CN110628724A - 一种三型副流感病毒野毒株及其应用 - Google Patents

一种三型副流感病毒野毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种三型副流感病毒野毒株及其应用，所述野毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201911，所述野毒株具有HPIV‑3病毒的HN蛋白和F蛋白，所述野毒株在HPIV‑3病毒感染小鼠模型及HPIV‑3中和抗体检测实验中的应用，野毒株在制备用于预防三型副流感疫苗中的应用；本发明的三型副流感病毒野毒株为克隆纯化的高滴度无特定外源因子噬斑形成型的HPIV3LZ1728C19病毒株，通过该病毒制备的三型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗能够有效预防3型副流感病毒的感染。

Description

一种三型副流感病毒野毒株及其应用
技术领域
本发明属于三型副流感病毒领域，特别涉及一种三型副流感病毒野毒株及其应用。
背景技术
三型副流感病毒(Human parainfluenzavirus type 3，HPIV-3)是仅次于呼吸道合包病毒的引起婴幼儿下呼吸道严重疾病的病原体。主要引起一岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎。另外，HPIV-3还是导致老年人慢性病患者和免疫力低下成年人下呼吸道疾病的重要病因。HPIV-3的爆发每年都会出现，主要发生在春夏两季。在美国每年由于HPIV-3感染导致的住院人数估计最高可以达到3万人，造成了很大的疾病负担，在发展中国家，由HPIV-3造成的疾病负担虽没有具体数据，但由HPIV-3导致的下呼吸道感染疾病是引起婴幼儿死亡的重要原因。对于HPIV-3感染的预防和治疗，目前还没有特效的药物和疫苗，WHO将HPIV-3疫苗列为未来优先开发的疫苗。因此HPIV-3临床野毒株的分离对疫苗研究具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种三型副流感病毒野毒株及其应用。
一种三型副流感病毒野毒株，所述野毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201911。
进一步地，所述野毒株具有HPIV-3病毒的HN蛋白和F蛋白。
一种所述的野毒株在HPIV-3病毒感染小鼠模型及HPIV-3中和抗体检测实验中的应用。
一种所述的野毒株在制备三型副流感疫苗中的应用。
一种所述野毒株在制备三型副流感诊断制剂中的应用。
一种三型副流感疫苗，所述三型副流感疫苗中含有如权利要求1所述的三型副流感病毒野毒株。
进一步地，所述疫苗为三型副流感病毒减毒活疫苗、三型副流感蛋白亚单位疫苗或三型副流感基因工程疫苗。
进一步地，所述三型副流感疫苗还含有医学上可接受的载体或佐剂。
一种制备三型副流感HN蛋白亚单位疫苗的方法，其特征在于，
将权利要求1所述三型副流感病毒野毒株接种至WI-38细胞，得到高滴度的病毒培养液；
将所述病毒培养液离心后的上清液50％蔗糖密度超离心，弃上清，得到沉淀病毒；
取所述沉淀病毒用10％曲拉通X-100搅拌裂解，进行HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化，获得所述野毒株病毒的纯化HN蛋白；
将所述纯化HN蛋白与医学上可接受的佐剂结合制得三型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗。
进一步地，所述沉淀病毒搅拌裂解后还需进行透析平衡，所述透析平衡的透析液pH为7.2，所述透析液由0.1M磷酸钠和0.15M NaCl组成，所述沉淀病毒透析平衡后进行HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化。
进一步地，所述HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化包括以下步骤：
饱和硫酸铵对兔抗重组HN血清进行重复沉淀，沉淀物用蛋白A/G、IgG琼脂糖珠亲和层析纯化，得到纯化的HN IgG抗体；
将所述HN IgG抗体与活化琼脂糖凝胶进行偶联；
对偶联后的所述HN IgG抗体进行HN蛋白的亲和层析纯化，得到纯化的HN蛋白。
进一步地，所述医学上可接受的佐剂为Al(OH)3。
进一步地，所述HN亚单位疫苗含有HN蛋白和Al(OH)3的浓度为:(1.5ug HN蛋白+250ugAl(OH)3)/100ul/剂。
本发明的三型副流感病毒野毒株为克隆纯化的高滴度无特定外源因子噬斑形成型的病毒株，具有高滴度易规模培养的特性，且在小鼠动物模型中，通过该病毒制备的三型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗能够有效预防三型副流感病毒的感染。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了根据本发明实施例的HPIV3LZ1728病毒株在MA104细胞上的蚀斑；
图2示出了根据本发明实施例的外源因子检测引物的阳性验证结果；
图3示出了根据本发明实施例的HPIV3LZ1728C19病毒株在不同哺乳动物细胞中的增殖曲线；
图4示出了根据本发明实施例蔗糖密度超速离心纯化后HPIV3LZ1728C19病毒电镜照；
图5示出了根据本发明实施例蔗糖密度超速离心纯化后HPIV3LZ1728C19病毒的Wester-blotting(蛋白质免疫印迹)分析图；
图6示出了本发明实施例HPIV3LZ1728C19病毒在小鼠肺脏和鼻腔中的增殖曲线；
图7示出了本发明实施例HPIV3LZ1728C19病毒感染小鼠肺脏组织切片；
图8示出了本发明实施例HPIV3LZ1728C19病毒在MA104细胞上的
免疫荧光斑；
图9示出了本发明实施例HPIV3LZ1728C19病毒HN蛋白的亲和层析纯化结果；
图10示出了本发明实施例HN亚单位疫苗可以诱导HPIV-3中和抗体；
图11示出了本发明实施例HN亚单位疫苗对HPIV-3病毒感染具有保护作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种高滴度三型副流感病毒野毒株，分离自下呼吸道感染患儿痰标本的高滴度噬斑形成型HPIV-3野毒株，命名为HPIV3LZ1728C19，该野毒株与三型副流感病毒相同均属于副黏病毒科、呼吸病毒亚科(Paramyxoviridae family,Respirovirussubfamily)。
HPIV3LZ1728C19毒株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2019年02月27日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号：CCTCC NO:V201911。
本发明分离纯化的三型副流感病毒野毒株HPIV3LZ1728C19能够建立HPIV-3感染小鼠动物模型，可以引起小鼠肺部炎症，且病理进程与HPIV3LZ1728C19病毒在肺组织的增殖曲线一致，可用于评价HPIV-3疫苗免疫保护效力。
本发明的HPIV3LZ1728C19野毒株，能够用于HPIV-3中和抗体滴度检测噬斑减少实验和HPIV-3中和抗体滴度检测免疫荧光斑减少实验中。
以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但本发明包括但不限于下述实施例。
实施例1 HPIV-3野毒株的分离和纯化
1、HPIV-3野毒株的分离
候选毒株要具有完整的记录、历史、来源。测定候选毒株的生物学特性，候选病毒株制备的减毒活疫苗和亚单位疫苗应当具备病毒产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、生物学特性稳定，并依据流行病学和分子流行病学选择的，在当前和今后具有广泛流行潜力的病毒株。
病毒来源：甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物。
病毒株分离：将所取分泌物0.5ml加入3ml的DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium，含各种氨基酸和葡萄糖)培养基，涡旋震荡2min，吸入1.5ml离心管，在12000rpm下离心20min，将离心后的上清液进行除菌过滤，再接种至生长有人胚肺二倍体细胞WI-38的6孔板中，所用培养液为含25ug/ml Plasmocin(支原体清除试剂)的DMEM培养基，连续传代5次，RT-PCR检测，取HPIV-3呈阳性的培养孔，用噬斑法检测病毒滴度，取滴度高于106pfu/ml的HPIV-3阳性孔，进行噬斑克隆纯化。将阳性、高滴度病毒株的分离出的结果标称为HPIV3LZ1728标本，且该标本的滴度检测为7.8×108pfu/ml，继续进行噬斑克隆。
2、克隆纯化：用噬斑法对分离出的病毒株进行克隆纯化。
取分离标本HPIV3LZ1728阳性培养的上清液进行10倍系列稀释，稀释倍数从10-1至10-8倍。分别接种至生长有MA104细胞、WI-38细胞和Vero细胞6孔板上，10-3至10-8每个稀释度接种1孔，每孔接种1ml，接种完成在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2小时，摈弃上清液，每孔加入DMEM配制的0.8％低熔点琼脂糖3ml，室温下凝固后，倒置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养4天。加入含有中性红的DMEM配制的1％低熔点琼脂糖，室温凝固，倒置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时。
观察蚀斑，结果为：分离的标本HPIV3LZ1728在MA104细胞上有蚀斑形成，在WI-38和Vero细胞上无蚀斑形成。HPIV3LZ1728在MA104细胞上有蚀斑形成结果如图1所示。
在MA104细胞的高稀释度孔中挑取蚀斑，接种于24孔板同种细胞上，37℃、5％CO2细胞培养箱培养7天。由于在WI-38细胞上无蚀斑形成，则盲挑蚀斑接种于24孔板同种细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱培养7天。Taqman探针Real-Time RT-PCR法检测病毒滴度，挑选高滴度HPIV-3阳性孔进行再次克隆。重复克隆5次，挑取6个滴度最高的克隆毒株进行外源因子检测。
3、外源因子的检测：
用nest-RT-PCR(巢式RT-PCR)方法测定纯化后克隆毒株中的鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、H1N1甲型流感病毒、H2N3甲型流感病毒和乙型流感病毒，用nest-PCR(巢式-PCR)方法检测克隆毒株中的支原体。检测引物由本实验室自行设计引物序列见表1，并通过阳性培养物验证见图2。
表1.外源因子检测引物序列
通过图2可知，检测结果为：所有克隆株除支原体外，检测的其余5种外缘因子均为阴性。因此还需要去除克隆病毒株中的支原体。
4、支原体的去除：
选取6个高滴度克隆纯化的HPIV3LZ1728病毒株，以0.05MOI接种至WI-38细胞上，所用培养基为含有10ug/ml Plasmocin(支原体清除试剂，货号：ant-mpt)的DMEM培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中培养7天。提取培养液内的RNA，TaqMan探针Real-Time RT-PCR法测定病毒滴度。再提取病毒培养液DNA，并用nest-PCR(巢式PCR)测定病毒培养液的支原体。以相同的MOI传代直至支原体检测阴性。
传代结果：经过在含有10ug/ml Plasmocin的DMEM培养基中传代13代后，6个克隆株支原体检测均为阴性，挑取滴度最高的一个克隆株，命名为HPIV3LZ1728C19，进行后续试验。
1.5、最适宿主细胞的确定：
采用T25细胞培养瓶进行WI-38、MA104和Vero细胞计数：将100％铺满的上述三种细胞，用含EDTA(乙二胺四乙酸)的2.5％胰酶消化1-2分钟，用含有10％胎牛血清的DMEM培养液吹打分散，用Casy细胞计数仪计数细胞总量。
HPIV3LZ1728C19病毒的接种：按照0.05MOI分别接种至生长有WI-38细胞、MA104细胞和Vero细胞的T25细胞瓶内，在37℃、5％CO2下孵育2小时，摈弃上清液后，每瓶加入10ml细胞培养液，继续在37℃、5％CO2的细胞培养箱培养。
HPIV3LZ1728C19病毒增殖曲线的测定：在接种后每天取T25细胞瓶内的培养上清液150ul，直到90％细胞脱落。用噬斑法测病毒滴度，绘制病毒滴度-时间曲线。
结果如图3所示，即HPIV3LZ1728C19病毒株在WI-38、Vero和MA104细胞上均可以高滴度增殖。由图3可知，在MA104细胞上培养7天，病毒滴度最高可以达到108-109pfu/ml；在WI-38、Vero细胞上培养7天，病毒滴度无显著性差异，均可以达到106-107pfu/ml。
因此本实施例培养的HPIV3LZ1728C19病毒株与WI-38、MA104和Vero细胞上均能够较好的结合，且在MA104细胞上繁殖能力最佳。
实施例2病毒滴度测定
用噬斑法测定病毒滴度
HPIV3LZ1728C19病毒10x系列稀释，接种6孔板MA104细胞，上37℃、5％CO2培养箱培养2小时，吸出上清液，加入0.8％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后，倒置于37℃、5％CO2培养箱培养72小时，加入含有中性红的1％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后37℃、5％CO2培养箱过夜，观察出斑，以出现噬斑的最高稀释度为病毒滴度。
通过噬斑法测定得到的病毒最高滴度为109pfu/ml，由此可知，HPIV3LZ1728C19病毒能够通过细胞培养获得较高的病毒滴度。
实施例3 HPIV-3病毒培养液的大量制备和纯化
1、HPIV-3病毒培养液的制备。
将克隆纯化去除特定外缘因子的HPIV3LZ1728C19病毒株以0.05MOI接种WI-38细胞，在37℃、5％CO2培养箱培养7天，收集培养上清液，检测病毒滴度，-80℃冻存。
2、采用超速离心法对HPIV-3病毒进行纯化。
HPIV3LZ1728C19病毒培养液在8000rpm、4℃下离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清液。取30ml上清加入到50ml专用离心管中，用8cm长针头从底部轻轻推入15ml、50％的蔗糖，注意保持界面清晰，放入超速离心机(型号：日立CP 70MX)内，在4℃、35000rpm下，超速离心4h，弃上清液；用无菌TNE Buffer(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液)重悬沉淀，测蛋白浓度，观察病毒形态，观察结果如图4所示，在电镜下可观察到150nm左右的病毒颗粒。
通过上述实验可知，HPIV3LZ1728C19病毒能够大量制备，且纯化后的病毒颗粒清晰明显，即HPIV3LZ1728C19病毒容易纯化获取。
实施例4 HPIV3LZ1728C19病毒外壳蛋白的鉴定及全长基因组序列的测定
1、HPIV3LZ1728C19病毒外壳HN蛋白和F蛋白的鉴定：
用Western-Blot(蛋白质免疫印迹)方法进行测定。超离心纯化的HPIV3LZ1728C19病毒蛋白首先进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶按照标准程序(SambrookJ，Fritsch EF，ManiatisT 1989)进行Western-blotting(蛋白质免疫印迹)分析。
特异性抗体为兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室自行制备的兔抗重组HPIV-3的HN蛋白和兔抗重组F蛋白多克隆抗体，按一定稀释度稀释后使用。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体(来源：Sigma公司)，按标示浓度使用。显色用Lumi-Light Western blotting substract(用于蛋白质印迹的化学发光过氧化物酶底物，来源：Roche120152000010)，凝胶成像仪(来源：GE公司)成像。
测定结果如图5所示：图中印迹1为HPIV-3病毒HN蛋白的多克隆抗体，印迹2为HPIV-3病毒F蛋白的多克隆抗体，印迹M为MagicMarkTM XP标准蛋白印迹；
超离心纯化病毒和重组HPIV-3HN蛋白抗体和重组F蛋白抗体在预期的分子量处出现了特异性反应条带。说明HPIV3LZ1728C19毒株具有HPIV-3病毒的HN蛋白和F蛋白。
2、HPIV3LZ1728C19毒株全基因组核苷酸序列的测定和分析：
采用二代基因测序法(具体过程上海伯杰医疗科技有限公司完成)。
结果表明：HPIV3LZ1728C19株全长基因组含有15402个核苷酸，通过核苷酸序列分析可知，该HPIV3LZ1728C19株符合副黏病毒科基因组"6碱基原则"，按照3'-NP-PP/C-M-F-HN-L-5'的顺序编码6种结构蛋白，基因结构与已知序列HPIV-3分离株相同。且与GenBank(DNA数据库)上3型人副流感病毒株——HPIV3/MEX/2545/2006(收录号：No.KF530250)同源性为99％，说明HPIV3LZ1728C19毒株的基因组具有人三型副流感病毒的遗传特征。
实施例5 HPIV3LZ1728C19感染小鼠动物模型的建立
1、小鼠麻醉，用水合氯醛麻醉：
14-16gSPF Balb/C的小鼠，腹腔注射5％水合氯醛100ul，待小鼠失去行动能力。
2、用HPIV3LZ1728C19病毒株鼻腔感染接种小鼠：
20ul克隆纯化HPIV3LZ1728C19病毒培养上清(lg滴度9.32)，用20ul移液器逐次滴加在麻醉小鼠鼻孔口，小鼠将其吸入鼻腔，每支鼠接种2×107pfu病毒。
3、感染小鼠上下呼吸道组织的收取：
于病毒接种感染后0、3、10、20、30天收取小鼠上下呼吸道标本。病毒感染小鼠眼球取血后，拉颈处死。用100ul灭菌PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤小鼠鼻腔，收集洗涤液。将小鼠浸泡于70％乙醇5分钟，无菌手术取出小鼠肺脏。
4、小鼠上下呼吸道病毒增殖曲线的测定：用噬斑法进行检测
4.1小鼠鼻腔洗液100ul，10x稀释后，用微型针式滤器除菌过滤，继续10x系列稀释，接种于6孔板MA104细胞，按照实施例2的方法检测小鼠鼻腔洗液中的病毒滴度。
4.2无菌摘取小鼠肺脏，称取100mg放入研磨管中，向其中加入200ulDMEN，研磨破碎组织，补加800ul DMEM，12000rpm离心20分钟，上清用微型针式滤器除菌过滤，取100ul滤出液10x系列稀释，加入6孔板MA104细胞，按照实施例2的方法检测小鼠肺组织中的病毒滴度。
测定结果：如图6所示，HPIV3LZ1728C19病毒株可以在小鼠鼻腔和肺脏中增殖。由图6可知在接种后第三天，小鼠上下呼吸道病毒负载量达到最高，后开始下降直到第10天到达最低，后维持在一定水平，但不能完全清除。
4.4 HPIV3LZ1728C19感染期间小鼠肺组织切片的制备和观察分析：切片制备由兰州大学基础医学院病理教研室完成。
分析结果：切片结果如图7所示，由图7可知与正常小鼠相比，HPIV3LZ1728C19感染小鼠肺脏出现明显的肺部炎症病变，包括肺泡和细支气管壁肿胀，肺泡和细支气管内充血和分泌粘性物质，以及巨噬细胞聚集等。而且病理进程与HPIV3LZ1728C19的增殖过程相一致。
结论：HPIV3LZ1728C19病毒株能够建立持续感染的小鼠动物模型，可用于HPIV-3疫苗免疫保护效力的评价。
实施例6 HPIV-3中和抗体检测蚀斑减少实验
1、HPIV3LZ1728C19病毒10×系列稀释，接种6孔板MA104细胞，上37℃、5％CO2培养箱培养2小时，吸出上清液，加入0.8％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后，倒置于37℃、5％CO2培养箱培养72小时，加入含有中性红的1％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后37℃、5％CO2培养箱过夜，观察出斑，以80％细胞出现蚀斑的病毒稀释度，作为病毒的工作稀释度。
2、将HPIV-3阳性血清4×系列稀释，与等体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，37℃下结合1小时。将结合血清的病毒接种于6孔板MA104细胞，37℃、5％CO2培养箱培养2小时，吸出上清液，加入1％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后，倒置于37℃、5％CO2培养箱培养72小时，加入含有中性红的1％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后于37℃、5％CO2培养箱过夜，观察出斑。血清稀释液(不含阳性血清)与等体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，接种MA104细胞作为mock对照。
3、与mock对照的蚀斑数相比，能使蚀斑数降低50％的血清稀释度为中和抗体滴度。
通过中和抗体检测蚀斑减少实验，HPIV3LZ1728C19病毒能够与HPIV-3阳性血清有效结合，使蚀斑数降低50％，说明HPIV3LZ1728C19病毒株能够为HPIV-3减毒活疫苗和组分疫苗的研制和HPIV-3疫苗中和抗体的检测提供重要基础。
实施例7 HPIV-3中和抗体滴度测定免疫荧光斑减少实验
1、HPIV3LZ1728C19病毒10×系列稀释，接种96孔板MA104细胞，37℃、5％CO2培养箱吸附2小时后，吸出上清液；
加入RIPM-1640培养液，37℃、5％CO2培养箱培养72小时，弃上清液，80％丙酮固定10分钟，弃丙酮后进行空气干燥；
加入适当稀释的兔抗重组HPIV-3HN蛋白抗体，37℃孵育1小时，PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗板，加入适当稀释的FITC-抗兔IgG二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板，荧光显微镜下观察荧光斑。
结果：荧光斑结果如图8所示，以80％细胞出现荧光斑的病毒稀释度，作为病毒的工作稀释度。
2、将HPIV-3阳性血清4×系列稀释，与等体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，37℃结合1小时；
接种于96孔板MA104细胞上，37℃、5％CO2培养箱吸附2小时，吸出上清液，加入RIPM1640培养液，37℃5％、CO2培养箱培养72小时，弃上清，80％丙酮固定10分钟，弃丙酮后进行空气干燥；
加入适当稀释的兔抗重组HPIV-3HN蛋白抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板，加入适当稀释的FITC-抗兔IgG二抗，37℃孵育1小时，PBST洗板，荧光显微镜下观察荧光斑；血清稀释液(不含抗体血清)与同体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，接种MA104细胞作为mock对照。
3、与mock对照的荧光斑数相比，能使荧光斑数降低50％的血清稀释度为中和抗体滴度。
通过中和抗体滴度测定免疫荧光斑减少实验，HPIV3LZ1728C19病毒株能够与现有HPIV-3抗体有效结合，降低荧光斑数，说明HPIV3LZ1728C19病毒株能够为HPIV-3疫苗免疫保护效力的评价及HPIV-3疫苗中和抗体的检测奠定重要基础。
实施例8三型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗的制备
1.病毒培养液的制备
取HPIV3LZ1728C19病毒株，0.05MOI接种WI-38细胞，37℃、5％CO2培养7天，得到高滴度的病毒培养液(滴度高于107pfu/ml)。
2.病毒培养液的蔗糖超离心纯化
培养液8000rpm离心40分钟，收集上清液，上清液加于50％蔗糖溶液上，保持界面清晰，35000rpm离心4小时，小心吸取上清丢弃，后用DMEM培养液重悬沉淀，测定沉淀物的蛋白浓度。
3.病毒的裂解
50％蔗糖超离心纯化后的病毒，加入TritonX-100(曲拉通X-100，聚乙二醇辛基苯醚)，至Triton X-100终浓度10％，4℃磁力搅拌12小时裂解病毒。将裂解液装入透析袋，于0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、pH7.2的环境中透析平衡。
4.HN抗体亲和柱的制备
4.1HN抗体的纯化
兔抗重组HN血清(滴度≥1:5000)10ml，加等量生理盐水稀释，电磁搅拌缓慢加入饱和硫酸铵至50％的饱和度；
4℃静置过夜，4000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀复溶于同体积去离子水中，边电磁搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵至30％饱和度；
4℃静置一小时，4000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀复溶于10ml去离子水中，30％饱和硫酸铵再沉淀一次；
弃上清，将沉淀复溶于4ml去离子水中，透析袋于生理盐水中透析去除硫酸铵，平衡于ProteinA/G IgG Bindingbuffer(蛋白A/G、IgG结合缓冲液，来源：Thermo Science)。用同一种ProteinA/G IgG Bindingbuffer平衡的ProteinA/G IgGAgarose(蛋白A/G、IgG琼脂糖珠)亲和层析纯化HN抗体，收集洗脱峰为纯化的HN IgG抗体。
4.2 HN IgG抗体和活化的琼脂糖凝胶的偶联
用Thermo Science的AmimolinkPlus Immobilization Kit(Amimolink Plus固定化试剂盒),按照说明书的实验程序完成。
4.3 HN蛋白的亲和层析纯化
HN抗体偶联亲和柱层析填材8ml，用0.1M sodium phosphate(磷酸钠)、0.15MNaCl、pH 7.2缓冲液平衡；
待流出液pH为7.2，用同样缓冲液平衡的20mg/2ml病毒裂解液上样，上样速度0.2ml/min，完成后闭柱1小时；
用同一缓冲液洗柱，直至流出液OD280下降至基线。0.1M pH为3.0的glycine-HCl(甘氨酸-盐酸)洗脱液洗脱，洗脱液收集到装有0.1M pH8.5Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)的收集管中，1ml/管，直至洗脱液OD280下降至基线。收集蛋白峰，测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳和WB(蛋白印迹)鉴定收集管蛋白。
测试及鉴定结果如图9所示，图9A为SDS-PAGE电泳结果，图9B为WB(蛋白印迹)鉴定结果。由图9可知：HN蛋白存在于洗脱峰中，总蛋白量3.6mg，灰度扫描显示HN蛋白纯度达到90％。
4.4 HN亚单位疫苗的免疫原性和保护效力的测定
4.4.1 HN蛋白亚单位疫苗的配制
HN蛋白和Al(OH)3(10mg/ml)混合，配成1.5ug HN蛋白+250ug Al(OH)3/100ul/剂，作为HN亚单位疫苗。
4.4.2 BalB/C小鼠的免疫
选取14-18gSPF级BalB/C小鼠45只，随机分为3组，每组15只。实验组，HN亚单位疫苗四肢肌肉注射，间隔4周相同剂量再注射一次。对照组，只注射250ugAl(OH)3/100ul/剂，空白组只注射PBS100ul/剂量。于第二次免疫接种后一周，将小鼠麻醉后，用HPIV3LZ1728C19鼻腔接种20ul攻毒。
4.4.3组织收集和检测
收集一次免疫前、二次免疫前、攻毒前小鼠的尾静脉血，蚀斑法检测中和抗体滴度。攻毒后三天杀死小鼠，取肺脏和鼻洗液检测HPIV3LZ1728C19病毒滴度。
检测结果如图10、11所示，由图10可知：实验组与对照组相比，HN蛋白亚单位疫苗诱导的中和抗体显著高于对照组(p<0.05)；由图11可知：攻毒后，实验组小鼠肺部病毒滴度显著低于对照组(p<0.05)。
表明HN蛋白亚单位疫苗在小鼠中对HPIV-3感染具有保护作用。
通过对三型副流感病毒野毒株的纯化，获得高滴度、易规模化培养的HPIV3LZ1728C19病毒株，再通过HPIV3LZ1728C19病毒株制备3型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗，能够有效预防3型副流感病毒的感染。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种三型副流感病毒野毒株，其特征在于，所述野毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201911。
2.根据权利要求1所述的野毒株，其特征在于，所述野毒株具有HPIV-3病毒的HN蛋白和F蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的野毒株在HPIV-3病毒感染小鼠模型及HPIV-3中和抗体检测实验中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的野毒株在制备三型副流感疫苗中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的野毒株在制备三型副流感诊断制剂中的应用。
6.一种三型副流感疫苗，其特征在于，所述三型副流感疫苗中含有如权利要求1所述的三型副流感病毒野毒株。
7.根据权利要求6所述的三型副流感疫苗，其特征在于，所述疫苗为三型副流感病毒减毒活疫苗、三型副流感蛋白亚单位疫苗或三型副流感基因工程疫苗。
8.一种根据权利要求6或7所述的三型副流感疫苗，其特征在于，所述三型副流感疫苗还含有医学上可接受的载体或佐剂。
9.一种制备三型副流感HN蛋白亚单位疫苗的方法，其特征在于，
将权利要求1所述三型副流感病毒野毒株接种至WI-38细胞，得到高滴度的病毒培养液；
将所述病毒培养液离心后的上清液50％蔗糖密度超离心，弃上清，得到沉淀病毒；
取所述沉淀病毒用10％曲拉通X-100搅拌裂解，进行HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化，获得所述野毒株病毒的纯化HN蛋白；
将所述纯化HN蛋白与医学上可接受的佐剂结合制得三型副流感病毒HN蛋白亚单位疫苗。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀病毒搅拌裂解后还需进行透析平衡，所述透析平衡的透析液pH为7.2，所述透析液由0.1M磷酸钠和0.15M NaCl组成，所述沉淀病毒透析平衡后进行HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述HN抗体交联琼脂糖亲和层析纯化包括以下步骤：
饱和硫酸铵对兔抗重组HN血清进行重复沉淀，沉淀物用蛋白A/G、IgG琼脂糖珠亲和层析纯化，得到纯化的HN IgG抗体；
将所述HN IgG抗体与活化琼脂糖凝胶进行偶联；
对偶联后的所述HN IgG抗体进行HN蛋白的亲和层析纯化，得到纯化的HN蛋白。
12.根据权利要求9或11所述的制备方法，其特征在于，所述医学上可接受的佐剂为Al(OH)3。
13.根据权利要求9或11所述的制备方法，其特征在于，所述HN亚单位疫苗含有HN蛋白和Al(OH)3的浓度为:(1.5ug HN蛋白+250ug Al(OH)3)/100ul/剂。
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