对极端酸碱环境、高温和蛋白酶的耐受程度，进而证实其开发成安全、高效、稳定抗真菌剂的潜力，如图16所示。
本发明公开了一种对柑橘采后致腐菌具有强抑制作用的安全、高效、稳定柑橘保鲜剂，该保鲜剂主要由三峡肽素、表面活性剂吐温-80、壳聚糖、维生素C四种物质组成，三峡肽素从草酸青霉SG-4发酵液中，通过无水乙醇浸提、旋转蒸发浓缩、冻干、高效液相色谱等步骤分离出来。在低浓度时也存在抑菌作用，效果优于市面上常用的柑橘保鲜剂百可得、咪鲜胺锰盐等。加入少量吐温-80可以降低表面张力和表面自由能，对抑菌效果有促进作用。壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的。壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，溶解后溶液中含有氨基，可通过结合负离子来抑制细菌，也可通过渗透进入细胞内，吸附细胞体内带有阴离子的物质，扰乱细胞正常的生理活动，从而抑制细菌生长。其抗菌性能主要受到温度、菌的种类、浓度、pH值、离子强度的影响。经研究发现，壳聚糖对真菌(柑橘致腐菌)也有抑制作用，其进入体内一部分能被人体降解吸收利用，具有激活人体免疫系统、抗癌抑菌的活性，另一部分可与脂类、氯离子结合，吸附体内毒素和重金属离子，起到降压、排毒的功效。维生素C主要起抗氧化作用，提高免疫力，此外，还可以促进机体对钙以及叶酸的吸收。以上四种物质共同参与抑制柑橘致腐菌，并起到了很好的抑菌效果。

Claims (10)

1.一种柑橘保鲜剂，其特征在于：该保鲜剂主要作用成分为三峡肽素，其具体的氨基酸组成为：Amoba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C23H43N5O10，分子量：548.2931；结构如下：
Figure FDA0003541465350000011
其中Amoba是β-氨基α-甲氧基丁酸。
2.含有权利要求1所述的三峡肽素为活性组分的柑橘保鲜剂，其特征在于：三峡肽素的质量含量为10％-20％。
3.根据权利要求2所述的柑橘保鲜剂，其特征在于：该柑橘保鲜剂由三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C、水混合后形成的乳状剂。
4.根据权利要求3所述的柑橘保鲜剂，其特征在于：三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C、水的质量百分数分别为10％-20％、1％-5％、40％-55％、1％-5％、20％-30％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的柑橘保鲜剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)菌株活化：
将保藏的草酸青霉SG-4原始菌株接种在PDA平板上，28℃条件下培养3-5d，活化备用；
(2)发酵培养：
挑取活化后的菌丝，放入PDA液体培养基中，28℃下120r/min条件下培养5-7d；
(3)三峡肽素提取物的分离
发酵完成后，进行真空抽滤，弃掉菌丝体，收集发酵液，加入等体积的无水乙醇进行沉淀后，将上清液进行旋蒸浓缩，浓缩物经冻干得到三峡肽素提取物。
6.权利要求1-4任一项所述的柑橘保鲜剂在柑橘之外的果蔬保鲜上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，柑橘保鲜剂的使用方法包括如下步骤：
(1)按含量百分比，将三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C混合后制成乳状剂，再将该乳状剂加水搅拌后制成柑橘保鲜剂悬乳液；
(2)将已成熟的柑橘直接浸泡在步骤(1)的悬乳液中，30-60s后取出即可对成熟后的柑橘进行保鲜。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，三峡肽素、吐温-80、壳聚糖、维生素C、水的质量百分数分别为10％-20％、1％-5％、40％-55％、1％-5％、20％-30％。
9.权利要求1-4任一项所述的柑橘保鲜剂在作为柑橘采后致腐菌的抑制剂上的应用，所述的致腐菌包括指状青霉在内的病菌。
10.权利要求1-4任一项所述的柑橘保鲜剂在作为防治农作物真菌性病害的药物上的应用及果蔬的采前应用。
CN202210240699.3A 2021-06-21 2022-03-10 柑橘保鲜剂 Pending CN114698685A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110686491X 2021-06-21
CN202110686491.XA CN113455541A (zh) 2021-06-21 2021-06-21 柑橘保鲜剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114698685A true CN114698685A (zh) 2022-07-05

Family

ID=77868955

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110686491.XA Pending CN113455541A (zh) 2021-06-21 2021-06-21 柑橘保鲜剂
CN202210240699.3A Pending CN114698685A (zh) 2021-06-21 2022-03-10 柑橘保鲜剂

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110686491.XA Pending CN113455541A (zh) 2021-06-21 2021-06-21 柑橘保鲜剂

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN113455541A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113455541A (zh) * 2021-06-21 2021-10-01 三峡大学 柑橘保鲜剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113455541A (zh) * 2021-06-21 2021-10-01 三峡大学 柑橘保鲜剂

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929430A (zh) * 2017-02-10 2017-07-07 三峡大学 一株具有强抗氧化性的草酸青霉菌sy‑15及其应用
CN108464347A (zh) * 2018-03-21 2018-08-31 江西农业大学 一种包含合欢皮提取物的柑橘采后植物保鲜剂
CN109608517A (zh) * 2019-01-18 2019-04-12 三峡大学 一种新型抗菌肽及在柑橘保鲜中的应用
CN111088167B (zh) * 2019-12-05 2023-05-02 三峡大学 草酸青霉菌中提取氧杂蒽酮的工艺及作为抗氧化剂上的应用
CN111269291B (zh) * 2020-03-20 2023-11-21 三峡大学 寡肽的合成及在抑制柑橘致腐菌指状青霉的药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113455541A (zh) * 2021-06-21 2021-10-01 三峡大学 柑橘保鲜剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨宇纯等: "草酸青霉中新型线性五肽的发现及对柑橘采后致腐菌拮抗活性研究", 微生物学通报, vol. 47, no. 2, pages 485 - 488 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113455541A (zh) 2021-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102150704B (zh) 一种果蔬保鲜剂及其制备方法
CN103355730B (zh) 一种乳酸链球菌素复合生物防腐剂及其制备方法
CN108739972A (zh) 一种迷迭香壳聚糖保鲜组合物、制剂、制备方法及其应用
CN109122833A (zh) 一种提高沃柑贮藏保鲜效果的方法
CN102370670B (zh) 一种冬虫夏草的高效加工方法
CN111202064B (zh) 厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用
CN114698685A (zh) 柑橘保鲜剂
CN104542927A (zh) 一种应用于鲜枣贮存保鲜的复合方法
Gallo et al. Applications of chitosan as a functional food
CN114304335B (zh) 一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用
CN113499288B (zh) 可用于化妆品的刺梨发酵物及其制备方法
CN106070586B (zh) 一种复配生物保鲜剂及其应用
CN108208654A (zh) 一种高活性的水果酵素粉的制备方法
CN104472676A (zh) 一种涂膜保鲜液及其制备方法
CN107788104A (zh) 一种鲜切果蔬保鲜剂及其制备方法和使用方法
CN113662121A (zh) 一种原花青素-多糖新型天然固体组合抑菌剂及制备方法和应用
CN103461471B (zh) 真姬菇凝集素和脱蛋白多糖在枇杷保鲜中的应用
CN112301542A (zh) 一种核壳型复合纳米纤维膜及其制备方法与应用
CN111000112A (zh) 纳他霉素组合物及其应用
CN110734866B (zh) 一种防治枇杷采后病害的活性冻干粉及其制备方法和应用
CN111134174B (zh) 一种季也蒙酵母用于西兰花采后病害的控制及贮藏保鲜的方法
CN113980870A (zh) 一株冻盐晶嗜冷杆菌及其在蔬菜冷藏保鲜中的应用
WO2019223409A1 (zh) 一种蓝莓保鲜剂及其制备方法和应用
CN115989828B (zh) 壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母防治番茄采后病害及贮藏保鲜的方法
CN114847342B (zh) 一种抑菌保鲜组合物及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination