CN109504662A - 一种柯萨奇病毒减毒株及其应用 - Google Patents

一种柯萨奇病毒减毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柯萨奇病毒减毒株及其应用，所述的柯萨奇病毒减毒株为柯萨奇病毒B组5型JZ‑P50株（Enterovirus coxsackie virus CVB5 JZ‑P50），保藏编号为CCTCC No：V201858。本发明利用减毒活疫苗的方式，对柯萨奇病毒B5毒株进行减毒，所用细胞为Vero细胞，通过低温连续培养50代，意外地获得CVB5减毒疫苗，与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的优势特征，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能改进，为降低生产成本，制备有效的、安全的、廉价的CVB5疫苗提供了保障。

Description

一种柯萨奇病毒减毒株及其应用
技术领域
本发明涉及一种柯萨奇病毒减毒株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
柯萨奇病毒B组5型(Coxsakievirus B5，CVB5)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)是一种常见的人类肠道病毒，感染后轻则可引起婴幼儿上呼吸道感染、腹泻及手足口病，重则能引起18岁以下人群病毒性脑膜炎，无菌性脑膜炎、胰腺炎、扩张性心肌病等多种疾病。CVB5在全世界范围内广泛流行，但对于引起的重症疾病目前并没有有效的治疗手段，更没有可预防的CVB5疫苗的报道。
当前研究疫苗的方法有很多，比如，亚单位疫苗，活载体疫苗、核酸疫苗等，这些疫苗已不是完整的病原体，而是相关的蛋白(多肽、肽)、多糖和核酸，经过载体免疫接种后，诱导机体产生特异性的体液或细胞免疫反应，但是也会存在免疫原性较弱，无法达到保护效果，甚至会导致疾病的加重。
传统的疫苗方法就显得安全有效很多。传统疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗。
灭活疫苗是用物理、化学方法杀死病原微生物，但仍保持其免疫原性的一种疫苗，优点是没有毒力，安全性好，相对稳定，4℃可保存一年以上，缺点抗原用量多且接种次数多，只引起体液免疫，免疫维持时间短，在体内不增殖。减毒活疫苗通过毒力变异或人工选择法(温度敏感株)而获得减毒或无毒株，但仍保留其繁殖能力和免疫原性的一种疫苗，优点是抗原用量少接种一次即可，可诱发体液免疫和细胞免疫的双重功效，免疫维持时间较长，缺点有毒力返祖的危险，相对不稳定，不易保存。
制备减毒活疫苗的方法也有多种，体内外传代减毒、低温培养筛选、诱变减毒等。目前我国已成功研制出的疫苗，脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、甲型肝炎疫苗和乙型脑炎疫苗都属于减毒活疫苗。
现有技术中存在的技术问题是：缺少一种免疫原性和安全性都符合要求的柯萨奇病毒B组5型减毒活疫苗。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种柯萨奇病毒减毒株及其应用。
本发明的目的是筛选出一株柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株(Enteroviruscoxsackie virus CVB5JZ-P50)，使其毒力降低且不丧失免疫原性。CVB5毒株是从云南省第一人民医院手足口病患儿的粪便中获得，通过连续低温传代而获得温度敏感株，命名为JZ-P50，该减毒株已于2018年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址中国武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：V201858；本发明的CVB5温度敏感株JZ-P50免疫动物后证明具有安全性和免疫原性，认为可作为减毒活疫苗的毒种。
本发明涉及到的微生物的保藏信息如下：
保藏日期：2018.10.23
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏编号：CCTCC No：V201858；
分类命名：柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株(Enterovirus coxsackie virus CVB5JZ-P50)。
特征：与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的特征优势，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能。
本发明还提供了上述的柯萨奇病毒减毒株在制备柯萨奇病毒B组5型减毒疫苗中的应用。
本发明制备柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株减毒活疫苗的方法如下：
(1)使用细胞生长液将Vero细胞(购自于ATCC)在37℃CO2培养箱下培养成致密的单层，细胞生长液为含有10％的胎牛血清的MEM培养基；
(2)弃掉细胞上清液，换成含有2％胎牛血清的MEM维持液，以盲传的方式接种柯萨奇病毒B组5型毒株，在33℃培养箱培养，直至细胞出现70％-80％病变，收获病毒液作为下一代接种的毒种，连续培养50代，最终获取柯萨奇病毒B组5型温度敏感株JZ-P50。
(3)收获病毒液采用本领域最常用的方法，将病变70％-80％的细胞反复冻融于-20℃2-3次，在超净台中收集病毒液，12000rpm，离心10min，获取上清即为病毒液，-20℃保存。
(4)制备疫苗首先将病毒纯化，采用的方法是本领域中常规的蔗糖密度梯度离心法，将粗制的减毒病毒悬液12000rpm离心1h，获取上清液，将含病毒的上清液经蔗糖梯度(浓度范围：从底层开始2ml 60％蔗糖；2ml 45％蔗糖；2ml 30％蔗糖；2ml 15％蔗糖)，4℃40000rpm离心7h，之后将条带样品经分子截留量为50kd的透析袋进一步去除残余蔗糖离子等杂质，PEG8000浓缩，用磷酸盐缓冲液如PBS悬浮所得样品，并测病毒滴度，由此制得柯萨奇病毒减毒疫苗。
本发明中的柯萨奇病毒B组5型原始毒株是从云南省第一人民医院手足口病患儿的粪便中分离获得能保证其有效的抗原；本发明中用于繁殖病毒的细胞基质为Vero细胞，是世界卫生组织(WHO)推荐为生产人用疫苗的理想细胞基质，与其他细胞基质相比，这些细胞基质作为人用疫苗细胞基质是安全可靠的。动物实验也已证明JZ-P50株具有良好的安全性和免疫原性。
本发明的优势在于利用减毒活疫苗的方式，对柯萨奇病毒B5毒株进行减毒，所用细胞为Vero细胞，通过低温连续培养50代，意外地获得本发明的CVB5减毒病毒株，与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的优势特征，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能改进，为降低生产成本，制备有效的、安全的、廉价的CVB5疫苗提供了保障。
附图说明
图1为正常的Vero细胞电镜示意图；
图2为接种柯萨奇病毒B组5型毒株的Vero细胞病变示意图；
图3为CVB5毒株不同代次33℃和37℃下的滴度变化情况；
图4为CVB5毒株不同代次33℃/37℃比值情况；
图5为幼鼠接种106TCID50平均体重变化；
图6为幼鼠5日龄体表特征变化；
图7为接种剂量106TCID50幼鼠存活情况；
图8为5日龄幼鼠各组织解剖图；
图9为5日龄幼鼠各组织病理切片；
图10为幼鼠攻毒后的平均体重变化；
图11为幼鼠攻毒后存活情况；
图12为P55CVB5毒株与不同代次33℃和37℃滴度比较情况；
图13为Mock、JZ-P50、P55毒株免疫幼鼠后5日龄各组织解剖图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学和动物免疫的方法，这些方法是本领域普通技术员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1Vero细胞的培养
从液氮中取出一支Vero细胞(购买于ATCC，编号CCL-81),迅速放入37℃温水中，使细胞迅速解冻，然后1000rpm离心10min，轻轻的拿到超净台消毒，然后用1ml含10％的胎牛血清的MEM培养基(购买于GIBCO Invitrogen公司)重悬，加入到底面积35cm2的细胞培养瓶中，补加9ml的含10％的胎牛血清的MEM培养基，37℃封闭培养过夜。次日，弃掉细胞上清的培养基，加入新鲜的MEM培养基继续培养。等到细胞长成致密的单层后，加入PBS(购买于GIBCO Invitrogen公司)清洗细胞三次，倒掉后，加入1ml的胰酶消化液(购买于GIBCOInvitrogen公司)37℃消化10min，然后用MEM培养基将细胞重悬、吹散，按1：2-1：4的比例分装到细胞瓶中，37℃封闭培养，直至细胞长到接种病毒所需的量。如图1为正常的Vero细胞状态。
实施例2CVB5的低温传代
本发明中所用到的柯萨奇病毒B组5型毒株是本实验室从云南省第一人民医院手足口病患儿的粪便中提取分离的，并得到进一步的鉴定。将冻存的CVB5毒株以盲传的方式接种500ul于上述实施例1中培养好的Vero细胞中，在接种前细胞培养基换成含2％胎牛血清的MEM维持液，37℃封闭培养。其中，每两个小时观察细胞病变情况，待细胞病变达到70％-80％时，-20℃与室温反复冻融2-3次，于超净台中收获病毒，保存于-20℃冰箱中，命名为JZ-WT。即该毒种为本发明的野毒株。如图2为Vero细胞病变的状态。
按照上述方法，将JZ-WT接种至2％胎牛血清的MEM维持液Vero细胞中，33℃封闭培养，收获毒种P1可继续接种Vero细胞，以此类推，直至进行50代的病毒培养，所获得的毒株即为CVB5温度敏感株，命名JZ-P50。
实施例3CVB5JZ-P50的冷适应性和温度敏感性
测定JZ-WT野毒株和JZ-P50温度敏感株的病毒滴度，具体内容如下:
不同代次的温度敏感株冷适应的测定
胰酶消化一35cm2培养瓶的Vero细胞，取20ul加入细胞计数板中计数，补加生长液调整浓度至1×105/ml。按照100ul/孔接种至96孔板中，使得104细胞/孔。当细胞长至单层的70％-80％时，用100ul的排枪每孔吸取50ul培养基，弃掉，将P0、P10、P20、P30、P40、P50温度敏感株分别按10-3、10-4…….10-11、10-12倍比稀释，50ul/孔接种到96孔板中，每个稀释度设4个平行，同时设置未接种病毒的对照组。每一代毒种做两个重复孔板。
分别在33℃、37℃恒温培养，一般连续观察7天(细胞不再出现病变时)，记录每孔细胞病变情况。再根据感染滴度查询表和反对数表计算感染滴度。如图3所示，CVB5毒株不同代次33℃和37℃下的滴度变化情况。CVB5温度敏感株在33℃病毒滴度比37℃高出100倍时可认为已成功的冷适应到Vero细胞上，根据不同代次的温度敏感株在33℃和37℃的病毒滴度比较，如图4所示，P40、P50 33℃病毒滴度比37℃高出100倍，说明具有温度敏感性。
实施例4CVB5JZ-P50的体内减毒特性
动物实验，Balb/c小鼠(购买于昆明医科大学实验动物中心)6-8周，雌雄各8只进行交配。JZ-WT和JZ-P50温度敏感株分别设置TCID50为102、104、106三种剂量，另设细胞对照组，共7组。21天后，颅内接种出生1日龄的幼鼠，每只幼鼠的接种剂量为20ul，每天称量幼鼠体重，观察其健康状况，直到第20天。其中第5天，每组幼鼠取三只，脱颈处死，取幼鼠完整的各个脏器称重，各脏器用于制作病理切片，观察其组织损伤程度。比较发现，在TCID50为106时对比明显。
图5表示为注射剂量106TCID50JZ-WT、JZ-P50、阴性对照幼鼠平均体重变化，JZ-WT组幼鼠第5天出现下降，到第九天为0，阴性对照与JZ-P50体重变化趋势持续上升仍然无明显差异，阴性对照比JZ-P50平均体重高一点，但区别不大。
图6表示JZ-WT组体型瘦小、四肢无力、弓背、不能饮食、濒临死亡。与阴性对照相比，JZ-P50组体型大小无差别，无瘫痪、弓背等症状。
图7所示为三组小鼠的存活率情况，JZ-WT到第9天全部死亡,存活率为0，而阴性对照与JZ-P50存活率为100％。
图8表示阴性对照、JZ-P50、JZ-WT三组幼鼠组织解剖图，从图中可以看出，JZ-WT组各组织基本都出现明显的萎缩，个别组织像肝、脑等形态都发生变形，脑组织还出现海绵状结构。而与阴性对照相比，JZ-P50各个组织在大小、颜色、形状、完整程度来看相差不大。
图9表示幼鼠各组织病理切片的观察，脑组织的JZ-P50组与阴性对照组无明显差异，核大小均一，而JZ-WT组会出现细胞核不完整甚至细胞坏死，细胞间隙变大，脑实质已无明显的血管组织；心脏的JZ-P50组与阴性对照的心肌细胞都呈长条的梭形，而JZ-WT组血管破裂，血细胞渗出，部分细胞核破损严重；肺组织JZ-P50与阴性对照相比无明显差异，肺泡腔完整肺泡壁厚度均一，而JZ-WT组肺泡塌陷，空腔不完整，肺泡壁变薄；胃组织JZ-P50与阴性对照相比无明显差异，JZ-WT组胃黏膜上皮细胞损伤，无完整的细胞结构，淋巴细胞浸润现象明显；肝脏组织JZ-P50与阴性对照相比无明显差异，而JZ-WT组有淋巴细胞浸润现象；小肠组织JZ-P50与阴性对照相比无明显差异，JZ-WT组小肠绒毛破损，肌肉层出现淋巴细胞浸润现象；肾脏无明显变化。以上结果全部说明CVB5JZ-P50是减毒的。
实施例5CVB5减毒疫苗的制备
将实施例2中收获的温度敏感株JZ-P50细胞悬液，超声破碎，4℃12000rpm离心1h，收集上清液，再将含有病毒的上清液经蔗糖(购买于GIBCO Invitrogen Corporation公司)梯度(浓度范围：从底层开始2ml 60％蔗糖；2ml 45％蔗糖；2ml 30％蔗糖；2ml 15％蔗糖)，4℃40000rpm离心7h，将离心后条带样品分别装入分子截留量为50kd的透析袋中，4℃PBS搅拌透析，每隔2h换一次PBS，每次500ml，透析8次，以完全去除蔗糖、盐离子等。然后将透析后的样品透析袋内进行PEG8000浓缩，室温放置若干小时，直至样品体积浓缩至最小，冲洗透析袋壁上的病毒样品，使用0.22um滤膜过滤除菌后分装，即得到柯萨奇病毒B组5型减毒疫苗。
实施例6CVB5JZ-P50减毒株的免疫原性
BALB/C小鼠，雌性，6-8周，JZ-P50温度敏感株为一组，另设细胞对照组，共2组，每组5只小鼠，腹腔一次注射TCID50为106的JZ-P50株病毒，细胞对照组注射同等体积的Vero细胞透析液，每天称量体重，观察免疫后的小鼠行为活动、精神状态等等，免疫后的2周、4周尾静脉取血200ul，37℃水浴2H,4℃过夜，次日，4℃5000rpm离心30min，取上层血清，测血清总抗体和中和抗体效价。
BALB/C小鼠，雌性，6-8周，JZ-P50温度敏感株为一组，另设细胞对照组，共2组，每组5只小鼠，分别在1天、7天、14天腹腔免疫三次，每次剂量为106，体积为100ul，细胞对照组注射同等体积的Vero细胞透析液，每天称量体重，观察免疫后的小鼠行为活动、精神状态等等，免疫后的2周、4周尾静脉取血200ul，37℃水浴2H,4℃过夜，次日，4℃5000rpm离心30min，取上层血清，测血清总抗体和中和抗体效价。以此评价温度敏感株JZ-P50的免疫原性。如表1所示，单次免疫6-8周小鼠总抗体和中和抗体效价表，表中显示免疫JZ-P50减毒株的总抗体效价为1：50，而中和抗体效价未测出。表2所示三次免疫小鼠血清总抗体和中和抗体的效价，JZ-P50总抗体效价为1：500，中和抗体效价1：10。说明CVB5JZ-P50具有良好的免疫原性。
表1：单次免疫小鼠血清总抗体和中和抗体效价
接种毒株名称 血清总抗体效价 血清中和抗体效价
JZ-P50 1：50 0
阴性对照组 0 0
表2：三次免疫小鼠血清总抗体和中和抗体效价
接种毒株名称 血清总抗体效价 血清中和抗体效价
JZ-P50 1：500 1：10
阴性对照组 0 0
实施例7CVB5JZ-P50减毒株的免疫保护性
动物实验，BALB/C小鼠，6-8周，雌雄各两只，雌鼠分为实验组和细胞对照组，实验组分别在1天、7天、14天腹腔免疫JZ-P50温度敏感株，每次免疫注射量TCID50为106，体积为100ul；阴性对照组以同样的方法免疫，每天称雌鼠的体重，观察雌鼠的行为特征和精神状态。第15天，雌雄鼠进行交配，怀孕生产幼鼠后，实验组和阴性对照组颅内攻毒一日龄幼鼠，攻毒剂量TCID50为106的JZ-WT野毒株，每只幼鼠20ul，每天称量幼鼠体重，观察其健康状况，直到第15天。
由图10可以看出，免疫JZ-P50的母鼠生的幼鼠在1日龄攻毒，15天的平均体重呈上升的趋势，而免疫阴性对照的母鼠生的幼鼠在1日龄攻毒，前六天体重逐渐上升，从第六天开始体重逐渐下降，直到第11天体重为0。说明在JZ-P50抗体的保护下，幼鼠体重未受到影响。
图11表示为被动免疫母鼠后幼鼠的存活率情况，从图中看出，免疫阴性对照的母鼠生的幼鼠从第七天开始出现死亡，到第11天全部死亡。而免疫JZ-P50的母鼠生的幼鼠在15天内没有死亡情况，说明在JZ-P50抗体的保护下，幼鼠未因野毒株的攻毒而死亡。表明CVB5减毒株具有良好的保护效力。
实施例8CVB5JZ-P50减毒株的遗传稳定性
将减毒株CVB5JZ-P50继续在Vero细胞中33℃和37℃培养至55代，测定55代毒株的感染性滴度，并与50代减毒株比较。如图12发现无论在33℃和37℃55代病毒滴度与50代相差不大。将55代的毒株以及JZ-WT野毒株注射一日龄幼鼠，另设阴性对照组。每只幼鼠接种106TCID50/20ul，观察7天幼鼠的临床特征，并选择5日龄的幼鼠进行解剖，观察部分组织病变程度。如图13，P55的幼鼠组织无论在颜色、形状、完整程度来看与阴性对照和JZ-P50组无明显差异。可表明该CVB5JZ-P50减毒株具有遗传稳定性。
综上所述，本发明制备出同时具有冷适应性和温度敏感性的CVB5减毒株，接种动物后，具有显著的减毒特性，以及良好的免疫原性、保护性和遗传稳定性，可用作人用减毒活疫苗的研究。

Claims (2)

1.一种柯萨奇病毒减毒株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒减毒株为柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株（Enterovirus coxsackie virus CVB5 JZ-P50），保藏编号为CCTCC No：V201858。
2.如权利要求1所述的柯萨奇病毒减毒株在制备柯萨奇病毒B组5型减毒活疫苗中的应用。
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