CN101698712B

CN101698712B - 壳聚糖溶液、其制备方法以及应用方法

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Publication number: CN101698712B
Application number: CN2009102112513A
Authority: CN
Inventors: 王健伟; 钟辉
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2009-11-05
Filing date: 2009-11-05
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2029-11-05
Also published as: CN101698712A

Abstract

本发明涉及高分子物质、物理化学、分子生物学、病毒学领域。具体而言，本发明涉及壳聚糖溶液、其制备方法以及应用其促进腺病毒载体介导的基因转导效率的方法。

Description

壳聚糖溶液、其制备方法以及应用方法

技术领域

背景技术

壳聚糖为甲壳素脱乙酰基后的产物，去乙酰程度可以为65％～100％。壳聚糖是目前已知的唯一的阳离子多糖，不溶于水和有机溶剂，可溶于pH＜6.5的稀酸，包括己二酸、盐酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸等。壳聚糖具有无毒、生物相容性良好和生物可降解的特点，因此在食品、医药及生物等领域应用广泛。

虽然壳聚糖具有无毒、生物相容性良好和生物可降解的优点，但是壳聚糖仅溶于部分酸性溶液，并在pH6.5以上的液体中不溶。由于绝大部分细胞均不能很好的耐受酸性环境，因此直接给予酸性壳聚糖溶液容易导致细胞损伤。而且机体内环境的pH值为7.4，在此条件下直接给予酸性壳聚糖将会被很快被机体中和至中性pH值，其中的壳聚糖将会形成沉淀，失去其生物学活性。此外在某些制药或生物工程过程中可能需要特殊的碱性反应条件，而壳聚糖在碱性条件下不溶将会导致相应的反应变得十分困难甚至不可能。因此改善壳聚糖的溶解性将有助于扩大壳聚糖的pH适应范围，为其更为广泛的应用提供了可能性。

目前中性或碱性条件下溶解壳聚糖的方法均为对壳聚糖进行化学基团的修饰，费时费力且难以操作。已有多篇报道称可以通过设计多种溶解性良好的壳聚糖的衍生物来实现溶解，并研究了其生物学性质。所述衍生物包括三甲基壳聚糖、PEG化壳聚糖和50％去乙酰化壳聚糖等。与未改造壳聚糖相比，三甲基壳聚糖在生理pH条件下Zeta电位高、DNA浓缩效果好、基因转导效率较高，但是其细胞毒性明显增大，而未改造的壳聚糖在酸性条件下才具有良好的DNA浓缩效果，在生理pH条件下其Zeta电位降低，DNA浓缩效果下降，DNA的转导效率也降低；PEG化对阳离子聚合物的DNA浓缩活性和细胞摄入效率有明显的干扰作用；去乙酰化为50％的壳聚糖水溶性很好，但是其基因转导效率低下。最近有关对自分支糖基化壳聚糖寡聚体的研究报道表明，该化合物具有水溶性好、无毒和基因转导效率较高的优点，但其化学合成过程十分复杂。这些缺点均阻碍了壳聚糖在促进基因转导效率中的应用。

本发明创新性在于采用了寻找合适化学物质促溶的思路，采用一种极其简单的方法实现了壳聚糖在pH6.8～pH14.0范围内的溶解，具有简单和易操作的特点。

重组腺病毒载体(rAdv)具有基因转导效率高、病毒载体滴度高以及能感染非复制相细胞等多种优点，因此在一过性、高水平的转基因表达具有特别的优势。以人类腺病毒为基础的载体已经在基础科研、基因治疗、基因疫苗领域中被广泛应用于不同细胞系的基因转导。由Journal of Gene Medicine提供的全球基因治疗临床试验数据库显示，截止到2009年4月，在全球范围内已有的1537个基因治疗临床试验中，应用重组腺病毒载体的试验为375例，约占24％，在各种应用载体中所占比例最高。目前绝大部分在体和离体应用的腺病毒载体均是基于5型腺病毒。

虽然重组腺病毒载体已得到广泛应用，但由于rAdv的基因转导主要是通过柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)介导，导致rAdv对CAR受体表达缺失的细胞的基因转导效率低下。因此开发非CAR受体依赖的、高效、低毒及简单易行的促进rAdv基因转导效率的方法十分必要。

已有多种研究试图从不同方向或者通过不同策略来提高rAdv在CAR受体缺失细胞系上的基因转导效率，包括采用新的血清型腺病毒载体或变换腺病毒载体外壳蛋白、腺病毒载体的PEG化、不阳离子脂质体以及阳离子聚合物包裹等。

不同血清型的腺病毒载体的细胞受体各不相同，因此采用不同血清型的腺病毒载体将有助于提高腺病毒载体对CAR表达缺失细胞的基因转导效率。但是目前5型外其他血清型的腺病毒载体尚不成熟，其应用的有效性和安全性尚有待评价。改变腺病毒外壳蛋白也可以改变腺病毒载体的细胞亲嗜性，提高其对CAR表达缺失细胞的转导效率。但是上述方法均是通过配体-受体系统进入细胞，因此其效率仍然受到相应细胞表面受体表达量的影响。

腺病毒的PEG化是将腺病毒载体外壳蛋白通过化学方法共价连接至PEG分子，能显著增强腺病毒非特异进入细胞的能力，从而促进其基因转导不敏感细胞系的能力。但是PEG化学共价连接反应过程需要精细调控反应条件，并且在化学反应前需要纯化腺病毒，反应完成后需要再次纯化回收PEG化的腺病毒。因此，该方法较难掌握且步骤繁琐，而且PEG化在增强腺病毒非特异进入细胞的能力之外，也降低了腺病毒对CAR高表达细胞的感染效率。

阳离子脂质体或阳离子聚合物可以与腺病毒表面上的酸性蛋白质结合，同时与细胞膜上带负电荷的磷脂相互作用，从而促进腺病毒进入细胞。但是阳离子脂质体和聚合物均具有明显的细胞毒性，因此其生物学应用受到一定的限制。

已有壳聚糖促进rAdv基因转导效率的实验的报道，但是由于该报道中并没有对壳聚糖的溶解性进行改进，因此需要特殊的酸性pH条件(pH6.4)，限制了其应用，因此需要开发新的方法。

综上所述，已有的这些方法均具有一定的局限性，尚不能够同时具有非受体依赖、高效、无毒及简单易行等多项优点。因此仍需发明更为有效及便利的促进rAdv基因转导效率的方法。

发明内容

本发明主要涉及以下几个方面：

本发明的第一方面是一种壳聚糖溶液，其特征在于所述溶液的pH为6.8-14.0，所述溶液中包括壳聚糖或其在上述pH条件下不溶的衍生物。任选地，所述壳聚糖或其衍生物具有65-99％的脱乙酰化。

本发明的第二方面是一种壳聚糖溶液的配制方法，包括下述步骤：

将壳聚糖溶于酸性溶液中，其中所述壳聚糖包括具有不同程度脱乙酰化——65～99％、不同分子量的壳聚糖以及具有化学上可能的化学基团修饰的壳聚糖衍生物，所述酸性溶液包括己二酸、盐酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸等所有已知的可溶解壳聚糖的酸性溶液、溶有其他化合物的上述酸性溶液以及上述酸性溶液的混合液体。壳聚糖酸性溶液的pH值可以在0.5～5.5的范围内，壳聚糖浓度可以为0.1mg/L～100g/L。

在剧烈震荡或者搅拌条件下，在上述壳聚糖酸性溶液中快速加入碳酸氢钠和/或碳酸氢钾溶液(包括NaHCO₃溶液、KHCO₃溶液、NaHCO₃和KHCO₃混合溶液以及任何含有NaHCO₃和/或KHCO₃的溶液)，中和至目的pH值所需的碳酸氢钠和/或碳酸氢钾溶液量必须事先计算或通过实验确定并一次性快速加入。加入碳酸氢钠和/或碳酸氢钾溶液时溶液的pH值会快速不断上升，并产生大量泡沫，加入完毕后继续剧烈震荡或搅拌30秒左右静置待泡沫消失，这时溶液处于澄清透明状态，即已实现壳聚糖在该pH值下的溶解。最后可用少量与壳聚糖相容的酸或碱精确调节pH值至所需pH值。其中所述与壳聚糖相容的酸包括盐酸、己二酸、盐酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸；所述与壳聚糖相容的碱包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾和氢氧化钠。

本发明第三方面是一种利用壳聚糖溶液促进重组现病毒载体基因转导效率的方法。

将含有重组腺病毒载体(纯化或未纯化)的液体，溶于不同液体中，然后与不同浓度的方案1中涉及的壳聚糖溶液混合，静置一段时间，加入到细胞培养液中用于感染各种细胞系。优选地，所述壳聚糖溶液与重组腺病毒载体溶液混合后，壳聚糖的浓度可以是0.1mg/L～5g/L、pH为6.8-9.0。更优选地，所述壳聚糖、重组腺病毒混合物与细胞相互作用的液体环境的pH值是6.8～9.0。

其中，含有重组腺病毒载体(纯化或未纯化)的液体可以是含有腺病毒的培养基上清及任何含有纯化腺病毒载体的液体，壳聚糖碳酸氢钠/钾溶液是指一切利用碳酸氢钠和/或碳酸氢钾实现壳聚糖在中性条件下溶解的溶液。用于混合重组腺病毒溶液和壳聚糖溶液的液体(工作液)可以是PBS、HBSS、水、培养基或者其他任何生物相容性液体。其中用于基因转导的细胞可以是离体的永生化的细胞系、原代培养的细胞系以及在体的动物及人体内细胞。

本发明所实现的有益效果：

1.提供了一种pH为6.8-14.0的壳聚糖溶液

2.实现壳聚糖在pH6.8～pH14.0条件下的溶解。

该方法可以实现壳聚糖在pH6.8～pH14.0环境下的溶解，解决了壳聚糖在中性和碱性条件下不溶的技术难题。从而为壳聚糖在中性和碱性环境下的应用打开了局面。除本专利直接涉及的提高病毒载体转导效率方面，该新溶液可以应用于其他任何需要在中性或者碱性条件下应用壳聚糖的领域，包括如DNA转染、提高病毒载体转导效率、抗病毒、抗菌、促进伤口愈合、药品制剂、生物制剂、食品添加剂等领域。

3.利用上述壳聚糖溶液促进重组现病毒载体基因转导效率

在CAR受体缺陷的细胞中，壳聚糖溶液可以将rAdv的基因转导效率提高10～20倍；而在CAR受体高表达的细胞系中，壳聚糖溶液也可以将rAdv的基因转导效率提高1.5倍左右。在体实验表明，壳聚糖溶液可以提高腺病毒载体对C57/BL6上B16细胞移植肿瘤的基因转导效率。

壳聚糖溶液的促进转导作用不受培养基中血清及rAdv纯度的影响，对抗5型腺病毒载体(Ad5)血清也有一定的耐受性。说明壳聚糖溶液可以非CAR受体依赖、高效、低毒及简便易行的促进rAdv基因转导效率。

附图说明

图1.壳聚糖碳酸氢钠溶液(壳聚糖/NaHCO₃)与壳聚糖乙酸溶液生理pH条件下(pH7.4)液体外观比较。不同pH条件下壳聚糖/NaHCO₃溶液和壳聚糖乙酸溶液外观比较。

图2.壳聚糖/NaHCO₃溶液在多个细胞系中促进rAdv基因转导效率。用表达半乳糖苷酶的5型腺病毒载体(Ad5-LacZ)(MOI＝20)单独或与不同浓度壳聚糖/NaHCO₃溶液混合后感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠树突状细胞(DC2.4)、人横纹肌肉瘤细胞(RD)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)细胞，24小时后进行检测细胞半乳糖苷酶活性。＊：T检验：P＜0.05

图3.壳聚糖分子量对其促进转导作用的影响。将Ad5-LacZ(MOI＝20)单独或与不同浓度的壳聚糖(不同分子量)/NaHCO₃溶液混合后感染CHO细胞，24小时后进行检测细胞半乳糖苷酶活性。＊：T检验：P＜0.05

图4.不同工作液对壳聚糖促进转导作用的影响Ad5-LacZ(MOI＝20)分别在HBSS、PBS、Hepes-NaCl、H₂O中与12.5μg/ml的壳聚糖/NaHCO₃溶液混合后感染CHO细胞，24小时后检测细胞半乳糖苷酶活性。

图5.腺病毒纯化对壳聚糖促进转导作用的影响纯化或未纯化Ad5-LacZ(MOI＝20)单独或与12.5μg/ml壳聚糖/NaHCO₃溶液混合后感染CHO细胞，24小时后进行检测细胞半乳糖苷酶活性。

图6.培养基中血清对壳聚糖促进转导作用的影响Ad5-LacZ(MOI＝20)与12.5μg/ml的壳聚糖/NaHCO₃溶液混合后加入到无血清、2％FBS或10％FBS的培养基中感染CHO细胞，24小时后检测细胞半乳糖苷酶活性。＊：T检验：P＜0.05。

图7.壳聚糖碳酸氢钠溶液对重组腺病毒载体在体基因转导效率的影响。将重组腺病毒Ad-Luc(含有萤光素酶(luciferase)报告基因的重组腺病毒)与壳聚糖碳酸氢钠溶液混合液体100ul(含5X10⁹病毒颗粒，壳聚糖终浓度为12.5μg/ml)注射入C57/BL6小鼠背部的B16细胞移植瘤内，分别在注射后1、2、3、6、10天利用生物在体发光检测系统进行肿瘤内荧光素酶表达量的检测，相同浓度及体积的Ad-Luc做为对照。(A)肿瘤内注射后1、2、3天后光子发射强度合成图片。(B)肿瘤内注射后1、2、3、6、10天肿瘤区域光子发射量统计。＊：T检验：P＜0.05。

具体实施方式

实施例1.壳聚糖碳酸氢钠溶液(壳聚糖/NaHCO₃)的配制

(1)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法1：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml蒸馏水，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖(高、中、低分子量壳聚糖均可应用，本例中壳聚糖购自Sigma-Aldrich，高分子量壳聚糖去乙酰化度为 75％，1％乙酸中粘度为800-2000cP；中分子量壳聚糖去乙酰化度为75％-85％，1％乙酸中粘度为200-800cP；低分子量壳聚糖去乙酰化度为75-85％，1％乙酸中粘度为20-200cP。)，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液3.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用100μl～200μl NaHCO₃调节pH值至7.4，即配制成pH7.4的壳聚糖溶液(图1)。如图1所示，左侧为常用的壳聚糖乙酸溶液，在pH6.4条件下处于无色透明状态，如果将其中和至pH7.4，则出现大量沉淀(图中壳聚糖乙酸溶液(pH7.4))，而右侧展示的是已配制好的壳聚糖碳酸氢钠溶液，其pH为7.4，从图中可见其处于无色透明状态。

(2)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法2：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入800μl 0.1M HCl，混匀，加入0.3g低分子量壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.6ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(3)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法3：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入700μl 0.1M甲酸，混匀，加入0.03g壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.6ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(4)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法4：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入800μl 0.1M苹果酸，混匀，加入0.03g壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.6ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(5)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法5：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入1ml 0.1M琥珀酸，混匀，加入0.03g壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.6ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(6)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法6：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入1ml 0.1M乳酸，混匀，加入0.03g壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.8ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(7)pH7.4壳聚糖溶液的配制方法7：

取50ml试管，加入11.6ml超纯水，然后加入0.7ml 0.1M己二酸，混匀，加入0.03g壳聚糖，涡旋混匀溶解，静置5分钟待溶解充分，涡旋过程中加入1M NaHCO₃2.6ml，用少许1M NaHCO₃调节最终PH值为7.4。

(8)PBS缓冲的pH7.4壳聚糖溶液：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml 0.1M的PBS，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液4.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用100μl～200μl NaHCO₃调节PH值至7.4，即配制成pH7.4的壳聚糖溶液。

(9)Hepes缓冲的PH7.4壳聚糖溶液：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml 0.1M的Hepes，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液4.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用100μl～200μl NaHCO₃调节pH值至7.4，即配制成pH7.4的壳聚糖溶液。

(10)pH6.8的壳聚糖溶液配制：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml 0.1M的PBS，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液4.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用HCl或其他与壳聚糖相容的酸如：己二酸、盐酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸调节pH至6.8。

(11)pH9的壳聚糖溶液配制：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml 0.1M的PBS，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液4.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用1M NaHCO₃和/或1M NaOH和/或KOH调节pH值至9。

(12)pH14的壳聚糖溶液配制：

取50ml试管，加入100μl冰醋酸，再加入10ml 0.1M的PBS，震荡制成乙酸溶液，加入0.03g壳聚糖，震荡充分溶解，在震荡过程中加入1mol/L的NaHCO₃溶液4.6ml，这时可见大量泡沫生成，同时溶液pH值急剧上升，震荡待泡沫消失后用1M NaHCO₃和/或1MNaOH和/或KOH调节pH值至14。

实施例2.壳聚糖碳酸氢钠溶液促进重组腺病毒载体转导效率

人胚肾细胞293、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠树突状细胞(DC2.4)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD)，人喉鳞状细胞癌细胞(Hep II)、人肺腺癌细胞(A549)均购自ATCC。

将293细胞、B16细胞、RD细胞、Hep II细胞、A549细胞在高糖DMEM培养基中，DC2.4细胞在RPMI 1640培养基中，CHO细胞在DMEM/F12培养基中培养(均添加2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青链霉素0.075％NaHCO₃及10％FBS)，培养条件为：37℃下、5％CO2的环境中，在96孔板中培养。上述所有培养基均购自Hyclone公司。

将4μl溶于0.1M PBS的含有半乳糖苷酶报告基因(β-galactosidase)的腺病毒载体(Ad5-LacZ)(腺病毒滴度为2x10⁸PFU/ml)溶液加入到149.1、148.13、146.25、142.5、135、120、90μl0.1M的PBS中，涡旋5秒混匀后加入0.9、1.87、3.75、7.5、15、30、60μl 0.2％的高分子量壳聚糖/NaHCO₃溶液(实例1(1))，涡旋5秒后静置20分钟，加入450μl含2％FBS的DMEM/F12，壳聚糖终浓度分别为3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀。弃去原96孔板中的培养基，以150μl/孔的量将所述混合物加入到96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时后进行目的基因活性检测。以未经重组腺病毒载体转导的细胞为空白对照，以单独使用重组腺病毒载体转导的细胞作为阴性对照。

报告基因检测方法如下：弃去原培养基，0.1M PBS洗涤细胞一次，加入1×细胞裂解液(report lysis buffer，Promega公司)，室温裂解30min后，在-20℃/37℃下冻融一次，然后在-20℃下保存待检测。检测时，在96孔酶标板中每孔加入30μl超纯水，然后加入20μl裂解产物，吹打混匀，然后加入ONPG检测液50μl，稍加震荡混匀，使其37℃反应30min，然后加入150μl 1M Na₂CO₃溶液。用分光光度计在420nm波长处检测上述混合物的吸光度。ONPG检测液配方：200mM磷酸钠(PH7.3)缓冲液、2mM MgCl2、100mM DTT、4mg/ml ONPG(lancaser公司产品)。

从结果中可以看到在Ad5-LacZ与壳聚糖的混合液感染的细胞中报告基因半乳糖苷酶活性显著高于Ad5-LacZ单独感染的细胞，说明壳聚糖碳酸氢钠溶液可以显著促进重组腺病毒载体转导效率(图2)

实施例3.不同分子量的壳聚糖碳酸氢钠溶液促进重组腺病毒载体在CHO细胞上的转导效率

将4μl溶于0.1M PBS的含有半乳糖苷酶报告基因的腺病毒载体(Ad5-LacZ)(腺病毒滴度为2x10⁸PFU/ml)溶液加入到149.1、148.13、146.25、142.5、135、120、90μl 0.1M的PBS中，涡旋5秒混匀后加入0.9、1.87、3.75、7.5、15、30、60μl 0.2％的不同分子量的壳聚糖/NaHCO₃(实例1(1))溶液(分为高、中、低三种分子量的壳聚糖/NaHCO₃)，涡旋5秒后静置20分钟，加入450μl含2％FBS的DMEM/F12，壳聚糖终浓度为3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀。弃去原96孔板中培养基，以150μl/孔的量将所述混合物加入到96孔板中，在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时后进行目的基因活性检测(检测方法如实施例2中所述)。其中以单独使用重组腺病毒载体转导的CHO细胞作为阴性对照。

从结果中可以看到不同分子量的壳聚糖碳酸氢钠溶液均有良好的促进转导作用。在低浓度水平下高分子量壳聚糖碳酸氢钠溶液表现较好，而在高浓度水平下低分子量的壳聚糖碳酸氢钠溶液表现较好(图3)。

实施例4.不同工作液的壳聚糖碳酸氢钠溶液促进重组腺病毒载体转导CHO细胞的效率

将4μl溶于0.1M PBS的Ad5-LacZ(腺病毒滴度为2x10⁸PFU/ml)溶液加入到50μl不同工作液中(本例中所述工作液为Hank’s液(HBSS)、磷酸缓冲液(0.1M PBS)、0.1M Hepes缓冲的生理盐水 (Hepes-NaCl)及无菌水(H₂O))，涡旋5秒混匀后加入100μl含高分子量壳聚糖/NaHCO₃溶液的不同工作液(100μl工作液中加入3.75μl0.2％的高分子量壳聚糖/NaHCO₃溶液(实施例1(1))，涡旋5秒后静置20分钟，然后再加入450μl含2％FBS的DMEM/F12，壳聚糖终浓度为12.5μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀。弃去原96孔板中培养基，以150μl/孔的量将所述混合物加入到96孔板中，在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时后进行目的基因活性检测(检测方法如实施例2中所述)。其中以单独使用重组腺病毒载体转导的CHO细胞作为阴性对照。

从结果中可以看到在不同工作液中的壳聚糖碳酸氢钠溶液均有良好的促进转导作用，其中PBS的效果最佳(图4)。

实施例5.壳聚糖碳酸氢钠溶液促进纯化或未纯化重组腺病毒载体转导CHO细胞的效率

将4μl溶于0.1M PBS的经纯化的Ad5-LacZ(腺病毒滴度为2x 10⁸PFU/ml)溶液和5.3μl溶于DMEM的未经纯化的Ad5-LacZ(腺病毒滴度为1.5x 10⁸PFU/ml)溶液加入到150μl PBS中，涡旋5秒混匀后加入3.75μl的0.2％的高分子量壳聚糖/NaHCO₃溶液(实施例1(1))，涡旋5秒后静置20分钟，然后再加入450μl含2％FBS的DMEM/F12，壳聚糖终浓度为12.5μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀。弃去原96孔板中培养基，以150μl/孔的量将所述混合物加入到96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时后进行目的基因活性检测(检测方法如实施例2中所述)。其中以单独使用重组腺病毒载体转导的CHO细胞作为阴性对照。

从结果中可以看到壳聚糖碳酸氢钠溶液对纯化或未纯化腺病毒载体均有良好的促进转导作用(图5)。

实施例6.有血清条件下壳聚糖碳酸氢钠溶液促进重组腺病毒载体转导CHO细胞效率

将含有4μl溶于0.1M PBS的Ad5-LacZ(腺病毒滴度为2x10⁸PFU/ml)溶液加入到150μl PBS中，涡旋5秒混匀后加入3.75μl的0.2％的高分子量壳聚糖/NaHCO₃溶液(实施例1(1))，涡旋5秒后静置20分钟，然后再加入450μl DMEM/F12、含2％FBS的DMEM/F12或含10％FBS的DMEM/F12，壳聚糖终浓度为12.5μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀。弃去原96孔板中培养基，以150μl/孔的量将所述混合物加入到96孔板中，3小时后更换为含2％FBS的DMEM/F12，继续培养24小时后进行目的基因活性检测(检测方法如实施例2中所述)。其中以单独使用重组腺病毒载体转导的CHO细胞作为阴性对照。

从结果中可以看到壳聚糖碳酸氢钠溶液在有血清条件下对重组腺病毒载体仍有良好的促进转导作用(图6)。

实施例7.壳聚糖碳酸氢钠溶液促进重组腺病毒在体基因转导效率。

B16细胞的培养如实施例2所示，在对数生长期收获细胞，将收获的细胞用Hank’s液洗2次，并用适量Hank’s液将最终细胞浓度调节至5x10⁷细胞/ml。将100μl所述B16细胞悬液(含5x10⁶个细胞)皮下注射入C57/BL6小鼠(6只，4-6周龄，SPF级，本例为雌性)背部区域。待注射9天后，肿瘤生长至直径0.5厘米，进行重组腺病毒载体基因转导在体实验。

将所述移植有B16肿瘤的小鼠分为两组，苯巴比妥钠(40mg/ml)麻醉后行瘤内注射，其中(1)腺病毒碳酸氢钠组注射Ad5-Luc(含有萤光素酶报告基因的重组腺病毒)和壳聚糖碳酸氢钠溶液的混合物，混合物的配制方法为：在含Ad5-Luc的PBS(5x10¹¹病毒颗粒/ml)溶液(400μl)中加入2.5μl 0.2％的壳聚糖碳酸氢钠溶液(实施例1(1))，壳聚糖的终浓度为12.5μg/ml，将混合物涡旋5秒混匀，静置20分钟后用于注射；(2)单纯腺病毒对照组注射液体为含Ad5-Luc的PBS (5x10¹¹病毒颗粒/ml)溶液。两组动物瘤内注射体积均为100μl。

分别在瘤内注射后1，2，3，6，10天进行肿瘤内萤光素酶报告基因表达量检测，检测方法为：在小鼠腹腔内注射萤光素酶报告基因底物D-萤光素(D-Luciferin，Promega，25mg/kg)，10分钟后将小鼠苯巴比妥钠(40mg/ml)麻醉并且利用在体生物发光成像检测系统(I.C.EChemi&Fluo System，Photometric，Tucson，Arizona)进行生物发光检测，曝光时间为10分钟，移植肿瘤范围内总光子发射量(total photonflux)通过slidebook软件进行检测并分析，结果见图7。

结果显示，在腹腔注射发光底物(D-luciferin)后，腺病毒碳酸氢钠组动物移植瘤区域的光子发生量要显著高于单纯应用腺病毒组。表明，其荧光素报告基因的表达量显著高于单纯应用腺病毒组。实验结果表明，Ad-Luc与壳聚糖/NaHCO₃溶液混合后感染小鼠体内的B16移植瘤的效率显著增加。

Claims

1.一种壳聚糖溶液，其特征在于所述溶液的pH为7.4-14.0，所述溶液中包括壳聚糖，所述壳聚糖具有75-99%的脱乙酰化，并且所述溶液中含有NaHCO₃和/或KHCO₃。

2.一种制备权利要求1所述的壳聚糖溶液的方法，包括下述步骤：

1）将壳聚糖溶于酸性溶液中；

2）然后利用NaHCO₃和/或KHCO₃溶液进行快速中和，将酸性壳聚糖溶液中和至pH中性或碱性；以及

3）再加入与壳聚糖相容的酸性或碱性溶液将所述溶液的pH值调节至pH7.4～14.0之间的任一所需值，其中所述与壳聚糖相容的酸性溶液包括盐酸、己二酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸，其中所述与壳聚糖相容的碱性溶液包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾和氢氧化钠，

从而实现壳聚糖或其衍生物在pH7.4～14.0条件下的溶解。

3.权利要求2所述的方法，其中所述酸性溶液包括己二酸、盐酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸的酸性溶液，以及它们的混合物。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述酸性壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度范围为0.1mg/L～100g/L。

5.一种应用壳聚糖溶液促进重组腺病毒载体基因转导效率的方法，包括下述步骤：将权利要求1所述的壳聚糖溶液与重组腺病毒载体溶液混合，然后将混合物用于对细胞进行基因转导，其中所述细胞选自离体的永生化的细胞系和原代培养的细胞系。

6.权利要求5所述的方法，其中所述用于混合所述壳聚糖溶液和重组腺病毒载体溶液的工作液是水、缓冲液或培养基。

7.权利要求5所述的方法，其中所述壳聚糖溶液与重组腺病毒载体溶液混合后壳聚糖的浓度是0.1mg/L～5g/L。

8.权利要求5所述的方法，其中所述壳聚糖溶液与重组腺病毒载体溶液混合后的混合物的pH值是6.8～9.0，且所述壳聚糖、重组腺病毒混合物与细胞相互作用的液体环境的pH值是6.8～9.0。

9.权利要求1所述的壳聚糖溶液用于制备促进重组腺病毒载体基因转导效率的溶液的用途。