CN108265052A - 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 - Google Patents

一种小干扰核酸和药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种小干扰核酸和药物组合物及其用途，该siRNA含有完全互补的正义链和反义链，所述正义链含有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；所述siRNA的磷酸‑糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基上具有或不具有修饰基团。本公开提供了全新高效的siRNA及其药物组合物，可以有效预防和/或治疗血脂异常。

Description

一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种小干扰核酸(siRNA)、一种药物组合物以及它们的用途。
背景技术
血脂异常，又名高脂血症，是脂肪代谢或运转异常，使血浆脂质高于正常值的一种全身性疾病。高脂血症的临床表现主要包括两大方面：(1)脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤；(2)脂质在血管内皮沉积所引起的动脉粥样硬化，产生冠心病和周围血管病等。据报道，全世界大约有35％的二型糖尿病患者也患有血脂异常。我国18岁及以上人群血脂异常患病率约为18.6％，甚至儿童中也有近10％者血脂升高，还有逐渐上升的趋势。血脂异常严重威胁着患者的健康。
现有的治疗血脂异常的药物主要有他汀类、胆固醇吸收抑制剂、树脂类、普罗步考、贝特类和烟酸及其衍生物。这些药物使用后或多或少都会有一些禁忌症和副反应，例如在2001年被曝出有31例服用他汀类降脂药拜斯亭的病人先后死于严重的肌病的案例。因此，亟需开发针对血脂异常的新药物和新疗法。
目前研究发现前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PSCK9)的高表达会导致肝细胞表面低密度脂蛋白受体的减少，进而导致肝细胞对低密度脂蛋白颗粒清除能力下降，PSCK9的高表达量会引起高胆固醇和早发心血管疾病。PSCK9的低表达可以减缓血脂异常，因此抑制PSCK9的表达可以有效预防和/或治疗血脂异常，设计合适的小干扰RNA(Smallinterfering RNA；siRNA)序列可以专一性的降低PSCK9 mRNA的表达。siRNA通过装载入沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，与靶标基因的mRNA的靶核酸互补配对，使靶标基因的mRNA降解，从而抑制靶标基因的表达。但是siRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点。开发有效预防和/或治疗血脂异常的siRNA及其药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
发明内容
本公开的目的是提供一种针对PSCK9基因的高效siRNA序列和其药物组合物，该药物组合物有效预防和/或治疗血脂异常。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种siRNA，该siRNA含有完全互补的正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；
其中，
正义链5’-UGAAGUUGCCCCAUGUCGA-3’(SEQ ID NO.18)，
反义链5’-UCGACAUGGGGCAACUUCA-3’(SEQ ID NO.19)；
正义链5’-GCCUGGUGGAGGUGUAUCU-3’(SEQ ID NO.20)，
反义链5’-AGAUACACCUCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO.21)。
第二方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。
第三方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物。
第四方面，本公开提供了如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途。
第五方面，本公开提供了一种预防和/或治疗血脂异常的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物给予有需要的患者。
第六方面，本公开提供了一种抑制肝细胞中PSCK9基因表达的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物导入所述肝细胞。
通过上述技术方案，本公开提供了一种有效预防和/或治疗血脂异常的siRNA和含该siRNA的药物组合物，通过该siRNA或者含该siRNA的药物组合物抑制PSCK9基因的表达引起了血液中低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量的下降，有效预防和/或治疗血脂异常。具体表现为，本公开提供的siRNA具有良好的活性，在细胞水平上，50nM的siRNA对PCSK9 mRNA的抑制率高达80％以上。本公开提供的修饰的siRNA活性保持不变，同时能够在血清中稳定存在72小时以上。特别地，本公开提供的由有机胺、辅助脂质、聚乙二醇化脂质形成的药学上可接受的载体与本公开的siRNA形成的特定药物组合物，显著抑制了人PSCK9转基因小鼠肝脏组织中PSCK9的表达水平，通过尾静脉每周单次施以本公开提供的药物组合物，给药剂量1mg/kg，连续给药4周，PSCK9 mRNA的抑制率最高可接近85％；经本公开药物组合物治疗的人PSCK9转基因小鼠血液中低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇的含量明显下降，其中，低密度脂蛋白胆固醇的含量可下降30％左右，总胆固醇的含量可下降60％-70％，而高密度脂蛋白胆固醇的含量呈现一定水平的上升，显示出积极的治疗效果。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是siRNA在体外人血浆中的稳定性检测的电泳图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，PSCK9是指mRNA序列如Genbank注册号NM_174936.3所示的基因。
第一方面，本公开提供了一种siRNA，该siRNA含有完全互补的正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；
其中，
正义链5’-UGAAGUUGCCCCAUGUCGA-3’(SEQ ID NO.18)，
反义链5’-UCGACAUGGGGCAACUUCA-3’(SEQ ID NO.19)；
正义链5’-GCCUGGUGGAGGUGUAUCU-3’(SEQ ID NO.20)，
反义链5’-AGAUACACCUCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO.21)。
本公开正义链如SEQ ID NO.18所示、反义链如SEQ ID NO.19所示的siRNA的靶核酸序列如SEQ ID NO.1(UGAAGUUGCCCCAUGUCGA)所示，其中，所述siRNA的靶核酸是指PSCK9的mRNA(NM_174936.3)编码区中第404-422位，可以与SEQ ID NO.19所示的反义链相互杂交的片段；本公开正义链如SEQ ID NO.20所示、反义链如SEQ ID NO.21所示的siRNA的靶核酸序列如SEQ ID NO.2(GCCUGGUGGAGGUGUAUCU)所示，其中，所述siRNA的靶核酸是指PSCK9的mRNA(NM_174936.3)编码区中第533-551位，可以与SEQ ID NO.21所示的反义链相互杂交的片段。
为了增强siRNA双链的稳定性，按照本公开的一个实施方式，相互互补的正义链和反义链中至少一条单链的3’末端还连有1至3个额外的核苷酸；从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端。优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(即dTdT)或尿嘧啶核苷酸(即UU)；优选地，所述正义链和所述反义链中都含有3’突出端。
为了进一步提高siRNA在血液中的稳定性，避免在体内遭到核酸酶降解，按照本公开的一个实施方式，相互互补的正义链和反义链中的至少一条单链中的至少一个核苷酸为含有修饰基团的核苷酸，所述修饰基团可以是现有的各种起到提高siRNA稳定性的修饰基团。这些修饰方式可参见Watts,J.K.,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemicallymodified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008.13(19-20):p.842-55。
在本公开的一些实施方式中，本公开提供的siRNA为含有如下修饰基团中的至少一种的siRNA：1)所述相互互补的所述正义链和所述反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基，2)所述相互互补的所述正义链和所述反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的核糖基中的至少一部分为具有修饰基团的核糖基。优选情况下，具有修饰基团的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基或者为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基；具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基。所述硫代磷酸酯基结构如式(1)所示：
根据本公开第一方面，本公开的发明人惊奇地发现，该siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团时具有更好的使用效果：
所述siRNA的正义链SEQ ID NO.18核苷酸序列的第1、7、12和14位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链SEQ ID NO.19核苷酸序列的第5、7和18位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO.20核苷酸序列的第1、2、4、7、13、15和17位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链SEQ ID NO.21核苷酸序列的第4、8和15位的糖基为2’-氟代核糖基。
根据本公开的第一方面，优选地，所述相互互补的正义链和反义链中至少一条单链的3’末端还连接有2至3个额外的核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由2至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(即dTdT)或尿嘧啶核苷酸(即UU)；优选地，所述正义链和所述反义链都含有3’突出端。按照本公开的一个优选的实施方式，该siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第20位和第21位之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
按照一个更为优选的实施方式，本公开提供的siRNA具有如SEQ ID NO.24所示的正义链和SEQ ID NO.25所示的反义链；或者具有如SEQ ID NO.28所示的正义链和SEQ IDNO.29所示的反义链。该siRNA具有出乎意料的抑制PSCK9 mRNA表达的活性和稳定性。
其中，
正义链：5’-U(M)GAAGUU(M)GCCCC(M)AU(M)GUCGAdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.24)，
反义链：5’-UCGAC(F)AU(F)GGGGCAACUUC(F)AdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.25)，
正义链：5’-G(M)C(M)CU(M)GGU(M)GGAGGU(M)GU(M)AU(M)CUdT-S-dT-3’(SEQ IDNO.28)，
反义链：5’-AGAU(F)ACAC(F)CUCCACC(F)AGGCdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.29)，
其中，(M)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-甲氧基核糖基，(F)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-氟代核糖基；S代表其左右两侧的脱氧核糖核苷酸残基dTdT之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
本领域技术人员清楚知晓的是，通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成)可以得到本公开所述的siRNA，其中，固相合成已经有商业化订制服务；本领域技术人员也清楚知晓，通过使用具有相应修饰的核苷酸单体可以将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，其中，制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法是本领域技术人员所熟知的，市场上也有商业化的单体供应。
第二方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的siRNA和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如Fe3O4、Fe2O3)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。在本公开的药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，优选为1：(1-50)。
所述药物组合物还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH缓冲液可以为pH7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为(200-700)mOsm/kg。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。
根据本公开的第二方面，优选情况下，所述药学上可接受的载体优选为含胺的转染试剂，所述的含胺的转染试剂含有有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质；其中，所述有机胺可以选自CN201180060664.1中所述的含胺的转染化合物和/或其药学上可接受的盐。本公开的发明人意外发现，本公开提供的含有siRNA和所述含胺的转染试剂的特定的药物组合物，在进一步提高所述药物组合物的稳定性和对肝脏的靶向性的同时不影响siRNA本身的活性，具有良好的的临床应用前景。更优选地，所述有机胺为如式(2)所示的化合物和/或其药学上可接受的盐：
其中：
X1和X2各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R2是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R3和在式(2)中的氮形成如式(3)或式(4)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式(2)中的氮原子。
在某些实施方式中，R3是多胺。在其它实施方式中，R3是缩酮。在某些实施方式中，在式(2)中的R1和R2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在某些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，R3可以是下述式(5)-式(14)中的任一个：
其中，式(5)-式(14)中，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R3与在式(2)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(2)中的氮原子的连接。
其中，式(2)所示化合物可以根据CN201180060664.1中的描述制备。
根据本公开的第二方面，特别优选地，所述有机胺为如式(15)所示的有机胺和/或如式(16)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
根据本公开的第二方面，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。
优选地，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。
由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
本公开提供的药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备；优选地，本公开提供的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物可以根据CN201180060664.1中的描述方法制备；更优选地，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，优选为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400中的一种或多种，优选为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，优选为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，优选为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，优选为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，优选为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，优选5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，优选1:3。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；优选地，pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，优选使用切相流系统，中空纤维柱，在100KDa条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，优选在0.22μm滤器上过滤除菌。
第三方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物。
按照本公开提供的试剂盒，siRNA、药学上可接受的载体和辅料可以单独存在，以其中两种或两种以上的的混合物的形式存在，或者以最终药物组合物的形式存在。当药学上可接受的载体单独存在且所述载体为上述含胺转染试剂时，有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可以各自独立存在，也可以以其中两种或三种的混合物的形式存在。在一个实施方式中，可使一个容器用于提供siRNA、另外一个或多个容器用于提供有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，任选地另外一个或多个容器提供辅料。
除了siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以外，所述试剂盒中还可包含实现本公开提供的药物组合物的一种或多种特定应用所必需或有益的组分，如(1)一种或多种用于实现所希望的细胞转染的组分，(2)一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分，如一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂，(3)一种或多种缓冲剂，(4)阳性或阴性对照样品，(5)赋形剂、稳定剂或防腐剂等。一般来说，所述组分存在于与siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料的容器均不同的容器中。此外，所述试剂盒还可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。可任选地在本公开的试剂盒中提供无菌水、生理盐水、PBS中的一种或多种。
第四方面，本公开提供了如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途，其中，所述血脂异常包括但不限于高胆固醇血症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化。
第五方面，本公开提供了一种预防和/或治疗血脂异常的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物给予有需要的患者。
通过将本公开的siRNA和/或药物组合物给予有需要的患者，可以通过RNA干扰的机制达到预防和/或治疗血脂异常的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物可用于预防和/或治疗血脂异常，或用于制备用于预防和/或治疗血脂异常的药物。
本公开所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将siRNA或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将siRNA或药物组合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述siRNA或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗血脂异常的手段，优选能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以用LD50/ED50的比值来表示。优选显示出高治疗指数的siRNA或药物组合物。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的人PCSK9转基因小鼠(C57BL/6J-Tg(ALB-PCSK9)1Pfi)，通过静脉给药的方式，以所述药物组合物中的siRNA的量计：对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，优选为0.01-10mg/kg体重，更优选为0.05-5mg/kg体重，最优选为0.1-3mg/kg体重；在给予本公开所述的siRNA时，可参考上述用量。
第六方面，本公开提供了一种抑制细胞中PSCK9基因表达的方法，该方法包括将如第一方面所述的siRNA和/或如第二方面所述的药物组合物导入所述细胞，通过RNA干扰的机制达到抑制细胞中PSCK9基因表达的目的，所述细胞为肝细胞。在一个优选的实施方式中，所述细胞为HepG2细胞。
采用本公开提供的方法抑制PSCK9基因在细胞中表达，无论使用提供的siRNA还是药物组合物，siRNA用量一般是足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处100pM至1μM、或1nM至100nM、或5nM至50nM或至约10nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
除非特别说明，本公开所用到的试剂、培养基等试验材料均为市售商品。
制备例1
本制备例中siRNA的序列如表2所示，编号为siPC9-1的正义链核苷酸序列如SEQID NO.4所示，其中1-19位核苷酸序列与人PSCK9 mRNA序列(NM_174936.3)中如SEQ IDNO.1所示的靶核酸相同；该siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中1-19位核苷酸序列与如表1中SEQ ID NO.1所示的靶核酸互补。编号为siPC9-2的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中1-19位核苷酸序列与PSCK9 mRNA序列中如SEQ ID NO.2所示的靶核酸相同；该siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中1-19位核苷酸序列与如表1中SEQ ID NO.2所示的靶核酸互补。编号为siPC9-3的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中1-19位核苷酸序列与PSCK9 mRNA序列中如SEQ ID NO.3所示的靶核酸相同；该siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中1-19位核苷酸序列与如表1中SEQ IDNO.3所示的靶核酸互补。
如表2所示本制备例还设置了正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的siRNA，编号为siNC。siNC为与PSCK9 mRNA无对应靶位点的无关序列，作为阴性对照。
siRNA的寡聚核苷酸单链按照本领域公知的方法进行化学合成，合成时在寡聚核苷酸单链的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT。siRNA互补的正义链和反义链退火形成双链，从而使得双链的两端分别具有dTdT的3’突出端。
表1
基因名称 SEQ ID No. 核苷酸序列(5′→3′) 对应的编码区靶位点序列
PSCK9 1 UGAAGUUGCCCCAUGUCGA 404-422
PSCK9 2 GCCUGGUGGAGGUGUAUCU 533-551
PSCK9 3 GUCACAGAGUGGGACAUCA 1140-1158
表2
实施例1
本实施例用于检测制备例1中得到的siRNA在HepG2细胞上对PSCK9 mRNA表达水平的抑制率。
将人类肝癌细胞株HepG2(购自ATCC)用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
将24孔板中细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL Opti-MEM无血清培养基。分别将1.5μL浓度为20μM制备例1中的siRNA用50μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μLLipofectamineTM2000(Invitrogen公司)稀释于50μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许复合物的形成。在接种有HepG2细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液。siRNA的最终浓度约为50nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了siNC、siPC9-1、siPC9-2和siPC9-3的HepG2细胞中PSCK9 mRNA的表达量。具体步骤为：培养转染的细胞24小时后，使用RNAVzol(Vigorous公司，货号N002)提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(Promega公司，货号A3500)的使用方法反转录得到cDNA。使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行PSCK9 mRNA的表达量的检测。其中，用于扩增PSCK9和作为内参基因的β-actin的PCR引物如表3所示。
表3
siRNA对PSCK9 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(实验组PSCK9 mRNA的表达量/实验组β-Actin mRNA的表达量)/(阴性对照组PSCK9 mRNA的表达量/阴性对照组β-Actin mRNA的表达量)]×100％。其中，各实验组为分别经siPC9-1、siPC9-2和siPC9-3处理的HepG2细胞；等量siNC处理的HepG2细胞作为阴性对照组。结果如表4所示。
表4
siRNA mRNA抑制率(％)
siNC 0
siPC9-1 82
siPC9-2 90
siPC9-3 8.4
从表4可以看出，本公开的siPC9-1和siPC9-2具有很高的抑制活性，50nM上述siRNA在HepG2细胞上对PSCK9 mRNA表达水平的抑制率达80％以上，而siPC9-3却几乎没有活性(mRNA抑制率仅约为8％)。可见，siPC9-1和siPC9-2能够高效抑制靶标基因PSCK9的表达。
制备例2
编号siNC的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的siRNA如表5所示，编号为siNC-M；编号siPC9-1的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的2组siRNA如表5所示，分别编号为siPC9-1-M1和siPC9-1-M2。编号siPC9-2的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的2组siRNA如表5所示，分别编号为siPC9-2-M1和siPC9-2-M2。其中(M)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-甲氧基核糖基，(F)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-氟代核糖基；S代表其左右两侧的脱氧核糖核苷酸残基dTdT之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
表5
实施例2
本实施例用于检测制备例1和制备例2中得到的siRNA在HepG2细胞上对PSCK9mRNA表达水平的抑制率。实验方法同实施例1，siRNA终浓度为50nM和10nM，检测结果如表6所示。
表6
从表6可以看出，经化学修饰的siRNA(siPC9-1-M1和siPC9-2-M1)分别与未修饰的siRNA(siPC9-1和siPC9-2)相比，其抑制活性相当，50nM siRNA活性可达80％以上，仍然可以高效抑制靶标PSCK9 mRNA的表达。而采用其他修饰方案得到的siPC9-1-M2和siPC9-2-M2却几乎没有活性。
实施例3
本实施例用于检测制备例1和制备2中得到的siRNA在体外人血浆中的稳定性。
取浓度为20μM的上述修饰和未修饰的siRNA各10μL分别与90μL 50％人类血浆(Human plasma，PBS稀释)混合后，在37℃下体外孵育0、2、4、6、8、24、48和72小时后得到处理样品。取处理样品10μL，并立即进行液氮速冻，冻存于-80℃备用。8个时间点取样完成后，用1×PBS(pH7.4)稀释5倍，然后将各样品的每个时间点处理样品取10μL进行20％的PAGE凝胶电泳。配制20％的聚丙烯酰胺凝胶，将使用pH7.4的1×PBS稀释液稀释5倍的上述样品10μL与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36％甘油，0.06％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen公司，货号11494)染色15分钟后凝胶成相，观察。
图1显示siNC、siNC-M、siPC9-1、siPC9-1-M1、siPC9-1-M2、siPC9-2、siPC9-2-M1、siPC9-2-M2的核酸序列在血浆环境中的稳定性检测结果，其中，M为未经人血浆处理的等量的siRNA标记，siNC-M在人血浆环境中稳定存在作为阳性对照。结果显示，未经修饰的siPC9-1和siPC9-2加入人血浆后不能稳定存在，在2h时主带(指与M所示的条带平行的带，代表全长序列)已发生降解；而经修饰的siPC9-1-M1和siPC9-2-M1加入血浆中并孵育一定时间后，其主带在血浆中稳定存在的时间能够延续至72h，甚至更长时间，大大地推迟了siRNA的降解时间，或不降解，表现出很高的血浆稳定性。说明本公开提供的已修饰siRNA具有作为药物在动物体中使用的可能。
制备例3
本制备例用来制备siRNA药物组合物RBP131/siRNA及RBP130/siRNA。
将三种干粉脂质化合物，即有机胺(如式(15)或式(16)所示，其制备方法参见CN201180060664.1中的化合物87或72)、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]按照59:29:12的摩尔比悬浮于乙醇中并混匀得到脂质乙醇溶液，其总质量浓度为8.85mg/mL。将siNC-M、siPC9-1-M1和siPC9-2-M1分别溶解于200mM醋酸钠(pH5.2)溶液中，使siRNA的浓度为0.2mg/mL得到siRNA醋酸钠水溶液。快速混合1体积脂质乙醇溶液和3体积的siRNA醋酸钠水溶液。混合后脂质体制剂的具体组成如表7所示。
表7
将混合后得到的脂质体制剂在50℃孵育10分钟，将孵育后的脂质体制剂使用切相流系统，中空纤维住100KDa超滤，超滤交换溶液为pH7.4的PBS。超滤的同时将制剂的siRNA浓度浓缩或稀释到目标值。超滤后的制剂在0.22μm滤器上过滤除菌。
将由式(15)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的含胺的转染试剂称为RBP131；由式(16)所示的有机胺、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的含胺的转染试剂称为RBP130。所得药物组合物RBP131/siRNA或RBP130/siRNA在使用前储存在4℃，并检测相关理化性质，RBP131/siRNA和RBP130/siRNA的理化参数相似，检测结果见表8。
表8
检测指征 结果
pH 7.2-7.6
包封率(％) ≥90％
siRNA浓度(mg/mL) 0.10-0.15
粒径(nm) 60-100
多分散指数 ≤0.2
渗透压(mOsm/kg) 300-400
其中，包封率采用RiboGreen法检测，所用试剂(Quant-iTTM RNA Reagentand Kit)购于Thermo Fisher(Invitrogen)公司，货号R11490。根据说明书操作步骤检测样品中siRNA的荧光强度，再按照文献(J.Heyes et.al,Journal of Controlled Release,107(2005):276–287)所述方法计算包封率：
包封率＝[(Triton处理组荧光强度-无Triton处理组荧光强度)/Triton处理组荧光强度]×100％
其他理化参数采用本领域技术人员熟知的常规技术手段检测。
实施例4
本实施例用于检测制备例3中的RBP131/siRNA药物组合物在人PCSK9转基因小鼠(C57BL/6J-Tg(ALB-PCSK9)1Pfi，购于Charles River Laboratories International,Inc.)体内对肝脏组织中PSCK9表达水平的抑制率和对血脂(血液中低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及总胆固醇)含量的影响。
(1)小鼠的给药方法
将6-8周龄人PCSK9转基因小鼠随机分成5组，每组6只(雌雄各半)，分组如下：(1)PBS对照组(1×PBS)；(2)阴性对照组(RBP131/siNC-M)；(3)阳性对照组(阿托伐他汀，Atorvastatin)；(4)RBP131/siPC9-1-M1组；(5)RBP131/siPC9-2-M1组。所有动物根据小鼠体重计算药量。阳性对照组阿托伐他汀采用灌胃方式给药，给药剂量为0.5mg/kg，给药体积为10mL/kg，每天给药一次。其余组别动物采用尾静脉注射方式进行给药，siRNA给药剂量为1mg/kg，给药体积为10mL/kg，每周给药一次。所有组别动物给药时间持续4周，末次给药48h后采集全血及肝脏组织。
(2)小鼠肝脏组织PSCK9表达水平检测
将采集的肝脏组织放入RNAlater(Sigma Aldrich公司，货号R0901)中保存；使用组织匀浆仪匀浆肝脏组织，再用TRIzol(Thermo Fisher公司，货号15596026)根据说明书操作步骤提取得到总RNA。将总RNA反转录为cDNA，然后采用实时荧光定量PCR方法检测肝组织中PSCK9的表达水平；反转录与实时荧光定量PCR具体步骤参照实施例1，用于扩增PSCK9的PCR引物如表3所示，作为内参基因的β-actin的PCR引物如表9所示。siRNA对PSCK9表达抑制率的计算参见实施例1，具体结果如表10所示。
表9
(3)小鼠血液中LDL-C、HDL-C及TC含量检测
将采集的全血进行离心得到血清，进一步使用SABA PM4000全自动生化分析仪(意大利)，根据北京中生北控生物科技股份有限公司试剂盒说明书的操作步骤，检测血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及总胆固醇(TC)的含量。
以PBS对照组的血脂含量为100％基准，血脂水平变化率按如下公式计算：血脂变化率＝(待测组血脂数据均值/PBS组血脂数据均值)×100％。检测结果表10所示。
表10
经表10中各组药物组合物比较可以看出，在人PCSK9转基因小鼠模型上，通过尾静脉每周单次施以本公开所使用的RBP131/siPC9-1-M1药物组合物和RBP131/siPC9-2-M1药物组合物，给药剂量1mg/kg，连续给药4周，PSCK9 mRNA的抑制率达到75％以上，最高可接近85％，同时对给药后小鼠血清中LDL-C、HDL-C及TC的含量进行了检测，结果显示在给药后，经RBP131/siPC9-1-M1和RBP131/siPC9-2-M1药物组合物治疗的人PCSK9转基因小鼠血清中LDL-C的含量可下降30％左右，TC的含量可下降60％-70％，HDL-C水平有一定的上升，均显示出积极的治疗效果。而药物组合物RBP131/siNC-M在人PCSK9转基因小鼠体内对PSCK9mRNA的抑制率仅为3％，血液中LDL-C和TC的含量也未发生下降。同时本公开的药物组合物与阳性药物阿托伐他汀比较，RBP131/siPC9-1-M1药物组合物和RBP131/siPC9-2-M1药物组合物，减少了给药次数，延长了给药时间间隔，血液中LDL-C及TC的含量下降更为显著，有着非常明显的优势及光明的药用前景。
此外，采用相同的方法，对制备例3中得到的RBP130/siRNA药物组合物进行了测试，测试结果与RBP131/siRNA药物组合物类似。
本公开提供的siRNA是一种有效预防和/或治疗血脂异常的全新手段，通过抑制PSCK9基因的表达引起了血液中低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量的下降，有效预防和/或治疗血脂异常；另外本公开提供的RBP131/siRNA或RBP130/siRNA药物组合物靶向肝脏，可有效降低肝脏中PSCK9基因的表达，预防和/或治疗血脂异常。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
<130> 5673RIBO
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ugaaguugcc ccaugucga 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gccuggugga gguguaucu 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gucacagagu gggacauca 19
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<220>
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<223> n is dT.
<400> 4
ugaaguugcc ccaugucgan n 21
<210> 5
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ucgacauggg gcaacuucan n 21
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gccuggugga gguguaucun n 21
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agauacaccu ccaccaggcn n 21
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gucacagagu gggacauca 19
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<211> 19
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ugauguccca cucugugac 19
<210> 10
<211> 21
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uucuccgaac gugucacgun n 21
<210> 11
<211> 21
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acgugacacg uucggagaan n 21
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aggggaggac atcattggtg 20
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ccaaccgcga gaagatga 18
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ccagaggcgt acagggatag 20
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tcagggagta atggttggaa t 21
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ggtctcaaac ataatctggg tca 23
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 18
ugaaguugcc ccaugucga 19
<210> 19
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 19
ucgacauggg gcaacuuca 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 20
gccuggugga gguguaucu 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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agauacaccu ccaccaggc 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<400> 22
uucuccgaac gugucacgun n 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<400> 23
acgugacacg uucggagaan n 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
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<223> n is dT.
<400> 24
ugaaguugcc ccaugucgan n 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<400> 25
ucgacauggg gcaacuucan n 21
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<212> RNA
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ugaaguugcc ccaugucgan n 21
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<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
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ucgacauggg gcaacuucan n 21
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<212> RNA
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gccuggugga gguguaucun n 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
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agauacaccu ccaccaggcn n 21
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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gccuggugga gguguaucun n 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> This sequence is synthesized in lab.
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<222> (20)..(21)
<223> n is dT.
<400> 31
agauacaccu ccaccaggcn n 21

Claims (12)

1.一种siRNA，该siRNA含有完全互补的正义链和反义链，其中，所述正义链含有如SEQID NO.18所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；
其中，
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，相互互补的正义链和反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至3个额外的核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸或尿嘧啶核苷酸；优选地，所述正义链和所述反义链都含有3’突出端。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中，该siRNA为含有如下修饰基团中的至少一种的siRNA：1)所述相互互补的正义链和反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基，2)所述相互互补的正义链和反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的核糖基中的至少一部分为具有修饰基团的核糖基；
优选地，所述具有修饰基团的核糖基选自2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基和/或2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基；所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基；所述硫代磷酸酯基结构如式(1)所示：
4.根据权利要求3所述的siRNA，其中，该siRNA的磷酸-糖骨架分别具有如下修饰基团：
所述siRNA的正义链SEQ ID NO.18核苷酸序列的第1、7、12和14位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链SEQ ID NO.19核苷酸序列的第5、7和18位的糖基为2’-氟代核糖基；
或者，
所述siRNA的正义链SEQ ID NO.20核苷酸序列的第1、2、4、7、13、15和17位的糖基为2’-甲氧基核糖基，所述siRNA的反义链SEQ ID NO.21核苷酸序列的第4、8和15位的糖基为2’-氟代核糖基。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其中，所述siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第20位和第21位之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
6.根据权利要求5所述的siRNA，其中，该siRNA具有如SEQ ID NO.24所示的正义链和SEQ ID NO.25所示的反义链；或者具有如SEQ ID NO.28所示的正义链和SEQ ID NO.29所示的反义链；
其中，
正义链：5’-U(M)GAAGUU(M)GCCCC(M)AU(M)GUCGAdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.24)，
反义链：5’-UCGAC(F)AU(F)GGGGCAACUUC(F)AdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.25)，
正义链：
5’-G(M)C(M)CU(M)GGU(M)GGAGGU(M)GU(M)AU(M)CUdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.28)，
反义链：5’-AGAU(F)ACAC(F)CUCCACC(F)AGGCdT-S-dT-3’(SEQ ID NO.29)，
其中，(M)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-甲氧基核糖基，(F)代表其左侧的核苷酸残基中核糖基为2’-氟代核糖基；S代表其左右两侧的脱氧核糖核苷酸残基dTdT之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
7.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1：(1-500)；优选地，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为为1：(1-50)。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体含有有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质；其中，所述有机胺为如式(2)所示的化合物和/或其药学上可接受的盐：
其中：
X1和X2各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R2是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R3和在式(2)中的氮形成如式(3)或式(4)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式(2)中的氮原子。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述有机胺为如式(15)所示的有机胺和/或如式(16)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)；优选地，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。
11.权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和/或权利要求7-10中任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血脂异常的药物中的用途；
优选地，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
12.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1-6中任意一项所述的siRNA和/或权利要求7-10中任意一项所述的药物组合物。
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