CN117298069A - 核酸分子微针制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微针制剂技术领域,尤其是涉及核酸分子微针制剂及其制备方法。采用本发明提供的核酸分子微针制备方法得到的微针贴片用于疫苗递送,可取得较电击等传统DNA疫苗递送模式相当甚至更优的效果。且该配方并不受核酸分子具体结构影响,普遍适用于核酸分子微针。可以合理预期该核酸分子微针可以进一步开发成疫苗贴片,用于临床实验以及根据临床实验结果用于上市。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2022-10-09、申请号为2022112310893、发明名称为“核酸分子微针制剂及其制备方法”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及微针制剂技术领域,尤其是涉及核酸分子微针制剂及其制备方法。
背景技术
冠状病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae),包括α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒四个属,新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)属于β属的冠状病毒,主要经呼吸道飞沫传播,也可通过接触传播引起肺炎(Novel Coronavirus-infected Pneumonia,NCP)或者新冠病毒感染引起的疾病(COVID-19),人群普遍易感。
包括DNA疫苗在内的核酸疫苗被称为“第三代疫苗”,其具有全方位诱导体液及细胞免疫应答,能够起到良好的预防疾病效果的优点;还具有生产工艺简单、保存稳定性好且无须冷链运输,适宜于大规模应用及分发的优点。
微针(microneedles,MN)是一种皮内药物递送技术。Henry等人于1998年首次将微针应用于透皮给药研究,开启了微针技术进入药物递送领域的时代。阵列微针贴片(microneedle array patch,MAP)由多个微米级的细小针尖以阵列的方式连接在基座上制成。二十多年来利用非可溶性微针对DNA疫苗进行皮内递送有过多种尝试,但结果多不理想。如今,可溶性微针(dissolvable MN)已成为行业主流。该技术是将生物可降解聚合物材料和药物制备成足够强度的微针阵列,在穿过角质层屏障刺入皮肤后,由可降解材料形成的针体在组织微环境中迅速降解,药物同步释放,药物分子经皮下组织吸收进入体内。可溶性MAP在DNA疫苗递送上的应用虽尚处于起步阶段,但非常值得期待。将新冠DNA疫苗与可溶性微针贴片相结合有可能带来核酸疫苗领域的一次革命,使新冠DNA疫苗像新冠mRNA疫苗那样得到广泛的认可和应用。
虽然目前已被条件性批准的紧急授权使用的新冠疫苗有mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗、蛋白疫苗、灭活疫苗等,但由于各种已上市疫苗存在着如针对突变株免疫原性不足、不能同时激发强的细胞免疫及体液免疫、稳定性不够理想(依赖冷链运输和存储)、借种方式不够便捷、副作用明显等问题。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供核酸分子微针制剂,使得该微针制剂实现目标核酸分子的递送,并达到疾病的预防或治疗效果。本发明目的还在于提供A组分,期望将其用于核酸分子递送微针的制备得到的微针在保证机械强度的前提下,能显著提高核酸分子的释放和翻译,取得优异的生物缓释和免疫应答效果。
本发明的描述中,术语“分子量”指的是重均分子量。
为了解决上述技术问题,实现上述目的,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种核酸分子微针制剂,包含微针辅料以及核酸分子;
所述微针辅料包括以下A组分:聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧乙基纤维素;
所述聚乙烯醇包括第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇,所述第一聚乙烯醇的粘度为2.4~12.3mpas,所述第二聚乙烯醇的粘度为17.2~42.6mpas;所述聚乙烯吡咯烷酮包括第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮,所述第一聚乙烯吡咯烷酮的分子量为3500~150000Da,所述第二聚乙烯吡咯烷酮的分子量为210000~1500000Da。
在可选实施方式中,其中,所述第一聚乙烯醇的粘度为0.8~10.6mpas,所述第二聚乙烯醇的粘度为16.5~88.4mpas。
在可选实施方式中,所述A组分包括以下重量组分:聚乙烯醇2~6份、聚乙烯吡咯烷酮9.5~15份和羧乙基纤维素5~7份。
在优选实施方式中,所述聚乙烯醇包括第一聚乙烯醇0.5~2.5份和第二聚乙烯醇1.5~3.5份;所述聚乙烯吡咯烷酮包括第一聚乙烯吡咯烷酮2.5~5份和第二聚乙烯吡咯烷酮7~10份。
在优选实施方式中,所述A组分还包括35~49重量份的第一溶剂。
在优选实施方式中,第一溶剂为水。
在优选的实施方式中,所述微针辅料包括以下A组分:粘度为2.4~12.3mpas的第一聚乙烯醇0.5~2.5份,粘度为17.2~42.6mpas的第二聚乙烯醇1.5~3.5份;分子量为3500~150000的第一聚乙烯吡咯烷酮2.5~5份,分子量为210000~1500000的第二聚乙烯吡咯烷酮7~10份;羧乙基纤维素5~7重量份和第一溶剂35~49重量份;
所述第一聚乙烯醇的粘度为0.8~10.6mpas,所述第二聚乙烯醇的粘度为16.5~88.4mpas。
在可选实施方式中,所述微针辅料还包括以下B组分:糖类、缓冲剂和盐。
在优选实施方式中,所述B组分包括以下重量组分:糖类11~16份、缓冲剂0.3~0.8份和盐0.5~2份。
优选地,所述糖类选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、果糖等单糖或二糖的一种或者两种;在微针贴剂中,主要用作稳定剂。是一种生物相容性佳、稳定性高、成本低且安全性好的碳水化合物。在可选实施方式中,所述糖类包括1~3重量份的蔗糖和10~13重量份的海藻糖。
优选地,所述缓冲液选自枸橼酸钠、磷酸、三羟甲基氨基甲烷或乙酸中至少一种;缓冲剂(例如枸橼酸钠)主要与盐配伍组成缓冲剂,防止制剂配制过程中的pH值出现较大的波动。
优选地,所述缓冲液为枸橼酸钠。
在进一步优选实施方式中,所述盐为氯化钠。
在优选实施方式中,所述B组分还包括0.002~0.01重量份的氢氧化钠(用于调节pH值)和14~17重量份的第二溶剂;
优选地,第二溶剂为水。
在优选实施方式中,上述微针辅料B组分包括:蔗糖1~3重量份和海藻糖10~13重量份;枸橼酸钠0.3~0.8重量份;所述B组分还包括氢氧化钠0.002~0.01重量份和第二溶剂14~17重量份。
在优选实施方式中,上述微针辅料包括以下B组分:蔗糖1~3重量份和海藻糖10~13重量份;枸橼酸钠0.3~0.8重量份;氯化钠0.5~2重量份;氢氧化钠0.002~0.01重量份和水14~17重量份。
在可选实施方式中,所述A组分和所述B组分的重量比为(16.5~77):(11.8~35.81)。
在优选的实施方式中,上述微针辅料包括以下A组分:粘度为2.4~12.3mpas的第一聚乙烯醇0.5~2.5重量份,粘度为17.2~42.6mpas的第二聚乙烯醇1.5~3.5重量份;分子量为3500~150000的第一聚乙烯吡咯烷酮2.5~5重量份分子量为210000~1500000的第二聚乙烯吡咯烷酮7~10重量份;羧乙基纤维素5~7重量份;第一溶剂35~49重量份;同时,所述微针辅料包括以下B组分:蔗糖1~3重量份和海藻糖10~13重量份;枸橼酸钠0.3~0.8份;氯化钠0.5~2重量份;氢氧化钠0.002~0.01重量份和水14~17重量份。
并且,其中,所述第一聚乙烯吡咯烷酮的粘度为0.8~10.6mpas,所述第二聚乙烯吡咯烷酮的粘度为16.5~88.4mpas。
在可选实施方式中,所述微针制剂中包含核酸分子,所述核酸分子选自核酸疫苗或者治疗性核酸分子。
在可选实施方式中,所述核酸疫苗选自DNA疫苗或mRNA疫苗等。
所述治疗性核酸分子选自包含目标基因的质粒/构建体,shRNA质粒/构建体和siRNA等。
在可选实施方式中,所述核酸疫苗包括抗原表达盒,所述抗原表达盒包括质粒和插入质粒的编码抗原的核酸片段;
在可选实施方式中,抗原包括但不限于冠状病毒抗原,新型冠状病毒抗原,流感抗原(流感疫苗)、HBs抗原(B型肝炎病毒表面抗原)、HBe抗原(乙型肝炎Be抗原)、BCG(Bacillede Calmette et Guerin)抗原、麻疹抗原、风疹抗原、水痘抗原、黄热病抗原、带状疱疹抗原、轮状病毒抗原、Hib(流感杆菌b型)抗原、狂犬病抗原、霍乱抗原、白喉抗原、百日咳抗原、破伤风抗原、灭活脊髓灰质炎抗原、日本脑炎抗原、人乳头瘤病毒抗原或上述病毒混合抗原等。
在可选实施方式中,当抗原选自新型冠状病毒抗原时,优选地,所述抗原包括病毒蛋白RBD片段。
优选地,所述核酸片段编码病毒蛋白二联或二联以上RBD片段。
优选地,所述核酸片段编码新冠DNA异二联RBD片段。
优选地,所述新冠DNA异二联RBD片段包括SARS-CoV S蛋白RBD片段、新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD片段或新冠SARS-CoV-2Omicron突变株S蛋白RBD片段。
优选地,编码所述SARS-CoV S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,编码所述新冠SARS-CoV-2Omicron突变株S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.16所示。
在可选实施方式中,在所述分层针的针尖液中或者所述一体针的整个针体中,所述A组分和药物活性成分的重量比为(16.5~77):(0.6~22.46)。
第二方面,本发明提供一种核酸分子微针制剂,包含抗原表达盒,所述抗原表达盒包括质粒和插入质粒的编码抗原核酸片段;所述抗原核酸片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.1或者SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或者SEQ ID No.16所示。
第三方面,本发明还提供前述实施方式任一项所述核酸分子微针制剂的制备方法,
上述微针制剂可以制备为分层针或者一体针;
所述制备方法包括将所述A组分溶液和所述B组分溶液混合得到基膜液;
对于分层针,在部分基膜液中加入核酸分子得到针尖液;使用微针模具,利用针尖液制备微针针尖,再利用基膜液制备微针的针体部分和基膜部分,得到微针制剂;
对于一体针,在基膜液中加入核酸分子得到成型液,利用成型液制备微针针体,得到微针制剂。
在一些实施例中,对于分层针,将羟乙基纤维素、第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮加入第一溶剂中,通过加热分散,得到A组分溶液;将糖类、缓冲剂、氢氧化钠和盐溶解于第二溶剂中,得到B组分溶液;将所述A组分溶液和所述B组分溶液混合得到基膜液;在部分基膜液中加入上述核酸分子得到针尖液;将针尖液施加于微针成型模具的微针腔中,脱水收缩得到微针的针尖部分,继续施加基膜液于微针成型模具上,预脱水得到连接所述针尖部分的针体部分以及连接所述针体部分的基膜,预脱水至含水量为3~15%,脱模得到微针贴片;将微针贴片装入保护件中,并将其置于加有脱水剂的密封袋中,再脱水3~5天,使微针贴片的含水量降至低于3%。
需要说明的是,对于部分基膜液占基膜液总量的百分比,本领域技术人员能够根据实际需要进行常规选择。
在一些实施例中,对于一体针,将羟乙基纤维素、第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮加入第一溶剂中,通过加热分散,得到A组分溶液;将糖类、缓冲剂、氢氧化钠和盐溶解于第二溶剂中,得到B组分溶液;将所述A组分和所述B组分混合得到基膜液;在基膜液中加入核酸分子得到成型液,将成型液施加于微针成型模具上,预脱水至含水量为3~15%,脱模得到微针贴片;将微针贴片装入保护件中,并将其置于加有脱水剂的密封袋中,再脱水3~5天,使微针贴片的含水量降低于3%。
在一些优选实施例中,加热分散的温度为65℃~95℃。
在一些优选实施例中,所述预脱水为冷风脱水,具体的,在-40~35℃的温度下风干3-4h;同时,将风速控制在范围风速为0.5~5m/s内。这样既不会将成型液吹出微针成型模具,也不会因风速太低导致固化速率降低,影响生产效率。在一些优选实施例中,所述保护件包括泡罩和贴板,所述泡罩设置于所述贴板上,所述微针贴片置于所述泡罩中。
在一些优选实施例中,所述泡罩和/或贴板的材质为水汽透过率为1~20g/㎡·24h的阻隔性材料。在一些优选实施例中,所述泡罩的材质为聚氯乙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯。
在一些优选实施例中,所述贴板的材质为纺粘型烯烃或铝塑膜。
在一些优选实施例中,所述密封袋水汽透过率低于0.8g/㎡·24h,可选的,所述密封袋为双向拉伸聚丙烯薄膜、聚对苯二甲酸乙二酯、氯化聚丙烯树脂、铝箔中的一种或多种混合膜。在可溶性微针制备过程中的脱水阶段,为了防止微针受热融化或是药物活性成分等物质的受热失效,往往都是采用常温以下温度进行风干脱水,同时不能使用过快的风速,避免微针受风力形变。然而采用这样的脱水条件导致脱水速率过于缓慢,尤其是在微针含水量处于较低的水平时,水分子脱除速度下降,其脱水速度相比于前期更加缓慢,不能满足规模生产的需要,同时,制备得到的微针其含水量过低也不利于其结构强度的提升。
本案通过将微针贴片预先在-40~35℃的温度下预脱水至含水量为3~15%,能够有效降低初步脱水所用的时间,加快了制备速率,降低了生产成本,如需要进一步脱水所需要的时间边际递增,故以3~15%的湿度作为初步脱水的临界点,更重要的是,在该含水量条件下,得到的微针贴片未完全固化,具有一定的韧性,此时有利于微针贴片的脱模操作,避免微针贴片在脱模是由于自身刚性过高而断针于微针成型模具中,提高微针形态完整性。
经过初步脱水后再将微针贴片装入保护件中,并将其置于加有脱水剂的密封袋中,脱水剂透过保护件吸收微针贴片的水分,使微针贴片的含水量降低于3%,所述脱水剂为分子筛或硅胶等吸水性材料,保护件可以作为微针贴片的包装件,只需在保护件中继续脱水3~5天即可将微针贴片的含水量降至低于3%。微针贴片在此含水量下具有最优的结构强度,且不需要付出多余的时间和成本。
第四方面,本发明提供了一种治疗或者预防疾病的方法,包括对受试者施用上述微针制剂。所述疾病包含任何可以适用核酸疫苗预防或适用核酸分子治疗的疾病。包括但不限于病毒性疾病,细菌性疾病,以及遗传性疾病,肿瘤等。
第五方面,本发明还提供了采用前述制备方法得到的微针制剂。
本发明通过将特定分子量的羟乙基纤维素、特定粘度的第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇以及特定分子量的第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮进行组合作为微针制剂中起主要强度支撑作用的骨架材料,能够有效提高该微针制剂制备得到的微针的结构强度,进而在受到较大压力的作用下不发生断裂,进而能够刺入皮肤深处,提高给药质量;上述粘度范围内的第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇和上述分子量范围的第一聚乙烯吡咯烷酮、第二聚乙烯吡咯烷酮之间的配合,推测是由于聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮之间相互交缠,且其分子链的长度差异起到互补作用,进而使第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮之间相互交缠以形成更为稳固的支撑骨架,提高了微针的整体强度。通过对不同粘度的第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇和不同分子量的第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮的添加量进行限制,有利于维持所述微针制剂得到的微针的整体强度,当第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮的添加量不在上述范围中时,会对所得到的微针的结构强度产生劣化作用。
本发明提供的特定的微针制剂配方适用于核酸分子例如DNA疫苗的递送,可以取得较电击等传统DNA疫苗递送模式相当甚至更优的效果,其中尤其是微针制剂配方B以及以配方B为基础获得的微针制剂配方G的效果最好。且该等配方并不受到DNA疫苗的具体结构影响,普遍适用于不同结构的核酸分子。
本发明提供的核酸分子pAD1002、pAD1003、pAD131由于其优异的序列设计,从而呈现处针对新型冠状病毒的优异的免疫原性,以及针对新型冠状病毒不同突变株具有优异的广谱性。可以合理预期本案核酸分子微针制剂可以进一步开发用于临床实验以及根据临床实验结果用于上市。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的三种重组质粒酶切鉴定结果;
图2为本发明实施例1提供的三种重组质粒qPCR表达结果;
图3为本发明实施例1提供的三种重组质粒Western Blot结果;
图4为本发明实施例2提供的微阵列DNA疫苗贴片的设计与制造流程图;
图5为本发明实施例3提供的微阵列DNA疫苗贴片的用法与皮肤耐受性初步评估结果图;
图6为本发明实施例4提供的不同配方微阵列DNA疫苗贴片的HPLC结果图;
图7为本发明实施例4提供的不同配方微阵列DNA疫苗贴片加强免疫后第14天抗原特异性抗体结果;
图8为本发明实施例4提供的免疫之后的不同配方微阵列DNA疫苗贴片中质粒残留含量检测结果;
图9为本发明实施例5提供的DNA疫苗不同递送方式免疫后抗原特异性抗体结果;
图10为本发明实施例6提供的微阵列DNA疫苗贴片不同剂量免疫与不同贴敷时间免疫的抗原特异性抗体结果;
图11为本发明实施例7提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫后血清针对新冠野生型和Omicron BA.1型突变株病毒的中和抗体结果;
图12为本发明实施例8提供的微阵列DNA疫苗贴片加强免疫后14天的抗原特异性INF-γ/IL-4的ELISopt结果;
图13为本发明实施例9提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫新西兰白兔的抗原特异性抗体结果;
图14为本发明实施例9提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫C57BL/6小鼠的抗原特异性抗体结果;
图15为本发明实施例9提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫C57BL/6小鼠的抗原特异性INF-γ/IL-4的ELISopt结果;
图16为本发明实施例10提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫hACE2转基因小鼠的抗原特异性抗体结果;
图17为本发明实施例10提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫hACE2转基因小鼠后针对新冠Omicron BA.1型突变株病毒的中和抗体结果;
图18为本发明实施例10提供的新冠Omicron BA.1型突变株病毒感染hACE2转基因小鼠后肺部gRNA和sgRNA检测的结果;
图19为本发明实施例11提供的不同配方微阵列DNA疫苗贴片免疫小鼠的抗原特异性抗体结果;
图20为本发明实施例12提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫新西兰白兔的抗原特异性抗体结果;
图21为本发明实施例12提供的微阵列DNA疫苗贴片免疫新西兰白兔后对新冠Omicron突变株BF.7、BQ.1.1、XBB的中和抗体结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
因此,以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下面结合附图,对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下,下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1.三种异二联RBD候选新冠DNA疫苗质粒的构建与体外表达鉴定
1.疫苗候选质粒的设计与制备
本研究中候选DNA疫苗质粒的设计原则是,将编码受体结合域(RBD)的核苷酸序列直接串联,并在序列N端加上HMM信号肽序列,C端加上终止密码子,用本公司自主知识产权的DNA疫苗基因序列优化算法及规则进行了基因优化,形成异二联RBD核苷酸序列,将之插入pVAX1载体(ThermoFisher,货号:V26020)的BamHI和XhoI酶切位点间,得到异二联RBDDNA质粒pADV131、pAD1002、pAD1003,它们分别编码分泌型SARS-Beta、SARS-Omicron和Beta-Omicron组合的串联RBD。
pADV131质粒构建:设计编码SARS-CoV S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于AY278488,GenBank)如SEQ ID No.1所示,和编码新冠SARS-CoV-2 Beta突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于EPI_ISL_860630,GISAID)如SEQ ID No.2所示。将SEQ ID No.1和SEQID No.2直接串联后,并在SEQ ID No.1的前端N端加上如SEQ ID No.7所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ ID No.2的末尾C端加上TGATAA终止密码子,最终得到如SEQ IDNo.4所示核苷酸序列,将SEQ ID No.4插入pVAX1载体的BamHI与Xho I位点间,得到重组表达质粒pADV131。
pAD1002质粒构建:设计编码SARS-CoV S蛋白RBD区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,和编码新冠SARS-CoV-2 Omicron突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于EPI_ISL_6640917,GISAID)如SEQ ID No.3所示。将SEQ ID No.1和SEQ ID No.3直接串联后,并在SEQID No.1的前端N端加上如SEQ ID No.7所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ IDNo.3的末尾C端加上TGATAA终止密码子,最终得到如SEQ ID No.5所示核苷酸序列,将SEQID No.5插入pVAX1载体的BamH I与Xho I位点间,得到重组表达质粒pAD1002。
pAD1003质粒构建:设计编码新冠SARS-CoV-2 Beta突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,和编码新冠SARS-CoV-2 Omicron突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3直接串联后,并在SEQ ID No.2的前端N端加上如SEQ ID No.7所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ ID No.3的末尾C端加上TGATAA终止密码子,最终得到如SEQ ID No.6所示核苷酸序列,将SEQ ID No.6插入pVAX1载体的BamH I与Xho I位点间,得到重组表达质粒pAD1003。
按下述步骤进行上述重组DNA质粒转化:在DH10B感受态细胞悬液中分别加入构建好的pADV131、pAD1002、pAD1003质粒DNA溶液(体积不超过10μL)轻轻摇匀,经过冰浴、42℃热激、冰浴冷却后,向管中加入不含抗生素的LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养45min,使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液涂布于含卡那霉素的筛选平板上,37℃培养12~16h。挑选形状均匀的单克隆菌体接种到5mL含有卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。
按下述步骤进行DNA质粒提取与鉴定:将上述菌液按照1:1000接种到400mL含有卡那霉素的LB选择培养基中,37℃200rpm培养12~16h。用EndoFree Plasmid Maxi kit试剂盒,按试剂盒说明书要求进行质粒提取,最终用500μL无内毒素水进行质粒洗脱,得到DNA疫苗质粒,使用多功能酶标仪在260nm波长下测定吸光值(OD260),得到DNA浓度,并记录OD260/OD280数值。使用BamHI和XhoI两种限制性内切酶进行双酶切鉴定,酶切体系20μL:BamHI 1μL、XhoI 1μL、10×K Buffer 2μL、DNA 1μg、无菌水补足至20μL,用移液器轻轻吸打混匀后37℃孵育2h,孵育完成后,采用1%琼脂糖凝胶电泳,参数设置为电压120V跑胶30min。完成后将胶板放在凝胶成像仪中进行拍照,观察结果。
结论:酶切鉴定结果如图1所示,pVAX1载体大小为2999bp,对于SARS-Beta、SARS-Omicron和Beta-Omicron的基因片段大小分别为1314bp、1314bp和1383bp,每个构建的质粒DNA经限制性酶BamH I和Xho I双酶切后两个片段分别大约在1000bp~2000bp之间和2000bp~3000bp之间,符合预期,质粒的片段大小正确。
2.DNA疫苗质粒的体外转录鉴定
为了验证上述构建的重组表达质粒在哺乳动物细胞内是否能够有效转录,通过DNA体外转染、提取RNA和qPCR的方法进行鉴定。
候选质粒的体外转染方法为:HEK293T细胞于转染前24h传代铺板,以4×106个细胞/孔的密度接种到60mm细胞培养皿中,37℃,5% CO2条件下培养24h左右。将4μg异二联RBD新冠DNA疫苗质粒加入500μL无血清OPTI-MEM培养基中,用移液器吹打混匀;同时将24μL的脂质体核酸转染试剂加入500μL无血清OPTI-MEM培养基中,用移液器吹打混匀。上述质粒溶液和脂质体溶液室温静置5min后按1:1混合,室温静置反应20min,得到质粒DNA/脂质体复合物。同时配制阴性对照(空载体pVAX1)的质粒DNA/脂质体复合物。将上述复合物按1mL/皿加入提前铺板并培养的细胞中,于37℃,5% CO2培养箱中培养48小时。
用1mL DMEM完全培养基重悬转染48小时后的细胞,吸取100μL细胞4000rpm室温离心5min后弃上清,先后加入350μL TRK Lysis Solution(含20%的β-巯基乙醇)和350μL的70%的乙醇,进行裂解和终止。将混合液转移至HiBind RNA Column柱内,10000g室温离心1min,弃去滤液后,向柱内加入500μL Wash Buffer I,10000g室温离心1min,弃去滤液。向柱内加入500μL Wash Buffer II洗涤2次,每次10000g室温离心1min,弃去滤液。将离心机转速调整至最高转速(17000g)室温离心2min以使柱内的乙醇充分挥发。将柱子转移至干净的无DNA和RNA酶的1.5mL离心管中,室温放置3~5min,彻底挥发乙醇后,向柱内加入50μL的RNase-Free Water,室温孵育5min,17000g室温离心1min。将滤液吸出再次加入到柱内,重复洗脱一次,收集RNA至无菌的1.5mL离心管中,用多功能酶标仪测定OD260/280下的RNA浓度,-80℃保存备用。
按照Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digesterplus)试剂盒说明书要求配制RNA反转录体系,并设置相应的阴性对照管和阳性对照管,按照25℃5min、42℃30min、85℃5min的条件进行孵育,获得相应的反转录产物cDNA。
表1.RNA RT-qPCR引物
按照试剂盒qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)说明书的要求,对cDNA进行RT-qPCR,目的基因上游引物RBD Both F3和下游引物RBD Both R4序列如表1所示,PCR条件为:95℃5min、95℃10s、56℃30s、72℃30s循环数40次,目的基因的表达水平与内参(GAPDH,上下游引物GAPDH-a和GAPDH-b)相比后采用2-△△C方法计算。
结论:如图2所示,pADV131、pAD1002、pAD1003三种质粒均能高水平地促使抗原RNA的转录。
3.DNA疫苗质粒的体外抗原蛋白表达鉴定
为了进一步验证上述构建的重组表达质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达,因此通过提取抗原蛋白,Western Blot方法进行鉴定。
将转染48小时后的细胞重悬后移至1.5mL离心管中,1500rpm室温离心3min后弃去上清,加入150μLWestern及IP细胞裂解液吹打混匀后12,000rpm 4℃离心5min,吸出上清至新的1.5mL离心管中。
取50μL蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳和转膜,转膜后的PVDF膜放置于5%脱脂奶粉溶液中室温摇晃孵育1h进行封闭,用PBST清洗10min,然后进行一抗孵育,使用SARS-CoV-2Spike Antibody,Omicron Reactive,Mouse MAb(工作浓度1μg/mL)于室温摇晃孵育1h。孵育完成后用PBST摇晃清洗5次,每次10min。清洗完成后在二抗Goat Anti-Mouse IgG HRP(工作浓度1:5000(v:v))溶液中室温摇晃孵育1h。孵育完成后用PBST摇晃清洗5次,每次10min,然后显色。
结论:如图3所示,pADV131、pAD1002和pAD1003三种质粒均能够在细胞内表达抗原蛋白。
实施例2微阵列DNA疫苗贴片的设计与制造
三种新冠DNA疫苗候选质粒按照图4中的A所示的工艺制成DNA疫苗贴片,其制备的微针贴片外观与创可贴相仿。与通过皮肤角质层渗透来输送药物的透皮贴剂不同,本发明DNA疫苗贴片通过刺穿角质层将编码新冠病毒重组蛋白的DNA质粒输送到真皮层。与涂有药物的固体微针或填充液体药物的中空微针不同,本产品采用微阵列技术是将DNA质粒与可定型但易溶解的辅料制成尖端取向完全一致向外的固相锥型颗粒(图4中的B)。本发明中所使用的动物实验用样贴每张含450个阵列含药锥型颗粒(共计可递送20微克质粒DNA)。可溶性微针锥体底部直径300微米,高约600微米(尖端含药部分150微米)(图4中的C),不足以刺激神经末梢引起疼痛。该可溶性微针刺入皮内后立即溶解,所释放的DNA被朗格汉斯细胞和树突细胞等抗原提呈细胞(APC)捕获后在胞内启动编码蛋白质分子的转录与表达程序,随之诱导抗原特异性体液(抗体)和细胞免疫应答与免疫记忆,发挥抗病毒免疫保护作用。
微针制剂的具体制备:
初选微针辅料配方包括配方A、B、C,以及在配方B基础上进一步优化的配方G。具体的各配方微针辅料组成及配比如表2所示;
将表2所示不同配方的组分A的各成分在90℃充分溶解后制备组分A溶液,冷却至室温。将组分B的各成分在室温溶解完全制备组分B溶液,加入0.5M氢氧化钠调节pH值到7。待A组分降温至室温后再进行混合,将组分A和组分B溶液混合均匀后此溶液即为最终的微针辅料溶液(该辅料溶液可作为基膜液使用)。取此辅料溶液(基膜液)1mL与10mL DNA质粒原液(质粒原液的浓度7~13mg/ml均可行,所述质粒浓度为10mg/ml)混合,轻轻的搅拌均匀,静置消泡,即可作为针尖液使用。
将针尖液刮涂于微针成型模具的微针腔中,脱水收缩得到微针的针尖部分,继续刮涂基膜液于微针成型模具上,预脱水得到连接所述针尖部分的针体部分以及连接所述针体部分的基膜,约200分钟,初步脱水至含水量为9%,脱模得到微针贴片;将微针贴片装于保护件中,并置于加有脱水剂的铝塑膜中继续脱水,静置3天后,检测得到微针贴片的含水量降低至2%。
表2
实施例3.DNA疫苗贴片的用法与皮肤耐受性初步评估
DNA疫苗贴片接种方法如敷创可贴样简单,使用时将贴片在皮肤表面轻按施压即将药物颗粒送入皮内,贴敷15分钟即完成接种。在志愿者测试过程中,大多数受试者在完成贴敷后局部略微发红的印记(图5中的A~C),但不痛不痒,1小时内贴敷痕迹彻底消失。小鼠实验中,需将接种部位先行机械及脱毛膏褪毛,次日在麻醉小鼠无毛皮肤表面将疫苗贴片拇指施压贴敷;虽然6~8周龄小鼠的皮肤稚嫩,但DNA疫苗贴片贴敷15~60分钟后很少造成皮肤红肿等过敏反应的表现,更不会造成皮肤的机械性损伤(图5中的D~G)。贴敷面皮肤局部的毛发在接种后5天左右完全恢复(图5中的H~K)。上述观察结果提示本发明的DNA疫苗贴片不仅使用方便,且皮肤耐受性良好,预示着在将来大面积人群推广应用中皮肤过敏类副作用应该不构成主要障碍。
实施例4.不同配方的微阵列DNA疫苗贴片的比较
1.高效液相色谱法(HPLC)检测DNA疫苗贴片中的超螺旋DNA质粒含量
为了评价DNA疫苗微阵列贴片制备的质量,分别将配方A(MNSA)、配方B(MNSB)、配方C(MNSC)的pAD1003 DNA疫苗微阵列贴片溶解之后,通过HPLC检测其中DNA疫苗质粒的浓度及超螺旋比例。实验过程如下:
1.1标准品及样品制备
标准品配置:将原液浓度为237ng/μL的DNA疫苗溶液在超纯水中按1:2连续稀释,总共稀释10个稀释度,对应的质粒DNA浓度分别为237ng/μL、118.5ng/μL、59.3ng/μL、29.6ng/μL、14.8ng/μL、7.4ng/μL、3.7ng/μL、1.9ng/μL、0.9ng/μL和0.5ng/μL。
样品制备(DNA疫苗微阵列贴片质粒DNA溶出):用移液器取2mL超纯水至干燥洁净的5mL离心管中,将DNA疫苗微阵列贴片从包装中取出,去掉白色衬纸,将贴片含药侧向内,贴于离心管口,将贴有微阵列贴片的离心管倒置于脱色摇床上,以转速170~200rpm室温振摇80min,撕下振摇后的离心管口的贴片,用2mL注射器吸出全部溶出液,经过0.22μm的针头式过滤器(PES)将溶出液过滤至干燥洁净的1.5mL离心管中,获得DNA疫苗微阵列贴片溶出的质粒DNA溶液,2-8℃保存备用。
1.2HPLC流动相的配制
流动相A配置:称取TRIS-Base,加入超纯水,搅拌使之充分溶解混匀,并用盐酸调节pH备用。
流动相B配置:称取TRIS-Base,氯化钠,加入超纯水,并用盐酸调节pH,备用。
1.3HPLC检测标准品及样品质粒DNA
使用检测条件为流动相A 50%,流动相B 50%,紫外检测波长260nm进行标准品和样品的检测。检测完成后,复制标准曲线浓度及峰面积,使用ELISA Calc软件绘制标准曲线及计算样品浓度。
表3不同配方DNA疫苗质粒贴片的检测结果
样品 | 超螺旋DNA峰面积 | 开环DNA峰面积 | 总峰面积 | 超螺旋DNA纯度(%) | 开环DNA纯度(%) |
MNSA | 73359 | 68066 | 141425 | 51.87 | 48.13 |
MNSB | 158577 | 12281 | 170858 | 92.81 | 7.19 |
MNSC | 53150 | 66690 | 119840 | 44.35 | 55.65 |
结论:图6中A为pAD1003 DNA质粒的标准品色谱图,图6中B、C和D分别为配方A、B、C的DNA疫苗贴片中DNA质粒色谱图,以标准品色谱图为依据计算(表3所示),可以看出配方B中的超螺旋DNA含量正常,纯度可达到92.81%,开环DNA纯度仅为7.19%;而其他两个配方A和配方C中的超螺旋DNA含量偏低,纯度仅为51.87%和44.35%,开环DNA纯度达到了48.13%和55.65%,证明了配方B制备的DNA疫苗贴片优于配方A和配方C。
2.不同配方微阵列DNA疫苗贴片的免疫原性比较
分别用配方A(MNSA)、配方B(MNSB)、配方C(MNSC)的pAD1003 DNA疫苗贴片免疫小鼠,贴片中pAD1003 DNA的含量均为20μg;免疫分组分别命名为MNSA-1003、MNSB-1003和MNSC-1003。以20μg pAD1003 DNA疫苗肌肉注射组(命名为1003)和20μg pAD1003 DNA疫苗肌肉注射后进行电击组(命名为1003-EP)为对照组。DNA疫苗贴片免疫程序:提前一天将小鼠背部接种部位先行机械褪毛和脱毛膏处理,次日在已脱毛皮肤表面将创可贴样的DNA疫苗贴片拇指施压贴敷,15分钟后揭下即完成免疫。“肌肉注射+电击”免疫程序:小鼠免疫前先剃除右后腿外侧毛发,然后中指抵住大腿内侧肌肉,近似垂直进针扎入大腿外侧肌肉,进针深度约2~3mm,肌肉注射疫苗溶液后,用电脉冲仪进行电击(0.2A、电脉冲两次),注射点应位于电极针的中央区域。免疫接种时间是第0天进行第一次免疫,第28天进行第二次免疫(加强免疫),二免后第14天采用ELISA的方法测定血清中的特异性抗体。
ELISA检测抗体浓度:将Nunc 96孔ELISA平板在4℃下用1μg/mL SARS-CoV-2野生株RBD蛋白(Acro Biosystems,DE,美国)包被过夜。将板洗涤3次,然后用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(含0.05%Tween 20,即PBST缓冲液)37℃下封闭1小时。洗涤之后将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中,并在37℃下孵育1小时。将板再次洗涤五次,然后在37℃加入原浓度为2mg/mL、1:20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript,NJ,CN)孵育1小时后,随后检测结合抗体。最后洗涤后,通过使用TMB底物使板显影,并用50μl/孔2M H2SO4终止反应。使用酶标仪在450nm和620nm处读数,用GraphPad对数据进行处理并作图。
结论:如图7所示,MNSB-1003免疫组在加强免疫后14天的抗体水平明显高于其他组,不仅进一步证明了DNA疫苗贴片的配方B优于配方A和配方C,也证明了本发明微阵列DNA疫苗贴片的免疫方式优于DNA疫苗肌肉注射后再电击的免疫方式。
3.免疫之后的微阵列DNA疫苗贴片中质粒残留含量检测
为了检测免疫之后不同配方DNA疫苗贴片中残留的DNA质粒含量,分别用质粒20μg、10μg和5μg配方A(MNSA),20μg、10μg和5μg配方B(MNSB),20μg配方C(MNSC)的pAD1003 DNA疫苗贴片免疫小鼠15min后揭下,采用琼脂糖凝胶电泳检测微针DNA贴片中溶出的DNA残留量。
3.1标准品及样品制备
标准品配置:将DNA质粒标准品按2倍进行等比稀释(起始浓度为59.2ng/μL),总共稀释6个稀释度,保证每个样品体积至少有15μL;对应的质粒DNA浓度分别为59.2ng/μL、29.6ng/μL、14.8ng/μL、7.4ng/μL、3.7ng/μL和1.9ng/μL。
样品制备:DNA疫苗微阵列贴片质粒DNA溶出的操作方法同上述HPLC中的样品制备方法一致。
3.2琼脂糖凝胶电泳检测标准品及样品质粒DNA
在制备的标准样品及微针溶出样品中加入终浓度为1×DNA Loading buffer,用移液器缓慢反复吹吸十次混匀后,轻轻加入配置好的1%琼脂糖凝胶加样孔底部,每孔上样量为10μL;加样完成后在样品孔后的空白孔中加入5μL DNA分子量标准试剂(DL15000 DNAMarker)。所有加样完成后,盖好电泳槽盖,设置电泳仪参数为:电压120V,时间30min。将电泳槽置于冰浴中开始电泳。
结论:如图8所示,图8中的A为配方A DNA贴片的结果图,与标准品对比,免疫之后的贴片中质粒残留明显,残留量小于2μg;图8中的B和C分别为配方B和配方C DNA贴片的结果图,与标准品对比,可以看出免疫之后的贴片中几乎无质粒残留。
综合上述DNA疫苗贴片配方的实验对比结果,包括HPLC对比结果、免疫原性对比结果以及免疫之后的质粒残留对比结果来看,总体上配方B是明显优于配方A和配方C,因此后续采用的是配方B制备的DNA疫苗贴片进行实验。
分析可能原因之一是配方B形成的微针结构强度优于配方A,配方C,进而在受到较大压力的作用下不发生断裂,进而能够刺入皮肤深处,提高给药质量。通过万能材料试验机直压测试针强度,配方B制备的微针的断裂点压力大于配方A,配方C;同时,配方B制备微针溶解释放速度合理,无需过久贴敷(该点在以下实施例6得到验证)。
实施例5.DNA疫苗贴片免疫与DNA疫苗“肌肉注射+电击”递送效果比较
接下来本发明用上述筛选出来的配方B制备的DNA疫苗贴片进行小鼠免疫实验,通过小鼠体内实验对三种新冠DNA疫苗贴片的免疫效果与DNA疫苗“肌肉注射+电击”的免疫效果进行比较。实验分组:(1)pAD131 DNA疫苗贴片组(MN-131);(2)pAD131 DNA疫苗肌肉注射+电击组(EP-131);(3)pAD1003 DNA疫苗贴片组(MN-1003);(4)pAD1003 DNA疫苗肌肉注射+电击组(EP-1003);(5)pAD1002 DNA疫苗贴片组(MN-1002);(6)pAD1002 DNA疫苗肌肉注射+电击组(EP-1002);(7)无DNA疫苗质粒贴片空白对照组(MNC);实验中各DNA质粒的剂量均为20μg。DNA疫苗贴片免疫程序和“肌肉注射+电击”免疫程序同实施例4相同,免疫接种时间是第0天进行第一次免疫,三种新冠DNA疫苗第二次免疫(加强免疫)的时间分别是第14天进行pAD131DNA疫苗第二次免疫、第28天进行pAD1003 DNA疫苗第二次免疫、第21天进行pAD1002DNA疫苗第二次免疫,初次免疫后第14天以及加强免疫后第14天收集血清,采用ELISA的方法测定血清中的特异性抗体。ELISA检测方法同实施例4一致。
结论:结果如图9中的A所示,小鼠经初次pAD131 DNA疫苗贴片(MN-131)免疫后14天血清中抗体水平低于pAD131 DNA疫苗肌肉注射+电击组(EP-131),但是加强免疫后14天EP-131组的优势不复存在;在加强免疫后14天MN-131组的抗体水平达到与EP-131组相当的水平,甚至更优(图9中的B)。用pAD1002和pAD1003贴片重复上述实验得到了完全一致的结果(图9中的C~F)。由此可见,在诱导体液免疫应答方面DNA疫苗的可溶性微针贴片递送完全可以与“肌肉注射+电击”这一传统且公认高效的递送途径相媲美。
实施例6DNA疫苗贴片免疫的量效关系与时效关系
为了给DNA疫苗贴片人体免疫剂量和免疫程序提供参考依据,本发明以pAD1003贴片为代表探索了不同接种剂量(5μg、10μg和20μg)对小鼠体液免疫应答的影响;并以pAD131疫苗贴片为代表观察了贴片免疫(贴敷)时长与免疫效果之间的时效关系。以ELISA方法检测各组特异性血清IgG滴度,ELISA具体操作方法同实施例4一致。
结论:如图10中的A所示,从pAD1003贴片初免后14天和28天小鼠血清IgG滴度来看,贴片递送质粒DNA的剂量(5μg、10μg和20μg)和IgG应答水平之间存在线性量效关系,随初免剂量上升,初次免疫后14天或28天的抗体滴度越高;初免后第28天用同样剂量的贴片加强免疫,间隔7天(初免后35天)和14天(初免后42天)再进行血清学分析,三个剂量组的IgG滴度提升均十分显著,但三组间的差异显著缩小。10μg可以达到与20μg相当的结果。这一结果提示,DNA疫苗贴片初免时加大剂量有助于特异性抗体的快速提升,加强免疫时较少剂量即可达到饱和免疫效果。
如图10中的B所示,以pAD131疫苗贴片为代表观察了贴片免疫(贴敷)时长与免疫效果之间的时效关系。BALB/c小鼠分别按10、30、60分钟进行贴敷,第14天进行第二次加强免疫,免疫后第35天、63天、77天以及90天的IgG滴度均维持在1/10000以上,且三组间无统计学差异。由此可见10分钟贴敷时间足够贴片所负载的疫苗DNA质粒及辅料完全溶解在皮肤组织中以完成质粒DNA的递送,在此基础上增加贴敷时长并不会提高免疫效果。后续小鼠贴片免疫实验中本发明均采用15分钟而非30~60分钟的贴敷时长。
实施例7新冠DNA疫苗贴片免疫的广谱性分析
在异二联RBD新冠DNA疫苗的设计理念中,广谱交叉保护性是一个核心目标。疫苗的交叉保护性可以从其诱导产生的抗体对各种病毒变异株的交叉识别、交叉中和以及攻毒保护三个角度加以衡量。
1.ELISA方法检测DNA疫苗贴片免疫后的抗体滴度
用pAD1002、pAD131以及pAD1003三种DNA疫苗贴片免疫小鼠,DNA疫苗的剂量均为20μg,加强免疫后14天收集血清,分别用源自SARS-CoV-1(SARS)、新冠野生株WT、Beta、Delta和Omicron BA1变异株的5种重组RBD作为包被抗原,通过ELISA方法对各DNA疫苗贴片加强免疫两周后BALB/c小鼠血清进行全方位交叉结合分析,ELISA具体操作方法参考实施例4,结果汇总于表4(将pAD1002贴片组的终末稀释滴度设定为100%,其它2组分别与之相比的百分比列于括号中)。
表4 DNA疫苗免疫血清对SARS或不同新冠毒株RBD的结合谱比较
结论:如表4所示,pAD1003质粒中没有SARS-RBD序列,因此pAD1003贴片免疫血清除SARS-RBD之外能高滴度结合全部四种新冠毒株RBD;而pAD1002和pAD131贴片免疫血清能高滴度结合全部5种RBD。本次实验均体现了本发明三种DNA疫苗贴片良好的免疫原性和广谱性。
2.假病毒中和抗体检测
IgG抗体与RBD的特异结合(binding)未必等同于对病毒的中和(neutralization),中和抗体水平更直接地反映抗体的保护效果,接下来本发明以pAD1003贴片免疫为代表,以不含质粒的贴片为空白对照组(MN-Blank),对BALB/c小鼠血清的假病毒交叉中和能力进行了测定。采用VSV系统构建针对新冠野生株(WT)和变异株OmicronBA.1的假病毒。pADV1003贴片对C57BL/6小鼠加强免疫后14天(Day 28),采集小鼠血清进行假病毒中和抗体滴度检测。
实验过程:将3x104/孔的293-ACE2细胞培养在含有10% FBS的DMEM中的96孔板中。为了检测中和抗体滴度,将小鼠血清(从1:30稀释开始)在DMEM培养基中按1:3连续稀释,总共稀释6个稀释度。随后,将稀释的血清样品与新冠各突变株假病毒(1x103 TCID50/孔)在37℃下孵育1小时后将混合物加入到293-ACE2细胞中进行感染,培养48小时后去除细胞上清液,使用萤火虫荧光素酶测定试剂盒(Promega)和酶标仪检测裂解后细胞内的绝对荧光素发光值,并通过将与同板中的病毒对照孔进行标准化来计算相对值。
结论:如图11所示,pAD1003DNA疫苗贴片免疫血清对WT和Omicron BA.1假病毒均有显著的中和作用,对WT假病毒的中和抑制率可达50%以上,对Omicron BA.1假病毒中和抑制率接近100%,说明pAD1003DNA疫苗贴片能够高效的诱导中和抗体的产生。
实施例8 DNA疫苗贴片诱导病毒特异性细胞免疫应答
病毒特异性T细胞,尤其CD8+杀伤T细胞(CTL),是清除病毒感染的关键免疫细胞。相对于灭活病毒疫苗或重组蛋白疫苗来说,DNA疫苗的一大优势就是诱导更强的细胞免疫应答。其中CD4+辅助性T细胞帮助B细胞产生特异性抗体,而CTL则能够高效剿灭被病毒感染的组织细胞,清除病毒的“藏身掩体”和“繁殖温床”。那么微针贴片递送DNA疫苗能否高效地诱导细胞免疫应答。
本发明以pAD1002贴片为代表研究了DNA疫苗贴片免疫BALB/c小鼠后的细胞免疫应答。经两次pAD1002贴片、pAD1002肌肉注射+电击免疫后14天,取引流淋巴结和脾细胞分别用WT-RBD肽库刺激5天(激活RBD特异性T淋巴细胞)后ELISpot检测IFN-γ+和IL-4+细胞。
实验方法:加强免疫后14天(Day 28),在无菌环境中将小鼠安乐死并取出淋巴结和脾脏研磨成细胞悬液,离心收获细胞,用红细胞裂解液重悬细胞后进行裂解和过滤,制备成单细胞悬液。通过试剂盒说明书要求,使用小鼠IL-4、IFN-γ双色FlouroSpot试剂盒(MabTech,USA)进行IL-4ELISpot、IFN-γELISpot测定。将单细胞悬液以5×105个/孔的接种量接种到ELISpot预包被板孔内,分别加入终浓度为10μg/mL的刺激物(新冠野生株RBD肽库)100μL,并设置复孔。按照说明书要求同时设置阴性(NC)、阳性对照孔(PC)。将铺好细胞的预包被板放入37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养18~22小时。按照试剂盒说明书要求进行实验操作,并通过荧光酶联斑点分析仪进行定量检测,获得每只小鼠每5×105个T淋巴细胞的平均斑点数目,以此来计算每只小鼠每1×106T淋巴细胞所能生成的INF-γ/IL-4的斑点数目,用GraphPad对数据进行处理并作图。
结论:如图12中的A所示,pAD1002贴片免疫小鼠的引流淋巴结中聚集了大量RBD特异性IFN-γ+T淋巴细胞,脾脏中则寥寥无几。“肌注+电击”免疫组的表现恰好相反,如图12中B所示,IFN-γ+T细胞主要见于脾脏而非引流淋巴结。pAD1002贴片免疫小鼠的引流淋巴结和脾脏中均可见RBD特异性IL-4+T细胞的聚集(图12中C~D),而“肌注+电击”免疫小鼠的淋巴结和脾脏中则鲜有RBD特异性IL-4+T细胞出现。上述结果显示,DNA疫苗贴片皮内免疫与肌注免疫所激活的适应性细胞应答有不同的特点,前者所激活的T淋巴细胞长时间滞留在引流淋巴结,而肌肉注射途径激活的细胞则很快进入外周循环。
实施例9 DNA疫苗贴片在新西兰白兔和C57BL/6小鼠中的免疫原性
以上的体内实验主要用BALB/c小鼠完成,为证明DNA疫苗贴片的强免疫原性并非是仅见于BALB/c这一小鼠品系的特殊现象,本发明在新西兰白兔和C57BL/6小鼠模型中重复了部分体内实验。
1.ELISA方法检测DNA疫苗贴片免疫后的抗体滴度
新西兰白兔于第0和第14天经pAD1002贴片两次免疫(10贴/次/只),DNA疫苗的剂量为每贴20μg;pVAX1质粒“肌注+电击”免疫为对照组。初免和二免后14天ELISA法测定血清IgG对SARS-CoV-1和新冠病毒WT、Beta、Delta和Omicron BA.1RBD结合的终末稀释滴度,ELISA具体操作方法参考实施例4。
结论:新西兰白兔的免疫结果如图13所示,pAD1002贴片初次免疫后(1002MNx1组)血清IgG对五种抗原RBD的结合滴度均在1/104左右,二免后(1002MNx2组)有了10倍以上的提升,呈现出较好的体液免疫应答强度以及交叉反应性。
C57BL/c小鼠的免疫结果如图14所示,pAD1002贴片两次免疫C57BL/c小鼠后14天血清IgG对WT、OmicronBA.1和SARS-CoV-1抗原RBD结合的结合滴度均在1/105~1/106之间,同样也呈现出较好的体液免疫应答强度以及交叉反应性。可见,DNA疫苗贴片在小鼠以及兔子中均具备优异的免疫原性。
2.ELISpot方法检测特异性细胞免疫应答
实验方法同实施例8一致,特异性刺激物分别为新冠野生株WT RBD肽库和OmicronBA.1RBD肽库,各刺激物终浓度为10μg/mL。
结论:如图15所示,从C57BL/c小鼠的细胞免疫反应上来看,pAD1002贴片免疫能有效激活WT和Omicron特异性IFN-γ+T细胞(图15的A~B),其中大多归巢于引流淋巴结,少量聚集在脾脏。而对于pAD1002贴片免疫有效激活的WT和Omicron特异性IL-4+T细胞,其主要见于脾脏,少数分布在引流淋巴结(图15的C~D)。
总之,新西兰白兔和C57BL/6小鼠对DNA疫苗贴片免疫的积极应答告诉本发明,DNA疫苗贴片的强免疫原性肯定不是局限于某些小动物品系的特殊现象,将来值得用猪或者猴等大动物进一步确认贴片免疫的非种属限制性,从而进一步将其推向临床和上市。
实施例10 DNA疫苗贴片的抗新冠病毒保护效果
利用小鼠、家兔或大动物(如NHP)模型开展活病毒攻毒实验是考察疫苗保护效果的重要手段。本研究中本发明采用人ACE2(hACE2)转基因小鼠(C57BL/6背景)模型对pAD1002贴片免疫的Omicron变异株保护效果进行实验,以空载体pVAX1肌注免疫为阴性对照。接种时间是第0天进行第一次免疫,第21天进行第二次免疫(加强免疫),二免后第14天测定血清中的特异性抗体。二免后第18天对小鼠进行病毒感染,感染后第4天测量肺组织病毒载量。
1.ELISA检测抗体浓度
实验方法参考实施例4,二免后14天ELISA法测定血清IgG对SARS-CoV-1和新冠病毒WT、Beta、Delta和OmicronBA.1RBD结合的终末稀释滴度。
结论:如图16所示,pAD1002疫苗贴片对hACE2-TG小鼠加强免疫后14天,血清IgG对SARS-CoV-1、新冠WT、Beta、Delta、Omicron BA.1等五种抗原来源RBD的结合效价约为1/104~1/106,进一步说明pAD1002疫苗贴片具有良好的体液免疫应答强度以及交叉反应性。
2.假病毒中和抗体检测
实验方法同实施例7一致,检测上述血清的中和能力。
结论:如图17所示,在BA.1假病毒中和实验中,pAD1002疫苗贴片加强免疫后第14天能够对新冠Omicron BA.1型突变株病毒产生很好的中和活性,pVAX1组则完全没有中和作用。相比于pVAX1对照组,pAD1002贴片组在Omicron BA.1活病毒攻毒实验中显示了显著的保护效果,可以诱导保护性免疫应答,说明本发明DNA疫苗贴片针对新冠Omicron突变株具有优秀的预防保护作用。
3.肺部病毒载量检测
加强免疫后第18天对小鼠进行Omicron BA.1型突变株病毒感染,感染后第4天取肺组织,采用qPCR法测量肺组织病毒载量。本次实验委托长春军事兽医研究所BSL-3实验室完成新冠Omicron BA.1病毒感染实验。按照制造商的说明书方法,使用QIAamp ViralRNAKit(Qiagen,52906)分离肺部组织中的病毒RNA;然后采用ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems,CA,United States),使用HiScript IIOne Step RT-qPCR SYBRGreen Kit(Vazyme Biotech,南京,中国)通过RT-qPCR方法检测病毒拷贝。RT-qPCR的反应条件如下:50℃ 15分钟,95℃ 30秒,然后在95℃ 10秒和63℃ 35秒下进行45个循环。用于检测SARS-CoV-2N基因和SgE基因的特异性引物为:
N-gene-F,GACCCCAAAATCAGCGAAAT(SEQ ID NO:12);
N-gene-R,TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG(SEQ ID NO:13);
sgRNA-E-F,CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC(SEQ ID NO:14);
sgRNA-E-R,ATATTGCAGCAGTACGCACACA(SEQ ID NO:15)。
结论:肺部病毒载量结果如图18所示,gRNA检测的是病毒N基因,检测到gRNA说明肺组织中有病毒的存在,说明病毒感染了肺组织;sgRNA是新冠病毒复制的中间产物,如果检测到sgRNA说明病毒感染了细胞且利用宿主细胞的环境进行了自我复制。从结果来看,pVAX1对照组都检测较高的gRNA基因和sgRNA基因,说明有病毒感染了细胞并在细胞里进行了复制;而本发明pAD1002 DNA疫苗贴片组的gRNA和sgRNA水平相对对照组显著降低,说明本发明的DNA疫苗贴片可以有效阻止或抑制病毒在体内的复制,具有很好的疫苗保护效果。
实施例11 B配方和G配方的微阵列DNA疫苗贴片的免疫原性比较
分别用配方G(MNSG)、配方B(MNSB)的pAD1002DNA疫苗贴片免疫小鼠,配方G和配方B的唯一区别在于,选用聚乙烯吡咯烷酮K90代替聚乙烯吡咯烷酮K120。
贴片中pAD1002 DNA的含量均为20μg;免疫分组分别命名MNSG-1002、MNSB-1002。以DNA质粒肌肉注射给药方式为对照组(1002)。免疫接种时间是第0天进行第一次免疫,第14天进行第二次免疫(加强免疫),初免后第14天和二免后第7天、第14天采用ELISA的方法测定血清中的特异性抗体。ELISA实验方法与实施例4一致。
结论:如图19所示,MNSG-1002免疫组、MNSB-1002免疫组在初免14天和加强免疫后第7天、14天的抗体水平均相当,二者之间没有明显的显著性差异。可见,G配方能取得与B配方相当的结果。
实施例12 G配方的微阵列DNA疫苗贴片在新西兰白兔中的免疫原性
进一步用G配方制备的pAD1016 DNA疫苗贴片验证在新西兰白兔模型中的免疫效果。
pAD1016重组质粒构建与微针贴片制造:设计编码SARS-CoV S蛋白RBD区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,和编码SARS-CoV-2Omicron BA.4/5突变株S蛋白RBD区的核苷酸序列(来源于EPI_ISL_12268493.2,GISAID)如SEQ ID No.16所示。将SEQ ID No.1和SEQ IDNo.16直接串联后,并在SEQ ID No.1的前端N端加上如SEQ ID No.7所示的编码信号肽的核苷酸序列以及在SEQ ID No.16的末尾C端加上TAA终止密码子,最终得到如SEQ ID No.17所示核苷酸序列,将SEQ ID No.17插入pVAX1载体的BamH I与Xho I位点间,即得重组表达质粒pAD1016。在体外验证pAD1016构建成功,可进行转录和表达蛋白,并具有免疫原性。同时,pAD1016微阵列DNA疫苗贴片的设计与制造参考实施例2。
免疫分组:(1)空载体pVAX1对照组;(2)1mg pAD1016 DNA疫苗皮内注射+电击组(1mg ID+EP);(3)2mg pAD1016 DNA疫苗肌肉注射组(2mg IM);(4)1mg pAD1016 DNA疫苗肌肉注射组(1mg IM);(5)0.5mg pAD1016 DNA疫苗肌肉注射组(0.5mg IM);(6)1mg pAD1016DNA疫苗皮内注射组(1mg ID);(7)1mg pAD1016 DNA疫苗贴片组(1mg MN);每组小鼠在第0天进行初免、第16天加强免疫一次。
1.ELISA检测抗体浓度
加强免疫后14天收集血清,用新冠野生株WT RBD蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法对各组加强免疫两周后的兔子血清进行分析,ELISA具体操作方法参考实施例4,测定血清IgG对新冠病毒WT RBD结合的终末稀释滴度。
结论:如图20所示,各免疫组加强免疫后14天,血清IgG对新冠WT抗原RBD的结合效价约为1/104~1/107,1mg pAD1016 DNA疫苗贴片组(1mg MN)的抗体结合滴度可达1/107,明显优于其他不同剂量的单独肌肉注射DNA疫苗组、单独皮内注射DNA疫苗组以及皮内注射+电击的DNA疫苗组,可见G配方制备的DNA疫苗贴片在兔子体内也具有强的免疫原性。
2.假病毒中和抗体检测
采用VSV系统构建针对新冠变异株Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、OmicronXBB的假病毒。加强免疫后14天,采集兔子血清进行假病毒中和抗体滴度检测。实验过程同实施例7一致,检测上述血清的中和能力。
结论:如图21所示,针对新冠Omicron突变株BF.7、BQ.1.1、XBB,检测1mg pAD1016DNA疫苗皮内注射+电击组(1mg ID+EP)和1mg pAD1016 DNA疫苗贴片组(1mg MN)两组血清当中针对新冠Omicron突变株的中和抗体,结果显示,DNA疫苗贴片组免疫血清对新冠Omicron突变株BF.7、BQ.1.1、XBB假病毒均有显著的中和作用,且明显优于DNA疫苗皮内注射+电击组。
实施例13 G配方各组分不同配比组以及对比例组的微针机械强度评价
参照配方G的组分组成,设置各组分不同重量份配比的组别(如下表5的1~7组),以及设置表5的对比例组别1~4(组分A中的部分成分缺失)。参照实施例2的方法,按照表5所示的各组分重量份配比制备不同组别的微针制剂。
表5
通过万能材料试验机直压测试上述1~7组和对比组1~4的微针强度。结果表明,通过本发明提供方法制备得到的微针贴片1~7明显具有更高的微针结构强度(单根在0.63~0.73N范围),而缺少第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮中任一种的对比组1~4均会导致微针强度的明显劣化(单根在0.39~0.46N范围),说明本案中的第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮在提高微针强度方面起到了较好的协同作用。
综上,首先,本案通过将特定分子量的羟乙基纤维素、特定粘度的第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇以及特定分子量的第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮进行组合作为微针制剂中起主要强度支撑作用的骨架材料,能够有效提高该微针制剂制备得到的微针的结构强度,进而在受到较大压力的作用下不发生断裂,进而能够刺入皮肤深处,提高给药质量;上述粘度范围内的第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇和上述分子量范围的第一聚乙烯吡咯烷酮、第二聚乙烯吡咯烷酮之间的配合,推测是由于聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮之间相互交缠,且其分子链的长度差异起到互补作用,进而使第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮之间相互交缠以形成更为稳固的支撑骨架,提高了微针的整体强度。通过对不同粘度的第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇和不同分子量的第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮的添加量进行限制,有利于维持所述微针制剂得到的微针的整体强度,当第一聚乙烯醇、第二聚乙烯醇、第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮的添加量不在上述范围中时,会对所得到的微针的结构强度产生劣化作用。
再者,本案的特定的微针制剂配方适用于核酸分子例如DNA疫苗的递送,可以取得较电击等传统DNA疫苗递送模式相当甚至更优的效果,其中尤其是微针制剂配方B以及以配方B为基础获得的微针制剂配方G的效果最好。且该等配方并不受到DNA疫苗的具体结构影响,普遍适用于不同结构的核酸分子。
此外,本案中的核酸分子pAD1002、pAD1003、pAD131、pAD1016由于其优异的序列设计,从而呈现处针对新型冠状病毒的优异的免疫原性,以及针对新型冠状病毒不同突变株具有优异的广谱性。可以合理预期本案核酸分子微针制剂可以进一步开发用于临床实验以及根据临床实验结果用于上市。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (11)
1.一种核酸分子微针制剂,其特征在于,包含微针辅料以及核酸分子;
所述微针辅料包括以下A组分:聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧乙基纤维素;
所述聚乙烯醇包括第一聚乙烯醇和第二聚乙烯醇,所述第一聚乙烯醇的粘度为2.4~12.3mpas,所述第二聚乙烯醇的粘度为17.2~42.6mpas;
所述聚乙烯吡咯烷酮包括第一聚乙烯吡咯烷酮和第二聚乙烯吡咯烷酮,所述第一聚乙烯吡咯烷酮的分子量为3500~150000Da,所述第二聚乙烯吡咯烷酮的分子量为210000~1500000Da。
2.根据权利要求1所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述第一聚乙烯吡咯烷酮的粘度为0.8~10.6mpas,所述第二聚乙烯吡咯烷酮的粘度为16.5~88.4mpas。
3.根据权利要求1所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述A组分包括以下重量组分:聚乙烯醇2~6份、聚乙烯吡咯烷酮9.5~15份和羧乙基纤维素5~7份;
优选地,所述聚乙烯醇包括第一聚乙烯醇0.5~2.5份和第二聚乙烯醇1.5~3.5份;
所述聚乙烯吡咯烷酮包括第一聚乙烯吡咯烷酮2.5~5份和第二聚乙烯吡咯烷酮7~10份;
优选地,所述A组分还包括35~49重量份的第一溶剂。
4.根据权利要求1所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述微针辅料还包括以下B组分:糖类、缓冲剂和盐;
优选地,所述B组分包括以下重量组分:糖类11~16份、缓冲剂0.3~0.8份和盐0.5~2份;
优选地,所述B组分还包括0.002~0.01重量份的氢氧化钠和14~17重量份的第二溶剂。
5.根据权利要求4所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述糖类包括1~3重量份的蔗糖和10~13重量份的海藻糖。
6.根据权利要求4所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述A组分和所述B组分的重量比为(16.5~77):(11.8~35.81)。
7.根据权利要求1~6任一项所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述核酸分子选自核酸疫苗或者治疗性核酸分子。
8.根据权利要求7所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述核酸疫苗包括抗原表达盒,所述抗原表达盒包括质粒和插入质粒的编码抗原的核酸片段;
优选地,所述抗原包括病毒蛋白RBD片段;
优选地,所述核酸片段编码病毒蛋白二联或二联以上RBD片段;
优选地,所述核酸片段编码新冠DNA异二联RBD片段;
优选地,所述新冠DNA异二联RBD片段包括SARS-CoV S蛋白RBD片段、新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD片段或新冠SARS-CoV-2Omicron突变株S蛋白RBD片段;
优选地,编码所述SARS-CoV S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述新冠SARS-CoV-2Beta突变株S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,编码所述新冠SARS-CoV-2Omicron突变株S蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.16所示。
9.根据权利要求1~6任一项所述的核酸分子微针制剂,其特征在于,所述微针制剂包括分层针或者一体针;在分体针的针尖液中或者在一体针的整个针体中,所述A组分和药物活性成分的重量比为(16.5~77):(0.6~22.46)。
10.一种核酸分子微针制剂,其特征在于,包含抗原表达盒,所述抗原表达盒包括质粒和插入质粒的编码抗原核酸片段;所述编码抗原核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或者SEQ ID No.16所示。
11.权利要求4~10任一项所述核酸分子微针制剂的制备方法,其特征在于,包括:将所述A组分溶液和所述B组分溶液混合得到基膜液;对于分层针,在部分基膜液中加入核酸分子得到针尖液;使用微针模具,利用针尖液制备微针针尖,再利用基膜液制备微针的针体部分和基膜部分,得到微针制剂;或者,对于一体针,在基膜液中加入核酸分子得到成型液,利用成型液制备微针针体,得到微针制剂。
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