CN103599068A - 纳米载药胶束和抗癌药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纳米载药胶束、抗癌药物及其制备方法。该纳米载药胶束包括透明质酸和通过己二酰肼基团连接在所述透明质酸直链上的二氢卟吩e6基团，且所述透明质酸将所述己二酰肼基团、二氢卟吩e6基团包覆形成核壳结构，所述二氢卟吩e6基团形成疏水性内核。该抗癌药物是将疏水性抗癌药物负载在纳米载药胶束疏水性内核中。纳米载药胶束具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，还具有在肿瘤细胞处近红外成像功能和光动力治疗功能。抗癌药物能通过该纳米载药胶束能使得疏水性抗癌药物顺利到达病灶实现精确的缓慢释放，降低毒性及免疫源性并增强该抗癌药物体内循环的半衰期。

Description

纳米载药胶束和抗癌药物及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米医学领域，尤其涉及一种纳米载药胶束及其制备方法和抗癌药物及其制备方法。

背景技术

随着纳米生物技术的发展，多功能智能型聚合物纳米颗粒越来越受到人们的重视，特别是在癌细胞治疗领域，多功能智能纳米载体作为一种新型药物载体已经广泛应用到靶向载药领域，并且具有较好的发展前景。智能纳米载体将药物选择性传递到特定的靶点后，被化学信号或温度或pH等“触发器”激发后，能响应性地释放被负载药物，这种纳米载体可分为主动靶向传递系统和被动靶向传递系统。

纳米被动靶向传递系统是指纳米载体对网状内皮系统具有靶向性，使载药载体在特定的给药部位聚集，然后释放出生物活性的药物。例如，聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)修饰的长循环纳米粒在静脉注射给药后，基于实体瘤的通透性和滞留效应(EPR效应)，使得载体在肿瘤组织周围聚集。纳米主动靶向传递系统是对药物载体进行特定的修饰然后在体内能定向靶向运输至特定的治疗部位。由于肿瘤细胞增殖迅速，一些特定的受体表达增强，使细胞对叶酸、维生素和糖的摄取增加，当药物载体修饰了这些特定的受体后，能显著提高细胞对载体的摄取，增强药效。主动靶向传递系统因其靶向性较强、毒副作用小等优点，越来越受到医药界的重视。

如透明质酸(hyaluronic acid,hyalumnan,HA)是常用的一种高分子的聚合物载药载体，其是由β-D-N-乙酞氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元的以β-1,3和β-1,4配糖键交替连接而成的一种直链线型阴离子粘多糖，具有独特理化性质和生理功能，已经在医学、生物材料方面得到了广泛应用。细胞表面受体多样，选择合适的受体及其配体是实现药物主动勒向的关键，CD44是研究比较广泛的细胞表面受体，在肿瘤的发生、发展方面具有重要的作用。

目前研究采用高分子量透明质酸作为主动靶向因子，与肿瘤细胞表面的CD44特异性受体CD44结合，介导药物入胞，在细胞内释放药物。且HA具有很多优势：水溶性好，生物可降解，生物相容性好，无毒，无免疫原性，容易进行化学修饰等。

虽然纳米聚合物药物载体已经被证明在传递抗肿瘤药物方面具有极大的发展前景，但是目前仍存在很多的不足，如目前使用的大部分载体作用单一，只是起到包载的作用，载药稳定性差，大部分只是靠被动运输富集在肿瘤部位，这些缺点极大的限制了聚合物纳米载体在临床上的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有主动靶向、稳定性好、能包裹抗癌药物的纳米载药胶束及其制备方法，旨在解决现有纳米聚合物药物载体作用单一，不能同时实现成像和对肿瘤光动力治疗以及载药稳定性差的技术问题。

本发明的另一目的在于提供一种具有主动靶向、纳米载体药物稳定性好的抗癌药物及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种纳米载药胶束，包括透明质酸和通过己二酰肼基团连接在所述透明质酸直链上的二氢卟吩e6(Ce6)基团，且所述透明质酸将所述己二酰肼(ADH)基团、二氢卟吩e6基团包覆形成核壳结构，所述二氢卟吩e6基团形成疏水性内核。

以及，一种制备上述纳米载药胶束的方法，包括如下步骤：

采用己二酰肼在酸性水溶液中对透明质酸进行化学修饰，得到HA-ADH衍生物；

将所述HA-ADH衍生物溶解，向其中加入羧基被活化后的二氢卟吩e6于室温中进行反应，待反应结束后，将反应后的溶液进行透析处理，冻干处理，得到所述纳米载药胶束。

以及，一种抗癌药物，包括疏水性抗癌药物和负载所述疏水性抗癌药物的载体，所述载体为上述纳米载药胶束或上述纳米载药胶束的制备方法制备获得的纳米载药胶束，且所述疏水性抗癌药物负载在所述纳米载药胶束的疏水性内核中。

以及，一种制备上述抗癌药物的方法，包括如下步骤：

将所述纳米载药胶束和疏水性抗癌药物溶解于有机溶剂中，将形成的混合有机溶液后，依次进行透析处理、冻干处理。

上述纳米载药胶束以透明质酸为壳体，从而使得该纳米载药胶束具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外。同时，作为壳体的透明质酸具有主动靶向肿瘤细胞的功能，能载抗癌药物至肿瘤细胞处，并利用在肿瘤微环境中富含大量的透明质酸酶，通过降解透明质酸链，从而实现制抗癌药物在肿瘤部位精确的缓慢释放。作为上述纳米载药胶束疏水性内核的二氢卟吩e6基团具有在肿瘤细胞处近红外成像功能和光动力治疗功能外，二氢卟吩e6基团疏水性能包裹疏水性抗癌药物，提高疏水性抗癌药物的水溶性和稳定性。因此，上述纳米载药胶束通过作为壳体的透明质酸和作为疏水性内核的二氢卟吩e6基团的协同作用，有效克服了现有纳米聚合物药物载体作用单一，不能同时实现成像和对肿瘤光动力治疗以及载药稳定性差的技术问题。

上述纳米载药胶束制备方法通过将透明质酸、己二酰肼和二氢卟吩e6之间依次缩合制备而成，其方法简单，且反应条件易控，使得产物的产率高。

上述抗癌药物采用上述纳米载药胶束作为载体，将疏水性抗癌药物负载在纳米载药胶束的疏水性内核之中，有效增强疏水性抗癌药物的水溶性，从而使得抗癌药物能使得疏水性抗癌药物顺利到达病灶实现精确的缓慢释放，降低毒性及免疫源性并增强该抗癌药物体内循环的半衰期。该疏水性抗癌药物与二氢卟吩e6基团协同作用实现联合治疗功能功效之外，还能赋予该抗癌药物良好的稳定性。

上述抗癌药物只需将上述纳米载药胶束与疏水性抗癌药物溶解于有机溶剂中，实现疏水性抗癌药物的自动负载，其制备方法工艺简单，且条件可控，良品率高，而且药物粒径可控。

附图说明

图1是本发明实施例提供的纳米载药胶束的分子结构示意图；

图2是本发明实施例提供的纳米载药胶束制备方法流程图；

图3是本发明实施例提供的抗癌药物微观结构示意图；

图4是本发明实施例提供的抗癌药物组装示意图；

图5是本发明实施例4提供的纳米载药胶束的电镜分析图；

图6是本发明实施例4提供的纳米载药胶束的粒径分布图；

图7是本发明实施例4提供的纳米载药胶束的荧光发射光谱曲线图；其中，曲线1为纳米载药胶束的水溶液荧光发射光谱曲线图，曲线2为纳米载药胶束的二甲基亚砜溶液荧光发射光谱曲线图；

图8是本发明实施例5提供的载药后纳米胶束的电镜分析图；

图9是本发明实施例5提供的载药后纳米胶束的粒径分布图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种能同时实现成像和对肿瘤光动力治疗以及具有主动靶向性的纳米载药胶束。该纳米载药胶束的结构示意图如图1所示，其为核壳结构，包括作为壳体的透明质酸1和通过己二酰肼基团2连接在透明质酸1直链上的二氢卟吩基团3，且该透明质酸1将己二酰肼基团2、二氢卟吩基团3包覆在其内，二氢卟吩基团3形成疏水性内核。

其中，作为纳米载药胶束壳体的透明质酸1具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，更重要的是其能与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合，将其负载的药物介导入胞内。同时，细胞内的透明质酸酶可降解透明质酸链，实现所包裹抗癌药物的释放。作为本发明的优选实施例，该透明质酸1的重均分子量为10K～100K。该高分子量的透明质酸可以作为主动靶向因子，与肿瘤细胞表面的CD44特异性受体CD44结合，介导药物入胞，在细胞内释放药物。低于10K分子量的透明质酸的该性能较差，当分子量大于100KDa时，透明质酸则会导致粒径较大而导致其不宜进入细胞膜而发挥作用。

上述己二酰肼基团2起到透明质酸1与二氢卟吩e6基团3连接的桥梁作用。具体地，己二酰肼基团2一端的肼基与透明质酸1主链上的羧基形成化学键实现连接，另一端的肼基与二氢卟吩e6基团3上的羧基形成化学键实现连接。因此，上述纳米载药胶束的分子结构式如下：

该纳米载药胶束（HA-ADH-Ce6）分子结构中的n由透明质酸1的分子量而定。这就是说，在纳米载药胶束分子结构中，二氢卟吩e6基团3与透明质酸1是通过共价键连接，因此，该纳米载药胶束结构稳定。

上述纳米载药胶束中的二氢卟吩e6基团3是由化合物二氢卟吩e6（Ce6）通过下文活化处理后与己二酰肼缩合反应而链接在透明质酸1主链上的。由于Ce6是一种很有潜力的光敏剂，它具备663nm的吸收波长，能够产生更多的多种活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)，包括单线态氧、超氧阴离子、羟自由基及过氧化氢等具有细胞杀伤作用，而且对皮肤的副反应较小，因此适合用于肿瘤光动力治疗。但是由于Ce6水溶性差，因此限制了其在临床的开发应用。而在上述纳米载药胶束中，该Ce6经缩合后形成二氢卟吩e6基团3通过己二酰肼基团2连接在透明质酸1主链上后，二氢卟吩e6基团3能有效形成具有负载有效药物成分的疏水性内核，被亲水性好的透明质酸1包覆，从而有效克服了Ce6水溶性差的不足。

为了使得二氢卟吩e6基团3形成的疏水性内核负载适量剂量的有效药物成分的能力，在优选实施例中，二氢卟吩e6基团3与透明质酸1的摩尔比为(2～5)：1。

作为本发明的进一步优选实施例，上述关于纳米载药胶束的各实施例中，纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm。这粒径大小的纳米颗粒更有利于进入细胞实现其生物特性。

因此，上述纳米载药胶束以透明质酸1主链为壳体，从而使得该纳米载药胶束具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外。同时，作为壳体的透明质酸1具有主动靶向肿瘤细胞的功能，能载抗癌药物至肿瘤细胞处，并利用在肿瘤微环境中富含大量的透明质酸酶，通过降解透明质酸链，从而实现制抗癌药物在肿瘤部位精确的缓慢释放。作为上述纳米载药胶束疏水性内核的二氢卟吩e6基团3具有在肿瘤细胞处近红外成像功能和光动力治疗功能外，二氢卟吩e6基团3疏水性能包裹疏水性抗癌药物，提高疏水性抗癌药物的水溶性和稳定性。因此，上述纳米载药胶束通过作为壳体的透明质酸1和作为疏水性内核的二氢卟吩e6基团3的协同作用，有效克服了现有纳米聚合物药物如现有透明质酸载体作用单一，不能同时实现成像和对肿瘤光动力治疗以及载药稳定性差的技术问题。

相应地，本发明实施例还提供了上述纳米载药胶束的一种制备方法，其图制备方法的流程如图2所示。该纳米载药胶束制备方法包括如下步骤：

S01.利用己二酰肼合成HA-ADH衍生物：采用己二酰肼在酸性水溶液中对透明质酸进行化学修饰，得到HA-ADH衍生物；

S02.将二氢卟吩e6与HA-ADH衍生物合成纳米载药胶束：将步骤S01中制备的HA-ADH衍生物溶解于甲酰胺中，向其中加入羧基被活化后的二氢卟吩e6于室温中进行反应，待反应结束后，将反应后的溶液依次于有机溶剂、水中透析处理，冻干处理，得到所述纳米载药胶束。

具体地，上述步骤S01中的所述采用己二酰肼在酸性水溶液中对透明质酸进行化学修饰的方法优选如下：

将己二酰肼（ADH）加入HA的水溶液中后，将水溶液的pH值调至4.5～4.8，加入缩合剂，保持pH值为4.5～4.8，使得所述己二酰肼与透明质酸进行缩合反应。其中，ADH与HA的化学反应式如下：

在上述ADH与HA缩合反应中，ADH中分子结构式中的一端肼基与HA主链上的羧基发生缩合脱水反应，从而形成稳定的化学键，使得ADH接枝至HA主链上。采用该ADH对HA进行改性，能有效适当的降低HA的水溶性，从而实现负载在二氢卟吩基团3疏水性内核中的疏水性药物缓释的目的，延长药物的药效时间和控制药物释放的剂量。因此，在优选实施例中，该HA与ADH、缩合剂的摩尔比优选为1:(4～6):(0.4～0.6)。在具体实施例中，该HA与缩合剂的摩尔比为1:0.5。

为了提高HA与ADH缩合反应的效率，在优选实施例中，该缩合剂为碳二亚胺（EDC）。

另外，在HA与ADH缩合反应过程中反应体系的pH可以采用盐酸进行调整，如浓度为0.1mol/L的盐酸溶液进行调节。该缩合反应的温度没有特别要求，如可以直接在常温如室温中进行，反应时间应该至少要保证反应物充分反应完毕，如可以1小时。

反应结束以后，将反应加入到纤维素透析袋中，连续透析处理如48h之后，冻干处理，得到HA-ADH目标产物。

上述步骤S02中，二氢卟吩e6（Ce6）的羧基被活化方法优选如下：

将缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入Ce6溶液中进行缩合反应，后进行纯化。

其中，在缩合剂作用下，Ce6与NHS发生缩合活化反应，生成下述被活化的中间产物Ce6-NHS，其化学反应式如下：

在该Ce6与NHS发生缩合活化反应过程中，根据Ce6的自身特性，NHS优先与Ce6中的（1）表示的-COOH进行缩合反应。当然也可以控制反应物NHS的量，NHS与Ce6中的（1）、（2）表示的-COOH进行缩合反应，更甚者与Ce6中三个-COOH均进行缩合反应，制备得到Ce6-NHS。在本发明中，Ce6中（1）表示的-COOH被活化即可满足本发明实施例的要求，因此，在优选实施例中，二氢卟吩e6与N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂三者的摩尔比优选为1：(1～2)：(1～2)，进一步优选为1：1.2：1.2。

为了提高NHS与Ce6的活化反应速率，该Ce6优选先溶于甲酰胺配制成溶液，然后NHS、缩合剂溶液滴加至Ce6溶液中进行反应。两反应物溶液浓度没有特别的限制，如可以是下文实施例1中的浓度。该缩合反应的温度没有特别要求，如可以直接在常温如室温中进行。反应时间应该至少要保证反应物充分反应完毕，如可以是搅拌反应24小时。待NHS与Ce6的活化反应结束后，不需要进一步纯化，溶液备用。

作为优选实施例，该NHS与Ce6的活化反应中的缩合剂可以选用EDC、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）。

该步骤S02中，将步骤S01中制备的HA-ADH衍生物进行溶解，如溶解至甲酰胺溶剂、pH是7.4的PBS溶液或水中，配制成HA-ADH衍生物的甲酰胺溶液，然后向该溶液中加入羧基被活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液，使Ce6-NHS与HA-ADH衍生物反应，从而生成最终目标产物。该Ce6-NHS与HA-ADH的化学反应式如下：

两反应物溶液浓度和温度没有特别的限制，如可以是下文实施例1中的浓度。该Ce6-NHS与HA-ADH衍生物间的缩合反应的温度没有特别要求，如可以直接在常温如室温中进行。反应时间应该至少要保证反应物充分反应完毕，如可以是搅拌反应24小时。待Ce6-NHS与HA-ADH衍生物间的反应结束后，需要对HA-ADH-Ce6目标产物进行透析处理，在透析处理之前，优选先对反应后的溶液进行减压抽滤，除去大颗粒不溶物。待抽滤处理之后，将滤液进行透析处理，该透析处理的方法优选如下：

20-40℃条件下将滤液置于纤维素透析袋中，连续透析24h-48h，冷冻干燥处理，得到HA-ADH-Ce6的纳米载药胶束。

上述纳米载药胶束的制备方法实施例中通过将透明质酸、己二酰肼和二氢卟吩e6之间依次缩合制备而成，其方法简单，且反应条件易控，使得产物的产率高。

另外，本发明还提供了一种抗癌药物，其微观结构如图3所示，其包括疏水性抗癌药物4和负载该疏水性抗癌药物4的载体01。其中，该载体01为上文所述和图1所示的纳米载药胶束或上文所述和图2所述的纳米载药胶束的制备方法制备获得的纳米载药胶束，该疏水性抗癌药物4负载在所述纳米载药胶束的疏水性内核中。

在优选实施例中，该疏水性抗癌药物4与载体01的质量比为(0.05～0.2):1。

在进一步优选实施例中，该疏水性抗癌药物4为阿霉素；紫杉醇；喜树碱中的至少一种。

另外，该抗癌药物还可以称为包裹抗癌药物纳米载药胶束，该抗癌药物可以根据患者实际情况或者市场的需求情况，将其制备成粉剂、胶囊等剂型。

这样，由于上述抗癌药物采用上述纳米载药胶束作为载体，将疏水性抗癌药物4负载在纳米载药胶束的疏水性内核之中，有效增强疏水性抗癌药物4的水溶性，从而使得抗癌药物能使得疏水性抗癌药物4顺利到达病灶实现精确的缓慢释放，降低毒性及免疫源性并增强该抗癌药物体内循环的半衰期。该疏水性抗癌药物4与二氢卟吩e6基团3协同作用实现联合治疗功能功效之外，还能赋予该抗癌药物良好的稳定性、主动靶向。

相应地，上述抗癌药物制备方法为：将上文所述的纳米载药胶束和疏水性抗癌药物4溶解于有机溶剂中，将形成的混合有机溶液后，依次进行透析处理、冻干处理。

其中，在优选实施例中，上述纳米载药胶束和疏水性抗癌药物4溶解于有机溶剂后，纳米载药胶束的浓度优选为10～500g/L，疏水性抗癌药物4的浓度范围为1～100g/L。

该有机溶剂只要能溶解纳米载药胶束和疏水性抗癌药物4的有机溶剂均可选用，如可以选用甲酰胺溶剂。

上述混合有机溶液的透析处理可以直接参照上文纳米载药胶束的透析处理，在透析过程中溶解的纳米载药胶束自动形成上文所述和图1所示的纳米载药胶束，在纳米载药胶束形成过程中，上述疏水性抗癌药物4进入纳米载药胶束的疏水内核中，自动组装成如图3所示的抗癌药物，具体地，该抗癌药物组装如图4所示。因此，该抗癌药物制备方法只需将疏水性抗癌药物4和纳米载药胶束溶解后，通过透析，自动形成对疏水性抗癌药物4的负载，因此，其制备方法易控，疏水性抗癌药物4被负载率高。

下面结合具体实施方法对本发明进行进一步的说明。

实施例1：

一种纳米载药胶束及其制备方法。该纳米载药胶束的制备方法如下：

S11.HA-ADH衍生物的制备：20g（0.05mol）透明质酸（HA，MW10K）溶于5L去离子水，向其水溶液中加入30g（0.17mol）己二酰肼（ADH），快速搅拌下用0.1M的盐酸溶液调节pH值到4.5-4.8，向上述反应溶液中加入19g（0.1mol）EDC，再用0.1M的盐酸溶液调节pH值在4.5-4.8后在常温下反应1h，透析，冻干，得到白色固体HA-ADH衍生物，取10g HA-ADH溶解于2.4L甲酰胺中备用；

S12.二氢卟吩e6（Ce6）的活化：将缩合剂EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶液加入24g（0.04mol）Ce6的甲酰胺溶液中进行缩合活化反应，得到被活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液；其中，所述二氢卟吩e6与NHS、EDC的摩尔比为1：1.2：1.2；

S13.HA-ADH-Ce6纳米载药胶束的制备：将步骤S12中活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液滴加到步骤S11配制的HA-ADH的甲酰胺溶液中，滴加完毕之后在常温下反应24h。反应结束后液减压抽滤，除去大颗粒不溶物，将滤液置于纤维素透析袋中，先用50%甲醇水溶液透析一天，再用去离子水透析二天，后冻干处理，得到平均粒径为50-200nm的纳米载药胶束。

在步骤S13的透析过程中，HA自动组装成壳体，将ADH基团、Ce6基团包覆其内，而Ce6基团在HA的壳体内自动形成疏水性内核，其结构如图1所示。

实施例2：

一种纳米载药胶束及其制备方法。该纳米载药胶束的制备方法如下：

S21.HA-ADH衍生物的制备：20g（0.05mol）透明质酸（HA，MW10K）溶于5L去离子水，向其水溶液中加入40g（0.23mol）己二酰肼（ADH），快速搅拌下用0.1M的盐酸溶液调节pH值到4.5-4.8。向上述反应溶液中加入25g（0.13mol）EDC，再用0.1M的盐酸溶液调节pH值在4.5-4.8后在常温下反应1h，透析，冻干，得到白色固体HA-ADH衍生物，取10g HA-ADH溶解于2.4L甲酰胺中备用。

S22.二氢卟吩e6（Ce6）的活化：将缩合剂EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶液加入18g（0.03mol）Ce6的甲酰胺溶液中进行缩合活化反应，得到被活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液；其中，所述二氢卟吩e6与NHS、EDC的摩尔比为1：1.5：1.5；

S23.HA-ADH-Ce6纳米载药胶束的制备：将步骤S22中活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液滴加到步骤S21配制的HA-ADH的甲酰胺溶液中，滴加完毕之后在常温下反应24h。反应结束后液减压抽滤，除去大颗粒不溶物，将滤液置于纤维素透析袋中，将滤液置于纤维素透析袋中，于蒸馏水中透析24小时，后冻干处理，得到平均粒径为50-200nm的纳米载药胶束。

在步骤S23的透析过程中，HA自动组装成壳体，将ADH基团、Ce6基团包覆其内，而Ce6基团在HA的壳体内自动形成疏水性内核，其结构如图1所示。

实施例3：

一种纳米载药胶束及其制备方法。该纳米载药胶束的制备方法如下：

S31.HA-ADH衍生物的制备：20g（0.05mol）透明质酸溶（HA，MW10K）于5L去离子水，向其水溶液中加入50g（0.28mol）己二酰肼（ADH），快速搅拌下用0.1M的盐酸溶液调节pH值到4.5-4.8。向上述反应溶液中加入32g

（0.17mol）EDC，再用0.1M的盐酸溶液调节pH值在4.5-4.8后在常温下反应1h，透析，冻干，得到白色固体HA-ADH，取10g HA-ADH溶解于2.4L甲酰胺中备用。

S32.二氢卟吩e6（Ce6）的活化：将缩合剂EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶液加入30g（0.05mol）Ce6的甲酰胺溶液中进行缩合活化反应，得到被活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液；其中，所述二氢卟吩e6与NHS、EDC的摩尔比为1：2：2；

S33.HA-ADH-Ce6纳米载药胶束的制备：将步骤S32中活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液滴加到步骤S31配制的HA-ADH的甲酰胺溶液中，滴加完毕之后在常温下反应24h。反应结束后液减压抽滤，除去大颗粒不溶物，将滤液置于纤维素透析袋中，先用50%甲醇水溶液透析一天，再用去离子水透析二天，后冻干处理，得到平均粒径为50-200nm的纳米载药胶束。

在步骤S33的透析过程中，HA自动组装成壳体，将ADH基团、Ce6基团包覆其内，而Ce6基团在HA的壳体内自动形成疏水性内核，其结构如图1所示。

实施例4：

一种纳米载药胶束及其制备方法。该纳米载药胶束的制备方法如下：

S41.HA-ADH衍生物的制备：20g（0.05mol）透明质酸溶（HA，MW100K）于5L去离子水，向其水溶液中加入30g（0.17mol）己二酰肼（ADH），快速搅拌下用0.1M的盐酸溶液调节pH值到4.5-4.8。向上述反应溶液中加入1.9g

（0.001mol）EDC，再用0.1M的盐酸溶液调节pH值在4.5-4.8后在常温下反应1h，透析，冻干，得到白色固体HA-ADH，取10g HA-ADH溶解于2.4L甲酰胺中备用。

S42.二氢卟吩e6（Ce6）的活化：将缩合剂EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶液加入2.4g（0.004mol）Ce6的甲酰胺溶液中进行缩合活化反应，得到被活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液；其中，所述二氢卟吩e6与NHS、EDC的摩尔比为1：1.2：1.2；

S43.HA-ADH-Ce6纳米载药胶束的制备：将步骤S32中活化后的Ce6-NHS甲酰胺溶液滴加到步骤S31配制的HA-ADH的甲酰胺溶液中，滴加完毕之后在常温下反应24h。反应结束后液减压抽滤，除去大颗粒不溶物，将滤液置于纤维素透析袋中，先用50%甲醇水溶液透析一天，再用去离子水透析二天，后冻干处理，得到平均粒径为50-200nm的纳米载药胶束。

在步骤S43的透析过程中，HA自动组装成壳体，将ADH基团、Ce6基团包覆其内，而Ce6基团在HA的壳体内自动形成疏水性内核，其结构如图1所示。

将本实施例4提供的纳米载药胶束进行电镜、粒径和荧光发射光谱分析，分析结果如下：

电镜分析：将本实施例4提供的纳米载药胶束进行电镜照片如图5所示，由图5可看出，纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm。

粒径分布图：粒径分布分析结果如图6所示，由图6可看出，该纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm，但其颗粒主要集中在100nm左右。

荧光发射光谱分析：将纳米载药胶束分别溶解在水、二甲基亚砜（DMSO）/水（9:1）溶剂中，分别配制成浓度为50ug/mL的HA-Ce6的水溶液和HA-Ce6的DMSO/水（9:1）溶液，然后分别以400nm波长的光激发对两溶液进行荧光发射光谱分析。纳米载药胶束的荧光发射光谱分析结果如图7所示，其中，曲线1为HA-Ce6的水溶液荧光发射光谱；曲线2为HA-Ce6的DMSO/水（9:1）溶液荧光发射光谱。由图7可看出，HA-Ce6的水溶液荧光发射光谱处于荧光猝灭状态，而HA-Ce6的DMSO/水（9:1）溶液在660nm的近红外区有明显的发射光谱。这是因为，在HA-Ce6的水溶液中，HA-Ce6纳米颗粒包裹完整，Ce6基团被HA壳层包覆；而在HA-Ce6的DMSO/水（9:1）溶液中，HA-Ce6并没有形成包覆结构，呈散开状，因此，能检测出-Ce6基团的荧光性。

实施例5：

一种酶敏型抗肿瘤抗癌药物及其制备方法。该酶敏型抗肿瘤抗癌药物结构如图3所示，包括上述实施例1提供的纳米载药胶束和负载在纳米载药胶束的疏水内核中的疏水性抗癌药物。其中，纳米载药胶束与疏水性抗癌药物的质量比为1：0.08。

该酶敏型抗肿瘤抗癌药物的制备方法为：将实施例1提供的纳米载药胶束和疏水性抗癌药物溶解于甲酰胺中，将形成的混合有机溶液进行透析处理，冻干。其中，混合有机溶液中的纳米载药胶束浓度为0.5g/L，疏水性抗癌药物的胶束浓度为0.25g/L。

将本实施例5提供的载药纳米胶束进行电镜和粒径分析，分析结果如下：

电镜分析：将本实施例4提供的纳米载药胶束进行电镜照片如图8所示，由图8可看出，纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm。

粒径分布图：粒径分布分析结果如图9所示，由图9可看出，该纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm，但其颗粒主要集中在90nm左右。

实施例6：

一种酶敏型抗肿瘤抗癌药物及其制备方法。该酶敏型抗肿瘤抗癌药物结构如图3所示，包括上述实施例4提供的纳米载药胶束和负载在纳米载药胶束的疏水内核中的疏水性抗癌药物。其中，纳米载药胶束与疏水性抗癌药物的质量比为1：0.08。

该酶敏型抗肿瘤抗癌药物的制备方法为：将实施例1提供的纳米载药胶束和疏水性抗癌药物溶解于甲酰胺中，将形成的混合有机溶液进行透析处理，冻干。其中，混合有机溶液中的纳米载药胶束浓度为0.5g/L，疏水性抗癌药物的胶束浓度为1g/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种纳米载药胶束，包括透明质酸和通过己二酰肼基团连接在所述透明质酸直链上的二氢卟吩e6基团，且所述透明质酸将所述己二酰肼基团、二氢卟吩e6基团包覆形成核壳结构，所述二氢卟吩e6基团形成疏水性内核。

2.如权利要求1所述的纳米载药胶束，其特征在于：所述二氢卟吩e6基团与透明质酸的摩尔比为(2～5)：1。

3.如权利要求1所述的纳米载药胶束，其特征在于：所述透明质酸的重均分子量为10K～100K。

4.如权利要求1～3任一项所述的纳米载药胶束，其特征在于：所述纳米载药胶束的平均粒径为50nm～200nm。

5.一种如权利要求1～4任一项所述纳米载药胶束的制备方法，包括如下步骤：

采用己二酰肼在酸性水溶液中对透明质酸进行化学修饰，得到HA-ADH衍生物；

将所述HA-ADH衍生物溶解，向其中加入羧基被活化后的二氢卟吩e6于室温中进行反应，待反应结束后，将反应后的溶液透析处理，冻干处理，得到所述纳米载药胶束。

6.如权利要求5所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述二氢卟吩e6的羧基被活化方法为：

将缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺加入二氢卟吩e6溶液中进行缩合反应，后进行纯化；其中，所述二氢卟吩e6与N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)。

7.如权利要求6所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述二氢卟吩e6与N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂的摩尔比为1：1.2：1.2。

8.如权利要求6～7任一项所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述缩合剂为碳二亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺中的一种或两种。

9.如权利要求5～7任一项所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述采用己二酰肼在酸性水溶液中对透明质酸进行化学修饰的方法如下：

将所述己二酰肼加入透明质酸的水溶液中后，将水溶液的pH值调至4.5～4.8，加入缩合剂，保持pH值为4.5～4.8，使得所述己二酰肼与透明质酸进行缩合反应。

10.如权利要求9所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述透明质酸与己二酰肼、缩合剂的摩尔比为1:(4～6):(0.4～0.6)。

11.如权利要求9所述的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：所述缩合剂为碳二亚胺。

12.一种抗癌药物，包括疏水性抗癌药物和负载所述疏水性抗癌药物的载体，所述载体为权利要求1～4任一项所述的纳米载药胶束或权利要求5～11任一项所述纳米载药胶束的制备方法制备获得的纳米载药胶束，且所述疏水性抗癌药物负载在所述纳米载药胶束的疏水性内核中。

13.如权利要求12所述的抗癌药物，其特征在于：所述疏水性抗癌药物与载体的质量比为(0.05～0.2):1；和/或所述疏水性抗癌药物为阿霉素；紫杉醇；喜树碱中的至少一种。

14.一种如权利要求12～13任一项抗癌药物的制备方法，包括如下步骤：

将所述纳米载药胶束和疏水性抗癌药物溶解于有机溶剂中，将形成的混合有机溶液进行透析处理。

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