CN104854242A - PCSK9 iRNA组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向PCSK9基因的RNAi剂例如双链RNAi剂，和使用这类RNAi剂来抑制PCSK9表达的方法以及治疗患有脂质失调例如高脂血症的受试者的方法。

Description

PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
相关申请
本专利申请要求于2012年12月5日提交的美国临时申请号61/733,518、于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/793,530、于2013年10月4日提交的美国临时申请号61/886,916、以及于2013年10月17日提交的美国临时申请号61/892,188的优先权。本申请还涉及2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710的优先权。将前述临时专利申请每一者的全部内容特此通过引用结合在此。
序列表
本申请包括已经以电子方式以ASCII格式提交并且通过引用以其整体并入本文中的序列表。创建于2013年10月29日的所述ASCII拷贝被命名为121301-00420_SL.txt，大小为433,512个字节。
发明背景
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族的一个成员。其他八种哺乳动物枯草杆菌蛋白酶蛋白酶PCSK1-PCSK8(也称为PC1/3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7、和S1P/SKI-1)是加工分泌途径中的很多种蛋白质并且在多样的生物学过程中起作用的前蛋白转化酶(博格龙(Bergeron)F.(2000)《分子内分泌杂志》(J.Mol.Endocrinol.)24，1-22，金斯伯格(Gensberg)K.,(1998)《细胞及发育生物学讨论会文集》(Semin.Cell Dev.Biol.)9，11-17，赛义达(Seidah)N.G.(1999)《大脑研究》(Brain Res.)848，45-62，泰勒(Taylor)N.A.,(2003)《美国实验生物学会联合会杂志》(FASEB J.)17，1215-1227，以及周(Zhou)A.,(1999)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)274，20745-20748)。
已经提出PCSK9在胆固醇代谢中起作用。类似于胆固醇生物合成酶和低密度脂蛋白受体(LDLR)，PCSK9 mRNA表达通过在小鼠中通过饲喂膳食胆固醇被下调(麦克斯韦尔(Maxwell)K.N.,(2003)《脂质研究杂志》(J.Lipid Res.)44，2109-2119)，通过他汀类药物在HepG2细胞中被上调(杜别克(Dubuc)G.,(2004)《动脉硬化、血栓形成和血管生物学》(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)24，1454-1459)，并且在固醇调节元件结合蛋白转基因小鼠中被上调(SREBP)(霍顿(Horton)J.D.,(2003)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100，12027-12032)。此外，已经发现PCSK9错义突变与常染色体显性高胆固醇血症形式(Hchola3)相关(阿比法德尔(Abifadel)M等人(2003)《自然遗传学》(Nat.Genet.)34，154-156，替姆斯(Timms)K.M.,(2004)《人类遗传学》(Hum.Genet.)114，349-353，乐仁(Leren)T.P.(2004)《临床遗传学》(Clin.Genet.)65，419-422)。PCSK9还可以在决定一般人群中的LDL胆固醇水平中起作用，因为单核苷酸多态性(SNP)与日本人的胆固醇水平相关(正治(Shioji)K.,(2004)《人类遗传学杂志》(J.Hum.Genet.49,109-114)。
常染色体显性高胆固醇血症(ADH)是单基因疾病，其中患者表现出升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、肌腱黃色瘤、和早熟性动脉粥样硬化(雷德(Rader)D.J.,(2003)《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)111，1795-1803)。ADH和隐性形式，常染色体隐性高胆固醇血症(ARH)的发病机制(科恩(Cohen)J.C.，2003)《当代脂质视点》(Curr.Opin.Lipidol.)14，121-127)是由于经由肝脏的LDL摄取缺陷。ADH可以由阻止LDL摄取的LDLR突变引起，或者由在LDL上的蛋白质(结合LDLR的载脂蛋白)的突变引起。ARH由ARH蛋白的突变引起，ARH蛋白对于经由它与网格蛋白的相互作用而内吞LDLR-LDL复合物是必需的。因此，如果PCSK9突变是HChola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受体介导的LDL摄取中起作用。
过表达研究指出PCSK9在控制LDLR水平并因此在控制经由肝脏的LDL摄取中的作用(麦克斯韦尔(Maxwell)K.N.(2004)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)101，7100-7105，本加内特(Benjannet)S.等人(2004)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)279，48865-48875，帕克(Park)S.W.,(2004)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)279，50630-50638)。在小鼠中，腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达3或4天导致总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的升高，而在LDLR敲除动物中未见到这种作用(麦克斯韦尔(Maxwell)K.N.(2004)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)101，7100-7105，本加内特(Benjannet)S.等人(2004)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)279，48865-48875，帕克(Park)S.W.,(2004)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)279，50630-50638)。另外，PCSK9过表达导致肝脏LDLR蛋白的严重降低，但不影响LDLR mRNA水平、SREBP蛋白水平或SREBP蛋白的细胞核/细胞质比例。
虽然高胆固醇血症本身是无症状的，但是长期的血清胆固醇升高可导致动脉粥样硬化。经过几十年，慢性升高的胆固醇促成动脉中动脉粥样硬化斑块形成，动脉粥样硬化可导致涉及动脉的进行性狭窄或甚至完全闭塞。另外，更小的斑块可能破裂并引起凝块形成和血流阻断，从而导致例如心肌梗死和/或中风。如果狭窄或闭塞的形成是逐渐的，那么到组织和器官的血液供应缓慢地减少，一直到器官功能变得受损。
因此，本领域中存在对用于PCSK9相关疾病(如高脂血症，例如高胆固醇血症)的有效治疗的需要。
发明概述
如下文更详细地描述，在此披露了包含靶向PCSK9的RNAi剂例如双链iRNA剂的组合物。还披露了使用本发明的组合物用于抑制PCSK9表达并且用于治疗与PCSK9表达相关的病状例如高胆固醇血症的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p’、q、和q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且、
其中该有义链与至少一个配体缀合。
在一个实施例中，i是0；j是0；i是1；j是1；i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0；l是0；k是1；l是1；k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
在一个实施例中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
在一个实施例中，YYY基序存在于该有义链的裂解位点处或附近。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序存在于该反义链的从5'端起的11、12以及13位处。
在一个实施例中，Y′是2'-O-甲基。
在一个实施例中，式(III)由式(IIIa)表示：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'   (IIIa)。
在另一个实施例中，式(III)由式(IIIb)表示：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'   (IIIb)
其中每个Nb和Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在又另一个实施例中，式(III)由式(IIIc)表示：
有义链：5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'   (IIIc)
其中每个Nb和Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，式(III)由式(IIId)表示：
有义链：5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'(IIId)
其中Nb和Nb′各自独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且Na和Na′各自独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，该双链区在长度上为15-30个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区在长度上为17-23个核苷酸对。在又另一个实施例中，该双链区在长度上为17-25个核苷酸对。在一个实施例中，该双链区在长度上为23-27个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区在长度上为19-21个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区在长度上为21-23个核苷酸对。在一个实施例中，每条链具有15-30个核苷酸。
在一个实施例中，核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基、及其组合。在另一个实施例中，核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
在一个实施例中，该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。在另一个实施例中，该配体是
在一个实施例中，该配体附接到该有义链的3′。
在一个实施例中，该RNAi剂根据以下示意图中所示与该配体缀合：
其中X是O或S。在一个特定的实施例中，X是O。
在一个实施例中，该试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的3'-末端处。在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的5'-末端处。在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。
在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的5’-末端和3’-末端两者处。在一个实施例中，该链是该反义链。
在一个实施例中，该双链体的反义链的5′端的1位处的碱基对是一个AU碱基对。
在一个实施例中，这些Y核苷酸含有2′-氟修饰。
在一个实施例中，这些Y′核苷酸含有2′-O-甲基修饰。
在一个实施例中，p′>0。在另一个实施例中，p′＝2。
在一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与该靶mRNA互补。在另一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与该靶mRNA不互补。
在一个实施例中，该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。
在一个实施例中，至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上。
在一个实施例中，所有np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上。
在一个实施例中，该RNAi剂选自下组，该组为在表1、表2、表9、表10、表12、和图12中列出的RNAi剂。
在一个实施例中，该RNAi剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-53815、AD-56663、AD-56658、AD-56676、AD-56666、AD-57928、和AD-60212。
因此，在另一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p’、q、和q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合。
因此，在又另一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合。
因此，在一个另外的方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'   (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
因此，在另一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'   (III)
其中
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
因此，在又另一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'   (IIIa)
其中：
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
本发明还提供了包含本发明的双链RNAi剂的细胞、载体、宿主细胞、和药物组合物。
在一个实施例中，本发明提供了RNAi剂，该RNAi剂选自下组，该组为在表1、表2、表9、表10、表12、和图12中列出的RNAi剂。
在一些实施例中，该RNAi剂使用一种药物组合物给予。
在优选实施例中，该RNAi剂在一种溶液中给予。在一些这样的实施例中，该siRNA在一种非缓冲溶液中给予。在一个实施例中，该siRNA在水中给予。在其他实施例中，该siRNA与一种缓冲溶液(如一种乙酸盐缓冲液、一种柠檬酸盐缓冲液、一种醇溶谷蛋白缓冲液、一种碳酸盐缓冲液或一种磷酸盐缓冲液或其任何组合)给予。在一些实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施例中，该药物组合物进一步包含一种脂质配制品。在一个实施例中，该脂质配制品包含一种LNP、或XTC。在另一个实施例中，该脂质配制品包含一种MC3。
在一个方面，本发明提供了抑制细胞中PCSK9表达的方法。这些方法包括：使该细胞与本发明的RNAi剂例如双链RNAi剂或载体接触并且将步骤(a)中产生的细胞维持段时间，该时间足以获得PCSK9基因的mRNA转录本的降解，由此抑制该细胞中PCSK9基因的表达。
在一个实施例中，该细胞在受试者体内。
在一个实施例中，受试者是人。
在一个实施例中，PCSK9表达被抑制至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在另一方面，本发明提供了治疗具有由PCSK9表达介导的失调的受试者的方法。这些方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的RNAi剂例如双链RNAi剂或载体，从而治疗该受试者。
在一个实施例中，受试者是人。
在一个实施例中，这个人患有高胆固醇血症。
在一个实施例中，该RNAi剂例如双链RNAi剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约15mg/kg至约25mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、或约20mg/kg至约30mg/kg的剂量给予的。
在一个实施例中，该RNAi剂例如双链RNAi剂是皮下或静脉内给予的。
在一个实施例中，该RNAi剂是以包括一个负荷阶段继之以一个维持阶段的给药方案给予的，其中该负荷阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周五次，并且其中该维持阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周一次、两次、或三次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，或每六个月一次。
在一个实施例中，该RNAi剂是以两个或更多个剂量给予的。在一个特定的实施例中，该RNAi剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：约每12小时一次、约每24小时一次、约每48小时一次、约每72小时一次以及约每96小时一次。
在又另一个方面，本发明提供了治疗受试者中的高胆固醇血症的方法。这些方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的RNAi剂例如双链RNAi剂或载体，从而治疗该受试者。
在一个实施例中，该受试者是灵长动物或啮齿动物。在另一个实施例中，该受试者为人。
在一个实施例中，该RNAi剂例如双链RNAi剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予的。在另一个实施例中，该双链RNAi剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予的。
在一个实施例中，该RNAi剂例如双链RNAi剂是皮下或静脉内给予的。
在一个实施例中，该RNAi剂是以包括一个负荷阶段继之以一个维持阶段的给药方案给予的，其中该负荷阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周五次，并且其中该维持阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周一次、两次、或三次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，或每六个月一次。
在一个实施例中，该RNAi剂是以两个或更多个剂量给予的。在一个特定的实施例中，该RNAi剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：约每12小时一次、约每24小时一次、约每48小时一次、约每72小时一次以及约每96小时一次。
在一个实施例中，这些方法进一步包括测定受试者的LDLR基因型或表型。
在一个实施例中，给药导致受试者中的血清胆固醇下降。
在一个实施例中，这些方法进一步包括测定受试者中的血清胆固醇水平。
本发明由以下详细说明和附图进一步展示。
附图简要说明
图1是描绘在所有三个测试剂量的、缀合到GalNAc上的AD-48400具有剂量反应效应的图。缀合到GalNAc上的AD-48399用作对照。
图2A和2B是描绘响应于指示的siRNAs的体内效能和持续时间的图。
图3是显示针对体内效能和先导物优化进行分析的双链体的有义链(分别为SEQ ID NOS 1633-1642，按出现顺序)和反义链(分别为SEQ ID NOS 1643-1652，按出现顺序)的序列的表。
图4是描绘针对先导物优化的体内效能测定结果的图。
图5是描绘在PCSK9转基因小鼠中进行的体内剂量反应测定的结果的图。在给予AD-57928的10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、和0.3mg/kg单剂量七十二小时之后，通过ELISA测定PCSK9蛋白水平。
图6是描绘在“负荷阶段”期间以5x 2mg/kg剂量以及在“维持阶段”期间以1x 2mg/kg或2x 2mg/kg剂量给予AD-57928之后在PCSK9转基因小鼠的血清中的PCSK9蛋白的水平的图。
图7是描绘在“负荷阶段”期间以5x 1mg/kg剂量以及在“维持阶段”期间以1x 1mg/kg或2x 1mg/kg剂量给予AD-57928之后在PCSK9转基因小鼠的血清中的PCSK9蛋白的水平的图。
图8是描绘在“负荷阶段”期间以5x 0.5mg/kg剂量以及在“维持阶段”期间以1x 0.5mg/kg或2x 0.5mg/kg剂量给予AD-57928之后在PCSK9转基因小鼠的血清中的PCSK9蛋白的水平的图。
图9是描绘在PCSK9转基因小鼠中进行的体内剂量反应测定的结果的图。在给予siRNA的0.3mg/kg单剂量七十二小时之后，通过ELISA测定PCSK9蛋白水平。
图10是显示在给予AD-57928或AD-58895的1mg/kg单剂量之后，每纳克C57B6野生型小鼠肝脏的AD-57928和AD-58895的量的图。
图11是显示在给予AD-57928或AD-58895的1mg/kg单剂量之后，在C57B6野生型小鼠肝脏中的表示为％理论量的AD-57928和AD-58895的量的图。
图12A是描绘含有相比于AD-57928序列经优化的序列的本发明的iRNA剂的表。图12A披露了按出现顺序分别为SEQ ID NO1653-1658的“有义”序列、以及按出现顺序分别为SEQ ID NO1659-1664的“反义”序列。
图12B是显示指示的iRNA剂的IC50值的图。
图13是显示在给予指示的iRNA剂的单个1mg/kg剂量之后在野生型小鼠肝脏中的该指示的iRNA剂的水平的图。
图14A是显示在以qdx5+qwx3给予指示的iRNA剂之后、表示为相对于的放血前PCSK9水平的剩余PCSK9百分比的、在非人类灵长动物血清中的PCSK9蛋白的量的图。
图14B是显示在以qdx5+qwx3给予指示的iRNA剂之后在非人类灵长动物血清中的PCSK9蛋白的绝对量的图。
图15是显示在以qdx5+qwx3给予指示的iRNA剂之后的、表示为相对于放血前LDL水平的剩余LDL百分比的、在非人类灵长动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或LDLc)的量的图。
图16A是显示在以2mg/kg(q1w)以及1mg/kg(2xw)给予AD-57928之后的、表示为放血前LDL水平的平均量的百分比的、在非人类灵长动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或LDLc)的量的图。
图16B是显示在以2mg/kg(q1w)以及1mg/kg(2xw)给予AD-57928之后、在非人类灵长动物血清中的、相对于放血前量的PCSK9蛋白的量的图。
图17A是显示在以2mg/kg(2xw)以及以单个25mg/kg剂量给予AD-57928之后的、表示为放血前LDL水平的平均量的百分比的、在非人类灵长动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或LDLc)的量的图。对于2mg/kg(2xw)组的最后剂量是在第36天。
图17B是显示在以2mg/kg(2xw)以及单个25mg/kg剂量给予AD-57928之后、在非人类灵长动物血清中的、相对于放血前量的PCSK9蛋白的量的图。
图18是显示在以qdx5+qwx3给予指示的iRNA剂之后的、表示为相对于放血前LDL水平的剩余LDL百分比的、在非人类灵长动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或LDLc)的量的图。
图19是显示在以qdx5+qwx3给予指示的iRNA剂之后的、表示为相对于放血前LDL水平的剩余LDL百分比的、在非人类灵长动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL或LDLc)的量的图。
本发明的详细说明
本发明提供了包含靶向PCSK9的RNAi剂例如双链iRNA剂的组合物。还披露了使用本发明的组合物用于抑制PCSK9表达并且用于治疗与PCSK9表达相关的病状例如高胆固醇血症的方法。
I.定义
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当一个值或一个参数的取值范围是列举的，其目的是表明这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在此处使用的冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素，例如多个元素。
术语“包括(including)”用在此处是指短语“包括但不限于”并且与之互换使用。
术语“或(or)”用在此处是指术语“和/或”并且与之互换使用，除非语境清楚的另外指明。
如在此使用的，“PCSK9”是指前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9基因或蛋白。PCSK9也称为FH3、HCHOLA3、NARC-1、或NARCl。术语PCSK9包括人PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可见于例如GenBank登录号GI:299523249；小鼠PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可见于例如GenBank登录号GI:163644257；大鼠PCSK9，其氨基酸和核苷酸序列可见于例如GenBank登录号GI:77020249。另外的PCSK9 mRNA序列的实例使用例如GenBank可易于获得。
如在此所使用的，“靶标序列”是指在PCSK9基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
如在此使用的，术语“包含序列的链”是指包含由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”以及“U”每一者通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在此可互换使用并且是指其中核碱基是胸腺嘧啶如脱氧核糖胸腺嘧啶(deoxyribothymine)、2’-脱氧胸苷或胸苷的脱氧核糖核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，而不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。包含此类置换部分的序列是本发明的实施例。
术语“iRNA”，“RNAi剂，”“iRNA剂，”，“RNA干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含RNA剂，并且介导通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径的RNA转录本靶向切割。iRNA通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如抑制，PCSK9在细胞如受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞中的表达。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂包括与靶RNA序列，例如PCSK9靶mRNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受理论约束，认为引入细胞中长的双链RNA由称作Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，基因与发育(GenesDev.)2001，15:485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)将dsRNA加工成至具有特征性双碱基3'突出端的19-23碱基对短干扰性RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人，(2001)自然(Nature)409:363)。这些siRNA随后掺入RNA诱导沉默复合物(RISC)中，在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(尼坎宁(Nykanen)等人，(2001)细胞(Cell)107:309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)基因与发育(GenesDev.)15:188)。因此，在一个方面，本发明涉及促进实现靶基因(如PCSK9基因)沉默的RISC复合物形成的、产生于细胞内的单链RNA(siRNA)。所以，术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的RNAi。
在另一个实施例中，RNAi剂可以是引进细胞或生物体内以抑制靶mRNA的单链siRNA。单链RNAi剂结合到RISC核酸内切酶Argonaute 2上，该核酸内切酶然后裂解该标靶mRNA。单链siRNA通常是指15-30核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和检测描述于美国专利号8,101,348中，以及利马(Lima)等人，(2012)《细胞》(Cell)150:883-894中，特此将它们各自的全部内容通过引用结合在此。在此处描述的任何反义核苷酸序列可以用做在此描述的或在利马(Lima)等人，(2012)细胞(Cell)150；:883-894所描述的方法化学修饰的单链siRNA。
在另一个实施例中，本发明组合物、用途、和方法中使用的“iRNA”是双链RNA，并且在此是指“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”、或“dsRNA”。术语“dsRNA”，是指核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包含两条反向平行的和基本上互补的核酸链，被称为相对于靶RNA，即PCSK9基因，具有“有义”和“反义”定向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(在此称为RNA干扰或RNAi)触发靶RNA例如mRNA的降解。
通常，dsRNA分子的每条链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如本说明书中所用，一种“RNAi剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；一种RNAi剂可以包括在多个核苷酸处的实质性修饰。这些修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在siRNA型分子中使用的，任何这样的修饰出于本说明书和权利要求书的目的都由“RNAi剂”涵盖。
形成双链结构的两条链可以是一个更大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在这两条链是一个更大分子的部分并且因此通过一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下，该连接的RNA链称作“发夹环”。在这两条链是通过除了一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下，该连接结构称作“连接物(linker)”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何突出。除了该双链体结构之外，一种RNAi剂还可以包含一个或多个核苷酸突出端。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂是具有24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶mRNA序列(例如PCSK9靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。不希望受理论约束，引入细胞中的长双链RNA被称作Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，《基因与发育》(Genes Dev.)2001，15:485)。Dicer(核糖核酸酶III样酶)将dsRNA加工成至具有特征性双碱基3'突出端的19-23碱基对短干扰性RNA(Bernstein等人，(2001)自然(Nature)409:363)。这些siRNA随后掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(Nykanen等人，(2001)细胞(Cell)107:309)。一旦与适宜的靶mRNA结合，RISC内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)《基因与发育》(Genes Dev.)15:188)。如在此使用的，一个“核苷酸突出端”是指当一种RNAi剂的一条链的一个3'端延伸超出另一条链的5'端时从该RNAi剂的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“平端”或“平末端”意指在该双链RNAi剂的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。一种“平末端的”RNAi剂是一种在其整个长度上都是双链、即在该分子的任一端处都无核苷酸突出端的dsRNA。本发明的RNAi剂包括在一端处具有核苷酸突出端(即，具有一个突出端和一个平端的试剂)或在两端处都具有核苷酸突出端的RNAi剂。
术语“反义链”是指一种双链RNAi剂的、包括与一种标靶序列(例如一种人类PCSK9 mRNA)基本上互补的一个区的链。如在此使用的，术语“与一种编码甲状腺素运载蛋白的mRNA的一部分互补的区”是指该反义链上的与一种PCSK9 mRNA序列的一部分基本上互补的一个区。在该互补性区域不与该靶标序列完全互补的情况下，错配在末端区域是最为可容忍的，并且如果出现错配，它们通常在末端的一个或多个区域，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3、或2个核苷酸之内。
如在此所使用的术语“有义链”指的是含有与反义链区域基本上互补的区域的dsRNA链。
如在此使用的，术语“裂解区”是指定位为与裂解位点紧紧相邻的一个区。该裂解位点是在该靶标上的发生裂解的位点。在一些实施例中，该裂解区包含三个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解区包含两个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解位点具体来说存在于由该反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且该裂解区包含核苷酸11、12以及13。
如在此所使用的，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域技术人员所理解。此类条件可以是，例如，严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，随后洗涤。可以应用其他条件，比如可以在有机体中遇到的生理学相关条件。例如，互补序列足以允许核酸例如RNAi的相关功能进行。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于检验两个序列的互补性的条件集合。
当该第一核苷酸序列的核苷酸与该第二核苷酸序列的核苷酸在该第一和该第二核苷酸序列的整个长度上存在碱基配对时，序列可以相对于每一者“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出的情况下，此类突出不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21核苷酸序列。
如在此使用的，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的有义链与反义链之间，或dsRNA的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码PCSK9的mRNA)的一个连续部分(包括5'UTR，开放阅读框(ORF)或者3'UTR)基本互补的多核苷酸。例如，如果一种多核苷酸与编码PCSK9的mRNA的非间断部分基本上互补，则该序列与PCSK9 mRNA的至少一部分互补。
在此使用的术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。
如在此使用的，短语“抑制PCSK9的表达”包括抑制任何PCSK9基因(如例如小鼠PCSK9基因、大鼠PCSK9基因、猴PCSK9基因、或人类PCSK9基因)以及PCSK9基因的变体(例如天然存在的变体)或突变体的表达。因此，该PCSK9基因可以是野生型PCSK9基因、突变PCSK9基因、或在遗传操作的细胞、细胞群组或生物体的情形下的转基因PCSK9基因。
“抑制PCSK9基因表达”包括任何水平的PCSK9基因的抑制，例如至少部分抑制PCSK9基因的表达，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。
基于与PCSK9基因表达相关的任何变量水平，例如PCSK9mRNA水平、PCSK9蛋白水平、或血清脂质水平，可以评估PCSK9基因的表达。抑制可通过这些变量中的一个或多个与对照水平相比的绝对或相对水平的减少来评估。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。
如在此使用的，短语“使细胞与双链RNAi剂接触”包括通过任何可能手段使细胞接触。使细胞与双链RNAi剂接触包括使细胞在体外与该RNAi剂接触或使细胞在体内与该RNAi剂接触。该接触可以直接或间接地进行。因此，例如RNAi剂可通过执行该方法的个体与细胞的物理接触，或者可替代地，RNAi剂可进入许可或导致它后来接触到该细胞的一种情况。
在体外接触细胞可通过例如用该RNAi剂孵育该细胞来进行。体内接触细胞可以通过以下进行，例如通过将RNAi剂注入该细胞所在的组织或其附近，或通过将RNAi剂注入另一个区域(血流或皮下空间)，使得该试剂将随后到达待接触的细胞所在的组织。例如，该RNAi剂可以含有和/或偶联到将该RNAi剂导向到感兴趣的部位(例如肝脏)的配体(例如，GalNAc3配体)。体外和体内接触方法的组合也是可能的。结合本发明的这些方法，细胞还可以在体外与RNAi剂接触并且随后被植入受试者中。
如在此使用的，“患者”或“受试者”旨在包括人类或者非人类动物，优选哺乳动物，例如猴。最优选地，该受试者或患者是人。
如在此使用的，“PCSK9相关疾病”旨在包括任何与PCSK9基因或蛋白相关的疾病。这种疾病可以例如由PCSK9蛋白的过量产生、由PCSK9基因突变、由PCSK9蛋白的异常裂解、由PCSK9与其他蛋白质或其他内源或外源物质之间的异常相互作用引起。示例性PCSK9相关疾病包括脂血症，例如高脂血症、以及其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与这些失调相关的病理情况，如心脏和循环系统疾病。
如在此使用的，“治疗有效量”旨在包括当给予患者用于治疗一种PCSK9相关疾病时足以实现该疾病的治疗(例如通过削弱、改善或维持该现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi剂的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi剂、该试剂如何给予、该疾病及其严重程度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、由PCSK9表达介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。
如在此使用的，“预防有效量”旨在包括当给予尚末经历过或显示出一种PCSK9相关疾病的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的RNAi剂的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或减少后发疾病的严重度。该“预防有效量”可以取决于该RNAi剂、该试剂如何给予、该疾病的风险程度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在适用于任何治疗的合理利益/风险比下产生某种所希望的局部或全身效应的RNAi剂的量。本发明的方法中所用的RNAi剂可以按足以产生适用于这样的治疗的合理利益/风险比的量给予。
如此处使用的，术语“样品”包括从受试者体内分离的类似的流体、细胞、或组织，以及受试者体内存在的流体、细胞、或组织的一个集合。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼内液(ocular fluid)、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如，肝细胞)。在优选实施例中，“源自受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或血浆。在其他实施例中，“源自受试者的样品”是指源自该受试者的肝脏组织(或其亚成分)。
II.本发明的iRNA
在此描述的是改进的抑制PCSK9基因在细胞如具有例如高胆固醇血症的脂质失调的受试者(例如哺乳动物，如人类)体内的细胞中表达的双链RNAi剂以及这样的双链RNAi剂的用途。
本发明的双链RNAi剂包括例如在2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710中披露的具有化学修饰的试剂，其全部内容通过引用结合在此。
正如在此和在临时申请号61/561,710中显示，可以通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到RNAi剂的一条有义链和/或反义链中、特别是在裂解位点处或附近而获得一种优越结果。在一些实施例中，该RNAi剂的有义链和反义链可以别的方式完全修饰。这些基序的引入中断了该有义链和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。该RNAi剂可以任选地与例如在该有义链上的GalNAc衍生物配体缀合。产生的RNAi剂呈现优越的基因沉默活性。
更具体地说，出人意料地发现，当该双链RNAi剂的有义链和反义链被完全修饰而在RNAi剂的至少一条链的裂解位点处或附近具有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，该RNAi剂的基因沉默活性被卓越地增强。
因此，本发明提供了能够体内抑制靶基因(即，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(PCSK9)基因)表达的双链RNAi剂。该RNAi剂包含一条有义链和一条反义链。该RNAi剂的每条链可以具有在12-30个核苷酸范围的长度。例如，每条链可以在14-30个核苷酸长度、17-30个核苷酸长度、25-30个核苷酸长度、27-30个核苷酸长度、17-23个核苷酸长度、17-21个核苷酸长度、17-19个核苷酸长度、19-25个核苷酸长度、19-23个核苷酸长度、19-21个核苷酸长度、21-25个核苷酸长度、或21-23个核苷酸长度之间。
该有义链和该反义链典型地形成一种双链体双链RNA(“dsRNA”)，在此还称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链体区可以具有12-30个核苷酸对长度。例如，该双链体区可以在14-30个核苷酸对长度、17-30个核苷酸对长度、27-30个核苷酸对长度、17-23个核苷酸对长度、17-21个核苷酸对长度、17-19个核苷酸对长度、19-25个核苷酸对长度、19-23个核苷酸对长度、19-21个核苷酸对长度、21-25个核苷酸对长度、或21-23个核苷酸对长度之间。在另一个实例中，该双链体区具有选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26以及27个核苷酸长度。
在一个实施例中，该RNAi剂可以在一条链或两条链的3'端、5'端、或两端处含有一个或多个突出端区和/或封端基团。突出端可以具有1-6个核苷酸长度、例如2-6个核苷酸长度、1-5个核苷酸长度、2-5个核苷酸长度、1-4个核苷酸长度、2-4个核苷酸长度、1-3个核苷酸长度、2-3个核苷酸长度、或1-2个核苷酸长度。这些突出端可以是一条链比另一条链更长的结果，或两条具有相同长度的链交错的结果。该突出端可以与该靶mRNA形成错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。该第一和第二链还可以例如通过另外的碱基连接以形成一个发夹或通过其他非碱基连接物连接。
在一个实施例中，该RNAi剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是修饰的或未修饰的核苷酸，包括(但不限于)被2'-糖修饰的，如2-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任何组合。例如，TT可以是任一链上的任一端的一个突出端序列。该突出端可以与该靶mRNA形成错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
该RNAi剂的有义链、反义链或两条链处的5’-或3’-突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，该突出端区(一个或多个)含有两个在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一个实施例中，该突出端存在于有义链、反义链或两条链的3’端处。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于反义链中。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于有义链中。
该RNAi剂可以仅含有单个突出端，它可以加强该RNAi的干扰活性而不影响其总稳定性。例如，该单链突出端可以位于有义链的3'末端处，或可替代地，位于反义链的3'末端处。该RNAi还可以具有位于该反义链的5’端(或该有义链的3’端)处的平末端，或反之亦然。一般来说，该RNAi的反义链在3'端处具有核苷酸突出端，并且5'端是平的。虽然不希望受理论束缚，但该反义链的5’端处的不对称平端和该反义链的3’端突出端有利于引导链加载到RISC过程中。
在一个实施例中，该RNAi剂是具有19个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置7、8、9处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的基序。该反义链在从5’端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在另一个实施例中，该RNAi剂是具有20个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置8、9、10处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的基序。该反义链在从5’端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在又另一个实施例中，该RNAi剂是具有21个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置9、10、11处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的基序。该反义链在从5’端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，该RNAi剂包含一个21个核苷酸的有义链和一个23个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5’端起的位置9、10、11处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2'-F修饰的基序；该反义链在从5’端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的基序，其中该RNAi剂的一端是平的，而另一端包含一个2个核苷酸的突出端。优选地，该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’端处。当该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’端处时，在末端三个核苷酸之间可以有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且该第三个核苷酸是紧挨着该突出端核苷酸的配对的核苷酸。在一个实施例中，该RNAi剂在该有义链的5’端和在该反义链的5’端处都另外具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一个实施例中，该RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括是基序的一部分的核苷酸)都是修饰的核苷酸。在一个实施例中，每个残基独立地用2’-O-甲基或3’-氟修饰，例如，在交替基序中。任选地，该RNAi剂进一步包含配体(优选GalNAc3)。
在一个实施例中，该RNAi剂包含有义和反义链，其中该RNAi剂包含长度是至少25个并且至多29个核苷酸的一条第一链和长度是至多30个核苷酸、在从5'端起的位置11、12、13处具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的基序的一条第二链；其中该第一链的3’端和该第二链的5’端形成一个平末端并且该第二链在其3’端处比该第一链长1-4个核苷酸，其中该双链体区具有至少25个核苷酸长度，并且当该RNAi剂被引入到一种哺乳动物细胞中时，该第二链与一种靶mRNA沿着该第二链长度的至少19个核苷酸充分互补以减少靶基因表达，并且其中该RNAi剂的dicer裂解优先地产生包含该第二链的3’端的siRNA，从而减少该靶基因在该哺乳动物中的表达。任选地，该RNAi剂进一步包含配体。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一存在于该有义链中的裂解位点处。
在一个实施例中，该RNAi剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一存在于该反义链中的裂解位点处或附近
对于具有17-23个核苷酸长度的双链体区的RNAi剂来说，该反义链的裂解位点典型地在从5’-端起的10、11以及12位周围。因此，具有三个相同修饰的基序可以出现在该反义链的9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或13、14、15位处，计数从由该反义链的5'端起的第1个核苷酸开始，或计数从该双链体区内从该反义链的5'端起的第1个配对的核苷酸开始。该反义链中的裂解位点还可以根据该RNAi的从5’端起的双链体区的长度而变化。
该RNAi剂的有义链可以在该链的裂解位点处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且反义链可以在该链的裂解位点处或附近具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。当该有义链和该反义链形成一个dsRNA双链体时，该有义链和该反义链可以被如此比对，以使得在该有义链上具有三个核苷酸的一个基序和在该反义链上具有三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即该有义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者与该反义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者形成一个碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。第一基序可以出现在该链的裂解位点处或附近并且其他基序可以是翼修饰。术语“翼修饰”在此是指出现在该链的与同一链裂解位点处或附近的基序分开的另一个部分处的一个基序。该翼修饰或者与该第一基序相邻，或者被至少一个或多个核苷酸分隔。当这些基序与彼此紧紧相邻时，则这些基序的化学性质不同于彼此，并且当这些基序被一个或多个核苷酸分隔时，则化学性质可以是相同或不同的。可以存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以存在于相对于在裂解位点处或附近的该第一基序的一端处或该前导基序的任一侧上。
如同有义链，该RNAi剂的反义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，这些基序中的至少一者出现在该链的裂解位点处或附近。这个反义链也可以在一个比对中含有一个或多个与可以在有义链上存在的翼修饰类似的翼修饰。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰典型地在该链的3’端、5’端或两端处不包括前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施例中，该RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰典型地在该链的3’端、5’端或两端处的双链体区内不包括前一个或两个配对的核苷酸。
当该RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，该翼修饰可以落在该双链体区的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当该RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，该有义链和该反义链可以被如此比对，以使得各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的另一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一条链的两个修饰落在该前导基序的每一侧上，在该双链体区中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施例中，该RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括是基序的一部分的核苷酸)可以被修饰。每个核苷酸可以用相同或不同修饰来修饰，该修饰可以包括非键合磷酸酯氧和/或一个或多个键合磷酸酯氧中的一者或两者的一个或多个改变；核糖的一种成分(例如核糖上的2′羟基)的改变；磷酸酯部分经“脱磷酸”连接物的大规模置换；一种天然存在的碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯主链的置换或修饰。
由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰出现在核酸内重复的一个位置处，例如一种碱基或一种磷酸酯部分或一种磷酸酯部分的一个非键合O的修饰。在一些情况下，修饰将出现在该核酸中的全部标的位置处，但在许多情形下它不会这样。例如，一个修饰可以仅出现在3’或5’末端位置处，可以仅出现在一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或在最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以仅出现在RNA的双链区中或可以仅出现在RNA的单链区中。例如，一个非键合O位置处的一个硫代磷酸酯修饰可以仅存在于一个或两个末端处，可以仅存在于一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处，或可以存在于双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5’端可以被磷酸化。
为了增强稳定性，可能的是例如在突出端中包括特定碱基或在单链突出端中(例如，在一个5’或3’突出端或两者中)包括被修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可以希望在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个3’或5’突出端中的全部或一些碱基可以用例如在此描述的修饰进行修饰。修饰可以包括例如使用核糖的2’位处的修饰与本领域中已知的修饰，例如使用2’-脱氧-2’-氟基(2’-F)或2’-O-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不必与该靶序列同源。
在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基或2’-氟修饰。这些链可以含有多于一个修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2’-O-甲基或2’-氟修饰。
至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟修饰或其他修饰。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。如在此使用的，术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰、每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上的一种基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔三个核苷酸一个、或一种类似模式。例如，如果A、B以及C各自表示针对核苷酸的一种修饰类型，那么交替基序可以是“ABABABABABAB……”、“AABBAABBAABB……”、“AABAABAABAAB……”、“AAABAAABAAAB……”、“AAABBBAAABBB……”或“ABCABCABCABC……”等。
交替基序中所包含的修饰的类型可以是相同或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示针对核苷酸的一种修饰类型，那么交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一者可以选自交替基序内的修饰的若干种可能，例如“ABABAB……”“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCDCD……”等。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂包含：用于有义链上的交替基序的修饰模式相对于用于反义链上的交替基序的修饰模式移位。该移位可以是如此以使得有义链的修饰的核苷酸组对应于反义链的被不同地修饰的核苷酸组，并且反之亦然。例如，有义链当与dsRNA双链体中的反义链配对时，该有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’从“ABABAB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的5’-3’从“BABABA”开始。作为另一个实例，该有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’从“AABBAABB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的5’-3’从“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
在一个实施例中，该RNAi剂包含：最初有义链上的2'-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式相对于最初反义链上的2'-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式具有一个移位，即该有义链上的2'-O-甲基修饰的核苷酸与该反义链上的一个2'-F修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。该有义链的1位可以从2'-F修饰开始，并且该反义链的1位可以从2'-O-甲基修饰开始。
将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到有义链和/或反义链中断了该有义链和/或该反义链中存在的初始修饰模式。通过将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到该有义链和/或反义链而使该有义链和/或反义链的修饰模式的这一中断出人意料地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施例中，当在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序被引入到这些链中的任一者时，紧挨着该基序的核苷酸的修饰是一个不同于该基序的修饰的修饰。例如，包含该基序的序列的一部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的该基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对紧挨着该基序“YYY”的该核苷酸的不同于Y的修饰的一个修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同修饰。可替代地，当存在一个翼修饰时，Na和/或Nb可以存在或不存在。
该RNAi剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰可以存在于有义链或反义链或这两条链的该链的任何位置中的任何核苷酸上。例如，该核苷酸间键合修饰可以出现在该有义链和/或该反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键合修饰可以按一种交替模式出现在该有义链和/或该反义链上；或该有义链或该反义链可以按一种交替模式含有两个核苷酸间键合修饰。该有义链上的核苷酸间键合修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键合修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键合修饰的交替模式具有一个移位。
在一个实施例中，该RNAi在突出端区中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰。例如，该突出端区可以含有两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合的核苷酸。还可以进行核苷酸间键合修饰以使突出端核苷酸与该双链体区内的末端配对的核苷酸键合。例如，至少2个、3个、4个或全部的突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合而键合，并且任选地，可以存在将突出端核苷酸与紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸键合的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且该第三个是紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸。这些末端三个核苷酸可以在该反义链的3’端处、该有义链的3’端处、该反义链的5’端处、和/或该反义链的5’端处。
在一个实施例中，当该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’端处时，在末端三个核苷酸之间存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中这三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且该第三个核苷酸是紧挨着该突出端核苷酸的配对的核苷酸。任选地，该RNAi剂在该有义链的5’端和在该反义链的5’端处都可以另外具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
在一个实施例中，该RNAi剂在双链体内包含与靶标的一个或多个错配、或其组合。该错配可以出现在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。就促进解离而言：A:U与G:C相比是优选的；G:U与G:C相比是优选的；并且I:C与G:C相比是优选的(I＝肌苷)。错配(例如非标准的或除标准以外的配对(如在此别处所述))与标准(A:T、A:U、G:C)配对相比是优选的；并且包括一种通用碱基的配对与标准配对相比是优选的。
在一个实施例中，该RNAi剂包含从该反义链的5’端起在双链区内的前1、2、3、4、或5个碱基对的至少一个，这些碱基对独立地选自下组，该组为：A:U、G:U、I:C、以及错配对，例如非标准的或除标准以外的配对、或包括通用碱基的配对，以便促进该反义链在该双链体的5’端处的解离。
在一个实施例中，该双链体区内从该反义链中的5’端起的1位处的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U以及dT。可替代地，该双链体区内从该反义链的5’端起的前1个、2个或3个碱基对中的至少一者是AU碱基对。例如，该双链体区内从该反义链的5’端起的第一个碱基对是AU碱基对。
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'   (I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包括0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。优选地YYY全是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包括交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。例如，当该RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双链体区域时，该YYY基序可以出现在该有义链的裂解位点处或其附近处(例如，可以出现在位置6、7、8、7、8、9、8、9、10、9、10、11、10、11、12或11、12、13处)，其计数从5’端从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’端从该双链体区域内的第一配对核苷酸开始。
在一个实施例中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i和j两者都是1。该有义链因此可以由以下式表示：
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'   (Ib)；
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3'   (Ic)；或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'   (Id)。
当该有义链由式(Ib)表示时，Nb表示一个寡核苷酸序列，其包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。每个Na可独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链被表示为式(Ic)时，Nb表示一个包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6，每个Na可独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z各自可以彼此相同或不同。
在其他实施例中，i是0且j是0，并且该有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Na-nq3'   (Ia)。
当该有义链由式(Ia)表示时，每个Na独立地可以表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5'nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3'   (II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示包括0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示突出核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；
以及
X'X'X'、Y'Y'Y'、以及Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包括交替模式的修饰。
Y'Y'Y'基序出现在该反义链的裂解位点处或其附近。例如，当该RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双链体区域时，该Y′Y′Y′基序可以出现在该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，其计数从5’端从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’端从该双链体区域内的第一配对核苷酸开始。优选地，该Y'Y'Y'基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序全是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1且l是0，或k是0且l是1，或k和l两者都是1。
该反义链因此可以由以下式表示：
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3'   (IIb)；
5'nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3'   (IIc)；或
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3'   (IId)。
当该反义链由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IIc)时，Nb’表示一个包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IId)时，Nb’表示一个包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施例中，k是0且l是0，并且该反义链可以由下式表示：
5'np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3'   (Ia)。
当该反义链由式(IIa)表示时，每个Na’独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
X'、Y'和Z'各自可以是彼此相同的或不同的。
该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地由以下各项修饰：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2’-氟。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地由2’-O-甲基或2’-氟修饰。具体地，每个X、Y、Z、X′、Y′和Z′可以表示一个2’-O-甲基修饰或一个2’-氟修饰。
在一个实施例中，当该双链体区域是21nt时，该RNAi剂的有义链可以包含出现在该链的位置9、10和11处的YYY基序，其计数从5’端从第一个核苷酸开始；或任选地，该计数从5’端从该双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y表示2’-F修饰。该有义链可以另外包含XXX基序或ZZZ基序作为在该双链体区域的相反末端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示一个2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施例中，该反义链可以包含出现在该链的位置11、12和13处的Y′Y′Y′基序，其计数从5’端从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’端从该双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y′表示2’-O-甲基修饰。该反义链可以另外包含X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为在该双链体区域的相反末端处的翼修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)、和(Id)中任一项表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)中任一项表示的反义链形成了一个双链体。
因此，用于在本发明的方法中使用的RNAi剂可以包括一个有义链和一个反义链，每个链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’5'
(III)
其中：
i、j、k、以及l各自独立地是0或1；
p、p'、q以及q'各自独立地是0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’、np、nq’、和nq，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、以及Z'Z'Z'各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i是0且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0且l是0；或k是1且l是0；k是0且l是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
形成RNAi双链体的该有义链和反义链的示例组合包括下式：
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5'
   (IIIa)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5'
   (IIIb)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5'
   (IIIc)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5'
   (IIId)
当该RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸。
当该RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示一个寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含1-10个、1-7个、1-5个或1-4个修饰的核苷酸。每个Na独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂被表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂被表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20个、2-15个、或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’各自独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)中的每个X、Y和Z每个可以是彼此相同的或不同的。
当该RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示时，Y核苷酸中的至少一个可以与Y'核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，至少两个Y核苷酸与相应的Y'核苷酸形成碱基对；或全部三个Y核苷酸与相应的Y'核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi剂是由式(IIIb)或(IIId)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与Z'核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，至少两个Z核苷酸与相应的Z'核苷酸形成碱基对；或全部三个Z核苷酸与相应的Z'核苷酸都形成碱基对。
当该RNAi剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，X核苷酸中的至少一个可以与X'核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，至少两个X核苷酸与相应的X'核苷酸形成碱基对；或全部三个X核苷酸与相应的X'核苷酸都形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰、和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。在另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰且np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上。在又另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上，并且该有义链缀合到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物上。在另一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上，该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且该有义链缀合到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物上。
在一个实施例中，当该RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上，该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且该有义链缀合到通过一个二价或三价分支连接物附接的一个或多个GalNAc衍生物上。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，包含至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过连接物连接。该连接物可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含配体。这些双链体中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每一个可以靶向在两个不同靶部位的相同基因。
在一个实施例中，该RNAi剂是一种多聚体，该多聚体包含三个、四个、五个、六个、或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过连接物连接。该连接物可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含配体。这些双链体中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每一个可以靶向在两个不同靶部位的相同基因。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)表示的两种RNAi剂在5’端彼此连接，并且3’端中的一个或两个任选地缀合到配体上。这些试剂中的每一个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些试剂中的每一个可以靶向在两个不同靶部位的相同基因。
不同公开物描述了可以在本发明的方法中使用的多聚体RNAi剂。这样的公开物包括WO 2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO 2007/117686、WO 2009/014887以及WO2011/031520，这些公开物的每一者的全部内容特此通过引用结合在此。
含有一个或多个碳水化合物部分与一种RNAi剂的缀合的RNAi剂可以最佳化该RNAi剂的一种或多种性质。在许多情况下，该碳水化合物部分将附接到该RNAi剂的一个被修饰的亚单位。例如，一种dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚单位的核糖可以被另一个部分(例如，一个碳水化合物配体所附接的一个非碳水化合物(优选环状)载体)置换。其中亚单位的核糖已经如此被置换的核糖核苷酸亚单位在此被称为核糖置换修饰亚单位(RRMS)。一个环状载体可以是一个碳环系统，即全部环原子都是碳原子，或一个杂环系统，即一个或多个环原子可以是一个杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是一个单环系统，或可以含有两个或更多个环，例如稠合环。该环状载体可以是一个完全饱和的环系统，或它可以含有一个或多个双键。
该配体可以经由载体附接到该多核苷酸上。这些载体包括(i)至少一个“主链附接点”、优选两个“主链附接点”，和(ii)至少一个“系拴附接点”。如在此使用的，一个“主链附接点”是指一个官能团(例如一个羟基)，或通常，可用于并且适用于将该载体并入到一种核糖核酸的主链(例如含硫主链)中的一个键(例如磷酸酯或被修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，一个“系栓连接点”(TAP)是指该环状载体的、连接一个选定部分的一个组成环原子，例如一个碳原子或一个杂原子(不同于提供一个主链附接点的原子)。该部分可以是例如一种碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该选定部分通过一个介入系拴物连接到该环状载体。因此，该环状载体将通常包括一个官能团(例如氨基)，或通常，提供适用于将另一个化学实体(例如配体)并入或系拴到组成型环的一个键。
这些RNAi剂可以经由一个载体与一个配体缀合，其中该载体可以是环基或非环基；优选地，该环基选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢萘；优选地，该非环基选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些特定实施例中，用于在本发明的方法中使用的RNAi剂是一种选自下组试剂的试剂，该组试剂在表1和表2中列出。
这些试剂可进一步包含配体。
A.配体
本发明的双链RNA(dsRNA)试剂可以任选地缀合至一个或多个配体。该配体可以在3’端、5’端或两端处附接到有义链、反义链或两条链。例如，该配体可以与该有义链缀合。在优选实施例中，该配体与该有义链的3’端结合。在一个优选实施例中，该配体是一个GalNAc配体。在特别优选实施例中，该配体是GalNAc3：
在一些实施例中，该配体例如GalNAc配体附接到该RNAi剂的3′端上。在一个实施例中，该RNAi剂与配体(例如，GalNAc配体)缀合，如以下示意图中所示
其中X是O或S。在一个实施例中，X是O。
多种多样的实体可以偶联到本发明的RNAi剂。优选的部分是优选地直接地或者经由一个介入系栓物间接地共价偶联的配体。
在优选实施例中，一种配体改变了它所并入的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，一种配体例如与缺乏这样一种配体的一个种类相比对选定靶标提供了增强的亲和力，选定的靶标例如是分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的一个细胞区室或器官区室、组织、器官或区域。对一种选定靶标提供增强的亲和力的配体也被称为靶向配体。
一些配体可以具有内体溶解特性。该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运载。该内体溶解配体可以是一种显示出pH依赖性膜活性和融合性的多阴离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，该内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质运输的构象。示例性核内体溶解配体包括GALA肽(苏巴劳(Subbarao)等人，《生物化学》(Biochemistry)，1987,26:2964-2972)、EALA肽(沃格尔(Vogel)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)，1996,118:1581-1586)及其衍生物(特克(Turk)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochem.Biophys.Acta)，2002,1559:56-68)。在一个实施例中，该内体溶解组分可以包含将响应于pH变化而经历电荷变化或质子化的一种化学基团(例如一种氨基酸)。该内体溶解组分可以是直链或支链的。
配体可以改进运载、杂交以及特异性特性，并且还可以改进所得天然或被修饰的寡核糖核苷酸或包括在此描述的单体的任何组合的一种聚合分子和/或天然或被修饰的核糖核苷酸的核酸酶抗性。
配体通常可以包括治疗改性剂，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基团，例如用于监测分布；交联剂；以及赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺以及肽模拟物。
配体可以包括一种天然存在的物质，如一种蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；一种碳水化合物(例如一种右旋糖酐、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或一种脂质。该配体还可以是一种重组或合成分子，如一种合成聚合物，例如一种合成聚氨基酸、一种寡核苷酸(例如一种适体)。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸盐、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶或螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽缀合物(例如，触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对一种共配体具有一种特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合到一种指定细胞类型(如一种癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的一种抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适体。该配体可以是例如脂多糖，p38MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如，通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA剂摄入细胞中的物质，例如，药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
该配体可以通过例如活化炎症应答来增加寡核苷酸摄取到该细胞中。将具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β或γ干扰素。
在一方面，该配体是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许缀合物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使缀合物靶向肾。
在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，以使得该缀合物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，从而缀合物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞摄取的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋形细胞渗透剂。优选地，该渗透剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该渗透剂是肽，则它可以经修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键和D-氨基酸的使用。该螺旋剂优选为α-螺旋剂，其优选具有一个亲脂性相和一个亲油性相。
该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，肽部分可以包含疏水性膜转运序列(MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:1)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:2))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，其可携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸、和跨细胞膜的蛋白。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:3))和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:4))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以由随机DNA序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，《自然》(Nature)，354:82-84,1991)。优选地，经由一个并入的单体单元系拴到一种iRNA剂的肽或肽模拟物是一种细胞靶向肽，如一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。RGD肽部分可以用来靶向肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(齐茨曼(Zitzmann)等人，《癌症研究》(Cancer Res.)，62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进一种iRNA剂靶向多种其他组织(包括肺、肾脏、脾脏或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，《癌症基因治疗》(Cancer Gene Therapy)8:783-787,2001)。优选地，RGD肽将促进iRNA药物靶向肾。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以递送iRNA剂至表达αVβ3的肿瘤细胞(华博纳(Haubner)等人，《核医学杂志》(Jour.Nucl.Med.)，42:326-336,2001)。可以使用靶向富含增殖细胞的标记物的肽。例如，含有RGD的肽和肽模拟物可以靶向癌细胞，具体地说展现一种整合素的细胞。因此，可以使用RGD肽、含有RGD的环状肽、包含D-氨基酸的RGD肽以及合成性RGD模拟物。除RGD之外，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。通常，这类配体可以用来控制正在增殖的细胞和血管生成。这种类型的配体的优选的缀合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因(例如一种在此描述的癌基因)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。一种微生物细胞渗透肽可以是例如一种α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、一种含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或细菌素)或一种仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二重两亲肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合物肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人，Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
在一个实施例中，一种靶向肽可以是一种两亲α-螺旋肽。示例性两亲α-螺旋肽包括但不限于,天蚕素、莱科毒素(lycotoxin)、摩西鱼毒肽(paradaxin)、蟾蜍肽抗生素(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、蛇毒抗菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽、brevinins-2、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽、pleurocidin、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1以及caerins。许多因素将优选地被认为维持螺旋稳定性的完整性。例如，将使用最大数目的螺旋稳定化残基(例如leu、ala或lys)，并且将使用最小数目的螺旋去稳定化残基(例如脯氨酸或环状单体单元)。将考虑加帽残基(例如Gly是一种示例性N-加帽残基)和/或可以将C-末端酰胺化用于提供一个额外H-键以稳定该螺旋。具有相反电荷、间隔i±3或i±4个位置的残基之间的盐桥的形成可以提供稳定性。例如，阳离子残基(如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸)可以与阴离子残基谷氨酸盐或天冬氨酸盐形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括以下配体，那些配体具有天然发生的或被修饰的肽，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即键合被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键合置换的肽；或环肽。
该靶向配体可以是能够靶向一种特定受体的任何配体。实例是：叶酸盐、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或一种适体。一个簇是两个或更多个糖单元的组合。这些靶向配体还包括整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL以及HDL配体。这些配体还可以基于核酸，例如一种适体。该适体可以是未被修饰的或具有在此披露的修饰的任何组合。
内体释放剂包括咪唑、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂代表药代动力学调节剂。PK调节物包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括(但不限于)胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多硫代磷酸酯键合的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键合的短寡核苷酸(例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)作为配体(例如作为PK调节配体)也属于本发明。
另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体作为PK调节配体也属于本发明。
属于本发明的其他配体缀合物描述于以下美国专利申请中：2004年8月10日提交的USSN：10/916,185；2004年9月21日提交的USSN：10/946,873；2007年8月3日提交的USSN：10/833,934；2005年4月27日提交的USSN：11/115,989；以及2007年11月21日提交的USSN：11/944,227，将其出于所有目的通过引用以其全文结合。
当存在两个或更多个配体时，这些配体可以都具有相同特性，都具有不同特性，或一些配体具有相同特性而其他配体具有不同特性。例如，一种配体可以具有靶向特性、具有内体溶解活性或具有PK调节特性。在一个优选实施例中，全部这些配体都具有不同特性。
可以将配体偶联到寡核苷酸的不同位置，例如3’末端、5’末端和/或在一个内部位置。在优选实施例中，将该配体经由一个介入系栓物(例如一个在此描述的载体)附接到这些寡核苷酸。当将一个单体并入正在生长的链中时，该配体或系栓的配体可以存在于该单体上。在一些实施例中，可以在已经将一个“前体”单体并入正在生长的链中后，将配体经由偶联到该“前体”单体来并入。例如，可以将具有例如一个氨基封端的系拴物(即不具有缔合的配体)的一个单体(例如TAP-(CH2)nNH2)并入一条正在生长的寡核苷酸链。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，随后可以将具有一个亲电基团(例如一个五氟苯酯或醛基)的一个配体通过将该配体的该亲电基团与该前体单体的系栓物的末端亲核基团偶联来附接到该前体单体。
在另一个实例中，可以并入具有一个适用于参与点击化学反应的化学基团的一个单体，例如一个叠氮化物或炔烃封端的系栓物/连接子。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，可以将一种具有一个互补化学基团(例如一个炔烃或叠氮化物)的配体通过将该炔烃与该叠氮化物偶联在一起来附接至该前体单体。
对于双链寡核苷酸而言，可以将配体附接到一条或两条链上。在一些实施例中，双链iRNA剂包含一种与有义链缀合的配体。在其他实施例中，双链iRNA剂包含一种与反义链缀合的配体。
在一些实施例中，可以将配体与核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键合进行缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以在任何位置处(包括内环和外环原子)出现。在一些实施例中，将一种嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至一个缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合物也可以在任何位置处出现。在一些实施例中，可以将一种嘧啶核碱基的2-、5-以及6-位用一个缀合物部分取代。与核苷的糖部分的缀合可以在任何碳原子处出现。可以被附接至一个缀合物部分的一个糖部分的示例性碳原子包括2'、3'以及5'碳原子。还可以将1'位附接至一个缀合物部分，如在一个无碱基残基中。核苷间键合还可以具有缀合物部分。对于含磷键合(例如磷酸二酯、硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酰酯等)而言，可以直接将该缀合物部分附接至该磷原子或与该磷原子结合的一个O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键合(例如PNA)而言，可以将该缀合物部分附接至该胺或酰胺的氮原子或一个相邻碳原子。
可以使用RNA干扰领域中的任何适合配体，但该配体典型地是一种碳水化合物，例如单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖。
使该配体与该核酸结合的连接物包括以上论述的那些。例如，该配体可以是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA与一种二价和三价支链连接物缀合，包括式(IV)-(VII)中的任一者中所示的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
各次出现的P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
各次出现的Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C各自独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个所中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
各次出现的R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C各自独立地是不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C代表配体；即各次出现时各自独立地代表：单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；并且
Ra是H或氨基酸侧链。
三价缀合的GalNAc衍生物特别可用于与RNAi剂一起用于抑制一种靶基因的表达，如具有式(VII)的那些：
其中L5A、L5B与L5C代表单糖，例如GalNAc衍生物。
缀合GalNAc衍生物的适合的二价和三价支链连接物基团的实例包括但不限于以下化合物：
在其他实施例中，用于在本发明的方法中使用的RNAi剂是一种选自下组的试剂，该组由以下各项组成：AD-53815、AD-56663、AD-56658、AD-56676、AD-56666、AD-57928、和AD-60212。
III.本发明的iRNA的递送
可以按许多不同方式实现向细胞、例如受试者像人类受试者(例如对其有需要的受试者，例如患有脂质失调例如高脂血症的受试者)体内的细胞递送iRNA剂。例如递送可通过将细胞在体外或体内与本发明的iRNA接触来进行。也可以通过向受试者施用包含iRNA(例如dsRNA)的组合物，直接进行体内递送。可替代地，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在后文进一步论述。
通常，递送(体外或体内)核酸分子的任何方法可以适应于随本发明的iRNA使用(见例如阿赫塔尔(Akhtar)S.和朱利安(Julian)RL.(1992)细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)2(5):139-144和WO 94/02595，通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，为了递送iRNA分子考虑的因子包括：例如所递送的分子的生物学稳定性、非特异性作用的防止、和所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入至组织中或局部施用该制剂，使iRNA的非特异性作用最小化。局部施用至治疗位点使该试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受该试剂损害或可能降解该试剂，并且允许较低总剂量的iRNA分子施用。几项研究已经显示在局部施用iRNA时成功敲减基因产物。例如在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼球内递送VEGFdsRNA(托伦蒂诺(Tolentino)，MJ.等人(2004)视网膜(Retina)24:132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich)，SJ.等人(2003)分子视觉(Mol.Vis.)9:210-216)眼球内递送VEGF dsRNA均显示在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsRNA缩减肿瘤体积(皮勒(Pille)，J.等人(2005)分子疗法(Mol.Ther.)11:267-274)并且可以延长带瘤小鼠的存活(金姆(Kim)，WJ.等人(2006)分子疗法(Mol.Ther.)14:343-350；李(Li)，S.等人(2007)分子疗法(Mol.Ther.)15:515-523)。也已经显示通过直接注射将RNA干扰成功局部递至CNS(多恩(Dorn)，G.等人(2004)核酸(Nucleic Acids)32:e49；丹(Tan)，PH.等人(2005)基因疗法(Gene Ther.)12:59-66；牧村(Makimura)，H.等人(2002)BMC神经科学(BMC Neurosci.)3:18；希什吉娜(Shishkina)，GT.等人(2004)神经科学(Neuroscience)129:521-528；塔克尔(Thakker)，ER.等人(2004)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)101:17270-17275；阿卡涅亚(Akaneya)，Y.等人(2005)神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)93:594-602并且通过鼻内施用成功递送至肺(霍华德(Howard)，KA.等人(2006)分子疗法(Mol.Ther.)14:476-484；张(Zhang)，X.等人(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:10677-10684；比特科(Bitko)，V.等人(2005)自然·医学(Nat.Med.)11:50-55)。对于全身性施用iRNA以便治疗疾病，可以将RNA修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均起到防止dsRNA被体内核酸内切酶和外切酶快速降解的作用。RNA或药用载体的修饰也可以允许iRNA组合物靶向至靶组织并避免不想要的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学缀合至亲脂性基团如胆固醇以增强细胞摄取和防止降解进行修饰。例如将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射至小鼠并且导致肝脏和空肠中apoB mRNA的敲减(苏兹赫克(Soutschek)，J.等人(2004)自然(Nature)432:173-178)。iRNA与适配体的缀合已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara)，JO.等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24:1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包装siRNA的囊泡或胶束(见例如金姆(Kim)SH.等人(2008)控制释放期刊(Journal of Controlled Release)129(2):107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身施用时iRNA的降解。用于制造和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如索伦森(Sorensen)，DR.等人(2003)分子生物学杂志(J.Mol.Biol)327:761-766；维尔马(Verma)，UN.等人(2003)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)9:1291-1300；阿诺德(Arnold)，AS等人(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25:197-205，通过引用以其全文结合在此)。对全身递送iRNA有用的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森(Sorensen)，DR等人(2003)，同上；维尔马(Verma)，UN.等人，(2003)，同上)、Oligofectamine、“固体核酸酸脂质颗粒”(齐默尔曼(Zimmermann)，TS等人(2006)自然441:111-114。)，心磷脂(简(Chien)，PY，等人(2005)癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)12:321-328；帕尔(Pal)，A等人(2005)国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(邦尼特(Bonnet)ME等人(2008)药物研究(Pharm.Res.)8月16日印刷版之前的电子版(Aug 16Epub ahead of print)；爱格纳(Aigner)，A.(2006)生物医学和生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(柳(Liu)，S.(2006)分子医药(Mol.Pharm.)3:472-487)、和聚酰胺型胺类(托马利亚(Tomalia)，DA等人(2007)生化社会事务(Biochem.Soc.Trans.)35:61-67；由(Yoo)，H.，等人(1999)药物研究(Pharm.Res.)16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身性施用的复合物。用于施用iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用方式完整地结合在此。
A.本发明的载体编码的iRNA
靶向PCSK9基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(见，例如，卡秋尔(Couture，A)等人，TIG.(1996),12:5-10；思科勒尔(Skillern,A.)等人，国际PCT公开号WO 00/22113，卡雷德(Conrad)，国际PCT公开号WO 00/22114，和卡雷德(Conrad)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(Gassmann)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1995)92:1292)。
iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链待表达以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如通过转染或感染)靶细胞中。可替代地，dsRNA的每条单独链可以由均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，dsRNA表达为被一种连接物多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，由此该dsRNA具有茎环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生表达如本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从许多商业来源可获得。一般，提供这类载体，它们含有用于插入所需核酸区段的便利限制性位点。表达iRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所需靶细胞引入的任何其他手段。
可以将iRNA表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如Transit-TKOTM)的复合物转染至靶细胞中。本发明也构思了在一周或更长时间范围内用于iRNA介导的靶向靶RNA不同区域的敲减的多次脂质转染。成功地将载体引入宿主细胞可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告物来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(例如抗生素或药物)的抗性，例如潮霉素B抗性。
可以随本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺联病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小RNA病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如痘苗病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
可用于递送iRNA的载体将包括足以在所需靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。
可以精确地调节iRNA的表达，例如通过使用对某些生理调节物(例如循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替(Docherty)等人，1994，FASEB杂志8:20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类可诱导的表达系统包括例如由以下项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。
可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如可以使用逆转录病毒载体(见米列尔(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组件。将编码iRNA的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博森(Boesen)等人，生物疗法(Biotherapy)6:291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体递送mdr1基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克洛斯(Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93:644-651(1994)；基艾姆(Kiem)等人，血液(Blood)83:1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(Salmons)和京茨堡(Gunzberg)，人类基因疗法(Human GeneTherapy)4:129-141(1993)；和格罗斯曼(Grossman)和威尔逊(Wilson)，遗传学与发育学新观点(Curr.Opin.in Genetics andDevel.)3:110-114(1993)。构思使用的慢病毒载体例如包括基于HIV的载体，这些载体在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述，所述专利通过引用方式结合在此。
也构思腺病毒用于本发明的iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。科扎斯凯(Kozarsky)和威尔逊(Wilson)，遗传学与发育学新观点(Current Opinion in Genetics andDevelopment)3:499-503(1993)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。布特(Bout)等人，人类基因疗法(Human Gene Therapy)5:3-10(1994)展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，Science 252:431-434(1991)；罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，细胞(Cell)68:143-155(1992)；马斯特伦杰利(Mastrangeli)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91:225-234(1993)；PCT公开WO 94/12649；和王(Wang)等人，基因疗法(Gene Therapy)2:775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的iRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在夏(Xia)H等人，(2002)，自然生物技术(Nat.Biotech.)20:1006-1010中描述。
也可以使用腺联病毒(AAV)载体来递送本发明的iRNA(沃尔什(Walsh)等人，实验生物学与医学会会报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204:289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1RNA启动子或细胞巨化病毒(CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA分子表达。用于表达本发明中表征的dsRNA的合适AAV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1987)，病毒学杂志(J.Virol.)61:3096-3101；菲舍尔(Fisher)KJ等人(1996)，病毒学杂志(J.Virol.)，70:520-532；萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1989)，病毒学杂志(J.Virol.)63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641中描述，通过引用将其全部披露合并在此。
另一种适合于递送本发明的iRNA的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。
病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同血清型的衣壳蛋白，使得AAV载体靶向不同的细胞；参见例如拉比诺维茨(Rabinowitz)J E等人，(2002)，病毒学杂志(J Virol)76:791-801，通过引用将其全部披露合并在此。
载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。
V.本发明的药物组合物
本发明还包括药物组合物和配制品，它们包括本发明的iRNA。在一个实施例中，本文中提供含有如此处所述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与PCSK9基因的表达或活性相关的疾病或病症，如脂质失调。基于递送模型配制这类药物组合物。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是以下组合物，该组合物被配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。
包含本发明的RNAi剂的药物组合物可以是例如具有或不具有一种缓冲液的溶液或含有药学上可接受的载体的组合物。这样的组合物包括例如水性或结晶组合物、脂质体配制品、胶束配制品、乳剂以及基因治疗载体。
在本发明的方法中，该RNAi剂可以在一种溶液中给予。一种游离RNAi剂可以在一种非缓冲溶液中、例如在生理盐水中或在水中给予。可替代地，该游离siRNA还可以在一种适合缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个优选实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以将包含该iRNA剂的缓冲液的pH与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。
在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含一种用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的试剂，以使得克分子渗透压浓度被保持在一个所希望的值，例如在人血浆的生理值。可以加入到该缓冲溶液以控制克分子渗透压浓度的溶质包括(但不限于)蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质或盐。在一些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是一种盐。在某些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是氯化钠或氯化钾。
本发明的药物组合物可以按足以抑制PCSK9基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如dsRNA可以按每个单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、或约50mg/kg施用。
例如，可以按以下剂量给予RNAi剂(例如dsRNA)：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一个实施例中，可以按以下剂量给予RNAi剂(例如dsRNA)：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以按以下剂量给予RNAi剂(例如dsRNA)：约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一个实施例中，按以下剂量给予RNAi剂(例如dsRNA)：约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。在一个实施例中，该dsRNA是以大约10mg/kg至大约30mg/kg的剂量给予的。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如可以给予受试者治疗量的iRNA：例如大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该iRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个子剂量中所含的iRNA必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久iRNA释放的常规持续释放配制品。缓释配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
在其他实施例中，单一剂量的该药物组合物可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3、或4周的间距施用。在本发明的一些实施例中，每周给予一次单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施例中，每两月给予一次单剂量的本发明的药物组合物。
本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半寿期。
在小鼠遗传学方面的进展已经产生了许多用于研究人类不同疾病的小鼠模型，例如将从减少PCSK9表达受益的出血性障碍。这类模型可以用于iRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。适合的小鼠模型在本领域是已知的，并且包括例如含有表达人PCSK9的转基因的小鼠。
取决于希望局部还是全身性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如通过皮肤药贴)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，例如，经由植入装置；或颅内的，例如脑实质内的、鞘内的或心室内的给予。
iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如肝脏(例如肝脏的肝上皮实质细胞)。
用于局部给予的药物组合物以及配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的安全套、手套等等也可以是有用的。适合的局部用配制品包括其中本发明中表征的iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子脂质和脂质体(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明中表征的iRNA可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可以与脂质、尤其与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C1-20烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部用配制品在美国专利号6,747,014中详细描述，所述专利通过引用方式结合在此。
A.包括膜性分子集合体的iRNA配制品
用于在本发明的组合物和方法中使用的iRNA可以被配制成用于在膜性分子集合体中递送例如脂质体或胶束。如此处使用的，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含该iRNA组合物。该亲脂性材料从典型地不包括iRNA组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜与生物膜结构上类似，当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括iRNA的内部水性内容物被递送到细胞中，其中该iRNA可以特异性结合到一种靶标RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体也是特异地靶向的，例如将该iRNA引导到特定的细胞类型。
包含RNAi剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将该RNAi剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与RNAi剂相互作用并在RNAi剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到RNAi剂的脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应过程中添加协助缩合的载体化合物，例如通过控制添加。例如该载体化合物可以是一种聚合物而不是一种核酸(如精胺或亚精胺)。也可以调整pH，以有利于缩合。
用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法(其结合了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为该递送媒介物的结构组分)进一步描述在例如WO 96/37194中，通过引用将其全文结合在此。脂质体形成还可以包括描述于以下中的示例性方法的一个或多个方面：费尔格纳(Felgner)，P.L.等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)8:7413-7417,1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；班厄姆(Bangham)等人分子生物学方法(M.Mol.Biol.)23:238,1965；奥尔森(Olson)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)557:9,1979；斯左卡(Szoka)等人美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)75:4194,1978；梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)775:169,1984；金姆(Kim)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)728:339,1983；和福永(Fukunaga)等人内分泌学(Endocrinol.)115:757,1984。常用的用于制备用作递送媒介物的具有适当尺寸的脂质聚集体的技术包括超声处理和冻融加挤出(见例如梅耶(Mayer)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)858:161,1986)。当所希望的是一致的小的(50至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化(梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)775:169,1984)。这些方法容易地适用于将RNAi剂制剂封装到脂质体中。
脂质体分成两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的核酸/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在核内体中。由于核内体内部的酸性pH，脂质体破裂，释放它们的内容物至细胞胞质中(王(Wang)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，1987,147,980-985)。
pH-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与之复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，某种核酸包埋于这些脂质体的含水内部。pH-敏感脂质体已经用来递送编码胸苷激酶基因的核酸至培养的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控释杂志(Journal of ControlledRelease)，1992,19,269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一类型的脂质体组合物形成自磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC，蛋PC。另一个类型形成自磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物。
在体外和体内将脂质体引入细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；费尔格纳(Felgner)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:2550,1994；诺贝尔(Nabel)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90:11307,1993；诺贝尔(Nabel)，人类基因疗法(HumanGene Ther.)3:649,1992；革顺(Gershon)，生物化学(Biochem.)32:7143,1993；和斯特劳斯(Strauss)EMBO杂志11:417,1992。
非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将环孢霉素A递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明这类非离子型脂质体系统有效促进环孢菌素A沉积至皮肤的不同层中(胡(Hu)等人，S.T.P.制药科学(S.T.P.Pharma.Sci.)，1994,4(6)466)。
脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯GM1，或者(B)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或PEG-衍生脂质的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(RES)细胞的减少的摄取(艾伦(Allen)等人，FEBS通讯，1987,223,42；吴(Wu)等人，癌症研究(Cancer Research)，1993,53,3765)。
包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。帕帕哈都久珀罗斯(Papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1987,507,64)报道了单唾液酸神经节苷酯GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半寿期的能力。这些研究结果由噶碧佐(Gabizon)等人(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1988,85,6949)阐释。均为艾伦(Allen)等人的美国专利号4,837,028和WO 88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯(Webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1,2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在WO 97/13499(利姆(Lim)等人)中披露。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合至细胞膜的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取，并可用以递送RNAi剂到巨噬细胞中。
脂质体的另外的优势包括：获得自天然磷脂类的脂质体是生物相容性的以及生物可降解的；脂质体可以合并广泛范围的水以及脂质可溶性药物；脂质体可以保护包囊化的RNAi剂在其内部区室内免于受到代谢与降解(罗索夫(Rosoff)，于“药物剂型”(PharmaceuticalDosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，卷1，245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。
可使用一种带正电荷的合成阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)以形成小的脂质体，其自发地与核酸相互作用形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致递送RNAi剂(参见，例如费尔格纳(Felgner)，P.L.等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)8:7413-7417,1987和美国专利号4,897,355，关于DOTMA以及其与DNA一起使用的说明)。
可以将一种DOTMA类似物、1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)与磷脂组合使用形成DNA络合囊泡。LipofectinTM(毕士大研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州)，是一种有效试剂，用于递送高度阴离子性核酸到活组织培养细胞中,这些细胞包括带正电荷的DOTMA脂质体,其自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物的净电荷也为正。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地递送功能性核酸到例如组织培养的细胞中。另一种可商购的阳离子脂质体1,2-双(油酰氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司(BoehringerMannheim)，印第安纳波利斯，印第安纳州)不同于DOTMA在于该油酰基部分被酯连接而不是醚连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已缀合至多个部分的那些，包括例如已缀合至两种类型的脂质中的一种的羧基精胺，并且包括化合物如5-羧基精胺基甘氨酸二辛油酰基酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(见例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质缀合物包括用胆固醇(“DC-Chol”)对该脂质进行的衍生，其已被配制成脂质体与DOPE的组合(参见高(Gao)，X，和黄(Huang)，L.，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)179:280,1991)。脂质聚赖氨酸，通过将聚赖氨酸缀合至DOPE制成，已被报道在血清存在下是有效于转染的(周(Zhou)，X等人，生物化学和生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1065:8,1991)。对于某些细胞系，这些含有缀合阳离子脂质的脂质体据说显示出较低的毒性，并比含DOTMA组合物提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维考(Vical)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州)和Lipofectamine(DOSPA)(生命科技公司(Life Technology,Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰州)。适合于寡核苷酸的递送的其他阳离子脂质在WO98/39359和WO 96/37194中说明。
脂质体配制品特别适用于局部给药，脂质体比其他配制品呈现若干优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高全身性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将RNAi剂给予进入皮肤的能力。在一些实施例中，脂质体用于将RNAi剂递送到表皮细胞，并且也用以提高RNAi剂向真皮组织(例如皮肤)的渗入。例如可局部施用这些脂质体。已记录了配制成脂质体的药物向皮肤的局部递送(见例如韦纳(Weiner)等人，《药物靶向杂志》(Journal of Drug Targeting)，1992，第2卷，405-410和杜普莱西(du Plessis)等人，《抗病毒研究》(Antiviral Research)，18,1992,259-265；曼尼诺(Mannino)，R.J.和富尔德-弗格里特(Fould-Fogerite)，S.，《生物技术》(Biotechniques)6:682-690,1988；伊塔尼(Itani)，T.等人，《基因》(Gene)56:267-276.1987；尼古劳(Nicolau)，C.等人《酶学方法》(Meth.Enz.)149:157-176,1987；施特劳宾格(Straubinger)，R.M.和帕帕哈吉欧普洛斯(Papahadjopoulos)，D.《酶学方法》(Meth.Enz.)101:512-527,1983；王(Wang)，C.Y.和黄(Huang)，L.，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84:7851-7855,1987)。
也已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，尤其包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将一种药物递送入小鼠皮肤的真皮。具有RNAi剂的这样的配制品可用于治疗皮肤病学失调。
包括iRNA的脂质体可被制成高度可变形的。这样的变形可以使脂质体能够通过比该脂质体的平均半径小的孔渗透。例如传递体是一种可变形的脂质体的类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到一种标准的脂质体组合物中制成。包括RNAi剂的传递体可以例如通过皮下地感染被递送以将RNAi剂递送到皮肤中的角质形成细胞中。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。此外，由于这些脂质特性，这些传递体可以是自优化的(适应例如皮肤中的孔的形状)、自我修复性的，并且可频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。
服从本发明的其他配制品描述在2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的61/018,611；2008年3月26日提交的61/039,748；2008年4月22日提交的61/047,087和2008年5月8日提交的61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US 2007/080331也描述了服从本发明的配制品。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。
表面活性剂在配制品(例如乳剂(包括微乳剂)以及脂质体)中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最普通的方法是通过亲水/亲油平衡值(HLB)的使用。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了用于对在配制品中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯以及皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。
用于在本发明的方法中使用的iRNA也可提供为胶束配制品。“胶束”在此处定义为一种特定类型的分子集合体，其中两亲性分子排列在一个球形结构中，使得这些分子的所有疏水部分向内定向，而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。
适于通过经皮的膜递送的混合胶束配制品可通过混合该siRNA组合物的水溶液、碱金属C8-C22烷基硫酸盐、以及胶束形成化合物来制备。示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧胆烷基甘氨酸和其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加。混合胶束会随着基本上任何种类的这些成分的混合(但剧烈的混合)形成，以提供更小尺寸的胶束。
在一个方法中，制备一种第一胶束组合物，其包含该siRNA组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合，以形成混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成的化合物混合，然后添加剩余的胶束形成化合物(剧烈混合下)来制备。
可将苯酚和/或间甲酚添加到该混合胶束组合物中以稳定该配制品并防止细菌生长。可替代地，可随着胶束形成成分一起添加苯酚和/或间甲酚。也可以在该混合胶束组合物形成之后加入等渗剂，如甘油。
对于作为喷雾的胶束配制品的递送，该配制品可被装入气溶剂分配器中并将该分配器用推进剂填充。在该分配器中推进剂(其在压力下)处于液体形式。对各成分的比例进行调整，以便使该水相和推进剂相成为一体，即存在一个相。如果有两个相，有必要在分配这些内容物的部分(例如通过计量阀)之前摇动该分配器。药物试剂的分配量是从计量阀中以细雾推进。
推进剂可以包括含氢氯氟烃、含氢氟烃、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，也可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
这些必需成分的特定浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于经口腔的吸收，通常希望的是增加例如至少两倍或三倍的对于通过经胃肠道注射或给予的剂量。
B.脂质颗粒
iRNA，例如本发明的dsRNA可以被完全封装在脂质配制品(例如LNP或其他核酸-脂质颗粒)中。
如在此使用的，术语“LNP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。LNP含有一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种PEG-脂质缀合物)。LNP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。LNP包括“pSPLP”，pSPLP包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合体，如在PCT公开号WO 00/03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有大约50nm至大约150nm，更典型地是大约60nm至大约130nm，更典型地是大约70nm至大约110nm，最典型地是大约70nm至大约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及它们的制备方法披露于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432，美国公开号2010/0324120以及PCT公开号WO 96/40964中。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从大约1:1至大约50:1，从大约1:1至大约25:1，从大约3:1至大约15:1，从大约4:1至大约10:1，从大约5:1至大约9:1，或大约6:1至大约9:1的范围内。以上引用的范围的范围中间值也意在成为本发明的部分。
阳离子脂质可以是例如N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基(DiLinoleyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、l,2-二亚麻基氧基(Dilinolenyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)，或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，将其通过引用结合于此。
在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环:10％DSPC:40％胆固醇:10％PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有0.027siRNA/脂质比率。
该可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是，例如PEG-二月桂基氧丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧丙基(C]8)。防止颗粒聚集的缀合脂质可以占从0mol％至约20mol％或约2mol％在颗粒中存在的总脂质。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占该颗粒中存在的总脂质的大约10mol％到大约60mol％或大约48mol％。
在一个实施例中，利匹哆异德(lipidoid)ND98.4HCl(MW 1487)(见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和PEG-神经酰胺C16(阿文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16母液可以随后以例如42:48:10摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与(例如pH 5乙酸钠中的)含水dsRNA混合，从而乙醇终浓度是约35％-45％并且乙酸钠终浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA纳米颗粒一般自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北部脂质公司(Northern Lipids,Inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇移除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如约pH 7，例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换。
式1
LNP01配制品例如在国际申请公开号WO 2008/042973中描述，将其通过引用结合在此。
另外的示例性脂质-dsRNA配制品描述于表A中。
表A.
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-双二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-氨甲酰基-1,2-二肉豆蔻基氧丙胺(平均分子量为2000的PEG)
包含LNP(l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的配制品描述于2009年4月15日提交的国际公开号WO2009/127060中，通过引用将其结合于此。
包括XTC的配制品描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US 2010/022614，将其通过引用特此结合。
包括MC3的配制品描述于，例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120，其全部内容通过引用结合在此。
包括ALNY-100的配制品描述于例如以下中：例如，2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933，将其通过引用特此结合。
包含C12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777，将其通过引用特此结合。
可电离的/阳离子脂质的合成
在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。
“烷基”意味着一种直链或支链的、非环的或环的饱和脂肪族烃，包含从1至24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、等；而不饱和环状烷基包括环丙烯基和环己烯基等。
“烯基”意味着如上定义的一种烷基，该烷基在相邻碳原子之间包含至少一个双键。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意味着如上定义的任何烷烃或烯基，其另外包含在相邻碳之间的至少一个三键。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在附接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。杂环可以经任何杂原子或碳原子附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环”是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被置换。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一个可以进一步由以下取代基的一种或多种取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。
在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法学是本领域技术人员熟知的(见例如有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)，格林(Greene)，T.W.等人，威利国际科学出版社(Wiley-Interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。
式A的合成
在一些实施例中，使用式A的阳离子脂质配制本发明的核酸-脂质颗粒：
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以是一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。
方案1
根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。
方案2
可选地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(Grignard)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式A的相应脂质。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)，4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
515的合成
在0℃在氮气氛下向双颈RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mLTHF中的溶液。在完成添加后，将反应混合物加温至室温并且随后加热至回流持续4小时。通过TLC监测反应的进程。在完成反应(借助TLC检测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的盐酸盐515。产量：7.12g 1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝9.34(宽,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
516的合成
向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌悬液添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50mL无水DCM中的N-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过TLC检测2-3小时)后，将混合物用1N HCl溶液(1x 100mL)和饱和NaHCO3溶液(1x 50mL)依次洗涤。随后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，所述粗制材料通过硅胶柱层析纯化以获得作为粘性物质的516。产量：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10:1)的溶液内，并且在室温向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2mL7.6％OsO4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体Na2SO3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并且用水(2x 100mL)洗涤，随后用饱和NaHCO3(1x 50mL)溶液、水(1x 30mL)并最终用盐水(1x 50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱层析纯化提供了非对映异构体的混合物，所述非对映异构体由制备级HPLC分离。产率：约6g粗制物517A-峰-1(白色固体),5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X射线证实立体化学。
518的合成
使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得作为无色油的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H)。HPLC-98.65％。
用于合成化合物519的一般方法
将化合物518(1eq)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，随后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，随后经塞里滤料(celite)过滤并缩减成油。柱层析提供作为无色油获得的纯519(1.3g，68％)。13CNMRδ＝130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；电喷雾MS(+ve)：对于C44H80NO2(M+H)+的分子量，计算值是654.6，发现值是654.6。
通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的颗粒尺寸与颗粒尺寸分布可以使用例如马尔文(Malvern)Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern)，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是大约20-300nm，例如40-100nm尺寸。颗粒尺寸分布应该是单峰。配制品中的总dsRNA浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(Molecular Probes))在配制品破坏性表面活性剂(例如0.5％Triton-X100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性剂的样品的信号来确定。该捕获的片段是通过将“游离”dsRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsRNA内含物中减去来确定。封装的dsRNA的百分比一般大于85％。对于LNP配制品而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。适合的范围典型地是约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm、或约至少80nm至约至少90nm。
用于口服给予的组合物与配制品包括粉末或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：在其中本发明所表征的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。合适的胆酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合成微颗粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生化聚亚胺、短梗霉多糖纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备在美国专利6,887,906、美国公开号20030027780和美国专利号6,747,014中详述，各自通过引用结合在此。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的配制品。
本发明的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
C.另外的配制品
i.乳剂
可以将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μm)分散在另一种中的非均匀系统(参见，例如，《安塞尔药物剂型和药物递送系统》(Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen,LV.)，波波维奇(Popovich NG.)，以及安塞尔(Ansel HC.)，2004，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，纽约州；爱德森(Idson)，于《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页；洛索夫(Rosoff)，于《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(Block)于《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)中，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；希古契(Higuchi)等人，于《雷明顿氏药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)中，麦克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿(Easton,Pa.)，1985，301页)。乳剂经常是包含密切混合且彼此分散的两个不混溶的液相的双相体系。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，例如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统，构成o/w/o乳剂。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
合成性表面活性剂，也称作表面活性试剂，已经广泛应用于乳剂的制备并且已经在文献中综述(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲的，并且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比值定义为亲水/亲油平衡值(HLB)，它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两亲分成不同类别(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；列赫尔(Rieger)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页)。
乳剂配制品中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基质具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶态硅酸铝和胶态镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。
在乳剂配制品中还包括多种非乳化材料，它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，335页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相小滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些配制品通常含有防腐剂。乳剂配制品中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂配制品中，以预防配制品的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤途径、口途径和肠胃外途径途径使用乳剂配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。口服递送的乳剂配制品已经非常广泛地使用，原因在于易于配制以及从吸收和生物利用率的观点看有效(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；爱德森(Idson)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳剂口服给予的物质。
ii.微乳剂
在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳剂。可以将微乳剂定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分而形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(Leung)与纱(Shah)，在：药物的受控释放:聚合物和聚集体系统(Controlled Release of Drugs:Polymers andAggregate Systems)，洛索夫(Rosoff)，M.编著，1989，VCH出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(Schott)，于雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1985，第271页)。
已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且对本领域技术人员，该方法已经产生怎样配制微乳剂的广泛知识(见例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems)，艾伦(Allen)，LV.，波波维奇(Popovich)NG.，以及安赛尔(Ansel)HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版)，纽约，NY；洛索夫(Rosoff)，于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(Block)于药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，纽约州，卷1，335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。
在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)(decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG 300、PEG400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳剂(o/w和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用率(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药学研究(Pharmaceutical Research)，1994,11,1385-1390；里切尔(Ritschel)，实验与临床药理学的方法与发现(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)，1993,13,205)。微乳剂提供以下优点：改善药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性剂引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效价改善和毒性减少(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人，药学研究(Pharmaceutical Research)，1994,11,1385；霍(Ho)等人，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1996,85,138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自然形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳剂组合物和配制品将促进iRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳剂也可以含有额外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、和改善配制品特性并增强本发明iRNA和核酸吸收的渗透增强剂。本发明的微乳剂中使用的渗透增强剂可以分成归于五大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)。每个类型都已经在以上进行了讨论。
iii.微颗粒
本发明的RNAi剂可并入颗粒，例如微颗粒。微颗粒可通过喷雾干燥来制备，但也可以通过其他方法，包括冷冻干燥，蒸发，流化床干燥，真空干燥，或这些技术的组合来制备。
iv.渗透增强剂
在一个实施例中，本发明采用各种渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，尤其是iRNA。大多数药物以离子化和非离子化的形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。
可以将渗透增强剂划分为属于5大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(见例如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactantsand polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa HealthCare)，纽约，NY，2002；李(Lee)等人，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)。在下面对每类以上提及的渗透增强剂都详细进行了阐述。
表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能减少该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是iRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants andpolymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页)；以及全氟化学乳剂如FC-43(高桥(Takahashi)等人，J.Pharm.Pharmacol.(药物药理学杂志)，1988,40,252)。
充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)。(见例如，头头(Touitou,E.)等人，《药物递送增强》(Enhancement in DrugDelivery)，CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，《治疗性药物载体系统锐评》(Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems)，1991，p.92)；村西(Muranishi)，《治疗性药物载体系统锐评》(Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems)，1990,7,1-33；El海瑞(Hariri)等人,《药物药理学杂志》(J.Pharm.Pharmacol.)，1992,44,651-654)。
胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂肪维生素的分散和吸收(见例如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY，2002；布鲁顿(Brunton)，第38章，引自：古德曼&吉尔曼(Goodman&Gilman's)的治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，哈德曼(Hardman)等人编著，麦格劳希尔(McGraw-Hill)，纽约，1996，第934-935页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为渗透增强剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括胆汁中天然存在的任意成分和它们的任意合成衍生物。适合的胆汁盐包括，例如胆酸(或其药学上可接受的的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢夫西地酸钠(STDHF)、二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(见例如马尔姆斯滕(Malmsten)，M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers indrug delivery)，英富曼卫生保健(Informa Health Care)，纽约，NY，2002；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991，第92页；斯温亚德(Swinyard)，第39章，引自：雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)，第18版，真纳罗(Gennaro)编著，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.，1990，第782-783页；马尔姆斯滕(Malmsten)，M.治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990,7,1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1992,263,25；山下(Yamashita)等人，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1990,79,579-583)。
与本发明有关使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为大多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，J.Chromatogr.(层析学杂志)，1993,618,315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯(homovanilate))、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如凯特戴尔，A.等人，用于制药、生物技术和药物递送的赋形剂的发展(Excipientdevelopment for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery)，CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems)，1991，第92页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1990,7,1-33；布尔(Buur)等人，控制释放杂志(J.Control Rel.)，1990,14,43-51)。
如本文所用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(见例如村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems)，1990,7,1-33)。这种类别的渗透增强剂包括例如不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems)，1991，第92页)；和非甾体抗炎药如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(山本(Yamashita)等人，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1987,39,621-626)。
也可以添加在细胞水平增强摄取iRNA的试剂至本发明的药物组合物和其他组合物。例如阳离子脂质，如脂质体(淳一(Junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(洛洛(Lollo)等人，PCT申请WO 97/30731)也已知增强dsRNA的细胞摄取。市售转染试剂的例子包括例如LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Invitrogen；Carlsbad,CA))、Lipofectamine 2000TM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、CellfectinTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、DMRIE-CTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、FreeStyleTMMAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM 2000CD(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、RNAiMAX(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OligofectamineTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OptifectTM(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、X-tremeGENE Q2转染试剂(罗氏公司(Roche)；格兰扎克尔街，瑞士(Grenzacherstrasse,Switzerland))、DOTAP脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)、DOSPER脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)或Fugene(格兰扎克尔街，瑞士)、试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州(Promega；Madison,WI))、TransFastTM转染试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-20试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、TfxTM-50试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、DreamFectTM(OZ生命科学公司；马赛市，法国(OZ Biosciences；Marseille,France))、EcoTransfect(OZ生命科学公司；马赛市，法国)、TransPassa D1转染试剂(新英格兰生物实验室；伊普斯威奇市，马萨诸塞州，美国(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA))、LyoVecTM/LipoGenTM(英杰公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Invivogen；San Diego,CA,USA))、PerFectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(Genlantis；San Diego,CA,USA))、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、Cytofectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、TroganPORTERTM转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、RiboFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国(Bioline；Taunton,MA,USA))、PlasFect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国)、UniFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国(B-Bridge International,MountainView,CA,USA))、SureFECTOR(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)或HiFectTM(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)，连同其他。
可以用其他试剂来增强所施用核酸的渗透，包括二醇如乙二醇和丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜类如苧烯和薄荷酮。
v.载体
本发明的某些组合物还向配制品中并入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(一般后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4'异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少(宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res.Dev.)，1995,5,115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996,6,177-183)。
vi.赋形剂
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的组合物另外可以包括其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包括另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包括对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包括增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA化合物和(b)通过非RNAi机制发挥作用,并且对于治疗出血性疾病很有用的一种或多种试剂。这些试剂的实例包括,但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒和/或抗纤维化剂。此外，其他常用于保护肝脏的药物，如水飞蓟素，也可以与在此描述的iRNA结合使用。其他有用于治疗肝脏疾病的试剂包括替比夫定，恩替卡韦和蛋白酶抑制剂，如特拉匹韦和例如在董(Tung)等人，美国专利申请公开号2005/0148548，2004/0167116，和2003/0144217；以及在黑尔(Hale)等人，美国专利申请公开号2004/0127488中披露的其他试剂。
此类化合物的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。
从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制人类中使用的剂量范围时使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物实现症状的半最大抑制时的浓度)。这类信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相层析。
除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的iRNA与在治疗由PCSK9表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文所述的标准功效量值所观察到的结果，施用医师可以调整施用iRNA的量和时间。
IV.用于抑制PCSK9表达的方法
本发明提供了抑制前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)在细胞中表达的方法。这些方法包括使一种细胞与一种RNAi剂(例如一种双链RNAi剂)以有效抑制该细胞中的PCSK9表达的一个量接触，从而抑制该细胞中的PCSK9表达。
使一种细胞与一种双链RNAi剂接触可以在体外或体内进行。在体内使一种细胞与该RNAi剂接触包括使受试者(例如，人类受试者)内的一种细胞或细胞群组与该RNAi剂接触。体外和体内接触方法的组合也是可能的。如上文所论述，接触可以是直接或间接的。此外，使一种细胞接触可以经由一种靶向配体(包括在此描述或本领域中已知的任何配体)实现。在优选实施例中，该靶向配体是一种碳水化合物部分(例如一种GalNAc3配体)或将该RNAi剂导向到受试者的一个感兴趣的部位(例如肝脏)的任何其他配体。
如在此使用的，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、以及其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。
短语“抑制PCSK9的表达”旨在指抑制任何PCSK9基因(如例如小鼠PCSK9基因、大鼠PCSK9基因、猴PCSK9基因或人类PCSK9基因)以及PCSK9基因的变体或突变体的表达。因此，该PCSK9基因可以是野生型PCSK9基因、突变PCSK9基因、或在遗传操作的细胞、细胞群组或生物体的情形下的转基因PCSK9基因。
“抑制PCSK9基因的表达”包括PCSK9基因的任何水平的抑制，例如PCSK9基因的表达的至少部分抑制。基于与PCSK9基因表达相关的任何变量的水平或水平变化，例如PCSK9 mRNA水平、PCSK9蛋白水平、或脂质水平，可以评估PCSK9基因的表达。这一水平可以在个体细胞中或在一组细胞中(包括例如来源于一名受试者的一种样品)进行评估。
可以通过与对照水平相比的一个或多个与PCSK9表达相关的变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如，仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。
在本发明的方法的一些实施例中，PCSK9基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
PCSK9基因表达的抑制可以通过由第一细胞或细胞群组(这样的细胞可以存在于例如来源于受试者的样品中)表达的mRNA的量的降低来显现，其中PCSK9基因被转录并且该细胞或这些细胞已经被处理(例如通过使该细胞或这些细胞与本发明的RNAi剂接触，或通过向现在存在或以前存在这些细胞的受试者给予本发明的RNAi剂)，以使得与跟该第一细胞或细胞群组基本上相同但尚未被如此处理的第二细胞或细胞群组(一种或多种对照细胞)相比，PCSK9基因的表达被抑制。在优选实施例中，通过使用下式将被处理的细胞中的mRNA的水平表示为对照细胞中的mRNA的水平的百分比来评估该抑制：
可替代地，可以就与PCSK9基因表达在功能上有关的参数(如脂质水平、胆固醇水平，例如LDLc水平)的降低而言来评估PCSK9基因表达例如PCSK9蛋白表达的抑制。可以组成性地或者通过基因组工程化而表达PCSK9的任何细胞中并且通过本领域中已知的任何测定来确定PCSK9基因沉默。肝脏是PCSK9表达的主要部位。其他重要表达部位包括胰腺、肾脏以及肠。
PCSK9蛋白的表达的抑制可以通过由一种细胞或细胞群组表达的PCSK9蛋白水平(例如来源于受试者的样品中表达的蛋白质水平)的降低来显现。如以上关于mRNA抑制的评估所解释，一种被处理的细胞或细胞群组中的蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为一种对照细胞或细胞群组中的蛋白质的水平的百分比。
可以用来评估PCSK9基因表达的抑制的对照细胞或细胞群组包括尚未与本发明的RNAi剂接触的细胞或细胞群组。例如，该对照细胞或细胞群组可以来源于在用RNAi剂处理受试者之前的个体受试者(例如人类或动物受试者)。
可以使用本领域中已知用于评估mRNA表达的任何方法来测定由一种细胞或细胞群组表达的PCSK9 mRNA的水平。在一个实施例中，通过检测转录的多核苷酸或其部分(例如该PCSK9基因的mRNA)来测定样品中的PCSK9的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞提取RNA，包括例如使用酸苯酚/胍异硫氰酸酯提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytix，瑞士(Switzerland))。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包括核连缀测定(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNase保护测定(麦尔登(Melton)等人，《核酸研究》(Nuc.Acids Res.)12:7035)、RNA印迹法、原位杂交以及微阵列分析。
在一个实施例中，使用一种核酸探针确定PCSK9的表达水平。如在此使用的，术语“探针”是指能够选择性结合到一种特定PCSK9的任何分子。探针可以由本领域的技术人员合成或来源于适当生物制剂。探针可以具体来说经设计以被标记。可以用作探针的分子的实例包括(但不限于)RNA、DNA、蛋白质、抗体以及有机分子。
可以在包括(但不限于)以下各项的杂交或扩增分析中使用分离的mRNA：DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析以及探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法包括使该分离的mRNA与可以与PCSK9 mRNA杂交的一种核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将该mRNA固定在一个固体表面上，并且例如通过使该分离的mRNA在一个琼脂糖凝胶上跑胶并且将该mRNA从该凝胶转移到一个膜(如硝化纤维素)而与一种探针接触。在一个替代性实施例中，将该探针或这些探针固定在一个固体表面上，并且使该mRNA例如在一个Affymetrix基因芯片阵列中与该探针或这些探针接触。本领域技术人员可以容易地使已知mRNA检测方法适用于测定PCSK9 mRNA的水平。
用于确定样品中的PCSK9的表达水平的一种替代性方法涉及该样品中的例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(用以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(穆利斯(Mullis)，1987，美国专利号4,683,202中阐述的实验实施例)、连接酶链式反应(巴拉尼(Barany)(1991)《美国国家科学院院刊》88:189-193)、自主序列复制(瓜泰利(Guatelli)等人(1990)《美国国家科学院院刊》87:1874-1878)、转录扩增系统(郭(Kwoh)等人(1989)《美国国家科学院院刊》86:1173-1177)、Q-β复制酶(利萨尔迪(Lizardi)等人(1988)《生物技术》(Bio/Technology)6:1197)、滚环复制(利萨尔迪等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员所熟知的技术检测扩增的分子。如果这样的核酸分子以极低数目存在，那么这些检测方案尤其可用于检测这些分子。在本发明的具体方面，通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)确定PCSK9的表达水平。
可以使用膜印迹(如杂交分析中所用，如RNA印迹、DNA印迹、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体载体)监测PCSK9 mRNA的表达水平。参看美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195以及5,445,934，这些美国专利通过引用结合在此。PCSK9表达水平的确定还可以包括使用溶液中的核酸探针。
在优选实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。这些方法的使用描述并且例证于在此呈现的实例中。
可以使用本领域中已知用于测量蛋白质水平的任何方法测定PCSK9蛋白表达水平。这样的方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。
如在此使用的，术语“样品”是指从受试者分离的类似的流体、细胞或组织的集合，以及受试者内存在的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液、唾液、眼内液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如肝细胞)。在优选实施例中，“源自受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或血浆。在其他实施例中，“来源于受试者的样品”是指来源于该受试者的肝脏组织。
在本发明的方法的一些实施例中，该RNAi剂被给予给一名受试者，以使得该RNAi剂被递送到该受试者内的一个具体部位。可以使用来源于来自该受试者内的具体部位的流体或组织的样品中的PCSK9 mRNA或PCSK9蛋白的水平或水平变化的测量来评估PCSK9表达的抑制。在优选实施例中，该部位是肝脏。该部位还可以是来自前述部位的任一者的细胞的亚组或亚群。该部位还可以包括表达特定类型的受体的细胞。
V.用于治疗或预防PCSK9相关疾病的方法
本发明还提供了用于治疗或预防可通过下调PCSK9基因表达进行调节的疾病和病症的方法。例如，在此描述的组合物可用来治疗脂血症，例如高脂血症、以及其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与这些失调相关的病理情况，如心脏和循环系统疾病。可通过下调PCSK9基因表达进行调节的其他疾病和病症包括溶酶体贮积病，包括但不限于，尼曼-皮克病、泰-萨克斯病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、和高雪病。这些方法包括给予该受试者一个治疗有效量或预防有效量的一种本发明的RNAi剂。在一些实施例中，该方法包括向具有杂合LDLR基因型的患者给予治疗量的PCSK9 siRNA。
PCSK9基因减少的结果优选地导致哺乳动物血液中(更具体在血清中)的LDLc(低密度脂蛋白胆固醇)水平的降低。在一些实施例中，与治疗前水平相比，LDLc水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
如在此使用的，“受试者”包括或者人或者非人类动物，优选脊椎动物，并且更优选哺乳动物。受试者可以包括转基因生物体。最优选地，受试者是人，如罹患或倾向于患上PCSK9相关疾病的人。
在本发明的方法的一些实施例中，PCSK9表达下降持续延长的持续时间，例如，至少一周、两周、三周、或四周或更长。例如，在某些情况下，通过给予在此描述的iRNA剂，PCSK9基因表达被阻抑至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过给予iRNA剂，PCSK9基因被阻抑至少约60％、70％或80％。在一些实施例中，通过给予双链寡核苷酸，PCSK9基因被阻抑至少约85％、90％、或95％。
本发明的RNAi剂可以使用本领域中已知的任何给药模式给予给一名受试者，包括(但不限于)皮下、静脉内、肌肉内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在优选实施例中，这些试剂是皮下给予的。
在一些实施例中，该给予是经由积存注射。一个积存注射可以在长时间内以一种连贯方式释放该RNAi剂。因此，积存注射可以减少为了获得所希望的效果而需要给药的频率，例如所希望的PCSK9的抑制、或治疗或预防效果。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，该积存注射是皮下注射。
在一些实施例中，该给予是经由一个泵。该泵可以是外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一个输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选的实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是将该RNAi剂递送到肝脏的一个手术植入的泵。
其他给药模式包括硬膜外、脑内、脑室内、鼻给药、动脉内、心内、骨内输注、鞘内和玻璃体内以及经肺。给药模式取决于是希望局部治疗还是全身性治疗并且基于有待治疗的区域来进行选择。给药的途径与位点可以被选择为增强靶向。
该方法包括给予iRNA剂，例如以足以抑制PCSK9 mRNA的水平持续至少5天，更优选地持续7、10、14、21、25、30或40天的剂量；并且任选地，给予第二个单剂量的dsRNA，其中该第二个单剂量是在给予第一个单剂量之后至少5天，更优选7、10、14、21、25、30或40天之后给予的，由此抑制PCSK9基因在受试者中的表达。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂的剂量是以每4周不多于1次、每3周不多于1次、每2周不多于1次或每周不多于1次给予的。在另一个实施例中，给药可以维持1个、2个、3个或6个月，或1年或更长时间。
在另一个实施例中，当低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)水平达到或超过预定最低水平时，如大于70mg/dL、130mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、300mg/dL、或400mg/dL时，可以提供给药。
通常，iRNA剂不激活免疫系统，例如，其不增加细胞因子水平，如TNF-α或IFN-α水平。例如，当通过一种测定法如体外PBMC测定进行测量时，如在此所述的，TNF-α或IFN-α水平的增加小于用对照dsRNA(如，不靶向PCSK9的dsRNA)处理的对照细胞的30％、20％、或10％。
例如，受试者可以被给予治疗量的iRNA剂，如0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、或2.5mg/kg dsRNA。可以经过一段时间，如经过5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟时间静脉内输注而给予该iRNA剂。例如，基于定期，如每两周(即，每2周)持续1个月、2个月、3个月、4个月或更长时间重复给药。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如，在双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。iRNA剂的给予可以降低例如患者的细胞、组织、血液、尿或其他区室中的PCSK9水平至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
在给予全剂量iRNA剂之前，可以对患者给予一个较小剂量，例如5％>输注反应，并监测不良作用，例如，过敏反应、或升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，针对不想要的免疫刺激作用(比如增加的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平)对该患者进行监测。
当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善的时候，或者通过使得以另外方式可以被预期的症状不再恶化或发展，治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。也可以使用如本领域已知的针对给定疾病的实验动物模型，判定本发明的给定iRNA剂或这种iRNA剂的配制品的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学上显著的减少时治疗效果是明显的。
在一个实施例中，以约0.25mg/kg至约50mg/kg之间，例如在约0.25mg/kg至约0.5mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约1mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约5mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约10mg/kg之间、在约1mg/kg至约10mg/kg之间、在约5mg/kg至约15mg/kg之间、在约10mg/kg至约20mg/kg之间、在约15mg/kg至约25mg/kg之间、在约20mg/kg至约30mg/kg之间、在约25mg/kg至约35mg/kg、或在约40mg/kg至约50mg/kg之间的剂量给予该RNAi剂。
在一些实施例中，以约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg,30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg或约50mg/kg的剂量给予该RNAi剂。在一个实施例中，以约25mg/kg的剂量给予该iRNA剂。
给予受试者的RNAi剂的剂量可以被定制为平衡具体剂量的风险与效益，例如以实现所希望的水平的PCSK9基因抑制(如例如基于PCSK9 mRNA抑制、PCSK9蛋白表达或脂质水平的降低而评估)或所希望的治疗或预防作用，同时避免不希望的副作用。
在一些实施例中，该RNAi剂以两个或更多个剂量给予。如果希望促进重复或频繁输注，那么可能可取的是植入一个递送装置，例如一个泵、半永久性支架(例如静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储集器。在一些实施例中，后续剂量的数目或量取决于所希望的作用(例如PCSK9基因的抑制)的实现或治疗或预防作用(例如减轻高胆固醇血症的症状)的实现。在一些实施例中，该RNAi剂根据一种方案给予。例如，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、或每周五次给予该RNAi剂。在一些实施例中，该方案涉及定期间隔的给药，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周、或每月一次。在其他实施例中，该方案包括紧密间隔的给药，接着是较长时间期，在该时间期间不给予该试剂。例如，该方案可以包括在相对短的时间期(例如约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时或约每72小时)中给予的一组初始剂量，接着是更长时间期(例如约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)，在该时间期间不给予该RNAi剂。在一个实施例中，最初每小时给予该RNAi剂，并且后来以更长时间间隔(例如每天、每周、每两周或每月)给予。在另一个实施例中，最初每天给予该RNAi剂，并且后来以更长时间间隔(例如每周、每两周或每月)给予。在某些实施例中，更长的时间间隔随时间增加或基于所希望的作用的实现来确定。在一个具体实施例中，该RNAi剂在第一周期间每天给予一次，接着从给药的第八天开始每周给予一次。在另一个具体实施例中，该RNAi剂在第一周期间每隔一天给予一次，接着从给药的第八天开始每周给予一次。
在一个实施例中，该iRNA剂每周给予两次。在一个实施例中，该iRNA剂以1mg/kg的剂量每周给予两次。在另一个实施例中，该iRNA剂以2mg/kg的剂量每周给予两次。
在一个实施例中，该iRNA剂每两周给予一次。在一个实施例中，该iRNA剂以1mg/kg的剂量每两周给予一次。在另一个实施例中，该iRNA剂以2mg/kg的剂量每两周给予一次。
在一个实施例中，该iRNA剂每周给予一次。在一个实施例中，该iRNA剂以0.5mg/kg的剂量每周给予一次。在一个实施例中，该iRNA剂以1mg/kg的剂量每周给予一次。在另一个实施例中，该iRNA剂以2mg/kg的剂量每周给予一次。
在一些实施例中，该RNAi剂是以一个给药方案给予的，该给药方案包括一个紧密间隔给药的“负荷阶段”，继之以一个“维持阶段”，在该维持阶段中该RNAi剂以更长的间隔给予。在一个实施例中，该负荷阶段包括在第一周的期间每日给予该RNAi剂五次。在另一个实施例中，该维持阶段包括每周给予该RNAi剂一次或两次。在另一个另外的实施例中，该维持阶段持续5周。在一个实施例中，该负荷阶段包括以2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量每周给予五次。在另一个实施例中，该维持阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量每周一次、两次、或三次，每两周一次，每三周一次，每个月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，或每六个月一次。
这些方案中的任一者可以任选地被重复用于一个或多个迭代。迭代数可以取决于所希望的作用(例如PCSK9基因的抑制)的实现、和/或治疗或预防作用(例降低血清胆固醇水平或减轻高胆固醇血症的症状)的实现。
在另外的实施例中，将siRNA与另外的治疗剂组合给予。siRNA以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中组合地给予，例如，肠胃外给予,或该另外的治疗剂可以作为一个单独的组合物的一部分或通过在此描述的另一种方法给予。
另外的治疗剂的实例包括已知用来治疗脂质失调如高胆固醇血症、动脉粥样硬化或血脂异常的药剂。例如，在本发明中表征的siRNA可以与下列各项一起施用：例如，HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，他汀类)、贝特类、胆酸螯合剂、烟酸、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂(例如，氯沙坦钾，如默克公司的)、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTTP)抑制剂、胆固醇调节剂、胆酸调节剂、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)激动剂、基于基因的治疗剂、复合血管保护剂(例如，AGI-1067，来自Atherogenics公司)、糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、阿司匹林或阿司匹林样化合物、IBAT抑制剂(例如S-8921，来自盐野义制药株式会社(Shionogi))、鲨烯合酶抑制剂或单核细胞趋化蛋白(MCP)-I抑制剂。示例性HMG-CoA还原酶抑制剂包括阿托伐他汀(辉瑞公司的/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl)、普伐他丁(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的Pravachol、株式会社三共制作所(Sankyo)的Mevalotin/Sanaprav)、辛伐他汀(默克公司的/Sinvacor、勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)的Denan、伴宇公司(Banyu)的Lipovas)、洛伐他汀(默克公司的Mevacor/Mevinacor、Bexal公司的Lovastatina、Cepa；许瓦兹制药有限公司(SchwarzPharma)的Liposcler)、氟伐他汀(诺华公司的/Locol/Lochol、日本藤泽药品工业株式会社(Fujisawa)的Cranoc、索尔维公司的Digaril)、西立伐他汀(拜耳公司的Lipobay/葛兰素史克股份有限公司(GlaxoSmithKline)的Baycol)、瑞舒伐他汀(阿斯特捷利康制药公司(AstraZeneca)的)、以及皮替伐他汀(伊伐他汀/瑞西伐他汀)(日产化学工业公司、光和工业公司、株式会社三共制作所、和诺华公司)。示例性贝特类包括例如苯扎贝特(例如罗氏公司的日本桔生制药公司(Kissei)的Bezatol)、氯贝丁酯(例如惠氏公司(Wyeth)的)、非诺贝特(例如利博福尼制药有限公司(Fournier)的Lipidil/Lipantil、雅培公司(Abbott)的武田药品有限公司(Takeda)的Lipantil、generics)、吉非贝齐(例如，辉瑞公司的Lopid/Lipur)和环丙贝特(赛诺菲-安万特集团(Sanofi-Synthelabo)的)。示例性胆酸螯合剂包括例如，考来烯胺(百时美施贵宝公司的和Questran LightTM)、考来替泊(例如法玛西亚公司(Pharmacia)的Colestid)、以及考来维仑(基因酶公司/株式会社三共制作所(Genzyme/Sankyo)的WelCholTM)。示例性烟酸治疗剂包括例如立即释放配制品，如赛诺菲安万特公司的Nicobid、厄普舍－史密斯制药(Upsher-Smith)的Niacor、赛诺菲安万特公司的的Nicolar、以及三和化学研究所(Sanwakagaku)的Perycit。烟酸持续释放配制品包括例如，科斯制药公司(Kos Pharmaceuticals)的Niaspan和厄普舍－史密斯制药(Upsher-Smith)的SIo-Niacin。示例性抗血小板剂包括例如，阿司匹林(例如拜耳公司的阿司匹林)、氯吡格雷(赛诺菲圣德拉堡集团(Sanofi-Synthelabo)/百时美施贵宝公司的Plavix)、以及噻氯匹定(例如，赛诺菲圣德拉堡集团的Ticlid和第一株式会社(Daiichi)的Panaldine)。在与靶向PCSK9的dsRNA的组合中有用的其他阿司匹林样化合物包括例如，Asacard(法玛西亚公司的缓释阿司匹林)和帕米格雷(Pamicogrel)(佳丽宝公司(Kanebo)/济各安吉利克化学联合股份有限公司(Angelini Ricerche)/CEPA)。示例性血管紧张素转化酶抑制剂包括例如，雷米普利(例如赛诺菲安万特公司的Altace)和依那普利(例如默克公司的Vasotec)。示例性的酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂包括例如，阿伐麦布(辉瑞公司)、依鲁麦布(百奥梅里皮尔佛贝公司(BioMsrieux Pierre Fabre)/礼来公司(Eli Lilly)、CS-505(株式会社三共制作所(Sankyo)和京都(Kyoto))、以及SMP-797(住友公司(Sumito))。示例性胆固醇吸收抑制剂包括例如，依折麦布(默克公司/先灵葆雅制药有限公司(Schering-PloughPharmaceutical)的)和帕马苷(辉瑞公司)。示例性CETP抑制剂包括例如，托法替尼(也称为CP-529414，辉瑞公司)、JTT-705(日本烟草公司)、和CETi-I(阿万特免疫治疗公司(AvantImmunotherapeutics))。示例性微粒体甘油三酯转移蛋白(MTTP)抑制剂包括例如，英普他派(拜耳公司)、R-103757(强生公司(Janssen))、和CP-346086(辉瑞公司)。其他示例性胆固醇调节剂包括例如，NO-1886(大冢制药株式会社(Otsuka)/TAP制药公司)、CI-1027(辉瑞公司)、以及WAY-135433(惠氏公司(Wyeth-Ayerst))。
示例性胆酸调节剂包括例如HBS-107(久光制药株式会社(Hisamitsu)/伴宇公司)、Btg-511(英国科技集团(British TechnologyGroup))、BARI-1453(赛诺菲安万特公司)、S-8921(盐野义制药株式会社)、SD-5613(辉瑞公司)、和AZD-7806(阿斯特捷利康制药公司)。示例性过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)激动剂包括例如，替格列扎(AZ-242)(阿斯特捷利康制药公司)、萘格列酮(MCC-555)(三菱公司(Mitsubishi)/强生公司(Johnson&Johnson))、GW-409544((配体制药公司(Ligand Pharmaceuticals/葛兰素史克股份有限公司)、GW-501516(配体制药公司/葛兰素史克股份有限公司)、LY-929(配体制药公司和礼来公司)、LY-465608(配体制药公司和礼来公司)、LY-518674(配体制药公司和礼来公司)、以及MK-767(默克公司和杏林制药(Kyorin))。示例性的基于基因的治疗剂包括例如，AdGWEGF 121.10(金维克公司(GenVec))、ApoAl(优时比制药公司(UCB Pharma)/弗尔涅集团(Groupe Fournier)、EG-004(Trinam公司)(阿克治疗公司(ArkTherapeutics))、以及ATP结合盒转运子-Al(ABCA1)(CV治疗公司/英塞特公司(Incyte)、赛诺菲安万特公司、氙能科技有限公司(Xenon))。示例性的糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂包括例如，罗昔非班(也称为DMP754，百时美施贵宝公司)、更托非班(默克KGaA公司/山之内集团公司(Yamanouchi))、以及色满非班(千年制药公司(Millennium Pharmaceuticals))。示例性的鲨烯合酶抑制剂包括例如，BMS-1884941(百时美施贵宝公司)、CP-210172(辉瑞公司)、CP-295697(辉瑞公司)、CP-294838(辉瑞公司)、以及TAK-475(武田药品有限公司)。示例性的MCP-I抑制剂为例如RS-504393(罗氏生物科学公司)。抗动脉粥样硬化剂BO-653(中外制药株式会社(Chugai Pharmaceuticals))、以及烟酸衍生物乃克宁(Nyclin)(山之内集团公司)也适合用于与本发明中表征的dsRNA组合给予。适合于与靶向PCSK9的dsRNA一起给予的示例性联合治疗剂包括，advicor(来自科斯制药公司的尼克酸/洛伐他汀)、氨氯地平/阿托伐他汀(辉瑞公司)、以及依折麦布/辛伐他汀(例如，默克公司/先灵葆雅制药有限公司的10/10、10/20、10/40、和10/80片)。用于治疗高胆固醇血症并且适合于与靶向PCSK9的dsRNA联合给药的药剂包括例如，洛伐他汀、烟酸缓释片(Andrx Labs)、洛伐他汀片(辉瑞公司)、苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙片(阿斯特捷利康制药公司)、瑞舒伐他汀钙胶囊(诺华公司)、氟伐他汀钠(里来恩特公司(Reliant)，诺华公司)、氟伐他汀钠片(帕克—戴维斯公司(Parke-Davis))、阿托伐他汀钙胶囊(Gate公司)、诺之平(Niaspan)缓释片(科斯制药公司)、烟酸普拉固(Pravachol)片(百时美施贵宝公司)、普伐他汀钠片(雅培公司)、非诺贝特10/10片(默克公司/先灵葆雅制药有限公司)、依折麦布、辛伐他汀WelCholTM片(株式会社三共制作所)、盐酸考来维仑片(先灵葆雅制药有限公司)、依折麦布片(默克公司/先灵葆雅制药有限公司)、以及依折麦布片(默克公司)。
在一个实施例中，iRNA剂与依折麦布/辛伐他汀组合以联合方式给药(例如，(默克公司/先灵葆雅制药有限公司))。在一个实施例中，将iRNA剂给予患者，并且随后将另外的治疗剂给予该患者(或反之亦然)。在另一个实施例中，将iRNA剂和另外的治疗剂同时给予。
在另一方面，本发明的特征为一种指导终端使用者例如看护者或受试者关于如何给予在此描述的iRNA剂的方法。该方法包括，任选地，向终端使用者提供一个或多个剂量的iRNA剂，并且指导该终端使用者将该iRNA剂按照在此描述的方案进行给予，由此指导该终端使用者。
在一个方面，本发明提供了通过基于患者需要LDL降低、LDL降低而不降低HDL、ApoB降低、或总胆固醇降低来选择患者而治疗患者的方法。该方法包括向该患者以足以降低患者的LDL水平或ApoB水平(例如，没有实质上降低HDL水平)的量给予siRNA。
遗传易感性在与靶基因相关疾病例如高脂血症的发展中起作用。因此，通过采集家族史，或者例如筛选一个或多个遗传标记或变体，可以鉴定出需要siRNA的患者。涉及高脂血症的基因的实例包括但不限于，例如LDL受体(LDLR)、载脂蛋白(ApoAl、ApoB、ApoE、等等)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(LIPC)、内皮脂肪酶(EL)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)。
医疗保健提供者，如医生、护士或家族成员，可以在开处方或给予本发明的iRNA剂之前取得家族史。另外，可以进行试验来确定基因型或表型。例如，可以对来自患者的样品(例如，血样)进行DNA试验，以便在向患者给予PCSK9 dsRNA之前鉴定出PCSK9基因型和/或表型。在另一个实施例中，进行试验来鉴定出有关的基因型和/或表型，例如LDLR基因型。关于LDLR基因的遗传变体的实例可在本领域中找到，例如在下列通过引用进行结合的出版物中：科斯坦萨(Costanza)等人(2005)《美国流行病学杂志》(Am JEpidemiol.)15；161(8):714-24；山田(Yamada)等人(2008)《医学遗传学杂志》(J Med Genet.)Jan；45(1):22-8，电子版，2007年8月31日；和伯斯(Boes)等人(2009)《实验老年学》(Exp.Gerontol)44:136-160，电子版，2008年11月17日。
VI.试剂盒
本发明还提供了用于使用任何iRNA剂和/或执行本发明的任何方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种RNAi剂和使用说明书，例如用于通过使一种细胞与该RNAi剂或这些RNAi剂以有效抑制PCSK9表达的一个量接触来抑制该细胞中的该PCSK9表达的说明书。这些试剂盒可以任选地进一步包括用于使该细胞与该RNAi剂接触的工具(例如，注射装置)或用于测量PCSK9的抑制的工具(例如，用于测量PCSK9 mRNA或TTR蛋白的抑制的工具)。这样的用于测量PCSK9的抑制的工具可以包括用于从受试者获得样品(例如像，血浆样品)的工具。本发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于将该RNAi剂或这些RNAi剂给予给一名受试者的工具或用于测定治疗有效量或预防有效量的工具。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中表征的iRNA和方法，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。
实例
材料和方法
在这些实施例中使用如下材料和方法。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统(AppliedBiosystems)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)进行cDNA合成
将母混合物(每一反应：2μl 10×缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl RNA酶抑制剂以及3.2μl H2O)添加至10μl总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(大力神公司，CA)通过以下步骤产生cDNA：25℃ 10min、37℃ 120min、85℃5秒、4℃保持。
细胞培养和转染
将Hep3B、HepG2或HeLa细胞(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)在37℃下在5％CO2的氛围中在推荐的补充有10％FBS和谷氨酰胺(ATCC)的培养基(ATCC)中生长到接近汇合，随后通过胰蛋白酶消化从板释放。对于以96孔制式筛选的双链体，通过以下进行转染：将44.75μl的Opti-MEM加每孔0.25μl的LipofectamineRNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德CA.目录号13778-150)与5μl的各个siRNA双链体添加至96孔板中的每一个孔中。随后将该混合物在室温下孵育15分钟。然后将包括约2x 104个细胞的、不含抗生素的50μl的完全培养基添加至该siRNA混合物中。对于以384孔制式筛选的双链体，将5μl的Opti-MEM加0.1μl的LipofectamineRNAiMax(英杰公司，卡尔斯巴德CA.目录号13778-150)与每个单独的孔的5μl的各个siRNA双链体混合。然后将该混合物在室温孵育15分钟，随后将包括约8x 103个细胞的、不含抗生素的40μl完全生长培养基进行添加。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时。在10nM和0.1nM最终双链体浓度下进行单剂量实验，并且使用从2nM开始的8X 5倍连续稀释完成剂量响应实验。
自由摄取转染
将5μl的PBS中的每种GalNac缀合的siRNA与3X 104的刚解冻的冷冻保存的食蟹猴肝细胞(赛西斯离体技术公司(In VitroTechnologies-Celsis)，巴尔的摩，MD，lot#JQD)合并，这些细胞在96孔板的每个孔中重新悬浮于95μl的体外Gro CP培养基(赛西斯离体技术公司，巴尔的摩，MD)中中的或者对于384孔板制式而言5μl siRNA和含有1.2x 103个细胞的45μl培养基。将该混合物在37℃在5％CO2的气氛中孵育约24小时。对于单剂量实验，在500与0.1nM之间的多个浓度测试siRNA，并且对于剂量响应实验，使用从500nM开始的8X 5倍连续稀释。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件#：610-12)的总RNA分离
收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用Eppendorf热混合器在850rpm混合5分钟，混合速度在整个过程中相同。将十微升磁珠和80μl裂解/结合缓冲混合物添加到一个圆底板中，并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液移除而不扰动这些珠子。在移除上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在移出上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A洗涤2次并且混合1分钟。再次捕获珠子并且移除上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液B进行洗涤、捕获并且移除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液进行洗涤、捕获并且移除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。移除50μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
对于384孔制式，通过添加50μl裂解/结合缓冲液将细胞裂解一分钟。每孔使用2μl的磁珠。将所需体积的珠子等分、捕获在磁性表座上，并且将移除珠子保存溶液。然后将珠子重新悬浮在所需体积的裂解/结合缓冲液(每孔25μl)中并且将25μl的珠子悬浮液添加到裂解的细胞。将裂解产物-珠子混合物在设置#7的振动转译器(VibraTransaltor)上孵育10分钟(荷兰联合利华有限公司(UnionScientific Corp.)，兰德尔斯敦(Randallstown)，马里兰)。随后使用磁性表座捕获珠子，移除上清液并且将珠子用90μl缓冲液A洗涤一次，随后为用90μl缓冲液B和100μl洗脱缓冲液的单次洗涤步骤。将这些珠子浸泡在每种洗涤缓冲液中持续约1分钟(不涉及混合)。在最终洗涤之后，将珠子重新悬浮在15μl 70℃的洗脱缓冲液中持续5分钟，继之捕获珠子并移除上清液(多达8μl)，用于cDNA合成和/或纯化RNA的储存(-20℃)。
实时PCR
在384孔板(罗氏公司目录号04887301001)中，每孔向母混合物中添加2μl的cDNA，该母混合物含有用于人类细胞的0.5μl人GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司目录号4326317E)、0.5μl人PCSK9 TaqMan探针(应用生物系统公司目录号Hs03037355_m1)或用于食蟹猴细胞的0.5μl食蟹猴GAPDH定制TaqMan测定引物和探针(150nM食蟹猴GAP正向引物-5’GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO:5)；150nM食蟹猴GAP反向引物-5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO:6)；250nM食蟹猴GAP探针-5’-5HEX-CCAGGTGGTCTCCTCC-BHQ1-Q-3’(SEQ IDNO:7))、0.5μl食蟹猴PCSK9定制TaqMan测定引物和探针(900nM食蟹猴PCSK9正向引物5’-ACGTGGCTGGCATTGCA(SEQ IDNO:8)；900nM食蟹猴PCSK9反向引物5’-AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA(SEQ ID NO:9)；250nM食蟹猴PCSK9探针5’-6FAM-CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG-BHQ1-Q-3’(SEQ ID NO:10))以及5μl Lightcycler 480探针母混合物(罗氏目录号04887301001)。使用ΔΔCt(RQ)分析在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)上进行实时PCR。除非另外说明，否则在两次独立转染中测试每种双链体，并且一式两份地分析每个转染。
为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt法分析，并且针对用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的分析将数据归一化。针对自由摄取分析，针对PBS或GalNAc-1955(针对实验化合物使用最高浓度)处理的细胞将数据归一化。以利用XLFit的4参数拟合模型计算IC50并且针对用相同剂量范围AD-1955转染的细胞归一化或针对自身最低剂量归一化。
AD-1955的有义链和反义链序列是：有义序列：5’-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3’(SEQ ID NO:11)；和反义序列：5’-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3’(SEQ ID NO:12)。
表B：核酸序列描述中使用的核苷酸单体的缩写。
实例1. GalNAc缀合的寡核苷酸的合成
使用上述技术设计并合成了跨越PCSK9 mRNA序列的一系列siRNA双链体，并且将其与三价GalNAc在有义链的3-端缀合。这些双链体的序列显示在表1中。这些相同的序列也被合成为具有不同的核苷酸修饰并且与三价GalNAc缀合。修饰的双链体的序列示于表2中。
实例2.体外和体内筛选。
评估了这些双链体的子集在食蟹猴肝细胞中在单剂量自由摄取测定中的效能。简要地说，用处于三个浓度(500nM、100nM和10nM)的缀合的修饰的siRNA双链体处理原代食蟹猴肝细胞(PCH)。将100nM和10nM的自由摄取测定进行两次，并且数据被表示为相对于对照+/-标准差(SD)的平均信使剩余(average messageremaining)。将500nM的筛选进行单次。表3示出了这些测定的结果。
表3.通过在原代食蟹猴肝细胞中的自由摄取进行的PCSK9效能筛选
还通过在三个人类细胞系中的转染测定评估了该修饰且缀合的PCSK9 siRNA双链体的效能。以两个剂量10nM和0.1nM将PCSK9siRNA转染到三个不同的细胞系中(HeLa、Hep3B和HepG2)。这些测定的结果显示在表4中，并且数据表示为相对于对照的信使剩余的分数。
图1显示，在PCSK9双链体的沉默活性方面，在自由摄取测定与转染测定之间存在总体上的重现性。
通过食蟹猴细胞中的自由摄取以及通过在Hep3B细胞中的转染选定的双链体的IC50值显示在表5中。
表4.通过人类细胞系中的转染进行的PCSK9效能筛选
表5.通过在食蟹猴细胞中的自由摄取以及通过在Hep3B人类细胞系中的转染选定的双链体的PCSK9 IC50值。
还在携带人类PCSK9转基因的雌性小鼠中测定了AD-48400的体内效能，该人类PCSK9转基因随机插入到基因组中而没有破坏内源PCSK9基因。简要地说，用在第0天的单个20mg/kg剂量、在第0天的单个100mg/kg剂量、在第0、1、2、3、4、和5天的五个20mg/kg剂量皮下注射小鼠。在第-6、-3、0、1、2、3、4、和7天收集血清，并且通过ELISA测定来确定PCSK9蛋白的量。这些分析的结果描绘在图2中并且表明在所有三个测试剂量，缀合到GalNAc上的AD-48400具有剂量响应效应。
评估了通过上述体外筛选鉴定出的六种最有效的双链体的体内效能和响应持续时间。在第0、1、2、3、和4天，用5mg/kg或25mg/kg的AD-48400、AD-53830、AD-53806、AD-53815、AD-53748、或AD-53798注射转基因PCSK9小鼠。通过ELISA确定了在第-3、0、1、2、3、4、8、11、15、18、22、26、31、和36天的血清PCSK9蛋白水平。结果描绘在图3A和3B中。
实例3.先导物优化。
基于在以上实例2中描述的效能测定，在原代食蟹猴肝细胞(PCH)中在自由摄取测定中，评估了基于AD-53815和AD-53806的亲本序列的、具有多种化学修饰的PCSK9 siRNA在200nM、20nM、2nM、和0.2nM处的效能。对于除了0.2nM剂量的所有剂量，进行两次测定，并且将数据表示为相对于对照的平均的信使剩余分数(the average fraction message remaining)。对该0.2nM剂量测定单次。这些测定的结果在表6中示出。
表6.通过在食蟹猴肝细胞中的自由摄取针对AD-53815和AD-53806的先导物优化进行的效能筛选。
还通过在Hep3B细胞中的转染在10nM和0.1nM处针对体外效能对基于AD-53815和AD-53806的亲本序列的、具有多种化学修饰的siRNA进行了筛选的。这种结构-活性关系筛选的结果显示在表7中，并且被表示为相对于对照+/-SD的平均的信使剩余分数。
表7.通过在人类细胞中的转染针对对AD-53815和AD-53806的先导物优化进行的效能筛选。
为了确定来自体外SAR筛选的任何这些siRNA是否比切亲本siRNA(AD-53815)对沉默PCSK9更有效，对PCSK9转基因小鼠给予单个3mg/kg剂量的在图4中示出的siRNA，并且通过ELISA测定确定在给予后72小时的PCSK9蛋白水平。显示在图5中的这些结果证明，AD-57928对沉默PCSK9出任意料地有效。图6显示，不仅单剂量的AD-57928确实有效地敲低PCSK9蛋白，而且使用AD-57928也存在剂量响应。
实例4.使用AD-57928的分次给药研究
通过在给予AD-57928之后测量在hPCSK9转基因小鼠血清中的人PCSK9(hPCSK9)蛋白的水平，评估了AD-57928抑制PCSK9蛋白表达的能力。使用六个不同的给药方案皮下给予AD-57928，这些给药方案包括在第一周的期间的“负荷阶段”(每日0.5mg/kg、1mg/kg或2mg/kg的一个剂量，持续随后的5天)，继之以“维持阶段”(0.5mg/kg、1mg/kg或2mg/kg，每周给药一次或两次，持续5周)，如下表8中所述。最后的剂量在第38天给予。使用3只小鼠的一个组(包括两只雄性和一只雌性)测试每个给药方案。对照组接受PBS注射。
表8给予AD-57928的给药方案
在给予第一剂量之前3天以及在该第一剂量之后第1、4、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、42、45、52、59和65天采集血清。通过ELISA测定评估血清中的PCSK9蛋白水平。这些结果显示在图6、7和8中。
在该第一剂量之后72小时观察到hPCSK9血清蛋白水平降低，并且持续到第38天。以负荷剂量5x 2mg/kg、5x 1mg/kg和5x 0.5mg/kg给予AD-57928分别导致约90％、约70％和约60％的hPCSK9血清蛋白水平降低(参见图6-8)。在使用2x维持给药方案给药的组中，hPCSK9水平降低比使用1x维持给药方案给药的组中的持续时间长1周，并且在最后剂量之后4周返回到基线(参见图6-8)。
实例5.硫代磷酸酯滴定
为了确定硫代磷酸酯修饰的数目和位置对dsRNA抑制PCSK9表达的能力的影响，制备并测试了基于如表9中所示的AD-57928、AD-53806和AD-53830的亲本序列的多种siRNA。为了确定任何这些siRNA是否比AD-57928对沉默PCSK9更有效，对PCSK9转基因小鼠给予单个0.3mg/kg剂量的表9中的siRNA，并且通过ELISA测定确定在给药后72小时的PCSK9蛋白水平。显示在图9中的这些结果证明，AD-57928对沉默PCSK9出人意料地有效。与对照相比，AD-58893、AD-58894、AD-58896、AD-58897、AD-58898和AD-58899也能够沉默PCSK9。
表9.在硫代磷酸酯滴定实验中使用的siRNA
实例6. AD-57928和AD-58895的肝脏药物水平
本研究的目标是将野生型小鼠肝脏中的siRNA水平定量，以便定义用于药物水平筛选的适当条件。在该实验中使用的siRNA是AD-57928和AD-58895(在实例5中不产生PCSK9蛋白水平的降低)。AD-58895用作比较物质，以定义可观察到反映出效能的药物水平差异的时间点。
在该实验中总共使用了33只C57B6雌性小鼠(每组3只小鼠)。给这些小鼠给予单个皮下剂量的AD-57928、AD-58895或作为对照的PBS。在给药后4、24、48、72、96和168小时采集肝脏。对每个样品采集双份组织等分试样，使用新设计的反义序列特异性qRT-PCR测定来测量肝脏中的siRNA的浓度。测量的随着时间的每克肝脏的AD-57928和AD-58895的量显示在图10中，并且被表示为总理论剂量百分比的AD-57928和AD-58895的量显示在图11中。qRT-PCR测定的检测限(LOD)为约1ng/g肝脏，并且该测定显示了良好的性能和准确的重复再现性。这些结果表明，AD-57928在肝脏中更稳定，而AD-58895较不稳定，并且两者经过所有时间点都可以被检测到。在给药之后第7天，AD-57928水平比qRT-PCR测定的LOD高出100倍以上，并且AD-58895水平比LOD高出10倍以上。AD-57928和AD-58895的浓度根据它们的预期稳定性和观察到的效能而以平均10倍以上不同。在给药之后72和120小时之间的时间点对于基于siRNA浓度的筛选可以是适宜的。
实例7. AD-57928的优化
为了增强AD-57928的体内活性和稳定性，制备并测试了基于AD-57928的亲本序列的另外的iRNA剂(表10；在表10中的“有义”序列按出现顺序分别披露为SEQ ID NOS:1653-1658，并且“反义”序列按出现顺序分别披露为SEQ ID NOS:1659-1664；在表10中披露的相同有义和反义序列也披露在图12A中)。
AD-60212的未修饰的有义和反义序列是：
有义序列-5’-CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU-3’(A-122088.3；SEQ ID NO:1665)；和
反义序列-5’-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3’(A-120190.19；SEQ ID NO:1666)。
一般而言，含有较少2’-氟修饰和氟修饰尿苷的这些化合物被去除。通过转染HeLa和Hep3b细胞测试了这些双链体的体外效价。如图12B中所示，AD-59849、AD-59228、和AD-60212具有与亲本(AD-57928)可比的IC50值。
还通过向野生型小鼠给予1mg/kg的每种双链体并且通过定量PCR确定siRNA水平而确定了这些双链体在肝脏中体内存留的能力。如图13中描述的，所有这些双链体从给药之后120小时时间点开始显示出比亲本双链体在肝脏中更多的存留。
还通过测量在非人类灵长动物(NHP)血清中的PCSK9蛋白、LDL、HDL、总胆固醇(Tc)、甘油三酯(Tg)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、和碱性磷酸酶(ALP)的水平在体内评估了这些双链体抑制PCSK9蛋白表达的能力。还监测了注射部位反应的存在。使用一个给药方案给予这些双链体，该给药方案包括在第一周的期间的“负荷阶段”(每日2mg/kg的一个剂量，持续随后的5天，qdx5)，继之以“维持阶段”(2mg/kg的剂量每周三次，持续3周，qwx3)，如下表11中所述。
表11.给药方案
如图14A和14B中所示，除了AD-60688例外，所有化合物都实现了大于80％的PCSK9沉默，并且在AD-60212组中的个体动物实现了大于90％的PCSK9沉默。图15证明，在不存在他汀类的情况下，除了AD-60688例外，所有化合物都实现了60％的LDL胆固醇降低，并且在AD-59223组中的个体动物实现了高达77％的LDL胆固醇降低。令人惊讶的是，如图18中描绘，在这些指示的试剂的最后剂量之后，所指示的试剂维持胆固醇降低46天。甚至更令人惊讶的是，如图19中描绘，AD-60212和AD-59849维持高达60％的LDL胆固醇降低直到至少第120天(在最终剂量之后93天)，这比针对RNAi剂观察到的在体内的任何作用更长，表明在负荷阶段之后在维持阶段期间可以按照每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次的频率给予这些化合物。
实例8.基于PCSK9序列的另外的AD-57928的制备
制备了基于AD-57928的亲本序列的另外的iRNA剂(参见下表12)并且通过用这些试剂转染HeLa和Hep3B细胞测试了体外效价。这些试剂的IC50值显示在表13中。
表13.在表12中鉴定的iRNA剂的IC50值。
实例9. AD-57928的重复剂量效能
还通过测量在非人类灵长动物(NHP)血清中的PCSK9蛋白、LDL、HDL、总胆固醇(Tc)、甘油三酯(Tg)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、和碱性磷酸酶(ALP)的水平在体内评估了AD-57928抑制PCSK9蛋白表达的重复剂量效能。还监测了注射部位反应的存在。使用在下表14中描述的给药方案皮下给予AD-57928双链体。在第92天以单个25mg/kg剂量对组5的动物再次给药。对另一个组的动物给予25mg/kg的单剂量。“2xw”是每周两次；“q2w”是每两周一次；并且“q1w”每周一次。
表14.给药方案
如图16A中所示，用于降低LDL的最有效方案是每周两次方案(2xw)，其实现了约60％的LDL水平降低。以更低频率给予的相同累积剂量不如该每周两次的方案有效。图16B证明，该2xw方案实现了大于80％的PCSK9沉默。
图17和17B证明，如同每周两次(2xw)给予的较低的2mg/kg的AD-57928的多剂量，AD-57928的单个25mg/kg剂量具有在LDL和PCSK9降低方面的相同起始、在PCSK9和LDL降低方面的相同最低点、以及相等的LDL降低率。这些曲线图还证明，用单个25mg/kg剂量存在着更快的PCSK9降低倾向，并且对于25mg/kg单剂量而言，在达到最低点(第7天)之后约20天PCSK9水平和LDL水平两者都开始恢复。该25mg/kg单剂量的最低点是在第7天。
实例10.优化的AD-57928iRNA剂的耐受性
在大鼠中评估了基于图12A(和表10)中描述的AD-57928的亲本序列制备的另外的iRNA剂的耐受性。在第1、8、和15天，以225mg/kg的指示的iRNA剂皮下给予雄性大鼠，并且在第16天将其处死并进行尸检(参见表15)。在每日基础上观察这些动物的任何临床症状，并且在研究前以及在研究期间每周测定动物的体重。在第16天，在血液学上评估来自这些动物的血液的凝固作用和血清化学；使用来自这些动物的肝脏样品，确定了这些试剂的药物代谢与药代动力学；并且分析了心脏、肺(吹入)、肾、肝、脾、睾丸、以及第一和最后注射部位的任何变化。在临床体征、注射部位视觉观察、血清化学、凝固作用或肝、脾、肺、心脏、或睾丸的显微病理学方面没有变化。表16提供了对于每种测试试剂的肝脏重量、最终体重、血液学分析结果以及对于最终注射部位和肾脏的病理学严重性评分的总结。
表15.给药方案
表16.耐受性总结
病理学严重性评分：1＝极轻；2＝轻度；3＝中度
BW＝体重
WBC＝白细胞
LYM＝淋巴细胞

Claims (85)

1.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'    (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p’、q、和q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合。
2.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中i是0；j是0；i是1；j是1；i和j两者都是0；或i和j两者都是1。
3.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中k是0；l是0；k是1；l是1；k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
4.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中XXX与X'X'X'互补，YYY与Y'Y'Y'互补，并且ZZZ与Z'Z'Z'互补。
5.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。
6.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该Y'Y'Y'基序出现在该反义链的从5'-端起的11、12以及13位处。
7.如权利要求6所述的双链RNAi剂，其中该Y'是2'-O-甲基。
8.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中式(III)被表示为式(IIIa)：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'        (IIIa)。
9.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中式(III)被表示为式(IIIb)：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'     (IIIb)
其中每个Nb和Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
10.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中式(III)被表示为式(IIIc)：
有义链：5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'       (IIIc)
其中每个Nb和Nb′独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
11.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中式(III)被表示为式(IIId)：
有义链：5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5'    (IIId)
其中Nb和Nb′各自独立地表示包含1-5个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且Na和Na′各自独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
12.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为15-30个核苷酸对。
13.如权利要求12所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为17-23个核苷酸对。
14.如权利要求12所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为17-25个核苷酸对。
15.如权利要求12所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为23-27个核苷酸对。
16.如权利要求12所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为19-21个核苷酸对。
17.如权利要求12所述的双链RNAi剂，其中该双链区在长度上为21-23个核苷酸对。
18.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中每条链具有15-30个核苷酸。
19.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中在这些核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基、及其组合。
20.如权利要求19所述的双链RNAi剂，其中在这些核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
21.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
22.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体是
23.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体附接到该有义链的3′端。
24.如权利要求23所述的双链RNAi剂，其中该RNAi剂根据以下示意图中所示与该配体缀合
其中X是O或S。
25.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中所述试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
26.如权利要求25所述的双链RNAi剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的3'-末端处。
27.如权利要求26所述的双链RNAi剂，其中所述链是该反义链。
28.如权利要求26所述的双链RNAi剂，其中所述链是该有义链。
29.如权利要求25所述的双链RNAi剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的5'-末端处。
30.如权利要求29所述的双链RNAi剂，其中所述链是该反义链。
31.如权利要求29所述的双链RNAi剂，其中所述链是该有义链。
32.如权利要求25所述的双链RNAi剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一条链的5’-和3’-末端两者处。
33.如权利要求32所述的双链RNAi剂，其中所述链是该反义链。
34.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该双链体的反义链的5′-端的1位处的碱基对是AU碱基对。
35.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中这些Y核苷酸含有2′-氟修饰。
36.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中这些Y′核苷酸含有2′-O-甲基修饰。
37.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中p′>0。
38.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中p′＝2。
39.如权利要求38所述的双链RNAi剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出端核苷酸与该靶mRNA互补。
40.如权利要求38所述的双链RNAi剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出端核苷酸与该靶mRNA不互补。
41.如权利要求28所述的双链RNAi剂，其中该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。
42.如权利要求37-41中任一项所述的双链RNAi剂，其中至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上。
43.如权利要求42所述的双链RNAi剂，其中所有np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上。
44.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂选自下组，该组为在表1、表2、表9、表10、表12、和图12A中列出的RNAi剂。
45.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-53815、AD-56663、AD-56658、AD-56676、AD-56666、AD-57928、和AD-60212。
46.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'       (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p’、q、和q′各自独立地是0-6；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合。
47.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'       (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合。
48.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'     (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
49.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'     (III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb′各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
50.一种双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)的表达，其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中所述反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在长度上为约14至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-Y Y Y-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5'    (IIIa)
其中：
每个np、nq、和nq′，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示突出端核苷酸；
p、q、和q′各自独立地是0-6；
np′>0并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接到相邻核苷酸上；
Na和Na′各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键；并且
其中该有义链与至少一个配体缀合，其中该配体是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc衍生物。
51.一种选自下组的RNAi剂，该组RNAi剂为在表1、表2、表9、表10、表12、和图12A中列出的RNAi剂。
52.一种细胞，其含有如权利要求1和46-51中任一项所述的双链RNAi剂。
53.一种药物组合物，其包含如权利要求1和46-51中任一项所述的双链RNAi剂。
54.如权利要求53所述的药物组合物，其中RNAi剂在一种非缓冲溶液中给予。
55.如权利要求54所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
56.如权利要求53所述的药物组合物，其中所述siRNA与一种缓冲溶液给予。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。
58.如权利要求57所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
59.一种抑制细胞中PCSK9表达的方法，该方法包括：
(a)使该细胞与如权利要求1和46-51中任一项所述的双链RNAi剂或如权利要求53-58中任一项所述的药物组合物接触；并且
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持一段时间，该时间足以获得PCSK9基因的mRNA转录本的降解，由此抑制该细胞中PCSK9基因的表达。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
61.如权利要求60所述的方法，其中该受试者是人。
62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中该PCSK9表达被抑制至少约30％。
63.一种治疗患有由PCSK9表达介导的失调的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如权利要求1和46-51中任一项所述的双链RNAi剂或如权利要求53-58中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者中。
64.如权利要求63所述的方法，其中该受试者是人。
65.如权利要求64所述的方法，其中该人患有高胆固醇血症。
66.如权利要求63所述的方法，其中将该双链RNAi剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。
67.如权利要求66所述的方法，其中将该双链RNAi剂以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。
68.如权利要求66所述的方法，其中将该双链RNAi剂皮下给予。
69.如权利要求66所述的方法，其中将该双链RNAi剂静脉内给予。
70.如权利要求66所述的方法，其中将所述RNAi剂以两个或更多个剂量给予。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述RNAi剂是以包括一个负荷阶段继之以一个维持阶段的给药方案给予的，
其中该负荷阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周五次，并且
其中该维持阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周一次、每周两次、每周三次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，或每六个月一次。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述RNAi剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：约每12小时一次、约每24小时一次、约每48小时一次、约每72小时一次、以及约每96小时一次。
73.一种治疗受试者的高胆固醇血症方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如权利要求1和46-51中任一项所述的双链RNAi剂或如权利要求53-58中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者中。
74.如权利要求73所述的方法，其中该受试者是灵长动物或啮齿动物。
75.如权利要求73所述的方法，其中该受试者是人。
76.如权利要求73所述的方法，其中将该双链RNAi剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。
77.如权利要求73所述的方法，其中将该双链RNAi剂以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。
78.如权利要求73所述的方法，其中将所述RNAi剂以两个或更多个剂量给予。
79.如权利要求73所述的方法，其中所述RNAi剂是以包括一个负荷阶段继之以一个维持阶段的给药方案给予的，
其中该负荷阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量，每周五次，并且
其中该该维持阶段包括给予2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量每周一次、两次、或三次，每两周一次，每三周一次，每个月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，或每六个月一次。
80.如权利要求73所述的方法，其中所述RNAi剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：约每12小时一次、约每24小时一次、约每48小时一次、约每72小时一次、以及约每96小时一次。
81.如权利要求73所述的方法，其中将该双链RNAi剂皮下给予。
82.如权利要求73所述的方法，其中将该双链RNAi剂静脉内给予。
83.如权利要求73所述的方法，进一步包括确定该受受试者的LDLR基因型或表型。
84.如权利要求73所述的方法，其中给药导致该受试者的血清胆固醇减少。
85.如权利要求73所述的方法，进一步包括测定该受试者的血清胆固醇水平。
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