TWI638048B - 高成長腸病毒71型(ev71)病毒株及其疫苗 - Google Patents

高成長腸病毒71型(ev71)病毒株及其疫苗 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種用於提高哺乳動物疫苗產量的馴化腸病毒71型(EV71)疫苗株。該EV71疫苗株包含至少一個經修飾的腸病毒蛋白，可自哺乳動物宿主細胞(如Vero細胞)快速增殖EV71病毒。本發明亦關於一種從馴化之EV71病毒疫苗株產生的疫苗以及該疫苗的製造方法。

Description

高成長腸病毒71型(EV71)病毒株及其疫苗
本發明係關於一種分離出的腸病毒71型(EV71)疫苗株，尤其關於一種腸病毒71型(EV71)B5基因型疫苗病毒株，該病毒株可在哺乳動物宿主細胞(如Vero細胞)快速成長，以及誘導交叉反應中和抗其他基因型之EV71病毒之抗體效價。
腸病毒71型(EV71)與其他重要的人類病原體，如脊髓灰質炎病毒和鼻病毒，同屬於小核糖核酸病毒科腸病毒屬的正股RNA病毒。EV71最早在1969年分離自一患有神經系統疾病的美國病童，但依據近來的文獻回顧研究顯示，早在1963年EV71就已在荷蘭出現(Van Der Saden等人，2009年)。該EV71基因組轉譯為一有單一開放讀序框且接續有一多腺嘌呤序列段(poly A tract)之長聚蛋白，該單一多蛋白的5’及3’兩端均有未轉譯區，且可被分成三個不同的基因組區塊(P1、P2和P3)，其中P1基因可再分成VP1~VP4。
根據針對最易變VP1基因的親源分析，EV71可分為3個主要基因型組(A、B和C)，其中包括11個基因型(A、B1~B5和C1~C5)(Solomon等，2010年)。自1997年以來，不同基因型的EV71已經在馬來西亞、台灣、新加坡、汶萊、越南、 柬埔寨和中國等亞洲國家引發威脅生命的疾病，並造成嚴重的神經系統併發症。因此，開發EV71疫苗是這些國家的優先政策。
根據過去使用脊髓灰質炎滅活疫苗(IPV，即小兒麻痺滅活疫苗)的經驗，依IPV之法規管制策略，開發EV71全病毒滅活疫苗被認為是可行的。在1975年保加利亞的疫情後，有人在莫斯科依照IPV的類似製造方式製作了EV71全病毒候選滅活疫苗，並在1976年於保加利亞進行了評估，該EV71候選疫苗耐受性良好，且在1~4歲兒童身上產生免疫性。由於EV71沒有進一步爆發，並未針對該保加利亞候選疫苗更進一步評估其臨床療效，亦未開發效力分析法(potency assay)以量化疫苗抗原(黃氏等人，2011年)。
在此背景下，EV71滅活疫苗之前景可期，事實上已有5個候選疫苗在進行臨床試驗評估。目前，共計有5個候選疫苗分別在中國(3個候選疫苗在第三階段)、新加坡(1個候選疫苗在第一階段)、台灣(1個候選疫苗在第一階段)進行臨床試驗評估，如表1所列。
5個候選疫苗中有4個使用Vero細胞(生產人類疫苗常用的一種細胞株)，但病毒效價的峰值只能達到107TCID50/ml左右(Chou et al.2012；Liang et al.2012)。整體來說，這5個候選疫苗在可用於疫苗生產之細胞中的生長情況並不佳(~107PFU/ml)。此外，這5個候選疫苗的基因型包括B2(新加坡)、B4(台灣)，和三個C4(中國)的病毒株，並非目前在台灣和東南亞流行的B5基因型。
本發明係將B5基因型EV71疫苗病毒分離出來，並馴化成在使用無血清培養基的Vero細胞中可迅速生長。
因此，本發明一方面係關於一可在哺乳動物宿主細胞內快速成長且適合於增加哺乳動物宿主細胞之EV71疫苗產量之分離的B5基因型EV71疫苗病毒。
在某些實施例中，該分離的B5基因型EV71疫苗病毒包含一個以上之EV71基因，且該EV71基因可轉譯至少一經修飾之腸病毒蛋白以促進哺乳動物宿主細胞內之EV71病毒快速生長。較佳地，該腸病毒71型基因是分離及/或鑑定自一B5基因型的EV71病毒，如EV71 B5-141。
在某些實施例中，該分離出的B5基因型的EV71疫苗病毒包含至少一個位於選自P1-VP4、P1-VP1、P3-3A及P3-3D蛋白之EV71蛋白編碼序列變異。
另一個方面，本發明係關於一種EV71疫苗。該疫苗包 含本發明之分離自B5基因型的EV71疫苗病毒株及藥學上可接受之載體。
更進一步而言，本發明係關於一製備EV71疫苗的方法，亦提供可編碼一修飾EV71 B5蛋白之分離的核酸分子，及分離的修飾EV71 B5蛋白。本發明的其它面向、特徵和優點在下面的說明、關於本發明的詳細描述和申請專利範圍中，是顯而易見的。
圖1是使用無血清培養基(VP-SFM)在Vero細胞馴化高成長腸病毒71型的流程圖。
圖2是EV71 B5-141以及二Vero細胞馴化的病毒之蝕斑形態。圖2A顯示EV71 B5-141、4-2及6-5病毒在6孔培養盤的無血清培養基(VP-SFM)中Vero細胞上之蝕斑分析結果。圖2B顯示EV71 B5-141病毒、4-2及6-5在12孔培養盤的無血清培養基(VP-SFM)中Vero細胞上的免疫蝕斑分析結果。
下列實施例將進一步說明本發明的其它特徵和優點，惟該等實施例係為示例而用，並非對本發明的限制。
本文中「修飾病毒株」係指病毒株在哺乳動物宿主細胞通過連續繼代及/或親本病毒的選擇及其後代所獲得之病毒株。在本發明的一個實施例中，修飾病毒株在哺乳動物宿主細胞之病毒產量較親本病毒為高。
本文「腸病毒蛋白」係指由EV71病毒基因編碼的任何多肽或蛋白質。
本文「EV71病毒基因」可以是任何自EV71病毒分離及/或其相同之基因，該EV71病毒基因可以是由一B5基因型EV71病毒分離及/或其相同之基因。EV71 B5-141病毒基因組的核苷酸序列全長列於SEQ ID NO.2。
本文「修飾腸病毒蛋白」是指將一未修飾或一參考腸病毒蛋白之一個以上的胺基酸序列進行修飾。舉例而言，所述修飾包括插入、取代或刪除一未修飾或一參考腸病毒蛋白的胺基酸殘基。因此，該修飾腸病毒蛋白可以有一個以上的修飾胺基酸殘基及/或在一未修飾或參考蛋白上有特定位置之密碼子。
實驗例
高成長疫苗病毒在Vero細胞中之馴化
方法
細胞、培養基及病毒：依照標準程序(Wu等人，2001年、Huang等人，2010年)在人橫紋肌肉瘤(RD)細胞和非洲綠猴腎(Vero)細胞中培養腸病毒71型。
病毒學測定：病毒感染性效價測試係以50%的組織培養感染劑量(TCID50)觀測細胞病變效應(CPE)，並測定蝕斑形成單位(PFU)進行蝕斑分析(Huang等人，2010年)。亦包含一預先設定容許範圍的陽性對照組以進行TCID50及蝕斑分析。
病毒在細胞培養中之生長曲線測定：在6孔培養盤中培養EV71病毒，並在感染後的第1至6日取其上清液以測定病毒感染效價。此外，進行微載體細胞培養，以評估使用Vero細胞馴化之EV71病毒株作為疫苗種子病毒之效果。依據製造商的使用指南，將Cytodex 1微載體(GE Healthcare，美國)進行水合、高壓滅菌等 進行水合、高壓滅菌等預處理。Vero細胞在不同的培養條件下的生長曲線係以100毫升旋轉瓶(使用體積50毫升)測試，並對微載體進行取樣以計算每日之細胞密度。當細胞在微載體上長滿時，加入EV71病毒以感染細胞。
病毒顆粒的純化：疫苗抗原係以超速離心來純化，並使用SDS-PAGE，Western Blot和電子顯微鏡(Chia等人，2014年)來評估疫苗抗原的純度。
家兔之免疫原性研究：近來我們已開發了家兔模式，該模式可引發類似於EV71型感染幼兒之交叉反應中和抗體的情境(Chia等人，2014年)。家兔模式被用來評估Vero細胞馴化之疫苗病毒的免疫原性。
血清分析：使用實驗室方法，按照標準程序(Huang等人，2010年)測定EV71血清中和抗體效價。二倍稀釋的血清(1：8~1：512)，以及含有100TCID50EV71病毒株的病毒標準溶液，在一96微孔培養盤中以橫紋肌肉瘤細胞培養。在4~5天的培養後，在與倒置顯微鏡相連的監視器中可觀察到會導致細胞病變效應。中和效價在最高稀釋度時顯示可導致細胞病變效應減少50%。每個測試樣品之細胞對照、血清對照和病毒反滴定均同時進行。起始稀釋倍數為1：8，而血清陽性的截斷值設定為8。
實驗結果
如圖1所示，B5-141病毒是在2008年從20個月大的皰疹性咽峽炎患者的喉嚨拭子分離而得，該親本B5-141病毒不會在Vero細胞導致明顯細胞病變效應(CPE)，也不會在Vero細胞中形成明確的蝕斑。在Vero細胞23次繼代培養後，馴化的B5-141可以形成清晰的蝕斑，其後擇定其中兩個蝕斑(B5-141-4和B5-141-6)，分別為在Vero細胞中的第24繼代(B5-141-4)和第25繼代(B5-141-6)。
再經過一次蝕斑選擇及3次繼代培養後，進一步選擇二病毒株(B5-141-4-2和B5-141-6-5)，以產生病毒原液(圖1)。與親本B5-141病毒相較，B5-141-4-2和B5-141-6-5病毒可以形成非常明確的蝕斑，病毒效價達到高於108 PFU/ml(圖2)(表2)。
該二病毒原液之增殖效率係使用不同感染複數(MOI)對在24孔培養盤中的Vero細胞進行評估。如表3所示，B5-141-6-5病毒的高峰病毒效價在MOI 0.001和0.0001下皆超過108 TCID50/ml。
B5-141-6-5病毒的增殖效率係進一步使用搭配旋轉瓶之微載體-無血清Vero細胞培養系統進行評估。如表4所示，病毒效價可能在進行三次後平均值達到108 TCID50/ml，印證了B5-141-6-5病毒的商業化潛力。
EV71 B5-141-6-5疫苗抗原在家兔之免疫原性
藉由離心純化EV71 B5-141-6-5病毒顆粒，再以超速離心分離完整的與空的兩種病毒顆粒後，對完整病毒顆粒進行B5-141-6-5疫苗抗原在家兔之免疫原性評估。兩組家兔(每組兩隻)在第0天及第14天使用兩種劑量肌內注射免疫疫苗(總蛋白含量0.05和0.25微克)並使用明礬作為佐劑，收集第一次接種(第0天)、第一次接種後14日(第14日)及第二次接種後14日(第28日)之血清以評估中和抗體效價。
如表5所示，在第二次接種後14日(第28日)，兩組均可測得中和抗體效價，表示該疫苗抗原具免疫原性。
Vero細胞馴化的病毒之序列變異
為確認Vero細胞適應過程中發生的基因突變，針對B5-141、B5-141-4-2和B5-141-6-5進行完整的基因組測序和分析。以商業試劑盒(台灣桃園Geneaid)萃取病毒RNA，所萃取的病毒RNA以RT-PCR法(Promega，Madison,WI)進行擴增。倘有需要，可提供本研究使用的寡核苷酸引物序列供參。擴增的DNA則使用ABI 3730 XL DNA分析儀(Applied Biosystem Inc.,Foster City,CA)進行定序。
與親本B5-141病毒比較(EV71 B5-141的胺基酸長鏈及核甘酸序列的編碼分別在SEQ ID No.1和2中列出)，在B5-141-4-2和B5-141-6-5病毒檢測出5個和4個的核苷酸變化(表6)。因此，本發明分離的B5基因型EV71疫苗病毒包含至少一個位於選自P1-VP4(SEQ ID No.4)、P1-VP1(SEQ ID No.6)、P3-3A(SEQ ID No.8)及P3-3D(SEQ ID No.10)基因之基因變異。
<110> 財團法人國家衛生研究院
<120> 高成長腸病毒71型(EV71)病毒株及其疫苗
<130>
<150> 62/130,584
<151> 2015-03-09
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2193
<212> PRT
<213> Enterovirus 71
<400> 1
<210> 2
<211> 7415
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
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<212> DNA
<213> Enterovirus 71
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Claims (6)

  1. 一種分離的高成長B5基因型EV71疫苗病毒，包含位於對應EV71 B5之P1-VP4(SEQ ID No.3)蛋白的Thr7(T)被取代為Ala(A)、P1-VP1(SEQ ID No.5)蛋白的Thr802(T)被取代為Asn(N)或Pro811(P)被取代為Ala(A)之胺基酸殘基取代，其中該分離的B5基因型EV71疫苗病毒可在哺乳動物宿主細胞快速生長，並適用於增加EV71疫苗在哺乳動物宿主細胞之產量。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之分離的B5基因型EV71疫苗病毒，其中該分離的B5基因型EV71疫苗病毒包含：(a)一修飾腸病毒P1-VP4蛋白，其具有一位於對應EV71 B5蛋白(SEQ ID No.1)的胺基酸殘基Thr7之胺基酸殘基取代，其中該修飾腸病毒P1-VP4蛋白的Thr(T)被取代為Ala(A)；(b)一修飾腸病毒P1-VP1蛋白，其具有一位於對應EV71 B5蛋白(SEQ ID No.1)的胺基酸殘基Thr802之胺基酸殘基取代，其中該修飾腸病毒P1-VP1蛋白的Thr(T)被取代為Asn(N)；以及(c)一修飾腸病毒P1-VP1，其具有一位於對應EV71 B5蛋白(SEQ ID No.1)的胺基酸殘基Pro811之胺基酸殘基取代，其中該修飾腸病毒P1-VP1蛋白的Pro(P)被取代為Ala(A)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之分離的B5基因型EV71疫苗病毒，其中該分離的B5基因型EV71疫苗病毒包含： (a)一修飾腸病毒P1-VP4基因組，其具有一位於EV71 B5基因組(SEQ ID No.2)之核苷酸766之取代，其中該修飾腸病毒P1-VP4基因組的A被取代為G；(b)一修飾腸病毒P1-VP1基因組，其具有一位於EV71 B5基因組(SEQ ID No.2)之核甘酸3152之取代，其中該修飾腸病毒P1-VP1基因組的C被取代為A；(c)一修飾腸病毒P1-VP1基因組，其具有一位於EV71 B5基因組(SEQ ID No.2)之核甘酸3178之取代，其中該修飾腸病毒P1-VP1基因組的C被取代為G；(d)一修飾腸病毒P3-3A基因組，其具有一位於EV71 B5基因組(SEQ ID No.2)之核苷酸5097之取代，其中該修飾腸病毒P3-3A基因組的C被取代為T；或(e)一修飾腸病毒P3-3D基因組，其具有一位於EV71 B5基因組(SEQ ID No.2)之核苷酸7092之取代，其中該修飾腸病毒P3-3D基因組的A被取代為G。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之分離的B5基因型EV71疫苗病毒，其係被馴化為可在無血清培養基上的Vero細胞中快速生長。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之分離的B5基因型EV71疫苗病毒，其中該B5基因型EV71疫苗病毒係源自B5-141EV71病毒株(SEQ ID No.1)。
  6. 一種EV71疫苗，其包含如申請專利範圍第1項所述之分離的B5基因型EV71疫苗病毒，以及一藥學上可接受之載體。
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