CN116463296A - 猫细小病毒fpv cs-2016株及应用、疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品和预防兽医领域，具体涉及了猫小病毒FPV CS‑2016株及应用、含该株的疫苗组合物及其制备方法。一种猫泛白细胞减少症病毒CS‑2016株，保藏号为CCTCCNO:V202277。猫细小病毒FPV CS‑2016株经灭活后进行8‑12周龄幼猫免疫保护试验，结果表明，猫细小病毒FPV CS‑2016株，不仅安全性好，而且免疫效力试验中保护效率较高。证明该病毒株具有较好免疫原性，可用于该病的疫苗研究与开发。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品和预防兽医领域，具体涉及了猫细小病毒FPV CS-2016株及应用、疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
猫细小病毒(Feline Panleukopenia Virus，FPV)属细小病毒科细小病毒属，是已知的最古老的猫病毒性疾病，其引起的猫泛白细胞减少症是导致猫死亡的几种主要流行病之一。FPV感染猫科动物临床表现主要为呕吐、腹泻，血常规检测常见白细胞数明显减少，剖检能见肠道充血、出血现象。病毒直径20～24nm，无囊膜，基因组为单股DNA，基因组约为5000个碱基，包含两个主要的开放阅读框，表达非结构蛋白(NS1和NS2)和衣壳蛋白(包括VP1和VP2)。其中VP2蛋白的功能包括促进转铁蛋白受体结合、控制宿主范围和引发免疫反应，因此其编码基因常用于遗传进化特性分析及疫苗研发的关注重点之一。
目前国内没有猫细小病毒相关疫苗，旨在找寻国内猫细小病毒流行毒株，具有良好的免疫原性，可作为潜在的疫苗开发用毒株。
发明内容
本发明提供一种国内流行的了猫细小病毒FPV CS-2016株，该毒株对猫致病性强、致死率高，可引起典型的消化道症状(腹泻、呕吐等)；该毒株经灭活后具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可较好的刺激机体产生针对国内流行毒株CS-2016株的高水平中和抗体，对FPV的攻击能够提供较高的免疫保护率，并利用其毒价高，来探求实现产业化生产的可能性。
本发明解决上述技术问题本发明提供了：
一种了猫细小病毒FPV CS-2016株，保藏号为CCTCC NO:V202277。
进一步地，一种疫苗株，为猫杯状病毒毒株和所述的猫细小病毒毒株的组合，其中，所述猫杯状病毒毒株的命名为猫杯状病毒FCV LZ-2016株，于2022年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202276。
一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有疫苗上可接受的载体和所述的猫杯状病毒毒株、猫细小病毒毒株或其衍生病毒。
进一步地，所述疫苗组合物的原料包括所述病毒毒株的灭活病毒和佐剂。
所述疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将所述的猫细小病毒FPV CS-2016株和猫杯状病毒FCV LZ-2016株分别进行繁殖和培养，得到病毒原液；
步骤二、将步骤一所得病毒原液或其稀释液加入β-丙内酯用于灭活；
步骤三、灭活后的病毒液使用无菌PBS稀释，即得。
进一步地，步骤二中取病毒液原液或稀释液按0.1％的体积加入β-丙内酯，混合均匀后于4℃灭活24h，再37℃水解2h。
进一步地，步骤三中灭活后的猫细小病毒FPV CS-2016株和猫杯状病毒FCV LZ-2016株病毒液分别使用无菌PBS稀释至107.02TCID50/mL、109.02TCID50/mL，并分装后于4℃保存；将所制备的两种病毒的抗原液和无菌PBS按照1:1:1的体积配比混合，使得终体积为1mL，FPV CS-2016株抗原终浓度为106.5TCID50/mL、FCV LZ-2016株抗原终浓度为108.5TCID50/mL。
所述猫细小病毒FPV CS-2016株的以下任一应用：
(1)用于制备疫苗；
(2)用于制备猫细小病毒感染以及由其感染所致相关疾病的诊断试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的猫细小病毒FPV CS-2016株，采用F81贴壁型细胞同步接毒后培养，2％新牛血清DMEM培养基于37℃、5％CO2条件下培养，病毒滴度可达107.5TCID50/mL。克隆纯化后的CS-2016株在常规上述培养条件下培养后所得病毒液，以口服的方式攻毒13-16周龄健康易感猫和成年猫(血清FPV中和抗体＜1:2；肛拭子PCR检测FPV阴性；未注射过FPV相关疫苗)，13-16周龄试验猫均有不同程度的FPV感染，且105.0TCID50/mL亦有3/5试验猫出现猫泛白细胞减少症相关症状；而成年猫虽然对CS-2016株攻毒存在一定的抗性，但在病毒攻毒滴度提升至108.0TCID50/mL时，有3/5试验猫死亡，5/5试验猫出现猫泛白细胞减少症相关症状(腹泻、呕吐、白细胞显著减少等)；
2、本发明提供的猫泛白细胞减少症毒株CS-2016株经灭活后进行安全性试验结果显示：当灭活病毒含量107.0TCID50/mL时，单剂量接种、单剂量重复接种及超剂量接种后的试验猫均表现为采食、饮水正常，体温于正常范围内波动(37.5℃-39.5℃)，注射部位未见不良反应，5/5健活。表明安全性良好；
3、本发明提供的猫细小病毒FPV CS-2016株经灭活后进行有效性试验结果显示：105.5TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒的3/5体温、精神、饮食、粪便未见异常，2/5试验猫出现轻微腹泻、呕吐、白细胞下降等临床症状，其中1/5死亡；106.0TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒的4/5体温、精神、饮食、粪便未见异常，1/5试验猫出现轻微腹泻、呕吐、白细胞下降等临床症状；106.5TCID50/mL和107.0TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒体温、精神、饮食、粪便均未见异常，5/5存活；注射PBS缓冲液的非免疫攻毒对照组攻毒后5/5表现为腹泻或呕吐，5/5死亡，试验猫死亡前体温降低、白细胞数降低至不正常范围或检测不到(正常范围：2.87-17.02×109个/L)；空白对照组未见任何异常。表明当抗原含量不低于106.0TCID50/mL时，可对试验猫起到较好的保护作用，其激活的抗体水平亦不低于1:100。说明CS-2016株病毒免疫原性良好。
4、本发明所述的猫杯状病毒LZ-2016株，具有较高的病毒滴度，该毒株对健康易感猫的致病性强，可引起典型的口腔溃疡和结膜炎等症状；该毒株的灭活制品免疫猫可产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可较好的刺激机体产生针对FCV的高水平中和抗体，对FCV攻击能够提供较高的免疫保护率，具备开发疫苗的基本潜质。将该病毒株制备成疫苗可用于猫杯状病毒防治，为我国猫杯状病毒的防控提供重要的疫苗毒株源，以实现猫杯状病毒的有效防控。
5、本发明的疫苗组合物可一次接种有效免疫两种病毒的感染。
附图说明
图1是正常贴壁的F81细胞；
图2是CS-2016株肛拭子病料F81细胞盲传20代中第1、5、10、20代PCR检测；
图3是CS-2016株分离克隆纯化后蔗糖梯度稀释电镜观察图；
图4是FPV CS-2016株与13株NCBI数据库中的毒株核苷酸同源性分析；
图5是FPV CS-2016株与13株NCBI数据库中的毒株遗传进化图；
图6是各攻毒试验组试验猫腹泻情况；
图7是各试验组具有临床症状试验猫解剖后肠道俯瞰图；
图8是各试验组眼观病变肠道组织病理学观察HE染色切片图；
图9是FPV CS-2016株对成年猫毒力试验结果；
图9中A：CS-2016株107.0TCID50/mL攻毒组；B：CS-2016株108.0TCID50/mL攻毒组；C：对照组
图10是FPV CS-2016株对成年猫攻毒后肠道组织剖检观察；
图10中A：107.0TCID50/mL CS-2016株攻毒组；B：108.0TCID50/mL CS-2016株攻毒组；C：对照组
图11是CS-2016株对成年猫攻毒后肠道组织病理学观察；
图11中A：107.0TCID50/mL CS-2016株攻毒组；B：108.0TCID50/mL CS-2016株攻毒组；C：对照组；
图12是FCV LZ-2016株在F81细胞上培养的CPE观察结果(A为FCV LZ-2016株接种24h后的F81细胞，B为正常的F81细胞)；
图13是疑似感染样品RT-PCR鉴定结果(泳道M为DL2000 Marker，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为FCV LZ-2016株ORF3扩增产物)；
图14是FCV LZ-2016株的蔗糖超速离心浓缩纯化及电镜观察结果(A为FCV LZ-2016株不同蔗糖层超速离心浓缩结果，B为FCV LZ-2016株电镜观察结果)；
图15是FCV LZ-2016株全基因组RT-PCR扩增结果(泳道M为DL5000 Marker，泳道1为阴性对照，泳道2为FCV LZ-2016株Q1段PCR产物，泳道3为FCV LZ-2016株Q2段PCR产物，泳道4为FCV LZ-2016株Q3段PCR产物)；
图16是FCV LZ-2016株全基因组核苷酸的同源性分析；
图17是FCV LZ-2016株衣壳蛋白氨基酸的同源性分析；
图18是FCV LZ-2016株全基因组核苷酸的进化树分析；
图19是FCV LZ-2016株对试验猫攻毒结果(A、E为LZ-2016株107.0TCID50/mL攻毒组；B、F为LZ-2016株108.0TCID50/mL攻毒组；C、G为LZ-2016株109.0TCID50/mL攻毒组；D、H为对照组)；
图20是FCV其余流行分离毒株的RT-PCR鉴定(泳道M为DL2000 Marker，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为FCV BJ-2015株ORF3扩增产物，泳道4为FCV LY-2017株ORF3扩增产物，泳道5为FCV QD-2017株ORF3扩增产物，泳道6为FCV SH-2016株ORF3扩增产物，泳道7为FCV HZ-2015株ORF3扩增产物，泳道8为FCV JN-2014株ORF3扩增产物)；
图21是二联灭活疫苗二免后7天、14天、21天、28天试验猫血清中和抗体水平图；
图22是二联灭活疫苗单剂量组和超剂量组免疫后体温变化图；
图23是二联灭活疫苗单剂量重复组免疫后体温变化图。
具体实施方式
本发明所述“每头份”或“/头份”是指每只猫每次所用疫苗剂量。未作特别说明指出，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”均为1mL。
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1猫细小病毒的获取、鉴定与测试
一分离毒株
2016年8月，用无菌棉拭子采集湖南长沙临床疑似感染猫的肛拭子。进行12000rpm离心10min，然后将上清吸取出来用0.22μm滤器过滤直接除菌。将过滤的上清按1％的体积比接种到F81细胞中持续培养，每日观察，出现细胞病变即及时收毒。将样品处理后，根据OMEGA Viral DNA Kit操作手册提取DNA，-15℃以下保存备用。根据GenBank登录的FPV基因组序列设计一对特异性引物，扩增FPV VP2基因保守区(表1)，引物序列为：
上游引物F：5’－CAAATAGAGCATTGGGCTTACC－3’
下游引物R：5’－TCGGGTGTTTCTCCTGTTGTAG－3’
扩增片段大小为345bp。
表1 PCR反应体系
反应条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃30s，54℃30s，72℃30s；35个循环后72℃延伸10min。产物4℃保存待检。
用含2％血清的DMEM将分离的FPV作连续10倍稀释(从10-1至10-8)，将每个稀释度的病毒液同步接种于F81细胞的6孔细胞培养板，每个稀释度接种2孔，于37℃、含5％CO2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，覆盖含2％血清、0.8％低熔点琼脂糖的无酚红DMEM，于37℃、含5％ CO2培养箱中继续培养3-5天，在显微镜下看到明显的空斑出现后，用0.1‰的中性红于37℃染色1h，吸弃染色液，挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，同步接种于F81细胞的24孔细胞培养板，于37℃、含5％ CO2培养箱吸附1h后补加0.8mL细胞维持液，于37℃、含5％CO2培养箱中培养至完全发生病变后，收集病变的细胞培养物，冻融3次后，测定各克隆毒的TCID50，选择毒价高的克隆毒株如上述操作再纯化2次，随后得到纯净的FPV毒，命名为FPVCS-2016株。
二日常培养毒株
在细胞培养瓶中贴壁培养F81细胞，待长满单层后使用0.25％胰酶进行消化收集备用，以2％新牛血清细胞维持液按细胞瓶适宜培养体积稀释F81细胞至(4.5-5.0)×106个/mL后加入细胞培养瓶，按0.01MOI接种猫细小病毒FPV CS-2016株，接毒后每24h进行细胞病变(CPE)的观察，当出现明显眼观细胞病变时(96h～120h)，收获病毒液。
将液氮罐内冻存的F81细胞37℃水浴1min快速融化，1000rpm离心后弃上清，用1mL10％新牛血清DMEM细胞培养液重悬细胞，缓慢加入至T25方瓶内并补充4mL 10％新牛血清DMEM细胞培养液，37℃、5％ CO2条件下进行细胞贴壁培养24-48h。待细胞长满单层，使用0.25％胰酶进行消化并收集细胞，按(5-6)×105个/mL的细胞密度(补足10％新牛血清DMEM细胞培养液后的密度)于37℃、5％ CO2条件下进行细胞贴壁扩大培养24-48h。
在EP管中用无血清DMEM将病毒液作连续10倍稀释，从10-1至10-8。弃去96孔板中长满60％左右F81细胞的培养液，将稀释好的病毒液(10-4至10-8)接种到上述96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔100μL，然后补加100μL/孔2％新牛血清DMEM细胞维持液。设8孔正常细胞对照，吸弃培养液后，每孔加入200μL 2％新牛血清DMEM细胞维持液。将上述96孔培养板置37℃、含5％ CO2条件培养6日镜下观察细胞病变(CPE)，统计每个稀释度病毒接种细胞孔中FPV细胞病变的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID50。结果显示，每毫升病毒液不低于107.02TCID50/mL。
三猫细小病毒FPV CS-2016株病毒液制备及疫苗的制备
1.毒种繁殖
使用10％新牛血清DMEM细胞培养液将贴壁型F81细胞以0.5×106.0-1.0×106.0个/mL的密度(图1)、5mL的终体积稀释并接种于T25细胞培养瓶中，于37℃、5％ CO2培养箱中培养24-48h，待长满单层后加入0.25％胰酶溶液消化细胞，并扩大至T75细胞培养瓶中，随后使用15mL 2％新牛血清DMEM细胞维持液重悬并按0.01MOI接种猫细小病毒FPV CS-2016株，37℃、5％ CO2条件下继续培养，96-120h收获病毒液，观察细胞病变测定病毒含量、PCR检测纯净性，符合规定后定量分装，于-70℃以下保存。
2.病毒液制备
将T75细胞培养瓶中长满单层的F81细胞弃去培养液，使用0.25％胰酶溶液消化后收集细胞并扩大至T175细胞培养瓶中，随后使用50mL 2％新牛血清DMEM细胞维持液重悬并按0.01MOI接种猫细小病毒FPV CS-2016株，37℃、5％ CO2条件下继续培养，96-120h收获病毒液，观察细胞病变计算病毒含量。
3.疫苗的制备
①灭活：将收获后的病毒液原液或稀释液按0.1％的体积加入β-丙内酯，混合均匀后于4℃灭活24h，然后37℃水解2h。
②无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
③灭活检验：取灭活后的抗原做无菌检测及将灭活液按0.01MOI接种于贴壁型F81细胞，置37℃、含5％ CO2条件培养观察6日，并再继续盲传2代，通过CPE观察确定是否灭活成功。
④疫苗制备：将上述已知抗原含量的抗原液使用无菌PBS稀释至105.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL、106.5TCID50/mL和107.0TCID50/mL，按1mL的规格分装后于4℃保存备用。
四猫细小病毒FPV CS-2016株的分离与鉴定
1.猫细小病毒鉴定
将PCR检测为阳性的CS-2016株的病料处理后接种F81细胞进行盲传20代，并通过PCR对第1、5、10、20代进行检测，结果病料盲传20代后均能检测到大小约345bp的特异性片段(图2)，说明分离的病毒具备感染性且可持续传代。
2.猫细小病毒的分离
将分离毒株CS-2016株进行空斑纯化，同时为了尽量减少病毒的传代次数，对病毒均选择了低代次病毒第3代用于空斑纯化。在第一轮空斑纯化时挑取了15个克隆毒株，接种24孔板培养的细胞后选取病变典型的克隆毒测定了病毒含量，以病毒含量高的克隆毒再进行下一轮空斑纯化，如此共纯化3次(表2)。通过3次纯化最终获得了纯化的猫细小病毒FPVCS-2016株。
表2 CS-2016株三次纯化中所挑取的15个克隆孔病毒滴度
3.猫细小病毒FPV CS-2016株克隆纯化株的微观形态观察
将CS-2016株克隆毒株的F6代细胞培养物扩大培养后进行超离纯化，将纯化的样品进行透射电镜观察。取20％-35％蔗糖之间的分层处的样品在电镜下可见直径大约在20-24nm呈等轴对称二十面体结构病毒粒子，其形态及大小与文献报道的FPV一致(图3)。
4.克隆纯化毒株FPV CS-2016株分子遗传进化分析
参照GenBank上登录的FPV基因组序列，设计引物，分段扩增病毒基因组的各段，引物序列见表3。对扩增的各片段分别进行测序，并用Seqman软件拼接成全基因组序列，用DNAstar和MEGA7.0分析国内外多株不同地方FPV分离株的同源性及亲缘关系(FPV_IZSSI_42807_15株(2019株)、FPV_IZSSI_3201_1_15株(2019株)、19R124C/TH/2019株(2019)、TN/FPV/2018株(2018株)、FPV/River otter/OTVI-3/BC_2019株(2019)、FPV/American mink/MIVI-21/BC_2017株(2017)、FPV/Raccoon/RC18/BC_2016(2016)、HH-1/86株(2016)、HRB-CS1株(2015)、HN-ZZ1株(2016)、GX01株(2018株)、MG132167A(2016株)、TH091305(2014株)共13株参考毒株)。
表3 FPV全基因组扩增引物
猫细小病毒FPV CS-2016株的VP2基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，结果显示国内FPV流行毒株CS-2016株与13株参考毒株核苷酸同源性介于98.8％-99.3％(图4)，结合遗传进化树分析可得(图5)，其中与2016年分离自意大利的FPV_IZSSI_3201_1_15毒株同源性最高(99.3％)，虽然处于同一大进化分支，却属于不同的次级分支。总的来说，CS-2016株与国外大多数毒株处于同一进化分支，说明近年来国内流行毒株可能逐渐被国外毒株替代。
微生物保藏
本发明将所分离得到的猫细小病毒FPV CS-2016株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CCTCC NO:V202277；分类命名为：猫细小病毒FPV CS-2016株；保藏时间是：2022年9月15日：保藏单位是：中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。
五猫细小病毒FPV CS-2016株毒力试验
1.13-16周龄健康易感猫毒力试验
13-16周龄健康易感猫共20只，每组5只，随机分成4组。第1-3组分别以105.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL和107.0TCID50/mL三个不同剂量经口服感染FPV CS-2016株病毒液，1.0mL/只；第4组为对照组。于感染后观察试验猫的临床表现，共观察14天。
结果表明用FPV CS-2016株感染13-16周龄健康易感猫后2-3天试验猫均出现持续性的精神沉郁，其中105.0TCID50/mL攻毒组有3只猫(3/5)试验猫出现呕吐、腹泻或死亡的症状，部分试验猫因腹痛而表现弓背伏卧状态；106.0TCID50/mL和107.0TCID50/mL攻毒组全部(5/5)试验猫出现呕吐、腹泻或死亡的症状。对照组试验猫均正常。试验猫眼观病变观察及病理学观察如图6-8所示。
2.成年猫毒力试验
将病毒含量为107.0TCID50/mL、108.0TCID50/mL的FPV CS-2016株口服感染成年猫，1.0mL/只。健康成年猫共15只，每组5只，随机分成3组。第1组经口服感染107.0TCID50/mL CS-2016株病毒液，1.0mL/只；第2组经口服感染108.0TCID50/mL CS-2016株病毒液，1.0mL/只；第3组为对照组。于感染后观察试验猫的临床表现，共观察14天。
结果107.0TCID50/mL攻毒组中感染FPV CS-2016株成年猫中，3/5试验猫在攻毒后2-3日出现精神沉郁，其中有2只猫第3-4日出现腹泻；108.0TCID50/mL攻毒组中感染FPV CS-2016株的成年猫中，5/5试验猫于攻毒后1-2日出现精神沉郁，4/5试验猫第3-5日出现腹泻、呕吐临床症状，并且3/5试验猫最终死亡；对照组试验猫无明显症状。
六猫细小病毒FPV CS-2016株灭活疫苗安全性试验
1.选用对猫细小病毒检测为阴性和猫细小病毒中和抗体不高于1:2的8-12周龄幼猫，共计20只。
2.将试验猫随机分为4组，每组5只，组1颈部皮下注射实施例2制备的抗原含量107.0TCID50/mL的灭活苗各1头份/只(单剂量组)；组2颈部皮下注射2头份/只(超剂量组)；组3于试验开始时注射1头份，2周后进行重复1头份接种(单剂量重复组)；组4不做任何处理(空白对照组)。单剂量组、超剂量组连续观察2周；单剂量重复组和空白对照组连续观察4周。在免疫前2日进行基础体温的监测，免疫后继续每日监测体温，时间与临床观察日数相同。
3.结果：单剂量组、超剂量组和单剂量重复组与对照组比较均表现为采食、饮水正常，体温于正常范围内波动(37.5℃-39.5℃)，注射部位未见不良反应，5/5健活。
以上试验结果表明，本发明提供的猫泛白细胞减少症灭活疫苗的安全性良好。
七猫细小病毒FPV CS-2016株的免疫原性试验
1.试验方案
(1)选取8-12周龄猫细小病毒中和抗体效价不高于1:2的幼猫25只，随机分成5组(组1、组2、组3、组4和组5)，每组5只猫，组1、组2、组3和组4分别免疫实施例2制备的抗原含量依次为105.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL、106.5TCID50/mL和107.0TCID50/mL的灭活苗1头份/只，组5颈部皮下注射相同量的无菌PBS缓冲液作为对照组，分别于免疫后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天采血，测定其中和抗体水平。
(2)选取8-12周龄猫白细胞减少症病毒中和抗体效价不高于1:2的幼猫30只，随机分成6组(组6、组7、组8、组9、组10和组11)，每组5只猫，组6至组9分别免疫实施例2制备的抗原含量依次为105.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL、106.5TCID50/mL和107.0TCID50/mL的灭活苗1头份/只作为免疫攻毒组，组10颈部皮下注射相同量的无菌PBS缓冲液作为非免疫攻毒对照组，组11不做任何处理作为空白对照组，免疫14天后，组6、组7、组8、组9和组10分别口服猫细小病毒1mL/只，病毒含量为107.0TCID50/mL，攻毒后每日监测体温、每3日采血检测血液内白细胞水平、每日观察临床表现。所有试验猫于攻毒后14日处死并解剖观察。
2.试验结果
结果表明在免疫后14天中和抗体水平最高，且中和抗体高水平可以维持到35天(免疫猫三联灭活疫苗周龄)。105.5TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒的3/5体温、精神、饮食、粪便未见异常，2/5试验猫出现轻微腹泻、呕吐、白细胞下降等临床症状，其中1/5死亡；106.0TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒的4/5体温、精神、饮食、粪便未见异常，1/5试验猫出现轻微腹泻、呕吐、白细胞下降等临床症状；106.5TCID50/mL和107.0TCID50/mL免疫猫细小病毒灭活疫苗试验猫14天后攻毒体温、精神、饮食、粪便均未见异常，5/5存活；注射PBS缓冲液的非免疫攻毒对照组攻毒后5/5表现为腹泻或呕吐，5/5死亡，试验猫死亡前体温降低、白细胞数降低至不正常范围或检测不到(正常范围：2.87-17.02×109个/L)；空白对照组未见任何异常。试验数据见表4和表5。
表4 8-12周龄幼猫免疫猫细小病毒灭活疫苗后针对猫细小病毒FPV CS-2016株的中和抗体水平
表5 8-12周龄幼猫免疫猫细小病毒灭活疫苗及未免疫攻毒保护率
以上试验结果表明，当CS-2016株灭活疫苗抗原含量高于106.0TCID50/mL时，免疫8-12周龄幼猫1头份/只后能够产生针对我国猫泛白细胞减少症流行毒株CS-2016株的中和抗体，免疫后14天可至少保护4/5试验猫免受猫细小病毒的感染。
本实施例提供的猫细小病毒FPV CS-2016株，分离自猫泛白细胞减少症感染后死亡猫肠道组织，是我国流行的强毒野毒株(感染后引起急性死亡，而现有的毒株感染后3天左右开始出现死亡)，经分离纯化后，于F81细胞上增殖滴度较高，变异性小。收获的病毒液经β-丙内酯灭活后，具有安全性良好、免疫原性较好等优点，可以有效防止8-12周龄幼猫感染猫细小病毒FPV CS-2016株。其作为一株潜在的疫苗制备的猫细小病毒可为FPV的防控提供有效手段。
实施例2猫杯状病毒LZ-2016株的获取、鉴定与测试
一.分离毒株
2016年5月，用无菌棉拭子采集广西柳州市临床疑似感染猫的上呼吸道拭子。将拭子加1mL PBS缓冲液溶解5min,3000r/min离心10min，将棉拭子弃去，样品3000r/min离心10min，取上清后加入等量的DMEM营养液，用0.22um滤器过滤除菌，接种至长满单层的F81细胞，置37℃ 5％ CO2培养箱中培养，每日观察，出现细胞病变即及时收毒，接种第1代即出现明显病变，传至第3代时细胞病变稳定，表现为细胞圆缩，聚团，呈葡萄串样，最后完全坏死脱落(附图12)。将样品处理后，参照常规Trizol提取RNA法提取上述制备液中的病毒RNA，再参照诺维赞生物技术有限公司的反转录试剂盒说明书进行反转录操作；
根据GenBank登录的FCV FB-NJ-13株基因组序列(GenBank ID：KM111557)设计一对特异性引物，扩增FCV ORF3基因，引物序列为：
上游引物ORF3-F：5’-GTTGACCCTTACTCATACAC-3’
下游引物ORF3-R：5’-CCCTGGGGTTAGGCGC-3’
扩增片段大小为136bp，反应条件为：94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃30s，54℃30s，72℃30s；35个循环后72℃延伸10min。产物取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。所扩增的PCR片断大小为136bp，与预期大小相符(附图13)；
二.培养毒株
用含2％血清的DMEM将分离的FCV作连续10倍稀释(从10-1至10-10)，将每个稀释度的病毒液同步接种于F81细胞的6孔细胞培养板，每个稀释度接种2孔，于37℃、含5％CO2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，覆盖含2％血清、0.8％低熔点琼脂糖的无酚红DMEM，于37℃、含5％ CO2培养箱中继续培养3～5天，在显微镜下看到明显的空斑出现后，用0.1‰的中性红于37℃染色1h，吸弃染色液，挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，同步接种于F81细胞的24孔细胞培养板，于37℃、含5％ CO2培养箱吸附1h后补加0.8mL细胞维持液，于37℃、含5％ CO2培养箱中培养至完全发生病变后，收集病变的细胞培养物，冻融3次后，测定各克隆毒的TCID50，选择毒价高的克隆，如上再纯化2次，选择毒价高的克隆毒标记为F1代，并进行病毒含量测定，根据Reed-Muench法计算TCID50。最终所收获FCV LZ-2016株病毒液病毒含量可达109.5TCID50/mL；
将FCV LZ-2016株毒株的F1代细胞培养物扩大培养后进行超离纯化，将获得的病毒悬液样品分别滴到铜网上吸附5min，用滤纸轻轻吸取病毒悬液，待干燥后滴加20g/L的磷钨酸进行负染1min，负染后用滤纸吸去磷钨酸，待干燥后在电子显微镜下观察。结果可见典型杯状结构病毒粒子，直径37～40nm(附图14)。
三.纯化毒株FCV LZ-2016株分子遗传进化分析
根据GenBank中已知的FCV基因组序列(GenBank ID：KM111557)设计了表6中的引物，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用表6引物，将全长基因分成3段，进行分段PCR扩增。PCR反应采用50μl反应体系：Prime STAR Max DNA Polymerase25μl，模板3μl，上下游引物(10μmol/L)各2μl，ddH2O 18μl。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃复性15s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。扩增产物电泳结果见附图15；
表6 FCV全基因组扩增引物
注：R为常用的兼并碱基(R＝A,G)；
2、连接转化：将各段基因分别与载体连接，具体步骤如下：取4μl凝胶回收产物与1μl pEASY-T1克隆载体轻轻混匀，16℃反应30min后置冰上。从-70℃冰箱中取出Trans DH5α感受态细胞，融化时加入连接产物，轻弹混匀后冰浴30min，42℃热激1min，冰浴3min。无菌加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃200rpm摇菌1h。3000rpm离心3min，保留100μl上清，悬浮沉淀菌体，涂布于LB-Amp+琼脂平板上，于37℃培养箱内倒置培养12～14h。琼脂平板上有可见菌落后，每个平板无菌挑取菌落于2mL LB-Amp+液体培养基中，37℃200rpm培养10～12h；
3、PCR鉴定与测序：以1μl菌液为模板，使用pEASY-T1载体的通用引物M13F/R进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，取阳性的质粒进行测序。将测序结果使用DNAStar-Seqman进行拼接，得到FCV LZ-2016株基因组序列，全长7683bp。(具体序列如SEQID NO：3所示)，其表达的衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
4、序列分析：将FCV LZ-2016株全基因组序列与GenBank登录的FCV-255株、FCV-F9株、FCV-F4株、FCV-GX2019株、FCV-SH株、FCV-GD株、FCV-FB-NJ-13株和FCV-HB-S4株等共25株(表7)的全基因组核苷酸序列进行比较，结果显示LZ-2016株全基因组序列与国内外参考毒株全基因组序列的核苷酸同源性在74.9％～82.8％之间，与国外流行毒株遗传差异较大。FCV全长基因组核苷酸序列的进化树分析表明，CH-JL1株与毒株FB-NJ-13、GD、12Q087-1形成一个小分支，这些毒株均分离自中国和东亚(附图16、18)；
由于ORF2基因片段编码的衣壳蛋白是FCV的主要结构蛋白，是刺激机体产生中和抗体的最主要的免疫原性蛋白，对其编码氨基酸进行比对分析发现LZ-2016株衣壳蛋白氨基酸序列(具体序列如SEQ ID NO：2所示)。与国内外参考毒株间同源性在80.6％～89.5％之间，与国外流行毒株遗传差异较大，进一步说明当前流行毒株间抗原差异较大(附图17)；本发明分离的猫杯状病毒毒株的命名为猫杯状病毒FCV LZ-2016株，于2022年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202276。
表7 FCV参考毒株信息以及与LZ-2016株同源性分析
四、猫杯状病毒FCV LZ-2016株毒力试验
将病毒液用DMEM分别稀释至107.0TCID50/mL、108.0TCID50/mL和109.0TCID50/mL，选取猫杯状病毒中和抗体、抗原均为阴性的4～8周龄试验猫20只，分为4组，采用滴鼻的方式进行攻毒，第1组为107.0TCID50/mL攻毒组，第2组为108.0TCID50/mL攻毒组，第3组为109.0TCID50/mL攻毒组，第4组为对照组，攻毒剂量为1mL，隔离饲养，并于攻毒后临床观察14天。结果表明107.0TCID50/mL攻毒组3/5试验猫出现精神沉郁、眼睑红肿、口腔溃疡、浆液性或脓性眼鼻分泌物等临床症状；108.0TCID50/mL和109.0TCID50/mL攻毒组均5/5试验猫出现精神沉郁、眼睑红肿、口腔溃疡、浆液性或脓性眼鼻分泌物等临床症状，且2/5最终死亡；对照组无明显症状(图19)。
五、FCV LZ-2016株的灭活、灭活检验及安全检验
1、LZ-2016株灭活及灭活检验：将病毒液加入体积分数为0.06％的β-丙内酯并不断搅拌，置4℃低温灭活24h，后置于37℃水解β-丙内酯2h，结束后放至4℃保存。取灭活后的病毒按1:100比例接种对数生长期的F81细胞，并盲传2代。结果无病毒生长，即为灭活彻底的LZ-2016株；灭活杯状病毒可以通过使用福尔马林、β-丙内酯(betapropriolactone，BPL)或者使用Binary ethyleneimine(BEI)处理，或者使用本领域已知的其它方法。
2、制备LZ-2016株灭活疫苗：将灭活前LZ-2016株病毒液测定的病毒含量，并使用无菌PBS将灭活彻底后的LZ-2016株病毒液稀释至109.0TCID50/mL；
3、安全检验：选取猫杯状病毒中和抗体、抗原均为阴性的4～8周龄健康易感猫10只，分为2组，第1组每只试验猫颈部皮下注射2头份FCV LZ-2016株灭活疫苗，第2组接种等量生理盐水，临床观察14天，均为5/5健活，未见不良反应。
六、FCV LZ-2016株的免疫原性及效力研究
将15只4～8周龄健康易感猫，随机分为3组，每组5只。第1组作为FCV LZ-2016株灭活疫苗免疫组，第2组作为商品化疫苗免疫组(选用当前国内唯一同类产品的勃林格殷格翰动物保健有限公司商品化疫苗“妙三多”疫苗(美国辉瑞)(猫鼻气管炎、嵌杯病毒、泛白细胞减少症三联灭活疫苗))，第3组作为对照组，免疫等量生理盐水。免疫途径为颈部皮下接种，1.0mL/只，于二免后21日采血，分离血清。按照固定病毒稀释血清法测定血清中FCV中和抗体，以及免疫后血清对本实验室分离鉴定的国内其它FCV流行毒株(国内其它FCV流行毒株采用实施例2中的鉴定方法鉴定后的结果见附图20)的中和抗体交叉保护作用。并于二免后28日采用滴鼻的方式进行攻毒，攻毒剂量为108.0TCID50/只，攻毒毒株为LZ-2016株。攻毒后14天内观察试验猫有无出现浆液性或脓性眼鼻分泌物、口腔溃疡以及死亡等典型猫杯状病毒特征症状，并于攻毒后第7天采集上呼吸道拭子(若试验猫存在死亡，则当天取样检测)，使用RT-PCR进行FCV病原鉴定；
结果显示，FCV LZ-2016株灭活疫苗免疫后试验猫中和抗体水平在1:631-1:1024之间，使用FCV LZ-2016株攻毒后可达到5/5保护，攻毒后第7天上呼吸道拭子采样FCV病原鉴定结果均为阴性；而商品化疫苗免疫后试验猫中和抗体水平在1:13-1:37之间，使用FCVLZ-2016株攻毒后仅1/5保护，攻毒后第7天(或死亡当天)上呼吸道拭子采样FCV病原鉴定结果多数为阳性，对照组全部发病，并且攻毒后第7天(或死亡当天)上呼吸道拭子采样FCV病原鉴定均为阳性。二免后21日采集血清对国内其它流行分离株的中和抗体交叉反应检测结果表明，FCV LZ-2016株灭活疫苗免疫后血清对7株国内流行代表毒株的中和抗体在1:128-1:1024，而商品化疫苗免疫后，仅对个别毒株中和抗体水平高于1:16，商品化疫苗可能对同源性较接近的GX2019株、GX01-13株、及HB-S4株的免疫保护性不佳，而本发明的，FCV LZ-2016株灭活疫苗对同源性较接近的GX2019株、GX01-13株、及HB-S4株的免疫保护性相对现有商品疫苗较好。
表8疫苗免疫猫血清FCV中和抗体检测结果
注：“-”代表RT-PCR鉴定FCV病原阴性，“+”代表RT-PCR鉴定FCV病原阳性，“—”代表未见异常，“E”代表出现浆液性眼鼻分泌物，“F”代表出现脓性眼鼻分泌物，“I”代表出现口腔溃疡,“S”代表死亡；
表9疫苗免疫猫血清对其它FCV分离毒株的中和作用
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综上所述，本实施例所述的FCV LZ-2016株，具有较高的病毒滴度，该毒株对健康易感猫的毒力较强，可引起典型的口腔溃疡和结膜炎等症状；该毒株的灭活制品免疫猫可产生良好的免疫应答，具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可较好的刺激机体产生针对FCV的高水平中和抗体，对FCV攻击能够提供较高的免疫保护率，具备开发疫苗的基本潜质。
实施例3.联苗的制备
(1)猫细小病毒FPV CS-2016株制苗用病毒液的制备
将T75细胞培养瓶中长满单层的F81细胞弃去培养液，使用0.25％胰酶溶液消化后收集细胞并扩大至T175细胞培养瓶中，随后使用50mL 2％新牛血清DMEM细胞维持液重悬并按0.01MOI接种猫细小病毒FPV CS-2016株，37℃、5％ CO2条件下继续培养，96-120h收获病毒液，观察细胞病变计算病毒含量。然后按照实施例1的步骤三灭活病毒，取灭活后的已知抗原含量的抗原液使用无菌PBS稀释至107.02TCID50/mL，按1mL的规格分装后于4℃保存备用。
(2)猫杯状病毒FCV LZ-2016株制苗用病毒液的制备
将T75细胞培养瓶中长满单层的F81细胞弃去培养液，使用0.25％胰酶溶液消化后收集细胞并扩大至T175细胞培养瓶中，随后使用50mL 2％新牛血清DMEM细胞维持液重悬并按0.01MOI接种猫杯状病毒LZ-2016株，37℃、5％ CO2条件下继续培养，96-120h收获病毒液，观察细胞病变计算病毒含量。然后按照实施例2的步骤五灭活病毒，取灭活后的已知抗原含量的抗原液使用无菌PBS稀释至109.02TCID50/mL，按1mL的规格分装后于4℃保存备用。
(3)猫细小病毒FPV CS-2016株和猫杯状病毒FCV LZ-2016株二联苗的制备
将实施例3步骤(1)和步骤(2)所制备的抗原液和无菌PBS按照1:1:1的配比混合，使得终体积为1mL，FPV CS-2016株抗原终浓度为106.5TCID50/mL、FCV LZ-2016株抗原终浓度为108.5TCID50/mL。按照1mL/1头份的规格4℃保存备用。
(4)有效性试验
选用对肛拭子猫细小病毒PCR检测为阴性、咽拭子猫杯状病毒PCR检测为阴性，猫细小病毒和猫杯状病毒中和抗体均小于1:2的8-12周龄幼猫，共计15只。将试验猫随机分为3组，每组5只，组1(动物编号26-30)和组2(动物编号36-40)颈部皮下注射制备的FPV抗原含量106.5TCID50/mL和FCV抗原含量108.5TCID50/mL的二联灭活苗各1头份/只；28天后以相同剂量、相同方式进行第二次免疫。组3为对照组，不做任何处理(空白对照组)。组1、组2和组3于二免后7天、14天、21天、28天分别采血进行血清中和抗体的检测。二免后28天，所有试验猫进行攻毒，其中组1攻毒FCV(攻毒剂量为108.0TCID50/mL)，组2攻毒FPV(攻毒剂量为107.0TCID50/mL)。FPV CS-2016株+FCV LZ-2016株联合免疫后抗体数据如下(8周龄以上开始免疫，一免28天进行二免，二免后每7天进行采血检测血清中和抗体)：
表10 8-12周龄健康易感猫二次免疫后FCV中和抗体检测结果
表11 8-12周龄健康易感猫二次免疫后FPV中和抗体检测结果
二联灭活疫苗二免后7天、14天、21天、28天试验猫血清中和抗体水平图如图21。
表12 8-12周龄健康易感猫二次免疫后28天FCV攻毒结果
注：“—”代表未见异常，“F”代表出现脓性眼鼻分泌物，“I”代表出现口腔溃疡，“S”代表死亡。
表13 8-12周龄健康易感猫二次免疫后28天FPV攻毒结果
注：“—”代表未见异常，“J”代表出现呕吐，“K”代表出现腹泻，“S”代表死亡。
总结：以上结果表明，当FPV和FCV进行二联灭活疫苗制备联合使用后，在既定的免疫程序(8-12周龄首免，首免28天后进行二免)结束后28天均可引起试验猫体内产生较高水平的抗体(FCV：1:796-1:1175；FPV：1:1260-1:2344)，这使得试验猫可以免受强毒毒株的感染。
(5)安全性试验
FPV CS-2016株与FCV LZ-2016株二联灭活疫苗安全性试验
选选用对肛拭子猫细小病毒PCR检测为阴性、咽拭子猫杯状病毒PCR检测为阴性，猫细小病毒和猫杯状病毒中和抗体均小于1:2的8-12周龄幼猫，共计20只。
将试验猫随机分为4组，每组5只，组1颈部皮下注射制备的FPV抗原含量106.5TCID50/mL和FCV抗原含量108.5TCID50/mL的二联灭活苗各1头份/只(单剂量组)；组2颈部皮下注射2头份/只(超剂量组)；组3于试验开始时注射1头份，2周后进行重复1头份接种(单剂量重复组)；组4不做任何处理(空白对照组)。单剂量组、超剂量组连续观察2周；单剂量重复组和空白对照组连续观察4周。在免疫前2日进行基础体温的监测，免疫后继续每日监测体温，时间与临床观察日数相同。
结果：单剂量组、超剂量组和单剂量重复组与对照组比较均表现为采食、饮水正常，体温于正常范围内波动(37.5℃-39.5℃)，注射部位未见不良反应，5/5健活。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种猫细小病毒FPV CS-2016株，其特征在于：保藏号为CCTCC NO:V202277。
2.一种疫苗株，所述疫苗株为猫杯状病毒毒株和权利要求1所述的猫细小病毒毒株的组合，其中，所述猫杯状病毒毒株的命名为猫杯状病毒FCV LZ-2016株，于2022年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202276。
3.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有疫苗上可接受的载体和权利要求1或2所述病毒毒株或其衍生病毒。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的原料包括所述病毒毒株的灭活病毒和佐剂。
5.如权利要求4所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将权利要求4所述的猫细小病毒FPV CS-2016株和猫杯状病毒FCV LZ-2016株分别进行繁殖和培养，得到病毒原液；
步骤二、将步骤一所得病毒原液或其稀释液加入β-丙内酯用于灭活；
步骤三、灭活后的病毒液使用无菌PBS稀释后混合，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤二中取病毒液原液或稀释液按0.1％的体积加入β-丙内酯，混合均匀后于4℃灭活24h，再37℃水解2h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤三中灭活后的猫细小病毒FPVCS-2016株和猫杯状病毒FCV LZ-2016株病毒液分别使用无菌PBS稀释至107.02TCID50/mL、109.02TCID50/mL，并分装后于4℃保存；将所制备的两种病毒的抗原液和无菌PBS按照1:1:1的体积配比混合，使得终体积为1mL，FPV CS-2016株抗原终浓度为106.5TCID50/mL、FCV LZ-2016株抗原终浓度为108.5TCID50/mL。
8.根据权利要求1所述猫细小病毒CS-2016株的以下任一应用，其特征在于：
(1)用于制备疫苗；
(2)用于制备猫细小病毒感染以及由其感染所致相关疾病的诊断试剂。
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