ES2362564T3 - Producción de vacunas de virus parainfluenza atenuado a partir de secuencias de nucleótidos clonadas. - Google Patents

Abstract

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende un promotor de la transcripción unido operativamente, una secuencia polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un terminador de la transcripción, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

Description

Antecedentes de la invención

[0001] Los virus parainfluenza humanos (HPIV), HPIV1, HPIV2 y HPIV3, son causas significativas de bronquiolitis, difteria y neumonía en lactantes y niños. Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins et al. “Parainfluenza Viruses”, págs. 1205-1243. En B.N. Fields et al., eds., Fields Virology, 3ª ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Filadelfia (1996); Murphy et al., Virus Res. 11: 1-15 (1988). Las infecciones por estos virus dan como resultado una morbilidad importante en niños menores de 3 años de edad y son responsables de aproximadamente el 20% de las hospitalizaciones entre lactantes y niños pequeños por infecciones del tracto respiratorio.

[0002] A pesar de los considerables esfuerzos por desarrollar terapias vacunales eficaces contra HPIV, no se han logrado todavía agentes vacunales autorizados para ninguna cepa de HPIV, ni para mejorar enfermedades relacionadas con HPIV. Hasta la fecha sólo dos candidatos a vacunas de PIV vivas atenuadas han recibido una atención particular. Uno de estos candidatos es una cepa de PIV bovino (BPIV) que está antigénicamente relacionada con el HPIV3, y que ha demostrado proteger a los animales frente al HPIV3. El BPIV3 está atenuado, es genéticamente estable e inmunogénico en lactantes y niños humanos (Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). Un segundo candidato a vacuna de PIV3, JS cp45 es un mutante adaptado al frío de la cepa de tipo silvestre (wt) JS del HPIV3 (Karron et al., (1995b), anteriormente; Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982)). Este candidato a vacuna de PIV3 viva atenuada pasada en frío (cp) presenta fenotipos termosensibles (ts), de adaptación al frío (ca) y de atenuación (att) que son estables después de la replicación viral in vivo. El virus cp45 protege frente a la exposición a PIV3 humano en animales de experimentación y está atenuado, es genéticamente estable e inmunogénico en lactantes y niños humanos seronegativos (Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., (1995b), anteriormente).

[0003] El HPIV3 es un miembro del género Paramyxovirus de la familia Paramyxovirus, orden Mononegavirales. Su genoma es una sola cadena de ARN de sentido negativo de 15462 nucleótidos (nt) de longitud (Galinski et al., Virology 165: 499-510, (1988); Stokes et al., Virus Res. 25: 91-103 (1992)) y codifica al menos ocho proteínas (Collins et al., anteriormente, (1996); Galinski, anteriormente, (1991); Spriggs y Collins, J. Gen. Virol. 67: 2705-2719, (1986)). Tres de estas proteínas se asocian con el genoma de ARN para formar la nucleocápside; en concreto, la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y la subunidad grande de la polimerasa L. Tres proteínas adicionales se asocian con la envuelta, en concreto la proteína de la matriz M, que ha demostrado mediar la unión y la liberación viral, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN y la proteína de fusión F. Otras dos proteínas, HN y F, representan los antígenos neutralizantes y protectores de los PIV (Collins et al. En Fields Virology, 3ª ed., 1: 120543 (1996)). La divergencia de secuencia significativa en estos dos antígenos protectores entre diferentes PIV es la base para la especificidad de inmunidad protectora tipo contra estos patógenos (ídem).

[0004] Otra proteína de PIV, la proteína C, está codificada por una fase de lectura abierta (ORF) solapante del ARNm de la proteína P (Spriggs y Collings, 1986) y la proteína D se genera por edición del ARN del cistrón P (Galinski et al. Virology 186: 543-50 (1992)). El ARNm de P también contiene una ORF interna que tiene el potencial de codificar un dominio rico en cisteína denominado V. La ORF V también se encuentra en otros paramixovirus y, típicamente, se accede a la misma por edición del ARN, pero éste no es el caso del PIV. Actualmente, no se sabe si se expresa la ORF V del PIV.

[0005] El genoma viral de PIV también contiene regiones líder y tráiler extragénicas, que poseen promotores necesarios para la replicación y transcripción viral. Por lo tanto, el mapa genético del PIV está representado como 3’ líder-N-P/C/D-M-F-HN-L-tráiler. La transcripción se inicia en el extremo 3’ y avanza mediante un mecanismo de terminación-inicio secuencial que está guiado por motivos conservados cortos que se encuentran en los límites de los genes. El extremo cadena arriba de cada gen contiene una señal de inicio de gen (GS), que dirige el inicio de su ARNm respectivo. El extremo terminal cadena abajo de cada gen contiene un motivo de final de gen (GE) que dirige la poliadenilación y la terminación.

[0006] La identificación de mutaciones atenuantes en cp45 y otros candidatos a vacunas de PIV3 es de interés por una diversidad de razones (documento WO 97 20468 A). En particular, será útil para comprender la base genética de la atenuación y para caracterizar la virología molecular y la patogénesis de cepas de HPIV3 atenuadas para proporcionar vacunas clínicamente aceptables para usar contra estos y otros paramixovirus, especialmente HPIV1 y HPIV2, que en conjunto representan un 7% adicional de los ingresos hospitalarios pediátricos. Para conseguir estos objetivos y objetivos relacionados, es necesario un método para producir virus con un fenotipo wt a partir de ADNc para determinar qué mutación o mutaciones en el virus cp45 especifican los fenotipos ts, ca y att y qué gen o genes del BPIV3 especifican el fenotipo de atenuación. [0007] Las secuencias de nucleótidos completas de la cepa de PIV3 prototipo, y de las cepas cp45 y HPIV3 JS wt se han determinado (Stokes et al., anteriormente, (1992); Stokes et al., Virus res. 30: 43-52 (1993)). A partir de estos estudios, se demostró que la cepa cp45 poseía al menos diecisiete sustituciones de nucleótidos en comparación con la cepa de HPIV3 JS wt parental, estando ocho de las mismas correlacionadas con cambios en proteínas virales. Sin embargo, no se ha mostrado previamente cuáles de estas mutaciones identificadas especifican los fenotipos deseados, por ejemplo, ts, ca y att. Recientemente, se describió que el crecimiento de cp45 a temperaturas no permisivas estaba complementado por la coexpresión de un clon de ADNc del gen de L de la cepa de PIV3 wt 47885 (Ray et al., J. Virol. 70: 580-584 (1996)), sugiriendo que el gen de L puede contener una o más mutaciones que contribuyen al fenotipo ts de cp45. Sin embargo, los resultados de este estudio se complican por el hecho de que la cepa 47885 no es isogénica con la parental JS de cp45 (por ejemplo, los dos virus son un 4% diferentes a nivel de nucleótidos y las proteínas L difieren en 41 posiciones de aminoácidos (Stokes et al., anteriormente, (1992); la fe de erratas aparece en Virus Res. 27: 96 (1993); Virus Res. 25: 91-103). Además, este método de complementación no proporciona una medición clara de la contribución relativa de la mutación o mutaciones del gen de L al fenotipo ts global de cp45.

[0008] El rescate y el análisis de mutaciones atenuantes en PIV3 y otros virus ARN requieren métodos eficaces para manipular ADNc para los virus de interés particulares. A pesar de los avances previos que identificaban ADNc para PIV, la manipulación del ARN genómico de este y otros virus ARN de sentido negativo ha demostrado ser difícil. Un obstáculo principal a este respecto es que el ARN genómico desnudo de estos virus no es infeccioso.

[0009] Sólo recientemente han comenzado a desarrollarse métodos exitosos para la manipulación genética directa de virus ARN de cadena negativa no segmentada (para revisiones, véase Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11354-58, (1996)) (véase también el documento EP 0 702 085 A y EP 0 440 219 A). Se han generado con éxito nucleocápsides funcionales a partir de la coexpresión intracelular de plásmidos transfectados por separado que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7 y que codifican ARN genómico o antigenómico y las proteínas N, P y L. La expresión de ADNc intracelular se dirige mediante ARN polimerasa de T7, que se produce por coinfección con un virus vaccinia recombinante. Esta estrategia se usó por primera vez para determinar las necesidades de transcripción y replicación de minirreplicones codificados por ADNc. Se han conseguido algunos éxitos en la aplicación de estos métodos generales para rescatar virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus del sarampión y virus Sendai infecciosos a partir de ARN antigenómico codificado por ADNc en presencia de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y la subunidad grande de la polimerasa L (Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1993); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8388-92 (1995)). También se ha recuperado virus respiratorio sincitial (RSV) a partir de antigenoma codificado por ADNc, pero esto requería la transfección de un plásmido adicional que codifica el factor de elongación de la transcripción ORF 1 M2 (Collins et al., 1995).

[0010] El rescate de virus PIV infeccioso y otros miembros de los Mononegavirales es complicado en virtud de su genoma de ARN de cadena negativa no segmentada. Los complejos genómicos de ribonucleoproteínas (RNP) de virus de genoma segmentado, tales como influenza, son generalmente de pequeño tamaño y están laxamente estructurados, y pueden ensamblarse in vitro a partir de ARN y de las proteínas virales necesarias. Sin embargo, el PIV y otros miembros de los Mononegavirales presentan RNP mucho mayores y más estrechamente estructuradas, que tienden a ser refractarias a la asociación funcional in vitro. Además, el potencial codificante de ARNm de P de HPIV3 se complica por la “edición de ARN” cotranscripcional (Galinski et al., Virology 186: 543-50 (1992)). Los desplazamientos resultantes en la fase de lectura pueden acceder a las ORF internas que se expresan como quimeras fusionadas a la parte N-terminal de P. Además, el HPIV3 parece diferir de la mayoría de los demás paramixovirus que expresan una proteína V quimérica, como se ha señalado anteriormente. El conjunto de proteínas correspondiente de la edición del HPIV3 no se ha identificado todavía y la ORF V interna del HPIV3 está separada del sitio de edición por numerosos codones de terminación de la traducción (Galinski et al. (1992, anteriormente)). Otro factor de complicación más es que la edición por BPIV3 y HPIV3 produce una nueva proteína quimérica D, en la que se fusiona la mitad cadena arriba de P a un dominio codificado por una segunda ORF interna (Pelet et al., EMBO J. 10: 443-448 (1991); Galinski et al., anteriormente, (1992)). La proteína D no tiene un homólogo en otros paramixovirus. En vista de lo anterior, existe en la técnica la necesidad urgente de herramientas y métodos para fabricar vacunas seguras y eficaces para aliviar los graves problemas de salud atribuibles al PIV, particularmente enfermedades entre niños y lactantes atribuibles al HPIV3. Bastante sorprendentemente, la presente invención cumple estas y otras necesidades relacionadas.

Descripción resumida de la invención

[0011] La presente invención proporciona nuevas herramientas y métodos para introducir cambios fenotípicos y estructurales predeterminados definidos en PIV infecciosos. De acuerdo con la invención, se proporciona una molécula polinucleotídica aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un promotor de la transcripción unido operativamente, una secuencia polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un terminador de la transcripción.

[0012] El genoma o antigenoma de PIV es una versión modificada recombinantemente de la secuencia de PIV3 humano. En una realización, la secuencia polinucleotídica codifica un genoma o antigenoma quimérico que comprende una secuencia de PIV3 humano unida recombinantemente con una secuencia de PIV bovino, tal como un gen o segmento génico del PIV bovino (BPIV). En ejemplos adicionales, el polinucleótido de la invención codifica una quimera de secuencias de PIV3 humano y al menos otro PIV de origen humano o bovino.

[0013] En otras realizaciones, la invención proporciona una partícula de PIV infecciosa aislada que comprende un genoma o antigenoma de PIV recombinante (rPIV), una proteína N, una proteína P y una proteína L. La partícula de PIV infecciosa aislada puede ser una partícula viral o subviral. Como se usa en la presente memoria, la partícula subviral se refiere a cualquier partícula de PIV infecciosa que carece de un elemento estructural, por ejemplo, un segmento génico, gen, proteína o dominio funcional de proteína, que está presente en un virus completo (por ejemplo, un virión ensamblado, incluyendo un genoma o antigenoma completo, nucleocápside y envuelta). Por lo tanto, un ejemplo de una partícula subviral de la invención es una nucleocápside infecciosa que contiene un genoma o antigenoma, y los productos de los genes de N, P y L. Otras partículas subvirales se producen por deleciones o sustituciones parciales o completas de genes no esenciales y/o sus productos (por ejemplo, F, HN, M o C), entre otros elementos estructurales no esenciales.

[0014] La partícula de PIV infecciosa aislada comprende secuencias quiméricas a partir de dos o más genomas de PIV diferentes e incorpora secuencias polinucleotídicas de HPIV3 y HPIV1, secuencias de HPIV3 y HPIV2, o está compuesta por secuencias de HPIV3 y BPIV.

[0015] En aspectos de la invención relacionados, se proporcionan partículas de PIV infecciosas aisladas que incorporan secuencias de nucleótidos de HPIV3 unidas a al menos una secuencia de un PIV heterólogo, tal como HPIV1, HPIV2 o BPIV. Por ejemplo, los genes completos de HPIV3 pueden sustituirse por genes homólogos de otras formas de PIV, tales como los genes de glicoproteína HN y/o F de PIV1 o PIV2. Los genes de segmentos génicos de un PIV pueden añadirse (es decir, sin sustitución) dentro de un fondo de PIV heterólogo para crear nuevas propiedades inmunogénicas dentro del clon resultante.

[0016] Otras modificaciones pueden producirse introduciendo en el genoma o antigenoma de HPIV3 una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótidos seleccionada para codificar una alteración fenotípica deseada, tal como una que dé como resultado la atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador, crecimiento in vitro mejorado o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV. En un aspecto de la invención, se identifican mutaciones que aparecen en PIV atenuados derivados biológicamente y se introducen individualmente o en combinación en un clon de PIV de longitud completa. Típicamente, estas mutaciones son cambios de un solo aminoácido presentados por virus mutantes derivados biológicamente sobre un PIV de tipo silvestre, por ejemplo cambios presentados por mutantes de PIV que tienen fenotipos ts, ca o att. Estos cambios de PIV mutantes derivados biológicamente se incorporan en un clon de PIV recombinante para especificar las características deseadas en el virus resultante. Las mutaciones ejemplares incluyen cambios de aminoácido que especifican un fenotipo atenuado en la cepa JS cp45 de HPIV3. Entre estas mutaciones ejemplares están mutaciones que aparecen dentro del gen L de la polimerasa de PIV que especifican fenotipos ts, ca o att, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos que aparecen en Tyr942, Leu992 y/o Thr1558 de la cepa de PIV de tipo silvestre JS. En aspectos más detallados, se describen PIV recombinantes atenuados en los que Tyr942 se sustituye por His, Leu992 se sustituye por Phe, y/o Thr1558 se sustituye por Ile.

[0017] También se proporcionan en la invención PIV recombinantes que tienen múltiples mutaciones especificantes de fenotipo introducidas en combinaciones seleccionadas en el genoma o antigenoma de un clon infeccioso para dar las características deseadas, incluyendo atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador, etc. Por ejemplo, se proporcionan clones de PIV que incorporan al menos dos mutaciones separadas adoptadas de un mutante de PIV derivado biológicamente, por ejemplo, dos mutaciones de ts de HPIV3 JS cp45. Se obtienen de este modo múltiples virus atenuados seleccionando mutaciones de un “menú” de lesiones identificadas e introduciendo estas mutaciones en diversas combinaciones para calibrar un virus vacunal a niveles de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad seleccionados.

[0018] En realizaciones adicionales, la invención proporciona la complementación de una o más mutaciones adaptadas a partir de PIV derivados biológicamente, por ejemplo, mutaciones ts, ca o att, con tipos de mutaciones adicionales que implican el mismo o diferentes genes. Los genes diana para mutación en este contexto incluyen la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P, la subunidad grande de la polimerasa L, la proteína de la matriz M, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN, la proteína de fusión F y los productos de las ORF, C, D y V. En aspectos preferidos, se incorporan mutaciones atenuantes adoptadas de PIV derivados biológicamente dentro de un PIV quimérico recombinante, por ejemplo, un PIV recombinante que tiene secuencias de nucleótidos tanto de HPVI3 como de HPIV1, o de virus tanto HPIV como BPIV. [0019] En otras realizaciones, la invención proporciona métodos para producir una partícula de PIV infecciosa, por ejemplo, una partícula viral o subviral, a partir de una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican un genoma o antigenoma de PIV (véase también la solicitud provisional de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 60/047474, presentada el 23 de mayo de 1997).

[0020] Para producir una partícula de PIV infecciosa de acuerdo con estos métodos, se coexpresa un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica aislada que codifica un genoma o antigenoma de PIV en una célula o sistemas sin células con un vector de expresión que comprende una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican proteínas N, P y L de un PIV, por lo que se produce una partícula de PIV infecciosa.

[0021] El genoma o antigenoma de PIV y las proteínas N, P y L pueden coexpresarse mediante un solo vector de expresión o mediante vectores de expresión separados. En realizaciones alternativas, las proteínas N, P y L están cada una codificadas en vectores de expresión separados.

[0022] Dentro de los métodos mencionados anteriormente, la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV corresponde a una secuencia genómica o antigenómica de PIV3 humano. Como alternativa, el polinucleótido codificante de PIV puede ser una quimera de una secuencia genómica o antigenómica de PIV3 humano, y la secuencia genómica o antigenómica de PIV no humano, BPIV. En métodos adicionales para producir PIV infecciosos, el polinucleótido que codifica el genoma o antigenoma de PIV es una quimera de dos o más genomas de PIV humano, es decir, un polinucleótido que contiene secuencias de HPIV3 unidas a secuencias de una

o más formas relacionadas de PIV humano, tales como PIV1 humano o PIV2 humano. Pueden sustituirse genes individuales de PIV3 humano por genes homólogos de PIV heterólogo, por ejemplo, los genes de glicoproteína HN y F de PIV1 o PIV2, para dar un genoma o antigenoma modificado que codifique un PIV quimérico.

[0023] En otros métodos adicionales para producir PIV infecciosos, el genoma o antigenoma de PIV se modifica para dar una quimera de una secuencia genómica o antigenómica de PIV humano y al menos una secuencia de PIV no humano, por ejemplo, un polinucleótido que contiene secuencias de PIV tanto humano como bovino.

[0024] En otros métodos para producir PIV infeccioso, el genoma o antigenoma de PIV se modifica por una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótidos seleccionada para codificar una alteración fenotípica deseable, tal como una que dé como resultado la atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV. Como alternativa, la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV puede modificarse para codificar moléculas distintas de PIV, por ejemplo, una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano diferente (por ejemplo, virus, bacteria u hongo) capaz de generar una respuesta inmune protectora en el hospedador deseado. En una realización, el genoma o antigenoma de PIV se modifica para codificar una proteína de un RSV humano o del virus del sarampión.

[0025] En otras realizaciones de la invención, se proporciona una célula o sistema de expresión sin células (por ejemplo, un lisado sin células) que incorpora un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica aislada que codifica un genoma o antigenoma de PIV, y un vector de expresión que comprende una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican las proteínas N, P y L de un PIV. Tras la expresión, el genoma o antigenoma y las proteínas N, P y L se combinan para producir una partícula de PIV infecciosa, tal como una partícula viral o subviral. Las moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican el genoma o antigenoma de PIV y la una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican las proteínas N, P y L de PIV pueden expresarse mediante un solo vector, o el genoma y una o más de las proteínas N, P y L pueden incorporarse en dos o más vectores separados.

Breve descripción de los dibujos

[0026]

La Figura 1 ilustra la construcción del plásmido p218(131), que codifica una copia completa de ARN genómico de HPIV3. El diagrama de p218(A*A’CC’D*E) (parte superior izquierda) ilustra la localización del terminador de T7 y de la ribozima de delta adyacente al nucleótido 1 del genoma de HPIV3. El diagrama de la parte superior derecha de p(E*FF’GHIJKL*) ilustra las localizaciones de los 7 marcadores de secuenciación (asterisco), véase la Fig. 2 a continuación, y el promotor de T7 adyacente al nucleótido 15462 de HPIV3. Los 15 clones solapantes usados para construir el ADNc genómico de longitud completa se indican mediante letras en el exterior de los dos plásmidos. Los sitios de restricción únicos NgoMI y Xhol se usaron para clonar el p218(131) que codifica el ARN genómico de sentido negativo completo de HPIV3 ilustrado en la parte inferior. La localización de cada marcador de secuenciación en p218(131) que diferencia el JS recombinante del JS wt se indica mediante un asterisco.

La Figura de referencia 2 representa marcadores de secuencia en el ARN genómico codificado por ADNc de los genes HN (1) y L(2) de HPIV3. Las secuencias son de sentido negativo, las mutaciones están recuadradas.

1) Una sustitución de nucleótido no codificante en 7903 elimina un sitio Hga I de JS wt. Las sustituciones nucleótidos en el ADNc de JS en 7913 y 7915 crean un sitio Sca I y cambian el aminoácido 370 de prolina a treonina, suprimiendo el epítopo de anticuerpo reconocido por los mAb 170/7 y 423/6. Además, se descubrió que el gen de HN contenía una mutación puntual adicional en el nucleótido 7593 que no se había reconocido anteriormente. Esto da como resultado un cambio de treonina a isoleucina en la posición aminoacídica 263 en la proteína HN.

2) Las tres mutaciones no codificantes accidentales en el gen de L del ADNc de JS que aparecían durante la construcción o el ensamblaje del plásmido están recuadradas.

La Figura de referencia 3 incluye un diagrama (no a escala) del ADNc de PIV3-CAT (parte superior, dibujado como un plásmido circular) y el ARN de minigenoma codificado (parte inferior, dibujado como una sola cadena de ARN de sentido negativo, de 3’ a 5’).

Plásmido: El promotor de T7 se muestra como una flecha negra que señala en la dirección de la transcripción. Se muestran las posiciones para la ribozima de delta, el terminador de la transcripción de T7, los terminadores de la transcripción de virus vaccinia insertados (T7CT y T5AT), sitios de enzimas de restricción y la secuencia codificante de los diversos dominios del minigenoma codificado.

ARN de minigenoma: El extremo 5’ (a la derecha) del minigenoma está definido por el promotor para la ARNpolimerasa de T7, que contribuye a una extensión de dos restos G no virales. Éstos no se incluyen en los cálculos de la longitud. El extremo 3’ está definido por la ribozima y está libre de cualquier nucleótido heterólogo. Se muestran las regiones específicas de PIV3 como recuadros en blanco. La ORF de CAT está sombreada y se muestran las complementarias de sentido negativo de los codones de inicio (UAC) y terminación (AUU) de la traducción. Las posiciones de nucleótidos se indican de acuerdo con el minigenoma de 898 nucleótidos más corto. Las longitudes de nucleótidos de regiones específicas se proporcionan entre paréntesis. La secuencia de las posiciones 90 a 124 (3’ a 5’, sentido negativo) se muestra en la parte inferior; la secuencia específica de PIV3 está subrayada, la complementaria de un terminador de la transcripción de virus vaccinia está subrayada por encima, la complementaria del sitio XbaI está en cursiva y la complementaria del codón de inicio de la traducción para la ORF de CAT está en negrita. El sitio en el que se insertaron de 0 a 6 restos G, dando como resultado PIV3-CAT 0 a +6, está indicado. Abreviaturas: GS, motivo transcripcional del inicio del gen; GE, motivo transcripcional del final del gen/poliadenilación; NT, secuencia génica no traducida.

La Figura de referencia 4 representa la expresión de la enzima CAT por minigenomas PIV3-CAT 0 a +6. Las células se transfectaron con plásmidos que codifican el minigenoma de PIV3-CAT indicado y las proteínas N, P y L, y se infectaron simultáneamente con virus vaccinia recombinante vTF7-3 que expresaba la ARN polimerasa de T7. Los lisados se prepararon 48 h post-infección y se analizaron muestras que representan 3000 células para determinar la actividad de CAT. Las actividades se expresan respecto al minigenoma +2, que es un múltiplo de seis, como 100. Las muestras en las que se omitió el plásmido L no tenían actividad de CAT detectable en estas condiciones.

Las Figuras de referencia 5a y 5B representan la síntesis de ARN miniantigenómico por minigenomas de PIV3CAT 0 a +6. Las células se transfectaron e infectaron como se ha descrito para la Fig. 4, excepto para los controles en los que se omitió el plásmido N (carril 1) o plásmido L (carril 2). El plásmido de minigenoma de PIV3-CAT que se transfectó en cada caso está indicado. Se prepararon lisados celulares a las 48 h posttransfección: se trató una alícuota con nucleasa microcócica (tratada) y en la segunda se realizó un tratamiento simulado (no tratada), seguido de procesamiento para purificación de ARN. Los ARN se analizaron mediante hibridación de transferencia de Northern con una ribosonda de CAT de sentido negativo. Como marcador y control para el tratamiento con nucleasa, el minigenoma de RSV-CAT C2 (Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995)) se complementó mediante las proteínas N, P y L de RSV y se procesó en paralelo (carril 10). Se muestran autorradiogramas de las transferencias hibridadas en la Fig. 5A. La Fig. 5B muestra un análisis de Phosphorimager en el que la cantidad de hibridación relativa al minigenoma +2 se calculaba por separado para las muestras tratadas y no tratadas.

Las Figuras de referencia 6A y 6B representan la síntesis de ARNm poliadenilado por minigenomas de PIV3-CAT de 0 a +6. Usando alícuotas de células del mismo experimento que se muestra en las Figs. 5A y 5B, se recogió el ARN intracelular total a las 48 h post-transfección y se fraccionó mediante cromatografía de oligo(dT) en fracciones de unido y no unido, que se analizaron mediante hibridación de transferencia de Northern con una ribosonda de CAT de sentido negativo. La Fig. 6A muestra autorradiogramas de las transferencias hibridadas. La Fig. 6B muestra el análisis de Phosphorimager en el que la cantidad de hibridación se normalizó respecto a la fracción de ARN unido del minigenoma +2, esto se calculó por separado para las fracciones de unido y no unido.

Las Figuras de referencia 7A y 7B representan la acumulación de minigenoma intracelular en respuesta a plásmido que codifica minigenomas de PIV3-CAT 0 a +6. Esto es una continuación del experimento mostrado en las Figs. 5A y 5B. Por lo tanto, las células que se habían transfectado con plásmidos que codifican un minigenoma y las proteínas N, P y L, e infectadas con vTF7-3, se recogieron 48 h post-transfección y se prepararon lisados celulares. Se trató una alícuota de lisado con nucleasa microcócica (tratada) y en la otra se realizó un tratamiento simulado (no tratada), seguido de procesamiento para purificación de ARN. Los ARN se analizaron mediante hibridación de transferencia de Northern con una ribosonda de CTA de sentido positivo, mientras que en la Fig. 5A la ribosonda era de sentido negativo. La Fig. 7A muestra autorradiogramas de las transferencias hibridadas. La Fig. 7B muestra un análisis de Phosphorimager en el que la cantidad de hibridación respecto al minigenoma +2 se calculaba por separado para las muestras tratadas y no tratadas.

Las Figuras 8-10 ilustran la construcción de p3/7(131)2G. El p3/7(131)2G codifica un antigenoma de HPIV3 de sentido positivo completo y contiene dos restos G entre el promotor de T7 y el nucleótido 1 del antigenoma. La construcción implicaba la modificación por separado de las mitades izquierda y derecha del ADNc 218(131) que codifica el genoma de sentido negativo. Usando la misma estrategia, se construyó un segundo ADNc, p3/7(131), que es idéntico a p3/7(131)2G excepto por que se omitieron los dos restos G.

La Figura 8 representa la construcción de p(Left+2G), realizada por sustitución de la ribozima y del terminador de la transcripción de T7 de p218(A*A’CC’D*E) con un promotor de T7 que incluía dos restos G. El p218 (A*A’CC’D*E) se usó como molde en una PCR que amplificaba los 1224 nucleótidos a la izquierda del genoma de HPIV3 (rectángulo en negro marcado como “PIV3seq.”) usando un cebador de PCR a la izquierda que introducía el promotor de T7. Este fragmento de PCR se clonó en la ventana Mlul-PmII de p218(A*A’CC’D*E), dando como resultado el p(Left+2G).

La Figura 9 representa la construcción de p(Right+), realizada por sustitución del promotor de T7 de p(E*FF’GHIHKL*) con una ribozima y el terminador de T7 situados adyacentes al nucleótido 15642 de PIV3 en la cadena de sentido positivo (antigenoma). Se usó el p(E*FF’GHIHKL*) como molde en una PCR que amplificaba los 649 nucleótidos a la derecha del genoma de HPIV3 (rectángulo en negro marcado como “PIV3seq.”) usando un oligonucleótido mutagénico que añadía parte de la ribozima de delta (incluyendo un sitio RsrII de origen natural). Este producto de PCR se clonó en la ventana RsrII-BssHII de p3/7 para dar el pPIV3-3/7, reconstruyendo de este modo una ribozima completa flanqueada por el terminador de T7. El fragmento SwaI-NgoMI de pPIV3-3/7 se clonó en las ventanas SwaI-NgoMI de p(E*FF’GHIHKL*), dando como resultado el p(Right+). Las localizaciones de los siete marcadores de secuencia están indicadas con asteriscos.

La Figura 10 representa la construcción de p3/7(131)2G. El fragmento NgoMI-Xhol de p(Right+) se clonó en la ventana NgoMI-Xhol de p(Left+2G), dando como resultado el p3/7(131)2G. Las posiciones de los genes de HPIV3 se indican (no a escala). Las localizaciones de los marcadores de secuencia se indican con asteriscos.

La Figura 11 muestra la confirmación de secuencia de un PIV3 recombinante de sentido negativo. Se generó un fragmento de 1379 pb (nucleótidos 7334-8713) que abarcaba las mutaciones en las posiciones 7903, 7913 y 7915 mediante RT-PCR de ARN de células infectadas, y después se analizó mediante secuenciación cíclica. Las mutaciones que diferenciaban el PIV recombinante del JS wt se indican mediante flechas. La secuencia completa del nucleótido 7897 al 7922 se muestra en el margen al lado de cada gel, indicándose las tres diferencias de nucleótidos en negrita.

La Figura 12 proporciona un mapa del plásmido pTM(L)942/992/1558, que contiene el ADNc de L de PIV3 con sustituciones de aminoácidos en las posiciones 942, 992 y 1558 en la secuencia proteica de L. La posición relativa de cada cambio de codificación se indica junto con la diferencia de aminoácido y el sitio de restricción de origen natural que se suprimía deliberadamente como marcador. Los sitios de restricción usados para la clonación (Sphl, PinAI, BamHI y Nhel) se indican. La flecha muestra la dirección de la secuencia codificante de proteína L y se numera de acuerdo con la posición de aminoácido.

La Figura 13 es una representación esquemática de virus PIV3 recombinantes que llevan mutaciones representativas dentro de la invención.

Las Figuras 14A y 15B ilustran la construcción de ADNc que codifica el antigenoma de PIV3-PIV1 quimérico, en el que las ORF F y HN de PIV3 se sustituyen por las de PIV1. En primer lugar (partiendo la parte inferior izquierda) los genes de HN y F de PIV3 se subclonaron (como fragmentos BspE-I I-Xho I y EcoR I-Spe I) a partir del clon de ADNc de PIV3 de longitud completa p3/7 (131) 2G (panel A) para generar pLit.PIV3.F3a y pLit.PIV3.HN4 (panel B), respectivamente. Se realizó mutagénesis por PCR (Panel C) para delecionar las regiones codificantes completas de los genes de HN y F de PIV3 e introducir nuevos sitios de restricción (recuadrados). Se prepararon ADNc de HN y F de PIV1 a partir de ARN de células infectadas mediante RT-PCR y se clonaron en pLITMUS28 (Panel D). Estos clones, pLit.1Fwt y pLit.1HNwt, se usaron como moldes para la modificación de los genes de HN y F de PIV1 en sus codones de inicio y terminación para introducir nuevos sitios de restricción compatibles con los introducidos en las deleciones de PIV3 (Panel E). Se construyeron genes de HN y F quiméricos importando las regiones codificantes de PIV1 en las deleciones de PVI3 para generar el pLit.PIV3-1.Fhc y pLit.PIV3-1.HNhc (Panel F). El F y HN quiméricos se ensamblaron juntos para generar el pSE.PIV3-1.hc (Panel G). El segmento quimérico de F y HN se introdujo en el clon de PIV3 de longitud completa p3/7(131)2G sustituyendo su fragmento BspE I-Sph I para generar el pFLC.2G+.hc (Panel H). Los pequeños recuadros entre genes representan las regiones del final del gen, intergénica y del inicio del gen, y las líneas representan las regiones no codificantes. Las porciones sombreadas son de PIVI, los recuadros en blanco son de PIV3. Las flechas negras representan el promotor de T7, mientras que los recuadros negros representan la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV).

La Figura 15A es una diagrama de los genes F y HN quiméricos del rPIV3-1 quimérico (mitad) en paralelo con los de rPIV3/JS (parte superior; denominado alternativamente en la presente memoria rJS y rPIV3 JS wt) y PIV1/Wash64 (parte inferior). Las cuatro regiones de unión que contenían las transiciones de secuencia de PIV3 a PIV1 están recuadradas y numeradas de I a IV. Cada recuadro pequeño entre genes representa la región del final del gen, intergénica y del inicio del gen, y las líneas representan las regiones no codificantes. Se representan como flechas los cebadores de RT-PCR específicos para los genes de L y M de PIV3 (pareja de cebadores A en la parte superior) o específicos para los genes de HN y M de PIV1 (pareja de cebadores B en la parte inferior) usados en las Figuras 14A y 14B.

La Figura 15B muestra una evaluación de los productos de RT-PCR generados usando ARN de virión (ARNv) como molde y las parejas de cebadores específicas de PIV3 o PIV1 descritas en las Figuras 14A y 14B. Se omitió la etapa de transcripción inversa en un duplicado de cada molde, según se indica, para confirmar que el producto de PCR procedía de ARN. Para rPI1V3-1, la pareja de cebadores específica de PIV3 A daba origen al producto de 4,6 kb esperado, mientras que la pareja de cebadores 3, específica para las secuencias de PIV-1, no presente en rPIV3-1, no producía producto. Se muestran en paralelo controles positivos usando ARNv de rPIV3/JS (marcado como rPIV3) o PIV1/Wash64 (marcado como PIV1).

La Figura 16 representa secuencias de uniones PIV3-PIV1 en los productos de RT-PCR de rPIV3-1 mostrados en las Figuras 14A y 14B que se determinaron. Se presenta la secuencia para cada una de las cuatro regiones de unión (Regiones I-IV) y se alinea con las regiones correspondientes de rPIV3/JS (línea superior) y PIV1/Wash64 (línea inferior), que se secuenciaron en paralelo a partir de productos de RT-PCR. Las barras verticales indican la identidad de secuencia y las regiones recuadradas indican mutaciones y sitios de restricción introducidos. El cambio de codón de Gln a Glu en el gen F quimérico está indicado por un recuadro sombreado. Están subrayados los codones de inicio y determinación.

Las Figs. 17A-17B muestran geles de secuenciación para la región III (izquierda) y IV (derecha) de productos de RT-PCR de rPIV3-1 en comparación con rPIV3 (izquierda) o PIV1 (derecha). Los codones de inicio y terminación están marcados por un recuadro, los sitios de restricción están marcados por flechas. La Figura 18 representa el crecimiento multicíclico de PIV parentales y quiméricos en cultivo tisular. Se inocularon monocapas de células LLC-MK2 con virus a una MOI de 0,01 y las células infectadas con virus se incubaron a 32 ºC en presencia de tripsina. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo tisular a intervalos de 24 horas, se congelaron y se analizaron en el mismo ensayo de DICT50 usando la hemadsorción para identificar los cultivos infectados por virus. Cada punto representa el título medio de tres cultivos separados, indicándose el E.E.. La línea horizontal de puntos indica el límite inferior de detección viral.

La Figura 19 ilustra la introducción de las tres mutaciones de gen L de cp45 en pFLC.2G+.hc, el clon de ADNc antigenómico del virus quimérico rPIV3-1. El pTM(L)942/992/1558 (A) es un clon de plásmido del gen de L que lleva las tres mutaciones encontradas en cp45. La mutación en la posición aminoacídica 942 en la proteína L de PIV3 es una sustitución de tyr (wt) a his (cp45) y se suprimió un sitio Eae I cercano para marcar este sitio. De forma similar, la mutación 992 es un cambio de leu a phe con un sitio Bsr I suprimido y la mutación 1558 es un cambio de thr a ile con un sitio Ava II suprimido. El fragmento SphI-NheI de 2,9 kb presente en pTM(L)942/992/1558 se introdujo en pFLC.2G+hc (B), llevando el plásmido el clon de ADNc de longitud completa de rPIV3-1, para dar el pFLC+hc.cp45L (C). Para las construcciones en (B) y (C), los recuadros en negro indican la localización de la ribozima del virus de la hepatitis D y el terminador de T7, las regiones sombreadas son las ORF F y HN de PIV1 y los recuadros en blanco representan secuencias derivadas de PIV3. Se usó el pFLC.2G+.hc.cp45L en la transfección para producir el virus recombinante quimérico atenuado denominado rPIV3-1. cp45L.

Descripción de las realizaciones específicas

[0027] La presente invención se refiere a composiciones y métodos para producir y modificar PIV infecciosos a partir de moléculas polinucleotídicas aisladas, preferentemente ADNc. Las partículas de PIV infecciosas se producen mediante un sistema de coexpresión recombinante que permite la introducción de cambios definidos en PIV infecciosos. Estas modificaciones son útiles en una amplia diversidad de aplicaciones, incluyendo el desarrollo de cepas vacunales vivas atenuadas que lleven mutaciones atenuantes definidas predeterminadas.

[0028] El PIV infeccioso de la invención se produce por coexpresión intracelular o sin células de una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican un ARN de genoma o antigenoma de PIV, junto con uno o más polinucleótidos que codifican proteínas virales necesarias para generar una nucleocápside que se replique y se transcriba. Entre las proteínas virales útiles para la coexpresión para producir PIV infecciosos están la proteína principal de la nucleocápside (N), la fosfoproteína de la nucleocápside (P), la proteína grande de la polimerasa (L), la proteína de fusión (F), la glicoproteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de la matriz (M). También son útiles en este contexto productos de las ORFs (open reading frames o pautas abiertas de lectura) C, D y V de PIV.

[0029] Se construyen ADNc que codifican un genoma o antigenoma de PIV para su coexpresión intracelular o in vitro con las proteínas virales necesarias para formar PIV infecciosos. Por “antigenoma de PIV” se entiende una molécula polinucleotídica de sentido positivo aislada que sirve como molde para la síntesis de genoma de PIV de progenie. Preferentemente, se construye un ADNc que es una versión de sentido positivo del genoma de PIV correspondiente al ARN intermediario replicativo, o antigenoma, para minimizar las posibilidades de hibridación con transcritos de sentido positivo de secuencias de complementación que codifiquen las proteínas necesarias para generar una nucleocápside que se replique y se transcriba.

[0030] En algunas realizaciones de la invención, el genoma o antigenoma de un PIV recombinante (PIVr) sólo tiene que contener aquellos genes o porciones de los mismos necesarios para hacer infecciosas las partículas virales o subvirales codificadas por los mismos. Además, los genes o porciones de los mismos pueden ser proporcionados mediante más de una molécula polinucleotídica, es decir, un gen puede proporcionarse por complementación o similar a partir de una molécula de nucleótido separada. En otras realizaciones, el genoma o antigenoma de PIV codifica todas las funciones necesarias para el crecimiento, la replicación y la infección viral sin la participación de un virus auxiliar o una función viral proporcionada por un plásmido o línea celular auxiliar.

[0031] Por “PIV recombinante” se entiende una partícula viral o subviral de PIV o tipo PIV derivada directa o indirectamente de un sistema de expresión recombinante o propagada a partir de partículas virales o subvirales producidas a partir del mismo. El sistema de expresión recombinante empleará un vector de expresión recombinante que comprende una unidad transcripcional unida operativamente que comprende un ensamblaje de al menos un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica de PIV, por ejemplo, un promotor, una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARN de PIV y secuencias de inicio y terminación de la transcripción apropiadas.

[0032] Para producir un PIV infeccioso a partir de un genoma o antigenoma de PIV expresado por ADNc, el genoma o antigenoma se coexpresa con las proteínas N, P y L de PIV necesarias para (i) producir una nucleocápside capaz de la replicación del ARN y (ii) hacer las nucleocápsides de la progenie competentes tanto para la replicación como para la transcripción del ARN. La transcripción por la nucleocápside del genoma proporciona las otras proteínas de PIV e inicia una infección productiva. Como alternativa, pueden suministrarse por coexpresión proteínas de PIV adicionales necesarias para una infección productiva.

[0033] La síntesis de genoma o antigenoma de PIV junto con las proteínas virales mencionadas anteriormente también puede conseguirse in vitro (sin células), por ejemplo, usando una reacción de transcripción-traducción combinada, seguida de transfección en células. Como alternativa, puede sintetizarse ARN de genoma o antigenoma in vitro y transfectarse en células que expresan proteínas de PIV.

[0034] En ciertas realizaciones de la invención, se proporcionan secuencias de complementación que codifican las proteínas necesarias para generar una nucleocápside de PIV que se replique y se transcriba mediante uno o más virus auxiliares. Dichos virus auxiliares pueden ser de tipo silvestre o mutante. Preferentemente, el virus auxiliar puede distinguirse fenotípicamente del virus codificado por el ADNc de PIV. Por ejemplo, es deseable proporcionar anticuerpos monoclonales que reaccionen inmunológicamente con el virus auxiliar, pero no con el virus codificado por el ADNc de PIV. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos neutralizantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden usarse en cromatografía de afinidad para separar el virus auxiliar del virus recombinante. Para contribuir a la obtención de dichos anticuerpos, pueden introducirse mutaciones en el ADNc de PIV para proporcionar diversidad antigénica a partir del virus auxiliar, tal como en los genes de glicoproteína HN o F.

[0035] En realizaciones alternativas de la invención, las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas están codificadas por uno o más vectores de expresión no virales, que pueden ser iguales o distintos de los que codifican el genoma o antigenoma. Pueden incluirse si se desea proteínas adicionales, cada una codificada por su propio vector o por un vector que codifique una o más de las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas, o el genoma o antigenoma completo. La expresión del genoma o antigenoma y proteínas de plásmidos transfectados puede conseguirse, por ejemplo, estando cada ADNc bajo el control de un promotor para la ARN polimerasa de T7, que a su vez se suministra por infección, transfección o transducción con un sistema de expresión para la ARN polimerasa de T7, por ejemplo, una cepa MVA de virus vaccinia recombinante que exprese la ARN polimerasa de T7 (Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995)). Las proteínas virales y/o la ARN polimerasa de T7 también pueden proporcionarse por células de mamífero transformadas o por transfección de proteína o ARNm preformado.

[0036] Puede construirse un antigenoma de PIV para usar en la presente invención, por ejemplo, ensamblando segmentos de ADNc clonados, que representan en conjunto el antigenoma completo, por reacción en cadena de la polimerasa o similar (PCR; descrita en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202 y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990), de copias obtenidas por transcripción inversa de ARNm o ARN de genoma de PIV. Por ejemplo, se genera una primera construcción que comprende ADNc que contienen el extremo a la izquierda del antigenoma, que abarca desde un promotor apropiado (por ejemplo, promotor de ARN polimerasa de T7) y se ensambla en un vector de expresión apropiado, tal como un plásmido, cósmido, fago o vector de virus ADN. El vector puede modificarse por mutagénesis y/o inserción de un polienlazador sintético que contiene sitios de restricción únicos diseñados para facilitar el ensamblaje. Para facilitar la preparación, las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas pueden ensamblarse en uno o más vectores separados. El extremo a la derecha del plásmido antigenoma puede contener secuencias adicionales si se desea, tales como una ribozima flanqueante y terminadores de la transcripción de T7 en tándem. La ribozima puede ser de tipo cabeza de martillo (por ejemplo, Grosfeld et al., (1995), anteriormente), que produciría un extremo 3’ que contiene un solo un nucleótido no viral, o puede ser cualquiera de las otras ribozimas adecuadas tales como la del virus de la hepatitis delta (Perrotta et al., Nature 350: 434-436 (1991)), que produciría una extremo 3’ libre de nucleótidos que no fueran de PIV. Los extremos a la izquierda y la derecha se unen después mediante un sitio de restricción común.

[0037] Pueden realizarse una diversidad de inserciones, deleciones y reorganizaciones de nucleótidos en el genoma o antigenoma de PIV durante o después de la construcción del ADNc. Por ejemplo, pueden sintetizarse secuencias de nucleótidos deseadas específicas e insertarse en regiones apropiadas en el ADNc usando sitios de enzimas de restricción convenientes. Como alternativa, pueden usarse técnicas tales como mutagénesis específica, barrido con alanina, mutagénesis por PCR u otros procedimientos de este tipo bien conocidos en la técnica para introducir mutaciones en el ADNc.

[0038] Los medios alternativos para construir un ADNc que codifique el genoma o antigenoma incluyen transcripción inversa-PCR usando condiciones de PCR mejoradas (por ejemplo, como describe en Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994)), para reducir el número de componentes de ADNc de subunidades hasta tan pocos como uno o dos trozos. En otras realizaciones pueden usarse promotores diferentes (por ejemplo, T3, SP6) o ribozimas diferentes (por ejemplo, la del virus de la hepatitis delta). Pueden usarse diferentes vectores de ADN (por ejemplo, cósmidos) para la propagación, para alojar mejor el genoma o antigenoma de mayor tamaño.

[0039] Pueden insertarse polinucleótidos aislados (por ejemplo, ADNc) que codifican el genoma o antigenoma en células hospedadoras apropiadas mediante transfección, electroporación, inserción mecánica, transducción o similares, en células que sean capaces de soportar una infección por PIV productiva, por ejemplo, células HEp-2, FRhL-DBS2, LLC-MK2, MRC-5 y Vero. La transfección de secuencias polinucleotídicas aisladas puede introducirse en células cultivadas, por ejemplo, mediante transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham y Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), electroporación (Neumann et al., EMBOJ. 1: 841-845 (1982)), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987), transfección mediada por lípidos catiónicos (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79 (1993)) o un reactivo de transfección disponible en el mercado, por ejemplo, LipofectACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o similar. Como se ha señalado anteriormente, en algunas realizaciones de la invención, las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas están codificadas por uno o más virus auxiliares que son fenotípicamente distinguibles de los que codifican el genoma o antigenoma. Las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas también pueden estar codificadas por uno o más vectores de expresión que pueden ser iguales o distintos de los que codifican el genoma o antigenoma, y diversas combinaciones de los mismos. Pueden incluirse proteínas adicionales si se desea, codificadas por su propio vector o por un vector que codifique una o más de las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas, o el genoma o antigenoma completo.

[0040] Las composiciones y métodos de la invención permiten un análisis y manipulación de los mecanismos patogénicos y de la biología molecular del PIV usando, por ejemplo, mutaciones definidas para alterar la función o expresión de proteínas de PIV seleccionadas. Usando estos métodos y composiciones se pueden distinguir fácilmente las mutaciones responsables de cambios fenotípicos deseados de mutaciones accidentales silenciosas y seleccionar mutaciones específicas de fenotipo para su incorporación en un genoma o antigenoma de PIV recombinante para la producción de vacunas.

[0041] Las modificaciones de PIV proporcionadas dentro de la invención están dirigidas a la producción de virus vacunales mejorados, por ejemplo, para potenciar la atenuación viral y la inmunogenicidad vacunal, para suprimir epítopos asociados con una inmunopatología indeseable, para dar cabida a la deriva antigénica, etc. Para conseguir estos y otros objetivos, las composiciones y métodos de la invención permiten que se introduzcan una amplia diversidad de modificaciones en un genoma o antigenoma de PIV para su incorporación en un PIV recombinante infeccioso. Por ejemplo, pueden añadirse genes o segmentos génicos extraños que codifiquen antígenos o epítopos protectores dentro de un clon de PIV para generar cepas de PIV capaces de inducir inmunidad tanto contra PIV como contra el virus o agente del que procedía el antígeno protector. Como alternativa, pueden insertarse genes extraños en su totalidad o en parte, que codifiquen moduladores del sistema inmune, tales como citocinas, para potenciar la inmunogenicidad de un virus vacunal.

[0042] Otras mutaciones que pueden incluirse dentro de clones de PIV de la invención incluyen, por ejemplo, la sustitución de genes heterólogos o segmentos génicos (por ejemplo, un segmento génico que codifique una cola citoplasmática de un gen de glicoproteína) con un gen o segmento génico homólogo en un clon de PIV. Como alternativa, el orden relativo de los genes dentro de un clon de PIV puede cambiarse, el promotor del genoma de PIV puede sustituirse con su homólogo de antigenoma, o un gen o genes seleccionados pueden volverse no funcionales (por ejemplo, por supresión funcional que implica la introducción de un codón de terminación para evitar la expresión del gen). Pueden realizarse otras modificaciones en un clon de PIV para facilitar manipulaciones, tales como la inserción de sitios de restricción únicos en diversas regiones codificantes o no codificantes o en otra parte. Además, pueden eliminarse secuencias génicas no traducidas para aumentar la capacidad para insertar secuencias extrañas.

[0043] Por lo tanto, al proporcionar clones infecciosos de PIV la invención permite que se produzcan de forma recombinante una amplia variedad de alteraciones dentro del genoma (o antigenoma) de PIV, produciendo mutaciones definidas que especifican cambios fenotípicos deseados. Por “clon infeccioso” se entiende un ADNc o su producto, sintético o de otro tipo, ARN capaz de incorporarse directamente en viriones infecciosos que pueden transcribirse en ARN genómico o antigenómico capaz de servir como molde para producir el genoma de partículas virales o subvirales infecciosas. Como se ha señalado anteriormente, pueden introducirse mutaciones definidas por una diversidad de técnicas convencionales (por ejemplo, mutagénesis dirigida) en una copia de ADNc del genoma o antigenoma. El uso de subfragmentos de ADNc genómico o antigenómico para ensamblar un ADNc de genoma o antigenoma completo, como se describe en la presente memoria, tiene la ventaja de que cada región puede manipularse por separado, en el que casos de ADNc pequeño proporcionan una mayor facilidad de manipulación que casos de ADNc grandes, y después ensamblarse fácilmente en un ADNc completo. Por lo tanto, el ADNc de genoma o antigenoma completo, o un subfragmento seleccionado del mismo, puede usarse como un modelo para mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Esto puede ser a través del intermedio de una forma fagémida monocatenaria, tal como usando el kit MUTA-gen o de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) o un método que use el plásmido bicatenario directamente como molde, tal como el kit de mutagénesis Chameleon de Strategene (La Jolla, CA), o mediante la reacción en cadena de la polimerasa empleando un cebador oligonucleotídico o molde que contiene la mutación o mutaciones de interés. Después, un subfragmento mutado puede ensamblarse en el ADNc de genoma o antigenoma completo. Se conocen una diversidad de otras técnicas de mutagénesis y pueden adaptarse de forma rutinaria para usarse en la producción de las mutaciones de interés en un ADNc de genoma o antigenoma de PIV de la invención.

[0044] Por lo tanto, en una realización ilustrativa se introducen mutaciones usando el kit de mutagénesis in vitro de fagémidos MUTA-gene disponible en Bio-Rad Laboratories. En resumen, se clona un ADNc que codifica un genoma o antigenoma de PIV en el plásmido pTZ18U y se usa para transformar células CJ236 (Life Technologies). Se preparan preparaciones de fagémido según se recomienda por el fabricante. Se diseñan oligonucleótidos para mutagénesis por introducción de un nucleótido alterado en la posición deseada del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el genoma o antigenoma genéticamente alterado se amplifica después.

[0045] Las mutaciones pueden variar de cambios de un solo nucleótido a la introducción, deleción o sustitución de segmentos de ADNc grandes que contienen uno o más genes o segmentos genómicos. Los segmentos genómicos pueden corresponder a dominios estructurales y/o funcionales, por ejemplo, citoplasmáticos, transmembrana o ectodominios de proteínas, sitios activos tales como sitios que median la unión u otras interacciones bioquímicas con diferentes proteínas, sitios epitópicos, por ejemplo, sitios que estimulen la unión de anticuerpos y/o respuestas inmunes mediadas por células o humorales, etc. Los segmentos genómicos útiles a este respecto varían de aproximadamente 15-35 nucleótidos en el caso de segmentos genómicos que codifican pequeños dominios funcionales de proteínas, por ejemplo, sitios epitópicos, a aproximadamente 50, 75, 100, 200-500 y 500-1.500 o más nucleótidos.

[0046] La capacidad para introducir mutaciones definidas en PIV infecciosos tienen muchas aplicaciones, incluyendo la manipulación de mecanismos inmunogénicos y patogénicos de PIV. Por ejemplo, las funciones de proteínas de PIV, incluyendo las proteínas N, P, M, F, HN y L y los productos de las ORF C, D y V pueden manipularse introduciendo mutaciones que supriman o reduzcan el nivel de expresión de proteína, o que produzcan una proteína mutante. En una modificación ejemplar de este tipo, puede modificarse una secuencia en el sitio de escisión de la proteína F y los efectos de esta modificación sobre el crecimiento en cultivos tisulares y sobre la infección y patogénesis del PIV resultante pueden determinarse de forma rutinaria en animales de experimentación.

[0047] También pueden manipularse de forma rutinaria diversas características estructurales del ARN genómico, tales como promotores, regiones intergénicas y señales de transcripción, dentro de los métodos y composiciones de la invención. Los efectos de proteínas de transactivación y secuencias de ARN de acción en cis pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, usando un ADNc de antigenoma completo en ensayos en paralelo que emplean minigenomas de PIV (Dimock, et al., J. Virol. 67: 2772-8 (1993), cuyo estado dependiente de rescate es útil en la caracterización de aquellos mutantes que puedan ser demasiado inhibidores para recuperarse en virus infecciosos independientes de replicación.

[0048] La presente invención proporciona además herramientas y métodos para distinguir fácilmente entre mutaciones accidentales silenciosas y mutaciones responsables de diferencias de fenotipo, por ejemplo, introduciendo mutaciones sospechosas, por separado y en diversas combinaciones, en el genoma o antigenoma de un PIV de tipo silvestre infeccioso (es decir, para uno o más caracteres fenotípicos tales como termosensibilidad, replicación en un hospedador seleccionado, etc.). Este procedimiento permite la identificación de mutaciones responsables de fenotipos de vacunas deseados tales como atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador, etc. Las mutaciones identificadas por estos métodos pueden introducirse después en diversas combinaciones para modificar un virus vacunal hasta un nivel de atenuación apropiado, etc., según se desee. Además, la presente invención proporciona la capacidad de combinar mutaciones de diferentes cepas de virus en una sola cepa vacunal.

[0049] Como se ha señalado anteriormente, pueden seleccionarse mutaciones incorporadas dentro de clones de PIV alterados recombinantemente basándose en su capacidad para alterar la expresión y/o función de una proteína de PIV seleccionada, produciendo un cambio fenotípico deseado, o para una diversidad de otros fines. Los cambios fenotípicos deseados incluyen, por ejemplo, cambios en el crecimiento viral en cultivo, termosensibilidad, tamaño de placas, atenuación e inmunogenicidad.

[0050] Por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma puede modificarse mediante una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótidos para especificar atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador, alteración en la expresión génica o un cambio en un epítopo inmunogénico.

[0051] En un aspecto de la invención, se identifican mutaciones que aparecen en PIV atenuados derivados biológicamente y se introducen individualmente o en combinación en un clon de PIV de longitud completa, y se determinan los fenotipos de virus recombinantes rescatados que contienen las mutaciones introducidas. En realizaciones ejemplares, se incorporan dentro de clones de PIV recombinantes cambios de aminoácidos presentados por virus mutantes derivados biológicamente sobre un PIV de tipo silvestre, por ejemplo, cambios presentados por mutantes de PIV que tienen fenotipos ts, ca o att. Estos cambios de PIV mutantes derivados biológicamente especifican características deseadas en los clones resultantes, por ejemplo, un fenotipo de atenuación especificado por una mutación adoptada del mutante de HPIV3 JS cp45. Estos cambios se introducen preferentemente en virus recombinantes usando dos o tres cambios de nucleótidos en comparación con una secuencia mutante derivada biológicamente o de tipo silvestre correspondiente, que tiene el efecto de estabilizar la mutación contra la reversión genética.

[0052] La presente invención también proporciona un PIV recombinante que tiene múltiples mutaciones determinantes de fenotipo introducidas en combinaciones seleccionadas en el genoma o antigenoma de un clon infeccioso. Este procedimiento, acoplado con la evaluación de fenotipo, proporciona un PIV recombinante mutante que tiene características deseadas tales como atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador, etc. Por lo tanto, se describen clones de PIV ejemplares en la presente memoria que incorporan una o más, y preferentemente al menos dos mutaciones atenuantes, por ejemplo, mutaciones ts, ca o att adoptadas de un mutante de PIV derivado biológicamente, tal como JS cp45. Los genes diana para adoptar mutaciones derivadas biológicamente en un PIV recombinante en este contexto incluyen la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P, la subunidad grande de la polimerasa L, la proteína de la matriz M, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN, la proteína de fusión F y los productos de las ORF C, D y V. También se fijan como objetivo secuencias extragénicas, por ejemplo, secuencias en las regiones tráiler y líder 3’ de un genoma de PIV, y en elementos de acción en cis tales como secuencias del inicio del gen y del final del gen, por ejemplo, la señal de inicio del gen de N. Las mutaciones ejemplares incorporadas en un PIV recombinante en la presente memoria incluyen una o más sustituciones de nucleótidos que determinan un cambio o cambios de aminoácidos en el gen de polimerasa L, por ejemplo, en Tyr942, Leu992 y/o Thr1558. Por ejemplo, se describen recombinantes de PIV en los que Tyr942 se sustituye por His, Leu992 se sustituye por Phe y/o The1558 se sustituye por Ile. Estas mutaciones se han incorporado con éxito en diversos recombinantes de PIV ejemplares en la presente memoria, incluyendo los recombinantes r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558 o r942/992/1558 descritos en los Ejemplos a continuación. Otras mutaciones ejemplares adoptadas de un mutante de PIV derivado biológicamente incluyen una o más mutaciones en la proteína N, incluyendo mutaciones específicas en una posición correspondiente a los restos Val96 o Ser389 de JS cp45. En aspectos más detallados, estas mutaciones se representan como Val96 a Ala o Ser389 a Ala. También se describen en los Ejemplos a continuación un PIV recombinante que codifica una sustitución de aminoácido en la proteína C, por ejemplo, una mutación en una posición que corresponde a Ile96 de JS cp45, representada preferentemente por una sustitución de Ile96 a Thr. Las mutaciones ejemplares adicionales adoptadas de mutantes de PIV derivados biológicamente incluyen una o más mutaciones en la proteína F, incluyendo mutaciones adoptadas de JS cp45 en una posición que corresponde a los restos Ile420 o Ala450 de Js cp45, representadas preferentemente por las sustituciones de aminoácidos Ile420 a Val o Ala450 a Thr. Otros recombinantes de PIV dentro de la invención adoptan una o más sustituciones de aminoácidos en la proteína HN, como se ejemplifica a continuación en la presente memoria mediante un PIV recombinante que adopta una mutación en una posición correspondiente al resto Val384 de Js cp45, representada preferentemente por la sustitución de Val384 a Ala. Otros ejemplos adicionales dentro de este aspecto de la invención incluyen un PIV recombinante que incorpora una o más mutaciones en una secuencia extragénica, por ejemplo, una secuencia líder 3’ de genoma o antigenoma de PIV recombinante. Las mutaciones ejemplares en este contexto incluyen mutaciones en el líder 3’ que aparecen en una o más posiciones que corresponden al nucleótido 23, 24 y/o 28 de JS cp45, por ejemplo, un cambio de T a C en el nucleótido 23, un cambio de C a T en el nucleótido 24 o un cambio de G a T en el nucleótido 28. Otras mutaciones extragénicas adicionales incluyen una o más mutaciones en una secuencia de inicio del gen de N, como se ejemplifica a continuación en la presente memoria mediante una mutación en la secuencia de inicio del gen de N en una posición correspondiente al nucleótido 62 de JS cp45, representada preferentemente por un cambio de A a T. Las mutaciones ejemplares anteriores adoptadas de un PIV mutante derivado biológicamente se evaluaron y se combinaron en un PIV recombinante en los Ejemplos a continuación para dar como resultado, de forma individual y/o en combinación, nuevas cepas de vacunas candidatas atenuadas, como se ejemplifica mediante los recombinantes denominados en la presente memoria rcp45, rcp45 3’NCMFHN, rcp45 3’NL, rcp45 3’N y rcp45 F. Otros recombinantes de PIV dentro de la invención incorporarán una pluralidad y hasta una dotación completa de las mutaciones presentes en uno o más de estos recombinantes ejemplares, así como mutaciones identificadas en otras cepas de PIV mutantes derivadas biológicamente identificadas y adoptadas en un PIV recombinante de acuerdo con los contenidos de la presente memoria.

[0053] Las mutaciones identificadas de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se recopilan en un “menú” y se introducen en diversas combinaciones para calibrar un virus vacunal a un nivel seleccionado de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad. En realizaciones preferidas, la invención proporciona la complementación de una o más mutaciones adoptadas de PIV derivados biológicamente, por ejemplo, mutaciones ts, ca y att, con tipos adicionales de mutaciones que implican al mismo gen o a genes diferentes. Los genes diana para mutación en este contexto también incluyen la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P, la subunidad grande de la polimerasa L, la proteína de la matriz M, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN, la proteína de fusión F y los productos de las ORF C, D y V. En un aspecto, se proporcionan PIV recombinantes en los que se produce al menos una mutación atenuante en el gen de la polimerasa de PIV L e implica una sustitución de nucleótido que especifica un fenotipo ts o att adoptado de una cepa de PIV mutante derivada biológicamente, por ejemplo, JS cp45. Los recombinantes de HPIV3 ejemplares descritos en la presente memoria incluyen los recombinantes r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558 o r942/992/1558 descritos en los Ejemplos a continuación. Estos clones de PIV ejemplares incorporan una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado un cambio de aminoácido en el gen de la polimerasa, por ejemplo, en Tyr942, Leu992 y/o Thr1558. Por ejemplo, se describen recombinantes de PIV en los que Tyr942 se sustituye por His, Leu992 se sustituye por Phe y/o Thr1558 se sustituye por Ile. Preferentemente, se incorporan dos o tres mutaciones en un codón que especifica una mutación atenuante que añade una estabilidad aumentada contra la reversión fenotípica.

[0054] En aspectos adicionales, pueden producirse una diversidad de otras alteraciones genéticas en un genoma

o antigenoma de PIV recombinante para su incorporación en un PIV recombinante infeccioso, en solitario o junto con una o más mutaciones atenuantes adoptadas de un PIV mutante derivado biológicamente. Pueden insertarse o sustituirse genes heterólogos (por ejemplo, de cepas de PIV diferentes o fuentes distintas de PIV, tales como otros virus, por ejemplo, RSV o virus del sarampión), en su totalidad o en parte, cambiarse el orden de los genes, eliminarse solapamientos de genes, sustituirse el promotor del genoma de PIV con su homólogo antigenoma e incluso delecionarse genes no esenciales completos. En un aspecto, un gen de PIV seleccionado, por ejemplo la ORF C, D o V, se deleciona funcionalmente para producir un PIV recombinante que tenga características fenotípicas novedosas, por ejemplo, un crecimiento aumentado in vitro y/o una atenuación in vivo. También puede modificarse por ingeniería genética un clon de PIV infeccioso de la invención para aumentar su inmunogenicidad e inducir un nivel de protección superior al proporcionado por la infección natural, o para suprimir epítopos asociados con reacciones inmunopatológicas indeseables. La inmunogenicidad aumentada de las vacunas producidas por la presente invención aborda uno de los mayores obstáculos para controlar el PIV, en concreto la naturaleza incompleta de la inmunidad inducida por la infección natural. En este contexto, puede insertarse un gen o genes o segmento o segmentos génicos adicionales en o próximo al genoma o antigenoma de PIV que pueda ponerse bajo el control de un conjunto común o independiente de señales de transcripción. Los genes de interés incluyen los que codifican citocinas (por ejemplo, de IL-2 a IL-15, especialmente IL-2, IL-6 e IL-12, etc.) y proteínas ricas en epítopos de células T auxiliares. La proteína adicional puede expresarse como una proteína separada o como una quimera obtenida por ingeniería genética a partir de una segunda copia de una de las proteínas de PIV, tal como HN. Esto proporciona la capacidad de modificar y mejorar la respuesta inmune contra PIV tanto cuantitativa como cualitativamente.

[0055] Otras mutaciones útiles dentro de la invención implican la sustitución del extremo 3’ del genoma con su homólogo de antigenoma, que se asocia con cambios en la replicación y la transcripción del ARN. Además, las regiones intergénicas pueden acortarse o aumentarse de longitud, o cambiarse su contenido de secuencia. En otros aspectos adicionales, un PIV útil en una formulación de vacuna puede modificarse convenientemente para dar cabida a la deriva antigénica en el virus circulante. Típicamente, la modificación será en las proteínas HN y/o F. Por ejemplo, una forma antigénica seleccionada de un gen de F o HN completo, o el segmento o segmentos que codifican regiones inmunogénicas particulares de los mismos, se incorpora en un ADNc de genoma o antigenoma de PIV por sustitución de una región homóloga en el clon infeccioso, o por adición de una o más copias del gen de modo que estén representadas varias formas antigénicas en el clon resultante. El virus de progenie producido a partir del ADNc de PIV modificado se usa después en protocolos de vacunación contra cepas emergentes.

[0056] Otras mutaciones para usar en un PIV infeccioso de la invención incluyen mutaciones en señales de acción en cis identificadas durante el análisis mutacional de minigenomas de PIV. Por ejemplo, el análisis de inserciones y deleciones de secuencias líder y tráiler y flanqueantes identifica promotores virales y señales de transcripción y proporciona una serie de mutaciones asociadas con grados variables de reducción de la replicación o transcripción del ARN. La mutagénesis por saturación (por la que cada posición se modifica a su vez en cada una de las alternativas de nucleótido) de esta señales de acción en cis también identifica mutaciones que reducen o aumentan la replicación o transcripción del ARN. Cualquiera de estas mutaciones puede insertarse en el genoma o antigenoma completo, como se describe en la presente memoria.

[0057] Pueden realizarse modificaciones adicionales en clones de PIV para facilitar las manipulaciones, tales como la inserción de sitios de restricción únicos en diversas regiones intergénicas o en otra parte. También pueden eliminarse secuencias génicas no traducidas para aumentar la capacidad de insertar secuencias extrañas.

[0058] Se realizan determinadas sustituciones, inserciones, deleciones o reorganizaciones de genes o segmentos génicos dentro del PIV recombinante de la invención (por ejemplo, sustituciones de un segmento génico que codifica una proteína o región proteica seleccionada, por ejemplo, una cola citoplasmática, un dominio transmembrana o ectodominio, un sitio o región epitópica, un sitio o región de unión, un sitio o región activa que contiene en un sitio activo, etc.) en relación estructural o funcional con un gen o segmento génico “homólogo” existente del mismo PIV o de un PIV diferente u otra fuente. Dichas modificaciones producen nuevos recombinantes que tienen los cambios fenotípicos deseados en comparación con PIV parentales o de tipo silvestre u otras cepas virales. Por ejemplo, los recombinantes de este tipo pueden expresar una proteína quimérica que tenga una cola citoplasmática y/o un dominio transmembrana de un PIV fusionado a un ectodominio de otro PIV. Otros recombinantes ejemplares de este tipo expresan regiones proteicas duplicadas, tales como regiones inmunogénicas duplicadas.

[0059] Como se usan en la presente memoria, los genes, segmentos génicos, proteínas o regiones proteicas “homólogos”, son típicamente de fuentes heterólogas (por ejemplo, de genes de PIV diferentes, o que representan el mismo gen o segmento génico (es decir, homólogo o alélico) en tipos o cepas de PIV diferentes). Los homólogos típicos seleccionados en este contexto comparten características estructurales básicas, por ejemplo, cada homólogo puede codificar una proteína o dominio estructural proteico comparable, tal como un dominio citoplasmático, dominio transmembrana, ectodominio, sitio o región de unión, sitio o región epitópica, etc. Los dominios homólogos y sus segmentos génicos codificantes abarcan una colección de especies que tienen una variedad de tamaño y variaciones de secuencia definidas por una actividad biológica común entre las variantes de segmento génico o dominio. Por ejemplo, dos dominios proteicos seleccionados codificados por segmentos génicos homólogos dentro de la invención comparten sustancialmente la misma actividad cualitativa, tal como proporcionar una función transmembrana, una actividad de unión específica, un sitio de reconocimiento inmunológico, etc. Más típicamente, una actividad biológica específica compartida entre homólogos, por ejemplo, entre segmentos proteicos o proteínas seleccionadas, será sustancialmente cuantitativamente similar, es decir, no variará respecto a los niveles de actividad cuantitativa más del 30%, preferentemente no más del 20%, más preferentemente no más del 5-10%.

[0060] Los genes y segmentos génicos homólogos, así como otros polinucleótidos descritos en la presente memoria para producir un PIV recombinante dentro de la invención, comparten preferentemente una identidad de secuencia sustancial con una “secuencia de referencia” polinucleotídica seleccionada, por ejemplo, con otra secuencia homóloga seleccionada. Como se usa en la presente memoria, una “secuencia de referencia” es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencia, por ejemplo, un segmento de un ADNc o gen de longitud completa, o un ADNc o secuencia génica completa. En general, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, frecuentemente una longitud de al menos 25 nucleótidos, y con frecuencia una longitud de al menos 50 nucleótidos. Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos y (2) comprender además una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, se realizan típicamente comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos por comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos sobre una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguas, en la que una secuencia polinucleotídica puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos, y en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de los dos secuencias. Pueden realizarse alineamientos de secuencias óptimos para alinear una ventana de comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de similitud de secuencia a lo largo de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos. La expresión “identidad de secuencia” significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en base a nucleótido por nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje identidad de secuencia. La expresión “identidad sustancial”, como se usa en la presente memoria, indica una característica de una secuencia polinucleotídica en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 por ciento, preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 90 al 95 por ciento, más habitualmente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que asciendan al 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia de mayor tamaño.

[0061] Además de estas relaciones de secuencias polinucleotídicas, las proteínas y regiones proteicas codificadas por un PIV recombinante de la invención también se seleccionan típicamente para que tengan relaciones conservativas, es decir, que tengan una identidad de secuencia o similitud de secuencia sustancial con polipéptidos de referencia seleccionados. Como se aplica a los polipéptidos, la expresión “identidad de secuencia” se refiere a péptidos que comparten aminoácidos idénticos en posiciones correspondientes. La expresión “similitud de secuencia” se refiere a péptidos que tienen aminoácidos idénticos o similares (es decir, sustituciones conservativas) en posiciones correspondientes. La expresión “identidad de secuencia sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando los pesos por huecos por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento o más (por ejemplo, una identidad de secuencia del 99 por ciento). La expresión “similitud sustancial" significa que dos secuencias peptídicas comparten porcentajes correspondientes de similitud de secuencia. Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la posibilidad de intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas hidroxiladas son serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas son lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las abreviaturas para los veinte aminoácidos de origen natural usados en la presente memoria siguen el uso convencional(Immunology - A Synthesis (2ª ed., E.S. Golub & D.R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991). También pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos ,-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, carboxiglutamato, -N,N,N-trimetil lisina, e-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3metilhistidina, 5-hidroxilina, -N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4hidroxiprolina). Además, los aminoácidos pueden modificarse por glicosilación, fosforilación y similares.

[0062] El PIV infeccioso producido a partir de un genoma o antigenoma expresado por ADNc puede ser cualquiera de las cepas de PIV o tipo PIV, por ejemplo, humano, bovino, murino, etc. Para suscitar una respuesta inmune protectora, la cepa PIV puede ser una que sea endógena al sujeto que se está inmunizando, tal como un PIV humano que se usa para inmunizar a seres humanos. El genoma o antigenoma puede modificarse, sin embargo, para expresar genes o segmentos génicos de PIV heterólogos o genes o segmentos génicos de otras fuentes heterólogas, por ejemplo, RSV o virus del sarampión. Por lo tanto, los PIV infecciosos destinados a su administración a seres humanos pueden ser PIV humanos que se han modificado para contener genes o segmentos génicos de un tipo de PIV bovino o murino tal como con el fin de la atenuación. El BPIV3 posee mutaciones de intervalo de hospedador que restringen su replicación en monos rhesus y seres humanos (Karron et al., anteriormente, 1995a; van Wyke Coelingh et al., 1988)). El gen o genes, mutaciones y secuencias reguladoras de acción en cis de BPVI3 que especifiquen los fenotipos deseados, por ejemplo, la restricción del intervalo de hospedador, se identificarán por su sustitución de las secuencias correspondientes en un rPIV de la invención, y su incorporación dentro de un rPIV modificado adicionalmente para desarrollar otros agentes vacunales útiles adicionales. De forma similar, las mutaciones de JS cp45 que se sabe que confieren mutaciones atenuantes del intervalo de hospedador distintas de ts para el mono rhesus (Hall et al., anteriormente, (1992)) se identificarán asimismo y se incorporarán en agentes vacunales de rPIV modificados de la invención. Como alternativa, un PIV bovino puede modificarse para contener genes que codifiquen, por ejemplo, proteínas o epítopos inmunogénicos que generen protección contra una infección por PIV humano. Por ejemplo, los genes de glicoproteína de PIV humano pueden sustituir a los genes de glicoproteína bovinos homólogos, de modo que el PIV bovino genere una respuesta inmune protectora en seres humanos contra cepas de PIV humano.

[0063] Pueden sustituirse genes individuales, segmentos génicos o un solo o múltiples nucleótidos de un PIV por una secuencia o secuencias homólogas de un PIV heterólogo u otra fuente. Por ejemplo, segmentos génicos heterólogos, tales como uno que codifica una cola citoplasmática, un dominio transmembrana o ectodominio, un sitio

o región epitópica, un sitio o región de unión, un sitio o región activa que contiene un sitio activo, etc. de una proteína seleccionada de un PIV sustituyen a un segmento génico homólogo en otro PIV para dar nuevos recombinantes, por ejemplo, recombinantes que expresen una proteína quimérica que tenga una cola citoplasmática y/o dominio transmembrana de un PIV fusionado a un ectodominio de otro dominio PIV. Los segmentos génicos preferidos a este respecto varían de aproximadamente 15-35 nucleótidos en el caso de segmentos génicos que codifican pequeños dominios funcionales de proteínas, por ejemplo, sitios epitópicos, a aproximadamente 50, 75, 100, 200500 ó 500-1.500 o más nucleótidos para segmentos génicos que codifican dominios o regiones proteicas de mayor tamaño.

[0064] Los dominios seleccionados de proteínas HN y/o F de una cepa de PIV pueden sustituirse en un clon de PIV heterólogo para producir un virus recombinante capaz de estimular una respuesta inmune de protección cruzada frente a ambas cepas de PIV en un hospedador inmunizado. Los clones de PIV modificados pueden comprender una quimera de una secuencia genómica o antigenómica de PIV humano y al menos una secuencia de PIV no humano, por ejemplo un polinucleótido que contiene secuencias tanto de PIV humano como bovino. La sustitución de una secuencia codificante o secuencia no codificante de PIV humano (por ejemplo, un promotor, el final de un gen, el inicio de un gen, un elemento intergénico u otro elemento de acción en cis) con una secuencia de PIV bovino

o murino homóloga produce recombinantes que tienen una diversidad de efectos atenuantes posibles. Por ejemplo, un efecto de intervalo de hospedador surgirá con frecuencia de un gen de PIV heterólogo que no funcione eficazmente en una célula humana, de la incompatibilidad de la secuencia o proteína heteróloga con una secuencia

o proteína de PIV humano biológicamente interactiva (por ejemplo, una secuencia o proteína que comúnmente coopere con la secuencia o proteína sustituida para la transcripción, traducción, ensamblaje, etc. viral) entre otros efectos atenuantes útiles. Otro aspecto más de la invención, la inserción de genes o segmentos génicos extraños y, en algunos casos, de secuencias de nucleótidos no codificantes, en el genoma de PIV da como resultado un aumento deseado en la longitud del genoma que causa otros efectos fenotípicos deseados adicionales. Se espera que la longitud aumentada del genoma dé como resultado la atenuación del clon de PIV resultante, dependiente en parte de la longitud del inserto. Además, la expresión de ciertas proteínas de un gen insertado en un PIV recombinante dará como resultado la atenuación del virus debido a la acción de la proteína. Esto se ha descrito para IL-2 expresado en virus vaccinia (véase, por ejemplo, Flexner et al., Nature 33: -259-62 (1987)) y también se esperaría para el interferón gamma.

[0065] Las deleciones, inserciones, sustituciones y otras mutaciones que implican cambios de genes virales completos o segmentos génicos en un PIV recombinante de la invención producen candidatos a vacunas altamente estables, que son particularmente importantes en el caso de individuos inmunodeprimidos. Muchas de estas mutaciones darán como resultado la atenuación de las cepas vacunales resultantes, mientras que otras especificarán diferentes tipos de cambios fenotípicos deseados. Por ejemplo, se conocen determinados genes virales que codifican proteínas que interfieren específicamente con la inmunidad del hospedador (véase, por ejemplo, Kato et al., EMBO. J. 16: 578-87 (1997). Se espera que la supresión de dichos genes en virus vacunales reduzca la virulencia y la patogénesis y/o mejore la inmunogenicidad.

[0066] En aspectos preferidos de la invención, los clones de PIV modificados representan una quimera de dos o más genomas de PIV humano, por ejemplo un clon que contiene secuencias polinucleotídicas de HPIV3 unidas a secuencias de uno o más PIV humanos heterólogos, tales como HPIV1 y HPIV2. Por lo tanto, los genes o segmentos génicos individuales de PIV3 humano pueden sustituirse o complementarse con genes o segmentos génicos homólogos de HPIV2 o HPIV2, o viceversa. En un ejemplo descrito a continuación en la presente memoria, la invención proporciona un clon de PIV, rPIV3-1, en el que ambos genes de glicoproteína F y HN de HPIV1 sustituyen a sus genes homólogos en un fondo HPIV3, produciendo un virus quimérico que tiene características inmunológicas representativas de ambas cepas parentales.

[0067] En aspectos adicionales de la invención, los clones de PIV o PIV quimérico que tienen otras alteraciones de genes o segmentos génicos, como se han descrito anteriormente, se modifican adicionalmente introduciendo una o más mutaciones atenuantes adoptadas de un PIV mutante derivado biológicamente, por ejemplo, HPIV3 JS cp45, para conseguir un derivado mutante quimérico atenuado, o atenuado adicionalmente. Por ejemplo, uno o más polinucleótidos codificantes o no codificantes de PIV humano pueden sustituirse con una secuencia homóloga de un PIV humano, PIV bovino o PIV murino heterólogo, como se ha descrito anteriormente, y su alteración puede combinarse con una o más mutaciones que especifican, por ejemplo, un fenotipo ts, ca o att adoptado de un mutante de PIV atenuado derivado biológicamente, para dar un virus vacunal atenuado o atenuado adicionalmente (es decir, en comparación con el clon quimérico o el virus parental derivado biológicamente). Como alternativa, la deleción funcional de un gen o segmento génico no esencial, tal como la ORF C, D o V, puede combinarse en un PIV recombinante con una o más mutaciones que especifican un fenotipo ts, ca o att a partir de mutantes de PIV derivados biológicamente para producir una cepa vacunal atenuada. Estas modificaciones combinatorias producen un PIV recombinante que tiene las características fenotípicas deseadas, por ejemplo, una producción aumentada de virus, una atenuación aumentada y/o una resistencia genética a reversión desde un fenotipo atenuado, debido a los efectos combinados de las diferentes mutaciones seleccionadas.

[0068] En un diseño de mutación combinatoria, se proporciona un PIV modificado que comprende una quimera de una secuencia genómica o antigenómica de PIV humano y al menos una secuencia de PIV no humano, por ejemplo, un polinucleótido que contiene secuencias de PIV tanto humano como bovino, y que también incorpora una o más mutaciones adoptadas de un PIV derivado biológicamente, por ejemplo, una o más mutaciones ts, ca o att de origen natural. Como alternativa, el PIV modificado puede ser una quimera de dos o más genomas de PIV humanos, por ejemplo, un polinucleótido que contiene secuencias de HPIV3 unidas a secuencias de uno o más PIV humanos heterólogos, tales como HPIV1 y HPIV2, que incorpora además una o más mutaciones ts, ca o att u otras mutaciones seleccionadas de PIV derivados biológicamente (por ejemplo, una sustitución de nucleótido que especifique un fenotipo ts, ca o att adoptado de una cepa de PIV mutante derivada biológicamente, tal como JS cp45). En aspectos más detallados, los genes o segmentos génicos individuales de PIV3 humanos se sustituyen o complementan con genes o segmentos génicos homólogos de HPIV1 o HPIV2, o viceversa, en un clon que se atenúa o se atenúa adicionalmente mediante, por ejemplo, un cambio de nucleótido que codifica una sustitución de aminoácido que confiere una mutación de ts en el gen grande de la polimerasa L. Por ejemplo, la invención proporciona clones de PIV que tienen los genes de glicoproteína HN y/o F de HPIV1 sustituyendo a sus genes homólogos en un fondo HPIV3, en los que el fenotipo del clon quimérico resultante se modifica adicionalmente mediante una mutación o mutaciones ts, ca o att codificadas dentro de uno o más de los genes de N, P, L, M, HN, F, C, D y V. Pueden realizarse diversas combinaciones de un menú de posibles mutaciones descritas en la presente memoria para calibrar un virus vacunal a un nivel seleccionado de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad, por ejemplo, para conseguir un virus quimérico inmunogénico y satisfactoriamente atenuado que tenga características inmunológicas representativas de múltiples cepas de PIV. En un aspecto, se proporcionan PIV recombinantes en los que se aparece al menos una mutación atenuante en el gen de la polimerasa L de PIV (como se ejemplifica mediante los recombinantes r942, r992, r1558, r942/992, r942/1558, r992/1558 o r942/992/1558 descritos en los Ejemplos a continuación) incorporados en un fondo de PIV quimérico. Por ejemplo, los recombinantes de PIV quiméricos útiles dentro de este aspecto de la invención tendrán uno o más genes o segmentos génicos de los genes de glicoproteína HN y/o F de, por ejemplo, HPIV1 sustituyendo a su gen o genes homólogos en un fondo heterólogo, por ejemplo, en un clon de HPIV3, e incorporarán además una o más mutaciones atenuantes, por ejemplo, sustituciones de nucleótidos que den como resultado un cambio de aminoácido en el gen de la polimerasa (tal como un cambio de Tyr a His en la posición 942, un cambio de Leu a Phe en la posición 992 y/o un cambio de Thr a Ile en la posición 1558) de un mutante de PIV derivado biológicamente. Un recombinante atenuado quimérico de este tipo ejemplificado a continuación en la presente memoria es rPIV3-1.cp45L, un derivado de rPIV3-1 que incorpora las tres mutaciones del gen de L especificadas anteriormente a partir de JS cp45.

[0069] Otras mutaciones adicionales que pueden incorporarse en un fondo de PIV quimérico para desarrollar cepas vacunales se seleccionarán a partir de mutaciones derivadas biológicamente en otros genes, o se crearán de novo en un genoma recombinante por mutagénesis dirigida convencional u otros métodos mutagénicos puramente recombinantes. Los genes diana para adoptar mutaciones derivadas biológicamente o crear nuevas mutaciones en un PIV recombinante en este contexto incluyen la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P, la subunidad grande de la polimerasa L, la proteína de la matriz M, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN, la proteína de fusión F y los productos de las ORF C, D y V. También se fijan como objetivo secuencias extragénicas, por ejemplo, secuencias en las regiones tráiler o líder 3’ de un genoma de PIV. Las mutaciones ejemplares identificadas e incorporadas en un PIV recombinante no quimérico descritas anteriormente se incorporarán por lo tanto fácilmente en un fondo de PIV quimérico, por ejemplo, como se ejemplifica mediante rPIV3-1. Estas mutaciones ejemplares incluyen una o más mutaciones en la proteína N, incluyendo mutaciones específicas en una posición que corresponde a los restos Val96 o Ser389 de JS cp45. En aspectos más detallados, estas mutaciones se representan como Val96 a Ala o Ser389 a Ala. También se desean para su incorporación en recombinantes de PIV quiméricos mutaciones en la proteína C, por ejemplo, una mutación en una posición correspondiente a Ile96 de JS cp45, representada preferentemente por una sustitución de Ile96 a Thr, como se ha descrito anteriormente. Las mutaciones ejemplares adicionales para su incorporación en un fondo de PIV quimérico incluyen una o más mutaciones en la proteína F, por ejemplo, adoptadas de JS cp45 en una posición que corresponde a los restos Ile420 o Ala450, por ejemplo, sustituciones de Ile420 a Val o Ala450 a Thr. Otros recombinantes de PIV quiméricos adicionales dentro de la invención adoptarán una o más sustituciones de aminoácidos en la proteína HN, por ejemplo, una mutación en una posición correspondiente al resto Val384 de JS cp45, tal como de Val384 a Ala. Otros recombinantes quiméricos adicionales incorporarán una o más mutaciones en una secuencia extragénica, por ejemplo, una secuencia líder 3’ del genoma o antigenoma recombinante. Las mutaciones ejemplares en este contexto incluyen mutaciones en el líder 3’ que aparecen en una o más posiciones correspondientes al nucleótido 23, 24, 28 y/o 45 de JS cp45, por ejemplo, un cambio de T a C en el nucleótido 23, un cambio de C a T en el nucleótido 24, un cambio de G a T en el nucleótido 28 o un cambio de T a A en el nucleótido 45. Otras mutaciones extragénicas adicionales para su incorporación dentro de un fondo de PIV quimérico incluyen una o más mutaciones en una secuencia de inicio del gen de N, como se ejemplifica en la presente memoria, por una mutación en la secuencia de inicio del gen de N en una posición correspondiente al nucleótido 62 de JS cp45, tal como un cambio de A a T. Estas mutaciones ejemplares evaluadas y combinadas en un PIV recombinante en los Ejemplos a continuación se incorporarán fácilmente dentro de un recombinante de PIV quimérico usando los métodos y herramientas proporcionados en la presente memoria y especificarán, individualmente y/o en combinación, los cambios fenotípicos deseados para proporcionar otras cepas vacunales quiméricas atenuadas adicionales dentro de la invención.

[0070] En diseños de mutaciones combinatorias adicionales, se proporcionan PIV modificados que incorporan una

o más de las mutaciones ts, ca o att anteriores adoptadas de un PIV derivado biológicamente o generadas recombinantemente en un clon de PIV de la invención, en combinación con otra mutación distinta descrita en la presente memoria (por ejemplo, una deleción, adición o reorganización de un gen o segmento génico de N, P, L, M, HN, F, C, D o V de PIV, o un gen o segmento génico de otra fuente tal como RSV o virus del sarampión). También en este caso, pueden realizarse diversas combinaciones de un menú de mutaciones descritas en la presente memoria para calibrar el virus vacunal a un nivel seleccionado de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad. Por lo tanto, se proporcionan PIV recombinantes que presentan al menos una mutación atenuante de un mutante de PIV de derivado biológicamente, por ejemplo, una mutación en el gen de la polimerasa L de PIV que se encuentra en JS cp45, o una mutación generada recombinantemente, y que incorpora además uno o más cambios adicionales seleccionados de, por ejemplo, sustitución o introducción de un gen o segmento génico heterólogo de una fuente distinta de PIV (por ejemplo, un gen o epítopo de sarampión o RSV inmunogénico, o un gen que codifica una citocina), un cambio en el orden de los genes virales para alterar los niveles de expresión, eliminación de solapamiento de genes, sustitución de un promotor del genoma de PIV con su homólogo de antigenoma, acortamiento, aumento de la longitud o eliminación de regiones intergénicas, por ejemplo, para aumentar la capacidad para insertar secuencias extrañas, mutaciones en señales de acción en cis para reducir o aumentar la replicación o transcripción del ARN, inserción de sitios de restricción únicos o deleción de genes no esenciales incluso enteros, entre otros cambios.

[0071] Para uso vacunal, el virus producido de acuerdo con la presente invención puede usarse directamente en formulaciones de vacuna o liofilizarse, según se desee, usando protocolos de liofilización bien conocidos por el experto. El virus liofilizado se mantendrá típicamente a aproximadamente 4 ºC. Cuando esté listo para usarse, el virus liofilizado se reconstituye en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o que comprende SPG, Mg++ y HEPES, con o sin adyuvante, como se describe adicionalmente a continuación.

[0072] Las vacunas de PIV de la invención contienen como ingrediente activo una cantidad inmunogénicamente eficaz de PIV producido como se describe en la presente memoria. El virus modificado puede introducirse en un hospedador con un vehículo y/o adyuvante fisiológicamente aceptable. Son bien conocidos en la técnica vehículos útiles, e incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso como tales, o liofilizadas, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración, como se ha mencionado anteriormente. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oelato de trietanolamina, y similares. Los adyuvantes aceptables incluyen adyuvante incompleto de Freund, MPL (monofosforil lípido A 3-o-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge MA), entre muchos otros adyuvantes adecuados bien conocidos en la técnica.

[0073] Tras la inmunización con una composición de PIV como se describe en la presente memoria, mediante aerosol, gota, por vía oral, tópica u otra vía, el sistema inmune del hospedador responde a la vacuna produciendo anticuerpos específicos para proteínas virales de PIV, por ejemplo, glicoproteínas F y HN. Como resultado de la vacunación con una cantidad inmunogénicamente eficaz de PIV producido como se describe en la presente memoria, el hospedador se vuelve al menos parcialmente o completamente inmune a la infección por PIV, o resistente a desarrollar una infección por PIV de moderada o grave, particularmente del tracto respiratorio inferior.

[0074] El hospedador al que se administran las vacunas puede ser cualquier mamífero que sea susceptible a la infección por PIV o un virus estrechamente relacionado, y siendo dicho hospedador capaz de generar una respuesta inmune protectora contra los antígenos de la cepa de vacunación. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para crear vacunas para una diversidad de usos humanos y veterinarios.

[0075] Las composiciones de vacuna que contienen el PIV de la invención se administran a un hospedador susceptible a o de otro modo en riesgo de infección por PIV para aumentar las capacidades de respuesta inmune del propio hospedador. Se define que dicha cantidad es una “dosis inmunogénicamente eficaz”. En este uso, la cantidad exacta de PIV a administrar dentro de una dosis eficaz dependerá del estado de salud y del peso del hospedador, del modo de administración, de la naturaleza de la formulación, etc., pero en general variará de aproximadamente 103 a aproximadamente 106 unidades formadoras de placas (UFP) o más de virus por hospedador, más comúnmente de aproximadamente 104 a 105 UFP de virus por hospedador. En cualquier caso, las formulaciones de vacuna deberían proporcionar una cantidad de PIV modificado de la invención suficiente para proteger eficazmente al paciente hospedador frente a una infección por PIV grave o potencialmente mortal.

[0076] El PIV producido de acuerdo con la presente invención puede combinarse con virus de otros serotipos o cepas de PIV para conseguir una protección frente a múltiples serotipos o cepas de PIV. Como alternativa, la protección frente a múltiples serotipos o cepas de PIV puede conseguirse combinando epítopos protectores de múltiples serotipos o cepas modificados por ingeniería genética en un virus, como se describe en la presente memoria. Tópicamente, cuando se administran diferentes virus, estarán en una mezcla y se administrarán simultáneamente, pero también pueden administrarse por separado. La inmunización con una cepa puede proteger frente a diferentes cepas del mismo serotipo o de un serotipo diferente.

[0077] En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas de PIV de la invención con vacunas que induzcan respuestas protectoras contra otros agentes, particularmente otros virus infantiles. En otro aspecto de la invención, el PIV puede emplearse como un vector para antígenos protectores de otros patógenos, tales como virus respiratorio sincitial (RSV) o virus del sarampión, incorporando las secuencias que codifican esos antígenos protectores en el genoma o antigenoma de PIV que se usa para producir PIV infecciosos, como se describe en la presente memoria. La clonación de ADNc de RSV y otra descripción relevante para la invención se describen en las solicitudes de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente de Nº de Serie 08/534.768, 60/021.773, 08/720.132, 60/046.141, 60/047.634, y 08/892.403, y la solicitud de patente PCT PCT/US97/12269.

[0078] Pueden llevarse a cabo administraciones individuales o múltiples de las composiciones de vacuna de la invención. En neonatos y lactantes, puede ser necesaria una administración múltiple para generar niveles de inmunidad suficientes. La administración debería comenzar dentro del primer mes de vida, y a intervalos durante toda la niñez, tales como a los dos meses, seis meses, un año y dos años, según sea necesario para mantener niveles de protección suficientes frente a PIV nativo (de tipo silvestre) y/o otras infecciones víricas objeto. De forma similar, los adultos que son particularmente susceptibles a una infección por PIV grave o repetida, por ejemplo los trabajadores de atención sanitaria, los trabajadores de centros de atención de día, los miembros de familias con niños pequeños, las personas mayores y los individuos con una función cardiopulmonar comprometida, pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunes protectoras.

[0079] Los niveles de inmunidad inducida proporcionados por las vacunas de la invención pueden controlarse midiendo las cantidades de anticuerpos séricos y secretores neutralizantes. Basándose en estas mediciones, pueden ajustarse las dosificaciones de vacuna o repetirse las vacunaciones según sea necesario para mantener los niveles de protección deseados. Además, pueden ser ventajosos diferentes virus de vacuna para diferentes grupos de destinatarios. Por ejemplo, una cepa de PIV modificada por ingeniería genética que exprese una proteína adicional rica en epítopos de células T puede ser particularmente ventajosa para adultos más que para lactantes.

[0080] El PIV de la invención puede emplearse como vector para terapia génica transitoria del tracto respiratorio. De acuerdo con esta realización, el genoma o antigenoma de PIV recombinante incorpora una secuencia que es capaz de codificar un producto génico de interés. El producto génico de interés está bajo el control del mismo promotor o de un promotor diferente del que controla la expresión de PIV. El PIV infeccioso producido por coexpresión del genoma o antigenoma de PIV recombinante con las proteínas de PIV N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas, y que contiene una secuencia que codifica el producto génico de interés, se administra a un paciente. La administración es típicamente por aerosol, nebulizador u otra aplicación tópica en el tracto respiratorio del paciente que se esté tratando. El PIV recombinante se administra en una cantidad suficiente para dar como resultado la expresión de niveles terapéuticos o profilácticos del producto génico deseado. Los productos génicos representativos que pueden administrarse dentro de este método son preferentemente adecuados para una expresión transitoria, incluyendo, por ejemplo, interleucina-2, interleucina-4, interferón-gamma, GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina y otras citocinas, glucocerebrosidasa, fenilalanina hidroxilasa, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, citotoxinas, genes supresores de tumores, ARN antisentido y antígenos vacunales.

[0081] El ejemplo siguiente se proporciona a modo de ilustración, no como limitación.

EJEMPLO I

Construcción del plásmido p218 (131) que codifica ARN genómico de PIV de sentido negativo

[0082] Un clon de ADNc completo denominado p218(131) (Fig. 1; SEC ID Nº: 1) (depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, y al que se le concedió la denominación 97991) se construyó para codificar la secuencia genómica de 15462 nucleótidos completa de la cepa JS de HPIV3. Se puso una ribozima de hepatitis delta contigua al extremo 3’ de la secuencia genómica, de modo que la autoescisión produciría el extremo 3’ de HPIV3 (Perrotta y Been, Nature 350: 434-436, (1991).

[0083] Se puso un terminador de la transcripción de T7 después de la ribozima delta. El promotor de T7 se puso adyacente al extremo 5’ de la secuencia genómica, de modo que el nucleótido 5’-terminal del genoma de HPIV3 era el primer nucleótido sintetizado. En esta configuración, el ADNc codifica una copia de sentido negativo completa de ARN genómico de PIV3, que contiene el extremo terminal genómico correcto sin ningún nucleótido heterólogo adicional.

[0084] El ADNc de HPIV3 se ensambló a partir de 14 subclones solapantes (denominados A*-L, designando las letras entre paréntesis plásmidos individuales y no refiriéndose a genes virales específicos) construidos por transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ARN aislado de viriones purificados por centrifugación en gradiente de sacarosa (Stokes et al., anteriormente, 1992; Stokes et al., anteriormente, 1993). Los subclones abarcaban los nucleótidos de ARN genómicos siguientes (numerados designando el extremo 3’ como posición 1): 1-2058 (A*), 1874-3111 (A’), 3066-5140 (C), 4348-5276 (C’), 5072-6695 (D*), 5904-8532 (E), 7806-9898 (F), 9632-10740 (F’), 9760-10955 (G), 10862-11925 (H), 11835-12868 (I), 12426-13677 (J), 13630-14496 (K) y 14467-15462 (L). Cada fragmento se clonó en pBluescript KSII (Strategene, La Jolla, CA) usando técnicas de clonación convencionales y se secuenció completamente.

[0085] El plásmido p(L) se sometió después a mutagénesis dirigida para introducir el promotor de T7 mediante un intermedio de ADN monocatenario de acuerdo con el procedimiento MUTA-GENE (BioRad, Hercules, CA)). El promotor de T7 se situó de modo que la transcripción se inicie en el extreme 5’ exacto del genoma de HPIV3 usando el cebador mutagénico de sentido negativo: 5’-AATACGACTCACTATA*ACCAAACAAGAGAAG-3’ (SEC ID Nº: 2; las secuencias de T7 están en cursiva, las secuencias específicas de HPIV3 están subrayadas y el nucleótido de extremo 5’ de HPIV3, la posición genómica 15462, está indicado mediante un asterisco). Este p(L) modificado se denominó p(L*). El plásmido p(E) se modificó para dar p(E*) por el mismo método, usando el oligonucleótido mutagénico de sentido negativo 5’-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3’ (SEC ID Nº: 3) para insertar tres sustituciones de nucleótidos (subrayadas) en el gen de HN en las posiciones 7903, 7913, 7915 de HPIV3 (Fig. 1). Estas sustituciones eliminaron un sitio Hga I, insertaron un sitio Sca I y modificaron el aminoácido 370 de la proteína HN codificada de modo que se suprimía el epítopo reconocido por los anticuerpos monoclonales (mAb) 423/6 y 170/7 (van Wyke Coelingh et al., J. Virol. 61: 1473-1477, (1987). Los subclones de p (E*) a p(K) se ensamblaron por etapas en el plásmido p (L*) para dar el p(E*FF’GHIJKL*) (Fig. 1A). Este plásmido incluye los nucleótidos 590415462 de HPIV3 con el promotor de T7 adyacente al nucleótido 15462 en el extremo 5’ del genoma. Los subclones p(A*) a p(E) se ensamblaron en un segundo subclón solapante, p(A*A’CC’D*E), que contenía los nucleótidos 1-8532 de HPIV3.

[0086] Ambos subclones p(E*FF’GHIJKL*) y p(A*A’CC’D*E) se secuenciaron completamente. Además de las mutaciones puntuales introducidas descritas anteriormente, el ADNc difería de la secuencia de HPIV3 JS auténtica (Stokes et al., anteriormente, 1992) por la sustitución de un solo nucleótido en la posición 1615, que estaba dentro del gen de N, y que causaba una sustitución en el aminoácido 506 en la proteína codificada. Se encontraron otras tres sustituciones de nucleótidos en las posiciones 10355, 11333 y 15248 en el gen de L que no cambiaban la proteína codificada (Fig. 2). Estos tres cambios no codificantes se conservaron como marcadores de secuencia adicionales para identificar un virus recombinante (denominado rPIV) derivado de ADNc, y la mutación en el gen de N se corrigió como se describe más adelante.

[0087] El subclón p(A*A’CC’D*E) se modificó después para insertar la ribozima del virus de la hepatitis delta y el terminador de T7 adyacentes a la posición 1 del HPIV3. Se construyó previamente un minigenoma de HPIV3, en el que el extremo 3’ del genoma de HPIV3 (GGTGGG) (subrayado) se generó por autoescisión de una ribozima de antigenómico del virus de la hepatitis delta flanqueante (mostrada en parte en negrita) (Dimock y Collins, J. Virol. 67: 2772-2778, (1993); Perrotta y Been, anteriormente, (1991). La ribozima a su vez estaba seguida por un terminador de la transcripción de T7. Este ADNc de minigenoma se usó como molde en una reacción de PCR que modificaba la secuencia adyacente al sitio de escisión de ribozima para que fuera un sitio Sma I (CCCGGG) y colocaba un sitio ApaI (GGGCCC) en el lado cadena abajo del terminador de T7. El producto de PCR se clonó en pKSII, que se había digerido con BssHII y cuyos extremos se habían hecho romos por rellenado, produciendo el p218.

[0088] El p218 se diseñó de modo que pudiera introducirse cualquier secuencia en el sitio Sma I abierto por ligación de extremos romos y su transcrito de ARN se escindiría en el sitio de corte de la ribozima de delta (NNNGGG). El subclón de p(A*A’CC'D*E) se dirigió con Hga I y Sal I (8533), que liberaba el ADNc de HPIV3 y se rellenó con dNTP y ADN polimerasa de T4 para dar extremos terminales romos. El sitio Hga I está 10 nucleótidos cadena arriba de la posición 1 del HPIV3 y, cuando se digiere y se rellena, deja un extremo terminal romo que comienza con la posición 1 del HPIV3. El fragmento Hga I-Sal I modificado se purificó en gel y se clonó en el sitio Sma I del p218. La mutación en el gen de N (T en el nucleótido 1615) se corrigió con la secuencia wt de JS (A en el nucleótido 1615) (véase el nº de acceso de GenBank ZI1575) usando mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, (1987)). Este plásmido se denominó b218(A*A’CC’D*E) (Fig. 1).

[0089] El fragmento Xho I-Ngo MI de p(E*FF’GHIJKL*), que contenía el promotor de T7 y el ADNc de HPIV3 de los nucleótidos 7438-15462, se clonó en la ventana Xho I-Ngo MI de p218(A*A’CC’D*E) (Fig. 1). Esto unía los dos fragmentos de ADNc de HPIV3 en el nucleótido 7438 del HPIV3, produciendo un plásmido que contenía un ADNc de HPIV3 de longitud completa que codifica un ARN genómico de sentido negativo con las tres mutaciones deseadas mencionadas anteriormente en el gen de HN y tres mutaciones accidentales en el gen de L. La construcción final, denominada p218 (131) (Fig. 1; SEC ID Nº: 1) se secuenció después en su totalidad mediante secuenciación automática en el NCI Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD), usando el kit de secuenciación cíclica Taq DYE Deoxy Terminator (ABI, Foster City, CA). Esto identificó un cambio adicional en el gen de HN, en concreto un cambio de C a T en el gen de HN en la posición 7593, que cambiaba el aminoácido 263 de NH de treonina a isoleucina, que también está indicado en la Fig. 2.

EJEMPLO de referencia II

Sistema de replicación de ARN y transcripción para HPIV3

[0090] El presente ejemplo se proporciona como referencia solamente y describe composiciones y métodos para producir un sistema de replicación de ARN y transcripción reconstituido para un virus parainfluenza humano tipo 3 (HPIV3). Este sistema ejemplar se desarrolló usando componentes expresados intracelularmente a partir de plásmidos transfectados dirigidos por una ARN polimerasa de T7 suministrada por un virus vaccinia recombinante. El sistema se basa en un análogo de sentido negativo de ARN genómico de HPIV3 en el que los genes virales se delecionaron y sustituyeron con un polinucleótido que codifica la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) bacteriana. Las proteínas N, P y L se expresan a partir de plásmidos cotransfectados para dirigir una replicación de ARN y una transcripción eficaces. La transcripción de acuerdo con este ejemplo produce un ARNm poliadenilado subgenómico que puede aislarse fácilmente, por ejemplo, por cromatografía de oligo(dT). La replicación del ARN de acuerdo con este ejemplo produce un miniantigenoma y un minigenoma de progenie, que se muestra que están encapsidados basándose en la resistencia a la digestión con nucleasa microcócica.

A) Virus y células

[0091] Se proporcionó un virus vaccinia recombinante, vTF7-3, que expresa la ARN polimerasa de bacteriófago T7, como se describe por Fuerst et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8122-8126, 1986,). Se mantuvieron cultivos en monocapa de HEp-2 a 37 ºC en CO2 al 5% con OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con suero bovino fetal al 2% (FBS), sulfato de gentamicina 50 g/ml y glutamina 2 mM.

B) ADNc

[0092] Los ADNc correspondientes a las ORF de los genes de N, P y L de la cepa JS de HPIV3 (nº GenBank Z11575; Stokes et al., 1992) se clonaron individualmente en la ventana Nco I-Sal I del plásmido pTM-1, en el que la transcripción está mediada por la ARN polimerasa de T7 y la traducción por un sitio interno de entrada al ribosoma que precede a la ORF extraña (Elroy-Stein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6126-6130 (1989). Cada gen se modificó primero por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para poner un sitio Nco I o compatible con Nco I en el sitio de inicio de la traducción y un sitio Sal I en el extremo cadena abajo.

[0093] El plásmido p(131), que es similar al p218 (131) excepto por que carece de la ribozima del virus de la hepatitis delta, se usó como molde para cada PCR. Los cebadores usados para amplificar la ORF de N eran CCCTATAATTTCAACATGTTGAGCCTATTTG (SEC ID Nº: 4; cebador directo respecto al sentido positivo) y GATTAAAATGTTGGTCGACTTAGTTGCTTCC (SEC ID Nº: 5; la cursiva representa sitios de enzimas de restricción y el sitio de inicio de la traducción está en negrita). El producto de PCR, un fragmento de 1578 pb flanqueado por un sitio Afl III y Sal I, se clonó en la ventana Nco I-Sal I del pTM-1 para dar el pTM (N).

[0094] Los cebadores usados para amplificar la ORF de la fosfoproteína (P) de PIV3 eran 5’CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGATGCTAAAAACTATC-3’ (SEC ID Nº: 6; cebador directo) y 5’CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3’ (SEC ID Nº: 7; cebador inverso). Se usó un ADNc de longitud completa de la cepa JS de ARN genómico (p131) como molde para la PCR. El producto de PCR resultante era un fragmento de 1851 pb flanqueado por un sitio de restricción Nco I y Sal I (en cursiva). El producto de PCR se clonó después en la ventana Nco I-Sal I de pTM-1 para dar el pTM(P).

[0095] Se realizó una segunda PCR para amplificar la ORF de la fosfoproteína P de PIV3 sin la ORF de C. El p131 se usó de nuevo como ADNc de molde. Se usó un cebador directo diferente y el mismo cebador inverso para amplificar la ORF de P de PIV3 sin C, 5’-CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3’ (SEC ID Nº: 74; cebador directo) y 5’-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGAGTCATTGGCAATTGTTG-3’ (SEC ID Nº: 7; cebador inverso). El producto de PCR resultante era un fragmento de 1851 pb flanqueado por un sitio de restricción Nco I y Sal I (designados mediante cursiva). El nucleótido subrayado en el cebador directo representa una sustitución de nucleótido que es silenciosa en la ORF de P pero cambia el codón de inicio de la ORF de C a treonina. El siguiente codón de inicio para la ORF de C está más de 400 nucleótidos cadena abajo. Por lo tanto, sólo se produciría la proteína P. El producto de PCR se clonó después en la ventana Nco I-Sal I de pTM-1 para dar una segundo plásmido, pTM(P no C).

[0096] La ORF de L de HPIV3 se clonó en pTM-1 en tres partes: los extremos se obtuvieron de productos de PCR y el cuerpo principal era un fragmento de restricción de p218(131). El extremo cadena arriba de la ORF de L se amplificó usando los cebadores GCAAAGCGTGCCCGGGCCATGGACACTGAATCTAACAATGGC (SEC ID Nº: 8) y GAAATTCCTTAATCGATTCTCTAGATTC (SEC ID Nº: 9). Esto producía el producto de PCR de 1.020 pb L1, en el que las posiciones 8625-9645 del genoma de longitud completa estaban flanqueadas por sitios Sma I y Nco I en el extremo cadena arriba y un sitio Cla I en el extremo cadena abajo (los tres sitios están en cursiva). El extremo cadena abajo de la ORF de L se amplificó usando los cebadores CCCATCAACTGTAACATACGTAAGAAAGAC (SEC ID Nº: 10) y GGTTAGGATATGTCGACATTGTATTTATG (SEC ID Nº: 11). Esto producía el producto de PCR de 1.733 pb L2, en el que las posiciones 13, 645-15, 378 del genoma de longitud completa estaban flanqueadas por un sitio SnaB I y Sal I (en cursiva). El plásmido p (131) se digirió con Cla I y Pst I para dar el fragmento de 4.487 pb L medio, que contiene las posiciones 9.630-14.120 del genoma de longitud completa. El L1 y el L medio se unieron en el sitio Cla I común y se clonaron en la ventana Sma I-Pst I de pBluescript para dar el p(L1+L middle). El fragmento L2 se clonó después en la ventana Pst-Sal I de p(L1+L middle) para dar la ORF de L completa flanqueada por Nco I y Sal I. Esto se clonó después en la ventana Nco I-Sal I de pTM-1 para dar el pTM (L). Las secuencias de las regiones generadas por PCR de pTM(N) (SEC ID Nº: 20), pTM(P) (SEC ID Nº: 21) y pTM (L) (SEC ID Nº: 22) se confirmaron mediante el método de secuenciación con didesoxinucleótidos.

[0097] Para aumentar la eficacia de la transcripción de T7 se realizaron ciertas modificaciones en una construcción de ADNc que codifica un minigenoma de PIV de sentido negativo denominado PIV3-CAT(-) (Dimock y Collins, J. Virol. 67: 2772-2778 (1993)). El PIV3-CAT(-) incluye los 111 nucleótidos 3’-terminales y los 115 nucleótidos 5’terminales del genoma de HPIV3 fusionados a una copia de sentido negativo de la ORF de CAT. Este ADNc estaba diseñado para dar, tras las linealización con HgaI y la transcripción con ARN polimerasa de T7, un minigenoma que contenía los extremos correctos exactos del genoma de HPIV3. Se usaron dos rondas sucesivas de PCR usando oligonucleótidos mutagénicos (que añadían extensiones sucesivas al extremo de ADNc) para sustituir el sitio HgaI con la ribozima de la hepatitis delta (Perotta y Been, Nature 350: 434-436 (1991)), de modo que la autoescisión genera el extremo genómico de HPIV3 3’ correcto. Se insertó una señal de terminación de la transcripción de T7 inmediatamente después de la ribozima (Fig. 3) para dar el PIV3-CAT-delta.

[0098] Se modificó el ADNc de PIV3-CAT-delta mediante mutagénesis por PCR para insertar uno, dos o tres restos G entre el promotor de T7 y el extremo 5’ del minigenoma, usando sitios de restricción que flanquean el tráiler y el promotor de T7. Esta modificación producía una eficacia aumentada de la transcripción de T7. En experimentos preliminares, el minigenoma que contenía dos restos G, denominado PIV3-CAT-GG, era el más activo en la expresión de CAT en el sistema de replicación y transcripción reconstituido descrito a continuación, y se usó para todos los derivados posteriores.

[0099] El ADNc de PIV3-CAT-GG se modificó adicionalmente mediante mutagénesis por PCR solapante para introducir modificaciones simultáneamente en dos sitios, de la forma siguiente. En primer lugar, la secuencia T7CT, que contiene los motivos de terminación de la transcripción en tándem para la ARN polimerasa de fase temprana de virus vaccinia (T5NT) (Yuen y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6417-6421 (1987)), se insertó en la cadena de ADNc de cadena de sentido positivo entre la ribozima de delta y el terminador de la transcripción de T7 (Fig. 1). Este motivo, y un segundo motivo descrito a continuación en la presente memoria, se añadieron para evitar una transcripción promiscua del gen de CAT por la ARN polimerasa temprana de virus vaccinia. En segundo lugar, el inserto de ADNc de minigenoma se modificó en la unión entre la región no traducida de N y el gen de CAT para que contuviera (i) la inserción de un segundo motivo de terminación de virus vaccinia (T5AT) en la cadena de ADNc de sentido positivo en las posiciones 103 a 109 respecto al minigenoma codificado, y (ii) la inserción de 0 a 6 restos G (sentido negativo) en la posición 112 del minigenoma (Fig. 3). La mutagénesis por PCR solapante implicaba tres conjuntos de reacciones (PCR 1, 2 y 3) realizadas de la forma siguiente. La PCR 1 era un conjunto de siete reacciones en paralelo [PCR1 (0) a (+6)] que usaban el ADNc de PIV3-CAT-GG como molde y los dos oligonucleótidos mutagénicos siguientes como cebadores: el cebador directo era -111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG-62 (SEC ID Nº: 12) y el cebador inverso era: 124CTCCATTCTAGA (N) TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90 (SEC ID Nº: 13). La secuencia en negrita en el primer oligonucleótido es el terminador de vaccinia en tándem cadena arriba, y la secuencia en negrita en el segundo oligonucleótido es el segundo terminador. Esta reacción amplificaba la ribozima y la región líder adyacente e insertaba las mutaciones descritas anteriormente. La PCR 2 era una sola reacción que usaba el ADNc de PIV3-CATGG como molde, y un cebador directo que hibridaba en la secuencia del plásmido cadena arriba de un sitio NgoMI único (Fig. 3), y un cebador inverso complementario al cebador directo de la reacción uno. Por lo tanto, los productos de PCR 1 y 2 solapaban en esta última secuencia. Los productos de PCR 1 (0) a (+6) y PCR 2 se purificaron en gel. Los productos de PCR1 (0) a (+6) se mezclaron cada uno por separado con una alícuota de producto de PCR 2 y se amplificaron en una tercera reacción (PCR3 (0) a (+6)) que también contenía el cebador directo de la PCR 2 y el cebador inverso de la PCR 1. Los productos de PCR3 (0) a (+6) se digirieron con NgoMI, que corta en una secuencia específica de plásmido, y XbaI, que corta en el extremo cadena arriba del gen de CAT (Fig. 3), y se clonaron en la ventana NgoMI-XbaI de PIV3-CAT-GG. Esto dio como resultado un panel de ADNc que codifican minigenomas que se denominaron de acuerdo con el número de restos G insertados: PIV3-CAT 0 a PIV3-CAT +6. Las estructuras de todas las regiones de ADN obtenidas por PCR se confirmaron mediante secuenciación con didesoxinucleótidos.

C) Transfección

[0100] Se cultivaron células HEp-2 hasta una confluencia del 90% en placas de 6 pocillos. Cada pocillo de una placa de seis pocillos (1,5 X 106 células) se transfectó con 0,4 g de pTM (P), 0,4 g de pTM (N), 0,05 g de pTM (L) y 0,4 g de plásmido de minigenoma. Los plásmidos se añadieron a 0,1 ml de OptiMEM (Life Technologies) y se mezclaron con 0,1 ml de OptiMEM que contenía 12 l de LipofectACE (Life Technologies). Después de un periodo de incubación de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 0,8 ml de OptiMEM 1 que contenía suero de ternera al 2% y 1,5 X 107 ufp de vTF7-3 a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 12 horas, después de las cuales los medios se sustituyeron con OptiMEM 1 fresco que contenía suero bovino fetal al 2%. Las células se incubaron después a 37 ºC durante un total de 48 horas y se recogieron para análisis de ARN y ensayo de CAT. Cada minigenoma estaba representado por triplicado (3 pocillos) que se rasparon hacia el medio y se combinaron.

D) Ensayo de CAT

[0101] Se retiró una alícuota que representaba el 3,33% (1,5 x 105 células) de cada muestra combinada de células recogidas descrita anteriormente para ensayo de CAT. La alícuota se centrifugó a 1.000 rpm durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante. La suspensión celular se lavó con 1 ml de Tris 40 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM y se resuspendió en 50 l de Tris 0,25 M, pH 7,5. Se preparó un lisado mediante tres ciclos de congelación y descongelación y se aclaró por centrifugación a 8.000 rpm durante 5 minutos. Se ensayó 1 l de lisado para determinar la capacidad para acetilar D-treo-[dicloroacetil 1-14C]cloranfenicol (Amersham) usando un ensayo convencional (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051 (1982)). La acetilación se visualizó por cromatografía en capa fina y se cuantificó por análisis de Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

E) Análisis de ARN

[0102] La recolección de células restante de cada muestra combinada se dividió en tres partes iguales para el aislamiento de ARN encapsidado, ARN total y ARNm. Las tres alícuotas se centrifugaron a 1.000 rpm durante cinco minutos y los sobrenadantes se desecharon. Se resuspendieron dos alícuotas de suspensión celular en 50 l de RSB (NaCl 10 mM, Tris 10 mM, pH 7,5, MgCl2 1,5 mM) que contenía Triton X-100 al 1%, DOC al 0,5%. Después se añadieron a una alícuota 50 l de Tris 7,5 10 mM, CaCl2 1 mM y 20 g (solución madre 1 mg/ml) de nucleasa microcócica, y la otra recibió la misma mezcla sin nucleasa microcócica (Baker y Moyer, J. Virol. 62: 834-838 (1988)). El propósito de la nucleasa microcócica era destruir el ARN no encapsidado y las condiciones usadas se habían optimizado en experimentos preliminares. Las mezclas se incubaron a 30 ºC durante 30 min y el ARN se aisló con Trizol (Life Technologies) de acuerdo con el procedimiento del proveedor. La tercera alícuota de suspensión celular se procesó para la purificación del ARN con Trizol y el ARN purificado se separó mediante cromatografía de oligo(dT) celulosa en fracciones poliadenilada y no poliadenilada (Grosfeld et al., J. Virol. 69: 56775686 (1995)). Las muestras de ARN se procesaron en geles de agarosa al 1,5% que contenían formaldehído 0,44 M, se transfirieron a nitrocelulosa (Chomczynski, Anal. Biochem. 201: 134-139 (1992)), se hibridaron con ribosondas específicas de cadena y se cuantificaron mediante análisis de Phosphoimager.

EJEMPLO de referencia III

Construcción y expresión de minigenomas de PIV3 modificados

[0103] En el presente ejemplo, que se proporciona como referencia solamente, se construyó un panel de ADNc para codificar minigenomas de PIV3 que diferían en longitud por incrementos de un solo nucleótido. La replicación de ARN y la transcripción en este sistema reconstituido eran las más eficaces para el minigenoma cuya longitud era un múltiplo par de seis. En este contexto, los miembros de los géneros Paramyxovirus y Morbillivirus típicamente se ajustan a una “regla de seis”, es decir, los genomas (o minigenomas) se replican eficazmente sólo cuando su longitud de nucleótidos es un múltiplo de seis (se cree que es un requisito para un espaciamiento preciso de los restos nucleotídicos respecto a la proteína NP encapsidante). Sin embargo, los presentes descubrimientos ilustran que minigenomas cuyas longitudes eran de un nucleótido más o menos que un múltiplo par de seis eran sorprendentemente activos, especialmente en la replicación del ARN.

[0104] Se construyó un panel de siete ADNc para codificar siete minigenomas de PIV3-CAT, denominados PIV3CAT 0 a +6, que difieren en longitud por incrementos de un solo nucleótido (Fig. 3). Cada minigenoma es un análogo de sentido negativo corto de ARN genómico de HPIV3 en el que los genes virales se han eliminado y sustituido con una copia de sentido negativo de la ORF de CAT. La ORF de CAT está flanqueada por segmentos no traducidos de los genes de N y L, los motivos de transcripción GS de N y GE de L y los extremos terminales extragénicos líder 3’ y trailer 5’ del ARN genómico. El extremo 5’ de cada minigenoma de PIV3-CAT está definido por el promotor adyacente para la ARN polimerasa de T7. Este promotor se construyó para contribuir a una extensión de dos restos G no virales en el extremo 5’ del minigenoma codificado, como se ha descrito anteriormente. La presencia de restos G adicionales adyacentes al núcleo no transcrito del promotor de T7 mejora su eficacia de transcripción, y trabajos preliminares demostraron que la presencia de dos restos G proporcionaba los mayores niveles de actividad en el sistema reconstituido descrito a continuación. Estos dos restos G no están incluidos en los cálculos de longitud del minigenoma. El extremo de minigenoma 3’ se crea por autoescisión mediante una ribozima de virus de la hepatitis delta contigua, que generaría el nucleótido 3’-terminal correcto. Los siete minigenomas de PIV3-CAT difieren por incrementos de un solo nucleótido en la longitud debido a la inserción de 0 a 6 restos G en la unión entre la región no traducida de N y el gen de CAT (Fig. 3) y varían en longitud de 898 a 904 nucleótidos. El minigenoma de PIV3CAT +2 es el único que es un múltiplo par de seis (debería señalarse que cada minigenoma contenía dos restos G no virales adicionales en el extremo 5’ aportados por el promotor de T7, pero se asume que estos se perderían durante la replicación del ARN mediada por HPIV3 intracelular).

[0105] Cada ADNc de PIV3-CAT se usó para transfectar células HEp-2 que se habían infectado con vTF7-3, un virus vaccina recombinante que expresa la ARN polimerasa de T7. Los plásmidos que codifican las proteínas N, P y L bajo el control del promotor de T7 se transfectaron en paralelo. El ADNc de P se había modificado por mutagénesis dirigida para eliminar el sitio de inicio de la traducción de la ORF de C, como se ha descrito anteriormente. Las células se recogieron a las 48 h post-infección. Se procesó una alícuota de la suspensión celular para ensayo enzimático de CAT (Fig. 4). Las células restantes se dividieron en tres alícuotas iguales y se procesaron para el análisis del ARN como se describe a continuación.

[0106] El ADNc de minigenoma se modificó adicionalmente para contener dos motivos de terminación de la transcripción del gen temprano de virus vaccina en tándem (T7NT) en la cadena de plásmido de sentido positivo cadena arriba del inserto de PIV3-CAT, y un tercero (T5AT) en la misma cadena inmediatamente cadena arriba de la ORF de CAT. Estos estaban diseñados para minimizar la transcripción promiscua de la ORF de CAT por polimerasa de virus vaccinia (Grosfeld et al. (1995) anteriormente). La expresión de CAT se detectaba de forma reproducible cuando cada uno de los minigenomas de PIV3-CAT estaba complementado por los plásmidos N, P y L (Fig. 4) y la detección de CAT dependía de las tres proteínas de PIV3. Sin embargo, la expresión era mucho mayor para PIV3CAT+2, que tiene una longitud de nucleótidos que es un múltiplo par de seis. Se determinaron las proporciones y cantidades preferidas del minigenoma y plásmidos de soporte basándose en la expresión enzimática de CAT.

EJEMPLO de referencia IV

Síntesis de ARN de sentido positivo por minigenomas de PIV

[0107] La transcripción y la replicación de minigenomas de PIV se confirmó en este ejemplo, que se proporciona como referencia solamente, por detección de productos de ARN de ambos procedimientos. Como se ha descrito en el Ejemplo anterior, se tomaron tres alícuotas iguales de suspensión celular para el análisis de ARN. Se usó una alícuota para análisis de oligo(dT), como se describe a continuación. Las otras dos alícuotas se lisaron con detergente y se incubaron con nucleasa microcócica o se realizó un tratamiento simulado. Después, el ARN se aisló, se separó por electroforesis en geles de agarosa con formaldehído, se transfirió a nitrocelulosa y se analizó mediante hibridación con una ribosonda de CAT de sentido negativo. El ARN de lisados tratados con nucleasa microcócica y con tratamientos simulados se muestra en los paneles superior e inferior de la Fig. 5A, respectivamente.

[0108] El análisis de ARN de lisados con tratamiento simulado mostró que la complementación de cada minigenoma con los plásmidos N, P y L daba como resultado la síntesis de una banda de ARN que era muy similar en tamaño a un marcador que consistía en ARN expresado por el minigenoma RSV-CAT C2 de 931 nucleótidos (Grosfeld et al. (1995), anteriormente). El análisis de Phosphorimager se muestra en la Fig. 5B. Se detectó poco o nada de ARN cuando se omitían los plásmidos N o L, confirmando que estos ARN son productos de la polimerasa de PIV3 reconstituida.

[0109] Se espera que cada minigenoma de PIV3-CAT codifique dos ARN de sentido positivo, en concreto el ARNm de CAT subgenómico y miniantigenoma. Se espera que cada miniantigenoma sea el complementario exacto de su minigenoma, que tenía una longitud de 898 a 904 nucleótidos. El ARNm subgenómico esperado está definido por las señales GS y GE, y se espera que sea de 804 nucleótidos de longitud y contenga una cola poliA de 100 a 200 nucleótidos.

[0110] La detección de una sola banda de gel de ARN de sentido positivo en la Fig. 5A (panel inferior) sugería que el antigenoma y el ARNm no se resolvían por electroforesis en gel. Por consiguiente, el tratamiento con nucleasa microcócica se usó para identificar el ARN de antigenoma, puesto que el antigenoma (y el genoma), pero no el ARNm, estarían encapsidados y serían resistentes a la digestión. El uso de nucleasa microcócica con este fin está bien establecido (Baker y Moyer (1988), anteriormente) y las condiciones seleccionadas se verificaron con minirreplicones de RSV y demostraron degradar completamente el ARNm contenido en los lisados de células HEp-2. El ARN residual se purificó y se analizó mediante análisis de transferencia de Northern con una ribosonda de sentido negativo (Fig. 5A, panel superior) y se cuantificó mediante Phosphorimager (Fig. 5B; obsérvese que en este análisis las cantidades de ARN tratado con nucleasa microcócica y no tratado se normalizaron por separado). Estas investigaciones pusieron de manifiesto la presencia de una población de ARN protegido que correspondía al miniantigenoma encapsidado de sentido positivo. Entre varios experimentos, este ARN protegido representaba aproximadamente del 3 al 15% del ARN de sentido positivo.

[0111] Tanto para el ARN total como el resistente a nucleasa microcócica, la acumulación era mayor en el caso del minigenoma +2, que tiene una longitud de 900 nucleótidos y, por lo tanto, es un múltiplo de seis. Sin embargo, también se acumularon cantidades importantes de ARN en el caso de los minigenomas que no mostraban una longitud correspondiente a un múltiplo de seis nucleótidos, en particular los minigenomas +1 y +3, que eran un nucleótido más largos o más cortos que el minigenoma +2. De hecho, la cantidad de antigenoma encapsidado producido por los minigenomas +1 y +3 era del 85% y del 72% el del minigenoma +2 (Fig. 5B). Incluso el minigenoma de menos eficaz, el minigenoma +5, era el 20% tan activo como el minigenoma +2, según se determinó por medición del ARN encapsidado acumulado. En el caso de mediciones para detectar el ARN de sentido positivo total, los minigenomas +1 y +3 producían el 52% y el 45% tanto ARN total como el minigenoma +2.

[0112] Para confirmar la presencia de ARNm subgenómico, la alícuota final de suspensión celular recogida se procesó para la purificación del ARN. El ARN se sometió después a cromatografía de oligo (dT). Los ARN que no se unieron y los que se unieron y se eluyeron en tampón de baja concentración de sal se analizaron mediante hibridación de transferencia de Northern (Fig. 6A) y Phosphorimager (Fig. 6B; obsérvese que en este caso el unido y el no unido se normalizaron juntos respecto al ARN unido del minigenoma +2). Estos ensayos mostraban que aproximadamente el 64% del ARN de sentido positivo estaba poliadenilado, como se esperaba para el ARN subgenómico. La acumulación de ARNm era superior para el minigenoma +2. Sin embargo, también se observaron cantidades sustanciales de ARNm para los otros minigenomas. La cantidad de ARN sintetizado por los minigenomas +1 y +3 era del 30% y del 20%, respectivamente, en comparación con el sintetizado por el minigenoma +2, y era aproximadamente del 13% para los minigenomas menos activos.

EJEMPLO de referencia V

Síntesis de ARN de sentido negativo por minigenomas de PIV

[0113] Este ejemplo se proporciona solamente como referencia.

[0114] Los diversos minigenomas de PIV3-CAT descritos en los ejemplos anteriores dirigían la síntesis de ARNm y miniantigenoma encapsidado de sentido positivo, representando este último la primera etapa en la replicación del ARN. La segunda etapa en la replicación del ARN implica la síntesis de un minigenoma de progenie encapsidado a partir del producto de miniantigenoma. Para evaluar este último procedimiento, las muestras de ARN de lisados con tratamiento simulado y con tratamiento con nucleasa descritos en el Ejemplo anterior se analizaron mediante hibridación de transferencia de Northern con ribosonda de CAT de sentido positivo (Fig. 7A) y se cuantificaron mediante Phosphorimager (Fig. 7B).

[0115] El análisis de ARN de lisados con tratamiento simulado (Fig. 7A, panel inferior) mostró que se acumulaban intracelularmente cantidades considerables de minigenoma en todas las muestras, incluyendo controles negativos en los que se omitía el plásmido de soporte N o L. Los análisis descritos en las Figs. 5A-B y 6A-B mostraron que la síntesis de ARN de sentido positivo era insignificante en estas condiciones. Por lo tanto, el minigenoma observado en ausencia de N o L no podía ser el producto de la replicación de ARN mediada por la polimerasa de HPIV3 reconstituida, y en su lugar debe ser el producto de la transcripción de T7 del plásmido transfectado.

[0116] Se espera que el minigenoma producido por la polimerasa de HPIV3 reconstituida esté encapsidado, mientras que se espera que gran parte del minigenoma producido por ARN polimerasa de T7 no esté encapsidado. Por lo tanto, el ARN de las mismas muestras tratadas con nucleasa microcócica descritas para las Figs. 5A-5B se usó para preparar una segunda transferencia, que se hibridó con una ribosonda de CAT de sentido positivo (Fig. 7A, panel superior). Esto demostró que todo el ARN de minigenoma acumulado en ausencia de la proteína N se degradaba (Fig. 7A, panel superior, carril 1), como se esperaba. Esencialmente todo el minigenoma que se acumulaba en ausencia de L también era sensible a la degradación (Fig. 7A, panel superior, carril 2). El minigenoma derivado de plásmido sintetizado en ausencia de L y en presencia de N y P solamente no parecía producirse eficazmente.

[0117] Cuando estaba presente el conjunto completo de tres plásmidos de soporte, se acumulaban cantidades significativas de ARN de minigenoma resistente a nucleasa microcócica para cada uno de los minigenomas (Fig. 7A, panel superior). Como era el caso con los ARN de sentido positivo, la mayor cantidad de minigenoma de progenie se observaba con el minigenoma +2. Los minigenomas +1 y +3 eran los siguientes en abundancia, con niveles de ARN genómico que eran del 67% y del 42% el del minigenoma +2.

[0118] Los ejemplos anteriores demuestran que las proteínas N, P y L de HPIV3 eran necesarias y suficientes para una transcripción y replicación de ARN eficaz. La naturaleza muy robusta de la transcripción y replicación de ARN mediada por la polimerasa de PIV3 reconstituida confirmó la funcionalidad de las proteínas codificadas. Se espera además que la inclusión de proteínas virales adicionales dentro del sistema de expresión aumente o modifique estos procedimientos. La coexpresión de C, D y potencialmente V de PIV dentro de las composiciones y métodos de la invención será útil, por ejemplo, para aumentar y/o modificar la replicación del ARN. Con este fin, se construirán y se ensayarán plásmidos de acuerdo con los métodos anteriores para conseguir la coexpresión de uno o más de estos elementos para determinar sus efectos sobre la transcripción y replicación del ARN de PIV, así como sobre el fenotipo de PIV en modelos de infección adecuados.

EJEMPLO VI

Construcción de PIV recombinante infeccioso a partir de ADNc

[0119] Los ejemplos siguientes describen la producción de PIV recombinante infeccioso (rPIV) por coexpresión intracelular de cuatro ADNc incluidos en plásmidos. Estos ADNc codifican por separado un genoma de HPIV3 completo y la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y la proteína polimerasa L de HPIV3.

A) Virus y células

[0120] Se proporcionó la cepa de vaccinia modificada Ankara (MVA), el virus vaccinia recombinante que expresa la ARN polimerasa de bacteriófago T7, de acuerdo con Wyatt et al., Virol. 210: 202-205, 1995.

[0121] Se mantuvieron cultivos en monocapa de HEp-2 a 37 ºC en CO2 al 5% con OptiMEM 1 (Life Technologies) complementado con FBS al 2%, sulfato de gentamicina 50 g/ml y glutamina 2 mM. La cepa JS wt de HPIV3 y su derivado ts atenuado, JS cp45, se propagaron en células LLC-MK2 como se describe por Hall et al., Virus Res. 22: 173-184, (1992).

B) ADNc

[0122] El clon de ADNc completo denominado p218(131) (Fig. 1, SEC ID Nº: 1) que codifica una secuencia genómica completa de HPIV3 se construyó como se ha descrito anteriormente. Un segundo clon de ADNc denominado p3/7(131) (SEC ID Nº: 14) (depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la ATCC y al que se le concedió la denominación 97990) se construyó para codificar una secuencia antigenómica completa de HPIV3. El p3/7(131) difiere del p218(131) en que las posiciones del promotor de T7 y de la ribozima/terminador de T7 respecto al inserto de ADNc de HPIV3 se han intercambiado. Por lo tanto, el primer nucleótido sintetizado en p3/7

(131) es el extremo 5’ del antigenoma, en concreto el complementario de sentido positivo de la posición 1 del genoma, y el extremo del antigenoma 3’ definido por la escisión de la ribozima es el complementario de la posición del genoma 15462. Un tercer clon denominado p3/7(131)2G (SEC ID Nº: 15) depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la ATCC y al que se le concedió la denominación 97989) se construyó también idéntico a p3/7(131), excepto por que se insertaron dos restos G entre el extremo 5’ del antigenoma y el promotor de T7.

[0123] Para la construcción de p3/7(131)2G y p3/7(131), los dos plásmidos p(A*A’CC’D*E) y p(E*FF’GHIJKL*) se modificaron y se unieron para codificar el antigenoma de sentido positivo completo de HPIV3. En primer lugar, el terminador de T7 y la ribozima de delta contiguos al extremo 3’ de HPIV3 en p(A*A’CC’D*E) se sustituyeron por un promotor de T7 usando PCR (véase la Fig. 8). El cebador de sentido positivo 5’GGCCCGTCGACGCGTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3’ (SEC ID Nº: 18) puso el promotor de T7 (negrita) adyacente al líder 3’ de HPIV3 (secuencia de HPIV3 subrayada) con 2 restos G insertados entre estos dos elementos para mejorar la transcripción. Se puso un sitio Mlu I único (en cursiva) cadena arriba del promotor de T7 para fines de clonación (Fig. 8). El cebador de sentido negativo 5’-1224CGGCATCACGTGCTAC1209-3’ (SEC ID Nº: 19) abarcaba los nucleótidos 1209-1224 del gen de N de HPIV3 e incluía un sitio Pml I único (en cursiva) presente en la secuencia de HPIV3 natural. Tanto el producto de PCR como el molde parental p218 (A*A’CC’D*E) se digirieron con Mlu I y PmlI y el producto de PCR se clonó después en la ventana Mlu I-Pml I. Se realizó una segunda reacción de PCR usando el mismo cebador de sentido negativo y un cebador de sentido positivo sin restos 2G insertados entre el promotor de T7 y el extremo 3’ de HPIV3. Estos plásmidos se denominaron p(Left + 2G) y p(Left +). La construcción de p(Left + 2G) se ilustra en la Fig. 8, y la construcción de p(Left +) siguió la misma estrategia.

[0124] El plásmido p(E*FF’GHIJKL*) se modificó por PCR para colocar la ribozima de delta y el terminador de T7 adyacentes al extremo 5’ de HPIV3 (Fig. 9). El cebador de sentido positivo: 5’GATTTGCGCGC14813AATTTAAATCATCTGG14828-3’ (SEC ID Nº: 16) introducía un sitio BssH II (en cursiva) justo cadena arriba de un sitio Swa I único (en cursiva, subrayado) en el gen de L de HPIV3 (la secuencia específica de HPIV3 está subrayada). El cebador de sentido negativo: 5’CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC15435ACCAAAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG 15435-3’ (SEC ID Nº: 17) ponía una porción de la ribozima de delta (negrita) que incluía un sitio Rsr II único de origen natural (en cursiva) adyacente al extremo 5’ del genoma de HPIV3 (de sentido negativo subrayado). Este producto de PCR se dirigió con BssH II y Rsr II y se clonó en la ventana de BssH II-Rsr II del plásmido p3/7 (Fig. 9). El plásmido p3/7 es idéntico a p218 excepto por que la ribozima de delta y el terminador de T7 están en la orientación inversa. El plásmido p3/7 que contiene la inserción mencionada anteriormente se denominó pPIV3-3/7 y contenía la ribozima de delta y el terminador de T7 completos adyacentes a los 651 nucleótidos 5’-terminales de HPIV3. El fragmento de SwaI y el NgoMI del plásmido pPIV3-3/7 se aislaron después y se clonaron en la ventana SwaI-NgoM I de p(E*FF’GHIJKL*). El plásmido resultante, denominado p(Right +) puso la ribozima de delta y el terminador de T7 completos adyacentes al extremo 5’ de HPIV3 (véase la Fig. 9). El fragmento Xho I-NgoM I de p(Right +) se clonó en la ventana Xho I-NgoM I de p(Left +) y p(Left + 2G), dando como resultado los plásmidos p3/7(131) (SEC ID Nº: 14) y p3/7(131 2G) (SEC ID Nº: 15), respectivamente (Fig. 10). Estos codifican cada uno el análogo de sentido positivo completo de ARN antigenómico de HPIV3, conteniendo el último ADNc dos restos G adyacentes al promotor de T7 para una eficacia de transcripción mejorada.

C) Transfección

[0125] Se cultivaron células HEp-2 hasta una confluencia del 90% en placas de seis pocillos. Cada pocillo de una placa de seis pocillos (1,5 X 106 células) se transfectó con los tres plásmidos de soporte descritos anteriormente, 0,4 g de pTM (P), 0,4 g de pTM (N), 0,05 g de pTM (L), junto con 5 g de ADNc de HPIV3 genómico o antigenómico de longitud completa. Los plásmidos se añadieron a 0,2 ml de OptiMEM 1 (Life Technologies) que contenía 12 l de LipofectACE (Life Technologies). Después de un periodo de incubación de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 0,8 ml de OptiMEM 1 que contenía suero bovino fetal al 2% y 1,5 X 107 ufp de MVA-T7 a cada pocillo. Los cultivos se incubaron a 32 ºC durante 12 horas, después de las cuales los medios se sustituyeron con OptiMEM 1 fresco que contenía suero bovino fetal al 2%. Los cultivos se incubaron a 32 ºC durante tres días adicionales, después se recogieron y se pasaron (denominado pase 1) sobre monocapas de HEp-2 recién preparadas. Estos cultivos de pase 1 se incubaron a 32 ºC durante cinco días, y los virus presentes en el cultivo se recogieron, se pasaron una vez en cultivos de LLC-MK2 y se caracterizaron por inhibición de la hemaglutinación

5 (HAI) como se describe (van Wyke Coelingh et al., Virol. 143: 569-582, (1985)) para determinar si poseían la mutación resistente a anticuerpos monoclonales (MARM) que marcaba el virus recuperado a partir de ADNc.

D) Secuenciación de virus recombinante

10 [0126] La presencia de marcadores de secuencia de nucleótidos en los genes de HN y L de PIV recombinante se determino por RT-PCR de ARN aislado de viriones recuperados. Se precipitó 1 ml de rPIV (1 X 105 ufp/ml, nivel de pase 2) con 200 l de polietilenglicol al 25% por incubación en hielo durante una hora y centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos. El ARN se purificó con reactivo TRIzol (Life Technologies) siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. Se realizó una RT-PCR con el kit Superscript (Life Technologies) siguiendo el

15 protocolo recomendado por el fabricante. Las reacciones de control eran idénticas excepto por que se omitió la transcriptasa inversa de la reacción para confirmar que los productos de PCR procedían únicamente de ARN del virus y no de posibles plásmidos de ADNc contaminantes. Se usaron cuatro parejas de cebadores para generar productos de PCR a partir de los nucleótidos 7334-8715, 9364-10854, 10939-15392 y 13623-15392. Los productos de PCR resultantes se secuenciaron después usando análisis de secuencia cíclico con didesoxinucleótidos (New

20 England Biolabs, Beverly, MA).

EJEMPLO VII

Recuperación de virus recombinante a partir de ADNc que codifica ARN genómico de sentido negativo

25 [0127] El plásmido p218(131) y los tres plásmidos de soporte pTM(N), pTM(P) y pTM (L) se usaron para transfectar células HEp-2 con MVA que expresa la ARN polimerasa de T7. Un grupo de control que consistía en pTM(N), pTM(P), pTM(L) y MVA se cotransfectó en células HEp-2 sin p218(131). El día cuatro, la transfección se recogió, se pasó sobre monocapas de células HEp-2 recién preparadas durante cinco días y se pasó de nuevo

30 durante 5 días en cultivos de LLC-MK2 (pase 2). El virus presente en la recolección del pase 2 se caracterizó adicionalmente mediante HAI. Los cultivos del grupo de transfección que recibió los tres plásmidos de soporte sin el clon genómico de longitud completa p218(131) no produjeron HPIV3. Se confirmó que el virus recuperado rPIV era HPIV3 puesto que reaccionaba en el ensayo de HAI con los mAb 77/5, 101/1 y 454/11, que son específicos para HPIV3 (Tabla 1). Se identificó presuntamente que procedía de ADNc porque no reaccionaba con los mAb 170/7 y

35 423/6, lo que concuerda con la mutación MARM que se había introducido en el ADNc.

TABLA 1

rJS-NS contiene la mutación MARM introducida en el ADNc de sentido negativo de longitud completa p218(131)

(Inversa) del título de anticuerpo inhibidor de la hemaglutinación del mAb indicado Virus 77/51 101/11 454/111 170/12 423/62 JS wt3 800 6400 6400 25.600 25.600

rJS-NS4 3200 25.600 6400 ≤25 ≤25 1El mAb 77/5 reconoce el epítopo de anticuerpo IIB, los mAb 101/1 y 454/11 reconocen el epítopo de anticuerpo IIIA de la glicoproteína HN, ninguno de los cuales estaba alterado en el p218(131). 2Los mAb 170/7 y 423/6 que reconocían ambos el epítopo de anticuerpo I de JSwt, no reconocían el rJS debido a la mutación MARM en este sitio. 3HPIV3 JS de tipo silvestre derivado biológicamente. Virus JS recombinante derivado de ADNc genómico de sentido negativo.

[0128] Para confirmar que el rPIV se recuperaba de hecho a partir de ADNc, se analizó en paralelo con HPIV3 de

40 cepa JS de tipo silvestre mediante RT-PCR usando cuatro parejas de cebadores que flanquean las siete mutaciones marcadoras insertadas. Cada producto de PCR obtenido dependía de la inclusión de RT, indicando que cada uno procedía de ARN y no de ADNc contaminante. La secuenciación cíclica de los cuatros productos de PCR confirmó que la secuencia del rPIV contenía cada uno de los siete marcadores, y los datos de secuenciación que muestran tres de los marcadores se ilustran en la Figura 11. Las diferencias de secuencia entre rPIV y JS wt en el gen de HN,

45 incluyendo los nucleótidos 7903, 7913 y 7915 eran fácilmente evidentes. Se llevaron a cabo análisis de secuencia similares para los otros cuatro marcadores en las posiciones de nucleótidos 7593, 10355, 11333 y 15248, y el rPIV poseía cada mutación.

[0129] Estos resultados demuestran una recuperación con éxito de rPIV infeccioso a partir de ADNc que codifica

50 un ARN genómico de sentido negativo. Esto difiere de la mayoría de informes publicados para recuperación de virus de ARN de cadena negativa no segmentada, en los que el ADNc usado para la recuperación de virus se había diseñado para codificar ARN antigenómico de sentido positivo (Baron y Barrett, anteriormente, 1997; Collins et al.,

anteriormente, 1995; Conzelmann, anteriormente, 1996; Garcin et al., anteriormente, 1995; Lawson et al., anteriormente, 1995; Radecke et al., anteriormente, 1995; Whelan et al., anteriormente, 1995). La recuperación de virus infeccioso a partir de un ADNc que codifica ARN genómico se había descrito previamente sólo en el caso del virus Sendai, y la eficacia de recuperación era mucho menor que para el ADNc que codifica ARN antigenómico (Kato 5 et al., 1996). En la mayoría de otros estudios, la recuperación de virus se consiguió con ADNc antigenómico, pero no con ADNc genómico (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). Se han señalado varios problemas potenciales que pueden explicar estos resultados refractarios, incluyendo la posible hibridación de ARN genómico codificado por ADNc con ARNm producido por los plásmidos de soporte, dando como resultado híbridos inactivos (Conzelmann, anteriormente, 1996; Lawson et al., anteriormente, 1995). También se ha señalado que la ARN polimerasa de T7

10 parece terminar preferentemente en las uniones de genes del ARN genómico, quizá porque el tracto de oligo U de la señal GE se parece a la señal natural para la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa de T7 (Whelan et al., anteriormente, 1995).

EJEMPLO VII

15 Recuperación de virus recombinante a partir de ADNc que codifica ARN antigenómico de sentido positivo

[0130] Como se ha descrito en más detalle anteriormente, se construyeron p3/7(131) y p3/7(131)2G para codificar un antigenoma de sentido positivo que dio origen a PIV recombinante. El plásmido p3/7(131)2G es idéntico al p3/7

20 (131) excepto por la adición de dos restos G entre el promotor de T7 y el primer nucleótido del antigenoma. La adición de dos restos G entre el promotor de T7 y el primer nucleótido de HPIV3 del p3/7(131)2G se basa en los ejemplos anteriores, que demuestran que la presencia de los dos restos G añadidos (al contrario que 0, 1 ó 3 restos G añadidos) producía niveles sustancialmente aumentados de replicación de minirreplicón.

25 [0131] Los dos ADNc antigenoma [p3/7(131) y p3/7(131)2G] se transfectaron por separado en células junto con los plásmidos de soporte N, P y L y se infectaron simultáneamente con el virus recombinante MVA-T7 usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para p218(131). Se recuperó virus infeccioso de cada ADNc antigenómico y se identificó presuntamente que procedía de ADNc por su incapacidad para reaccionar con los mAb 423/6 y 170/7.

30 [0132] La eficacia de la recuperación de virus se evaluó para cada uno de los ADNc de antigenoma frente al ADNc de genoma p218(131). Se realizaron doce reacciones de transfección usando el ADNc de genoma de sentido negativo p218(131) (SEC ID Nº: 1) en paralelo con doce transfecciones usando el ADNc antigenoma de sentido positivo p3/7 (131) 2G (SEC ID Nº: 15) para comparar la eficacia de la recuperación de virus a partir de los dos

35 ADNc. Se tituló un ml de la recolección de transfección de cada pocillo en células LLC-MK2 y los 2 ml restantes se pasaron (pase 1) sobre células LLC-MK2 recién preparadas. El día cinco, el pase 1 se recogió y se tituló como se ha descrito anteriormente. Se recuperó virus recombinante a partir de 12/12 pocillos transfectados con p3/7(131)2G, pero de sólo 4/12 pocillos transfectados con p218 (131). El título medio de virus presente en cultivo del virus pasado a partir del antigenoma de sentido positivo era de 105,0, casi diez veces superior al del genoma de sentido negativo,

40 que era de 104,1. Sin embargo, con una amplificación adicional, los títulos se volvieron equivalentes.

TABLA 2

Comparación de la eficacia de recuperación de virus recombinante a partir de ADNc que codifican ARN genómico o antigenómico, este último con o sin adiciones de restos 2G al promotor de T7 Nº experimento ADNc Sentido de ARN Eficacia de Título medio (log10 ufp/ml) de

transfectado codificado rescate1 virus recuperado2 Nº 1 p3/7 (131) 2G3 Antigenómico 12/12 (100%) 5,0 ± 0,27 p218(131) Genómico 4/12 (33%) 4,1 ± 0,27

Nº 2 p3/7 (131) 2G3 Antigenómico 6/6 (100%) 6,6 ± 0,18 p3/7 (131) Antigenómico 12/12 (100%) 5,3 ± 0,12 p218 (131) Genómico 5/5 (100%) 4,9 ± 0,19

1 Número de cultivos de transfección que producían rJS/número ensayado. 2 El título medio  el error estándar se determinó después de un pase de la recolección de transfección durante cinco días en células LLC-MK2. 3 Contiene 2 restos G entre el promotor de T7 y el extremo 5’ del antigenoma.

[0133] La eficacia de recuperación de virus recombinante a partir de los tres plásmidos de longitud completa que

45 codifican los ARN de HPIV3 genómico o antigenómico se estudió a continuación, (i) para determinar si el ADNc genómico o antigenómico es más eficaz en la generación de virus recombinante y (ii) para determinar el efecto de dos restos G 5’ terminales extra sobre la producción de virus recombinantes (Tabla 2). Desgraciadamente, no fue posible titular directamente la recolección de transfección por titulación de placas porque el MVA-T7 residual interfería con la formación de placas de rJS en cultivos en monocapa de LLC-MK2. Por lo tanto, se comparó primero

50 la eficacia de recuperación de rJS a partir de múltiples transfecciones independientes y, como se observó en otros

experimentos, se descubrió que el rJS se recuperaba más frecuentemente de cultivos transfectados con p3/7(131)2G que de cultivos transfectados con p218(131). Puesto que cada recolección de transfección, incluyendo las de p218(131), producían rJS en otros experimentos, no era posible usar este método de análisis para comparar la eficacia relativa de la generación de virus recombinante. Por lo tanto, se estimó la cantidad relativa de virus 5 presente en la recolección de transfección cuantificando la cantidad de virus después de un pase de la recolección de transfección (Tabla 2). Puesto que cada plásmido estaba diseñado para producir un virus idéntico (rJS), las diferencias en títulos de los virus pasados se consideraron un reflejo de las diferencias en el título de virus presente en la recolección de transfección. En los experimentos anteriores, la construcción con dos restos G 5’-terminales era la más eficaz en la generación de rJS. Esto indicaba que los dos restos añadidos aumentaban de hecho la eficacia 10 de recuperación, pero el mecanismo para este pequeño aumento en la eficacia no estaba definido. Estos descubrimientos indican una ventaja pequeña pero apreciable del uso de p3/7(131)2G como sustrato para futuros experimentos diseñados para introducir mutaciones en el ADNc de HPIV3. La pequeña ventaja en la recuperación de virus recombinante a partir de p3/7(131)2G podría ser especialmente necesaria para recuperar virus que tengan mutaciones atenuantes que restrinjan la replicación in vitro. Aunque se ha recuperado VSV a partir de ADNc 15 antigenómico que incluía tres restos G en el extremo 5’-terminal, la eficacia de recuperación de virus a partir de esta construcción no se comparó con la recuperación a partir de la misma construcción que carecía de los restos extra (Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392 (1995)). Al contrario que la experiencia con el virus Sendai y el virus del sarampión, está claro que los restos G extravirales en el extremo 5’-terminal del antigenoma no son perjudiciales para la recuperación de virus recombinante y, de hecho, parecen ser ventajosos [Garcin et al.,

20 anteriormente, 1995; Radecke et al., anteriormente, 1995; Kato et al., 1996). Los plásmidos genómico y antigenómico sin dos restos de guanina 5’-terminales parecían ser igualmente eficaces en la generación de virus recombinante. Esto es al contrario que informes previos que han encontrado que el ADNc genómico es menos eficaz que el ADNc antigenómico en la generación de virus recombinante (Whelan, 1995; Kato et al., 1996).

25 [0134] La eficacia de recuperación de virus a partir de p3/7(131) (SEC ID Nº: 14) se comparó con la de p3/7(131)2G (SEC ID Nº: 15) y p218(131) (SEC ID Nº: 1) en un experimento similar al anterior. La recuperación a partir de p3/7(131) era comparable a la de p217(131). La recuperación era más uniforme y eficaz con ambos ADNc antigenoma que contienen las G extra (Tabla 2).

30 EJEMPLO VII

Eficacia de formación de placas de rPIV a temperaturas permisivas y restrictivas

[0135] El nivel de termosensibilidad de la replicación in vitro de virus de control y rPIV derivados tanto de

35 p218(131) como de p3/7(131)2G se determinó a 32 ºC, 37 ºC, 39 ºC y 40 ºC en cultivos en monocapa de LLC-MK2 como se ha descrito anteriormente (Hall et al., Virus Res. 22: 173-184, (1992)), con las modificaciones siguientes. Los virus se inocularon sobre monocapas de LLC-MK2 en placas de 24 pocillos en diluciones seriadas de 10 veces que se dejó que se adsorbieran durante una hora a temperatura ambiente. Los cultivos se cubrieron después con 1 ml de L-15 complementado con glutamina 2 mM y metilcelulosa al 0,8% y las placas se incubaron después durante 5

40 días a la temperatura indicada. La capa de metilcelulosa se eliminó y la monocapa se fijó con metanol al 80% a 4 ºC durante 1 h. Las placas virales presentes en la monocapa se puntuaron usando una mezcla de dos mAb murinos anti-HN específicos de HPIV3 101/1 y 66/4 como líquido ascítico usado a una dilución de 1:500, usando un método de tinción con inmunoperoxidasa específico para anticuerpos murinos, como se ha descrito anteriormente (Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)).

45 [0136] Los virus recombinantes derivados de ADNc de sentido positivo o negativo se caracterizaron mediante ensayo de placas a 32 ºC, 37 ºC, 39 ºC y 40 ºC para determinar si eran fenotípicamente similares al virus JS wt. Los rPIV tanto de sentido positivo como de sentido negativo eran comparables con el virus JS wt a nivel de su replicación a temperaturas elevadas de 39 ºC y 40 ºC (Tabla 3). Esto es al contrario que el mutante ts JS cp45, que

50 presenta una reducción de 30 veces en el título a 37 ºC y deja de producir placas a 39 ºC o 40 ºC.

TABLA 3

El rJS se parece a su virus JS de tipo silvestre parental derivado biológicamente a nivel de replicación a una temperatura restrictiva (39 ºC-40 ºC) Título de virus (log 10 ufp/ml)

Virus

32 ºC 37 ºC 39 ºC 40 ºC

rJS-PS1 rJS-NS2 JScp453

6,16,9 6,3 6,1 7,1 4,3 6,17,1<0,7 6,6 7,0 <0,7

JS wt

6,5 6,8 6,6 6,7

1 Virus recombinante derivado del clon de sentido antigenómico p3/7(131)2G. 2 Virus recombinante derivado del clon de sentido genómico p218(131). 3 JScp45 es un mutante termosensible derivado de JS wt.

[0137] La secuencia de JS cp45 se ha determinado completamente (Stokes et al., anteriormente, 1993) y se han identificado mutaciones en los genes de líder, N, P, M, F, HN y L. Sin embargo, se desconoce qué mutación o mutaciones son responsables de los fenotipos ca, att o ts. Debido a que el rPIV ejemplar de la invención demuestra el fenotipo ts+ como el parental JS wt, pueden introducirse mutaciones de cp45 entre otras mutaciones conocidas o 5 todavía por descubrir para PIV, en solitario o en combinación, en el ADNc de longitud completa para precisar los efectos de mutaciones individuales o combinaciones de las mismas, por ejemplo, evaluando la replicación del virus recombinante que incorpora la mutación o mutaciones de interés a temperaturas elevadas. La mutación o mutaciones identificadas de este modo pueden incorporarse en agentes vacunales atenuados eficaces, como sedescribe en los Ejemplos a continuación. Éstas y otras mutaciones incorporadas en el PIV recombinante pueden

10 optimizarse adicionalmente, por ejemplo, mediante mutagénesis, para crear dos o más sustituciones de nucleótidos por codón para hacer que un virus recombinante sea más genéticamente estable que una cepa mutante derivada biológicamente.

EJEMPLO VIII

15 Replicación de rPIV en hámsteres

[0138] Se dividieron treinta y seis hámsteres sirios dorados de 16 semanas de edad en cuatro grupos de nueve y se inocularon por vía intranasal con 0,1 ml que contenían 105,5 ufp de rPIV recuperado a partir de ADNc de sentido 20 negativo, rPIV recuperado a partir de ADNc de sentido positivo, virus JS cp45 o JS wt. El día 4, los hámsteres se sacrificaron y se extirparon los pulmones y los cornetes nasales. Los pulmones se homogeneizaron en una suspensión de L-15 al 20% p/v que contenía anfotericina B 2,5 g/ml (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD), pipericilina 200 g/ml (Lederle Laboratories, Pearl River, NY) y gentamicina 50 g/ml (Quality Biologicals). Los cornetes nasales se homogeneizaron de forma similar en una suspensión de L-15 al 10% p/v. Después de la

25 homogeneización, las muestras se dividieron en alícuotas y se congelaron rápidamente en un baño de nieve carbónica-etanol. Los virus presentes en las muestras se titularon en una fecha posterior en placas de 96 pocillos de células LLC-MK2 a 32 ºC puntuando el CPE a los cinco y siete días después de la inoculación. La media del log10 de la DICT50/g se calculó para cada grupo de nueve hámsteres.

30 [0139] La Tabla 4 ilustra que el rPIV recuperado a partir de ADNc de sentido negativo y el rPIV recuperado a partir de ADNc de sentido positivo se replican sustancialmente al mismo nivel que el JS wt en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres. Esto es al contrario que el virus JS cp45, que está atenuado en cada sitio.

TABLA 4

El rJS se parece a su virus JS wt parental derivado biológicamente a nivel de replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres

Título medio de virus (log10 DICT50/g)5

Virus

Cornetes nasales Pulmones

rJS-PS1 rJS-NS2 JScp453 JS wt4

6,6  0,2 6,40,1 4,20,2 6,30,2 4,10,3 4,20,2 1,40,0 4,60,3

1 Virus recombinante recuperado usando p3/7(131)2G que codifica el antigenoma de HPIV3 de sentido positivo.

2 Virus recombinante recuperado usando p218(131) que codifica el genoma de HPIV3 de sentido negativo.

3 Mutante ts derivado biológicamente.

4 Virus parental derivado biológicamente.

5 Títulos medios  errores estándar para nueve hámsteres por grupo. 35 [0140] Por lo tanto, los rPIV ejemplares de la invención pueden conservar la capacidad de replicación en hámsteres presentada por la cepa parental JS wt derivada biológicamente, por lo que mutaciones tales como las presentes en la vacuna candidata de JS cp45 que restringen la replicación en hámsteres y otros hospedadores, incluyendo primates no humanos y seres humanos, pueden identificarse e incorporarse dentro las cepas de rPIV

40 modificadas de la invención, como se describe en los Ejemplos a continuación.

EJEMPLO IX

Identificación de sustituciones de aminoácido en HPIV3 que especifican fenotipos atenuados e 45 incorporación de mutaciones atenuantes en clones de PIV infecciosos atenuados

[0141] La capacidad para generar PIV infecciosos a partir de ADNc facilita el desarrollo de vacunas de virus

parainfluenza vivo atenuado. Más específicamente, usando los métodos y herramientas descritos en la presente

memoria puede determinarse fácilmente la base genética de la atenuación de vacunas candidatas de PIV y pueden 50 diseñarse vacunas de PIV infeccioso producidas a partir de ADNc para conseguir un nivel finamente calibrado de atenuación e inmunogenicidad. [0142] Además, las herramientas y métodos de la invención proporcionan el desarrollo de vacunas para los tres virus parainfluenza humanos, HPIV1, HPIV2 y HPIV3, que son los más importantes en la enfermedad humana. Por ejemplo, para producir y seleccionar agentes vacunales de HPIV3 eficaces dentro de la invención, pueden

5 identificarse mutaciones asociadas con fenotipos deseados de vacunas candidatas de HPIV3 derivadas biológicamente o del virus BPIV3 atenuado, por ejemplo, mutaciones atenuantes, e incorporarse en rPIV. Aplicando estos métodos, se seleccionan mutaciones atenuantes de un gran menú de mutaciones candidatas y se combinan para generar rPIV que tengan un equilibrio deseado entre atenuación e inmunogenicidad, y que conserven el fenotipo de atenuación después de la replicación en seres humanos.

10 [0143] En el presente ejemplo, se describen las bases genéticas de los fenotipos termosensible (ts) y de atenuación in vivo (att) del virus vivo atenuado PIV3 JS cp45. Se recuperaron siete virus PIV3 recombinantes ejemplares (tres virus con una sola lesión, tres virus con una lesión doble y un virus con lesión triple) a partir de ADNc antigenómico de longitud completa y se analizaron para determinar sus fenotipos ts y att. Estos recombinantes

15 llevaban una o más mutaciones por sustitución de aminoácido presentes en el gen de L de JS cp45 (como alternativa denominado en la presente memoria cp45) adoptadas dentro de un clon de ADNc del parental JS wt. Estas tres mutaciones derivadas biológicamente ejemplares están todas presentes en una cepa representativa de JS cp45 cultivada en células Vero, denominada JS cp45 Vero, depositada el 21 de agosto de 1997 bajo los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville,

20 Maryland 20852, Estados Unidos, y a la que se le concedió el número de acceso ATCC VR 2588.

[0144] Los análisis de recombinantes de PIV ejemplares presentados a continuación demuestran que cada una de las tres mutaciones ejemplares en L (Tyr942 a His, Leu992 a Phe y Thr1558 a Ile) contribuyen a los fenotipos ts y att de cp45 y son útiles para la generación de virus vacunal recombinante.

25

Virus y células

[0145] Los virus PIV3 JS wt y cp45 se cultivaron en células LLC-MK2 como se ha descrito previamente (Hall et al., Virus Res. 22:173-184 (1992)). El virus vaccinia recombinante vTF7-3 se describe en Fuerst et al., Virology 225: 419

30 422 (1996) y el virus vaccinia modificado Ankara (MVA), que expresa la polimerasa de T7, se describe en Wyatt et al., Virology 210: 202-205 (1995)

[0146] Se mantuvieron células HEp-2 (ATCC CCL 23) y LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) en OptiMEM (Life Technologies) complementado con FBS al 2% y sulfato de gentamicina (50 g/ml).

35 Construcción de mutaciones puntuales en el gen de L de PIV3

[0147] Se modificó el pUC19 para aceptar un fragmento del gen de L de PIV3 JS wt para introducir mutaciones puntuales en el gen de L mediante mutagénesis dirigida. En primer lugar, se introdujo un sitio de restricción Nhe I

40 único en el pUC19 por ligación de una pareja de oligonucleótidos complementarios (5’ GATCGATGCTAGCCC 3’ (SEC ID Nº: 23) y 5’ GATCGGGCTAGCATC 3’ (SEC ID Nº: 24)) que contenían un sitio de restricción Nhe I en el sitio Hind III de pUC19 para crear el pUC19 (N). El fragmento de Sph I (nucleótido 11317 de PIV3) a Nhe I (nucleótido 14087 de PIV3) de pTM(L), que incluye las posiciones en las que aparecen los tres cambios codificantes en cp45 y que pueden introducirse directamente en el ADNc de PIV3 de longitud completa (véase a continuación), se clonó en

45 el sitio Sph I y Nhe I de pUC19 (N) para crear el pUCL(N-S). Se introdujeron mutaciones puntuales en el pUCL(N-S) usando oligonucleótidos mutagénicos con el kit de mutagénesis Transformer (Clontech, Palo Alto, CA) con el fin de

(i) crear sustituciones de aminoácidos ejemplares en las posiciones de la proteína L 942, 992 y 1558, individualmente y en combinación, y (ii) suprimir un sitio de enzima de restricción de origen natural específico próximo a cada sustitución de codón como marcador [Véase la Tabla 5].

50 TABLA 5: Sustituciones de nucleótidos introducidas en rPIV3 que codifican sustituciones de aminoácidos del gen de la proteína L de cp45 y, como marcadores, suprimir sitios de enzimas de restricción de origen natural.

Denominación de rPIV3

Sustitución de aminoácido (de wt a cp45) Secuencia de wta Secuencia de mutante Sitio de enzima de restricción suprimido

r942

Tyr-942 a His 11468-TTACATGGCCAT 11468-TCACATGGCGAT Eae I

(SEC ID Nº: 25)

(SEC ID Nº: 26)

r992

Leu-992 a Phe 11618-TTTTGATTGGGC 11618-TTTTGATTGGGC Bsr I

(SEC ID Nº: 27)

(SEC ID Nº: 28)

r1558

Thr-1558 a Ile 13307 13307 Ava II

TGGTCCTAATACTG

TGGGCCTAATATCG

(SEC ID Nº: 29)

(SEC ID Nº: 30)

32

a. Se muestra la secuencia de nucleótidos alrededor de cada una de las tres regiones mutadas. El primer nucleótido en cada secuencia proporcionada está numerado de acuerdo con su posición en el ARN antigenómico completo. El codón implicado en cada sustitución de aminoácido está en negrita. Los sitios de enzimas de restricción de origen natural presentes en la secuencia wt y que se suprimieron para marcar la mutación están en cursiva. Los nucleótidos que se mutaron para producir una sustitución de aminoácido o eliminar un sitio de enzima de restricción están subrayados.

Las mutaciones introducidas en derivados de pUCL(N-S) se verificaron por secuenciación con didesoxinucleótidos de ADN plasmídico. El fragmento de Sph I a BamHI (nucléotido 13733) de pUCL(N-S), que contenía las mutaciones del gen de L individuales de cp45, se subclonó en los sitios Sph I a BamHI de pTM(L) para dar el pTM(L)-942, -992, 5 942/992 y -1558; las otras dobles y triples mutaciones se ensamblaron usando los sitios Pin AI y Nhe I (Fig. 12). Los plásmidos pTM(L) mutantes se ensayaron cada uno a una temperatura permisiva (32 ºC) para determinar la capacidad para dirigir la expresión del gen marcador de cloranfenicol acetil transferasa en un sistema de minirreplicón que comprende un ARN de minigenoma codificado por plásmido y las proteínas N, P y L (Durbin et al., Virology 234: 74-78 (1997)). Los diversos plásmidos de L mutantes servían de soporte a la expresión de gen

10 marcador hasta el 75-106% del nivel de L wt, indicando que cada ADNc modificado por ingeniería genética estaba libre de falsas mutaciones importantes (no se muestra). Los fragmentos de Sph I a Nhe I de cada uno de los plásmidos pTM(L) mutantes se subclonaron después en la ventana de Sph I a Nhe I del ADNc antigenómico de PIV3 JS de longitud completa p3/7(131)2G para crear siete clones de ADNc de PIV3 de longitud completa que representan cada combinación posible de las tres sustituciones.

15

Recuperación de PIV3 recombinante (rPIV3) que lleva una, dos o tres sustituciones de proteína L de cp45

[0148] Cada ADNc antigenómico de longitud completa que lleva una o más mutaciones de gen de L de cp45, junto con los tres plásmidos de soporte pTM(N), pTM(P) y pTM(L), se transfectó en células HEp-2 en placas de 6 pocillos 20 (Costar, Cambridge, MA) usando LipofectACE (Life Technologies) y MVA-T7 como se ha descrito anteriormente. Después de la incubación a 32 ºC durante 4 días, la recolección de transfección se pasó sobre células HEp-2 en placas de 6 pocillos que se incubaron a 32 ºC durante 4 días. Cada sobrenadante de pase 1 se recogió y se pasó sobre un matraz T-25 de células LLC-MK2 que se incubó a 32 ºC durante 5-6 días. El sobrenadante del pase 2 se recogió y la presencia de virus recombinante se confirmó inicialmente por tinción con inmunoperoxidasa de placas 25 de virus (Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)), con anticuerpo monoclonal anti-HN (Mab) 77/5, que se une a PIV3 JS tanto recombinante como derivado biológicamente, y Mab 423/6, que no se une a virus derivado de ADNc porque su epítopo se suprimía para servir como marcador. El virus presente en el pase 1 se sometió a dos o tres rondas de purificación de placas en células LLC-MK2 como se ha descrito anteriormente. Cada virus recombinante biológicamente clonado se amplificó dos veces en células LLC-MK2 a 32 ºC para producir virus para una 30 caracterización adicional. El virus se concentró a partir de medio aclarado mediante precipitación con polietilenglicol y se extrajo el ARN viral (ARNv) con Reactivo Trizol (Life Technologies). Se realizó la transcripción inversa (RT) sobre ARNv usando el kit Superscript II con cebadores hexaméricos aleatorios (Life Technologies). Se usó el kit de PCR de ADNc Advantage (Clontech, Palo Alto, CA) y cebadores con sentido (5’ nt 11190GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG 3’ nt-11219) (SEC ID Nº: 31) y antisentido (5’ nt 14140

35 CCTGAATTATAATAATTAACTGCAGGTCCT 3’ nt-14111) (SEC ID Nº: 32) específicos para el gen de L de PIV3 para amplificar la región que abarcaba el fragmento de Sph I a Nhe I. Los fragmentos de PCR se analizaron por digestión con cada una de las enzimas de restricción cuyos sitios de reconocimiento se habían suprimido durante la inserción de las tres mutaciones de cp45 en L (véase la Tabla 5).

40 Eficacia de formación de placas (EOP) a temperaturas permisiva y restrictiva de rPIV3 que una, dos o tres sustituciones de aminoácido de proteína L de cp45

[0149] El nivel de termosensibilidad de la formación de placas in vitro de virus de control y recombinantes se determinó a 32 ºC, 37 ºC, 38 ºC, 39 ºC, 40 ºC y 41 ºC en cultivos en monocapa de LLC-MK2 y las placas se

45 enumeraron por hemadsorción con eritrocitos de cobaya después de la eliminación de la capa de metilcelulosa. Como alternativa, las placas virales presentes en la monocapa se identificaron mediante tinción con inmunoperoxidasa con una mezcla de dos mAb murinos anti-HN específicos de PIV3 101/1 y 454/11 diluidos 1:500 (Murphy et al., anteriormente, (1990)).

50 Estudios en hámster

[0150] Se inocularon hámsteres sirios dorados de 4 a 16 semanas de edad en grupos de seis por vía intranasal con 0,1 ml de OptiMEM1 por animal que contenía 105,5 ufp de rPIV3 JS wt, virus PIV3 cp45 o uno de los rPIV3 que contienen una o más sustituciones de proteína L de cp45. El día 4 post-infección, los hámsteres se sacrificaron, se

55 extirparon los pulmones y los cornetes nasales y los virus se cuantificaron como se ha descrito anteriormente. Se calculó la media del log10 de la DICT50/g para cada grupo de seis hámsteres.

RESULTADOS

Introducción de las sustituciones de aminoácidos de proteína L de PIV3 cp45 en rPIV3 JS wt

[0151] Como se ha señalado anteriormente, las tres sustituciones de aminoácidos presentes en la proteína L de cp45 (Tabla 5) se introdujeron individualmente o en combinaciones seleccionadas en el ADNc antigenómico que codifica su cepa de PIV3 JS wt parental. Cada mutación introducida se modificó por ingeniería genética para marcarse con una mutación silenciosa que suprimía un sitio de enzima de restricción de origen natural proximal para facilitar el control de la mutación en el rPIV3 recuperado (Tabla 5, Fig. 12). El cambio de codificación en el aminoácido 1558 estaba diseñado para contener dos cambios de nucleótidos en r1558, en comparación con una sustitución de nucleótido en cp45 para reducir las posibilidades de reversión en este sitio durante la replicación in vitro o in vivo.

[0152] Se recuperaron siete rPIV3 que llevaban una, dos o las tres sustituciones de aminoácidos de cp45 en cultivo tisular por transfección de cada ADNc antigenómico junto con los plásmidos de soporte pTM(N), pTM(P) y pTM(L) y coinfección con el virus vaccinia MVA/T7 pol recombinante (Wyatt et al., anteriormente, (1995)). Cada rPIV3 poseía el marcador de resistencia a Mab que se había introducido deliberadamente en el gen de HN por ingeniería genética del ADNc antigenómico. Los rPIV3 se clonaron biológicamente mediante dos o tres ciclos de pase de placa a placa para asegurarse de que cada preparación de virus fuera genéticamente homogénea. Esta precaución se tomó porque el virus vaccinia puede mediar la recombinación entre el ADNc antigenómico y los plásmidos de soporte.

[0153] Para confirmar que cada uno de los siete rPIV3 contenía la mutación o mutaciones introducidas por ingeniería genética en el gen de L, se purificó el ARN a partir de viriones precipitados y se copió a ADNc y se amplificó mediante RT-PCR. Las reacciones de control demostraron que la etapa de RT era necesaria para la generación de productos de RT-PCR, indicando que era necesario un molde de ARN más que ADNc contaminante para la generación del producto de RT-PCR. Los productos de RT-PCR se sometieron a digestión con las tres enzimas de restricción cuyas secuencias de reconocimiento se habían suprimido como marcadores para los cambios de codificación insertados. Como se esperaba, el producto de RT-PCR de rPIV3 JS wt se escindió el número de veces apropiado por cada una de las tres enzimas, mientras que el r942/992/1558 carecía de cada uno de los tres sitios suprimidos durante la creación de los cambios de codificación de cp45 individuales. Cada uno de los otros rPIV3 carecía del sitio o sitios de restricción apropiados, indicando la presencia de las mutaciones introducidas.

Eficacia de formación de placas a 32 ºC, 37 ºC, 38 ºC, 39 ºC, 40 ºC y 41 ºC de rPIV3 que lleva mutaciones de L de cp45

[0154] Los siete rPIV3 que llevan las diversas combinaciones de sustituciones de aminoácidos de proteína L de cp45 se ensayaron para determinar su capacidad para formar placas en monocapas de LLC-MK2 a 32 ºC, 37 ºC, 38 ºC, 39 ºC, 40 ºC y 41 ºC. Como se muestra en la Tabla 6, cada rPIV3 que lleva una sustitución de aminoácido de cp45 era ts, mientras que el rPIV3 JS wt parental no veía restringida su formación de placas a ninguna temperatura ensayada. La temperatura de interrupción de la formación de placas de r942, r992 y r1558 era de 40 ºC. El r492 manifestó una reducción de 700 veces de la formación de placas a 40 ºC, indicando que su replicación se veía ligeramente reducida a esta temperatura restrictiva. Sin embargo, el tamaño de placas del r942 también se reducía enormemente a 40 ºC, lo que también indica que su replicación estaba restringida a esta temperatura en comparación con el JS wt. El r942 se veía completamente restringido en la replicación a 41 ºC (no se muestran los datos). El r992 y el r1558 reducían enormemente (una reducción de más de 1.000.000 de veces) la formación de placas a 40 ºC. Estos resultados indican que cada una de las tres mutaciones del gen de L de cp45 especifica individualmente el fenotipo ts, aunque la de la mutación r942 es algo menos restrictiva. Los virus dobles mutantes r942/1558 y el triple mutante r92/992/1558 tenían una temperatura de interrupción de 39 ºC, mientras que la de r942/992 y cp45 era de 38 ºC. El doble mutante, r992/1558 era menos ts que el mutante individual r992. El r992/1558, como el r942, veía completamente restringida su formación de placas a 41 ºC. El nivel de termosensibilidad presentado por los dobles o triples mutantes es el resultado de una interacción delicada de rPIV de las tres mutaciones que no puede predecirse a partir del nivel de termosensibilidad presentado por los mutantes individuales. Además, puesto que el r942/992/1558 era ligeramente menos ts que el cp45, también es probable que otras mutaciones fuera del gen de L contribuyan al fenotipo ts de cp45, representando por lo tanto mutaciones adicionales de interés dentro de la invención.

Tabla 6: La eficacia de formación de placas (EOP) a 32 ºC, 37 ºC, 38 ºC, 39 ºC y 40 ºC de rPIV3 que lleva uno, dos

o tres sustituciones de aminoácidos de proteína L de cp45

Virusa

Título de virus (log10 ufp/ml)

32 ºC

37 ºC 38 ºC 39 ºC 40 ºC

r942 6,8 6,8b 6,6b 6,5b 4,3b r992 6,9 6,8b 6,7b 6,1b <0,7 r1558 6,6b 6,6b 6,4b 5,0b <0,7 r942/992 6,7 6,5b 4,5b 3,0b <0,7 r942/1558 5,2 5,0b 4,0b 1,0b <0,7 r992/1558 6,7 6,7b 6,5b 5,9a 5,1b r942/992/1558 6,6 6,2b 6,2b 2,7b <0,7 cp45b 6,6 4,8 4,5b <0,7 <0,7 rPIV3 JS 8,3 8,4 8,5 8,5 8,3

a.

El virus cp45 es un virus derivado biológicamente y cada uno de los otros virus ensayados es un recombinante.

b.

Las placas eran del tamaño de puntas de alfiler.

c.

Los números subrayados representan la temperatura de interrupción de la formación de placas, que se define como la temperatura restrictiva más baja a la que se observa una reducción de 100 veces en el título en comparación con el título a 32 ºC.

[0155] Crecimiento en hámsteres. Se inocularon grupos de seis hámsteres sirios dorados por vía intranasal con

5 rPIV3 JS wt, cp45 derivado biológicamente o con rPIV3 que contiene una o más sustituciones de aminoácidos de proteína L de cp45, y se determinó la replicación de virus en los pulmones y en los cornetes nasales. En este experimento [Tabla 7] se restringió la replicación de cada uno de los rPIV3 que llevaba una sustitución de un solo aminoácido en el tracto respiratorio superior e inferior [Tabla 7]. Sin embargo, el r942, el virus menos ts, se suprimía sólo marginalmente en replicación en el tracto respiratorio superior e inferior en un segundo experimento. Estos

10 datos demuestran que dos de las tres sustituciones de aminoácidos contribuyen al fenotipo att cuando están presentes como virus recombinantes con una sola lesión. Sin embargo, la mutación 942 contribuye de hecho a la atenuación (por ejemplo, el r942/992 está más atenuado que el r992 solamente). Por lo tanto, cada una de las sustituciones de aminoácidos en L contribuye al fenotipo att actuando en solitario o de acuerdo con otra mutación de aminoácido de L. Cada uno de los dobles mutantes estaba atenuado, indicando que la pérdida de cualquiera de las

15 tres sustituciones de gen L después de la replicación in vivo deja todavía un virus atenuado. Esta es una explicación parcial del alto nivel de estabilidad observado previamente del fenotipo ts del cp45 después de la replicación in vivo. El triple mutante r942/992/1558 estaba tan restringido como cp45 para la replicación en el tracto respiratorio superior e inferior, indicando que las tres sustituciones de aminoácidos en la proteína L eran los que contribuían fundamentalmente al fenotipo att de cp45.

20 Tabla 7: El nivel de replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres de rPIV3 que lleva uno, dos o tres sustituciones de aminoácidos de proteína L de cp45 en comparación con rPIV3 JS wt y cp45a. Título medio de virus (log10 DITC50/g  E.E.b)

Virus

Cornetes nasales Pulmones

rPIV3 wt 7,4,16 5,1,49 r942 6,6  0,17 3,0,78 r992 4,4,16 3,1,11 r1558 3,8,40 4,3,34 r942/992 <1,50 <1,50 r942/1558 2,9,23 1,8,17 r992/1558 5,7,16 3,2,57 r942/992/1558 3,9,15 <1,50 cp45 4,1,27 1,6,08

a.

A grupos de seis hámsteres cada uno se les administró por vía intranasal 105,5 ufp de virus por animal en un inóculo de 0,1 ml y se extirparon los pulmones y los cornetes nasales cuatro días después.

b.

Error estándar.

c.

cp45 es un virus derivado biológicamente y los otros son recombinantes.

[0156] Para resumir los resultados anteriores, las sustituciones en las posiciones de aminoácidos de proteína L

25 992 y 1558 especificaban cada una una reducción de 1.000.000 de veces en la formación de placas en cultivo celular a 40 ºC, mientras que la sustitución en la posición 942 especificaba una reducción de 700 veces. Por lo tanto, cada una de las tres mutaciones contribuye individualmente al fenotipo ts. El triple recombinante que posee las tres mutaciones L es ligeramente menos ts que cp45, sugiriendo que hay mutaciones fuera del gen de L en cp45 que también podrían contribuir a su fenotipo ts. Dos de las tres mutaciones individuales en L contribuían cada una a la

30 replicación restringida en el tracto respiratorio superior o inferior de hámsteres, lo que explica la estabilidad observada de los fenotipos ts y att de cp45 durante la replicación in vivo. De forma importante, el nivel de termosensibilidad de cepas vacunales recombinantes in vitro era muy predictivo de la atenuación in vivo. El virus recombinante que poseía las tres mutaciones estaba tan restringido en la replicación como el mutante cp45 en el tracto respiratorio tanto superior como inferior de los hámsteres, indicando que el gen de L del virus cp45 es un componente atenuante principal de esta cepa vacunal candidata. Aunque cada mutación por sí misma especifica el fenotipo ts, cuando se ponen juntas no son solamente aditivas, sino que en su lugar influyen de algún modo entre sí. El efecto de las tres mutaciones juntas en el triple mutante parecía aliviar más que aumentar el nivel de termosensibilidad observado en los dos dobles mutantes que se evaluaron. Curiosamente, esto debería proporcionar una presión selectiva inesperada para mantener al menos algunas de las mutaciones de L de cp45, puesto que la pérdida por reversión de la sustitución 992 o 1558 aumentaría más que disminuir el nivel de termosensibilidad. Considerados en su conjunto, estos descubrimientos indican que el alto nivel de estabilidad de los fenotipos ts y att de virus cp45 es el resultado de la contribución de múltiples mutaciones ts en L al fenotipo att. La identificación de estas tres mutaciones como las mutaciones atenuantes principales de cp45 proporciona la base para controlar los virus durante todas las fases de fabricación y después de la replicación en seres humanos.

[0157] Es de interés adicional que la mutación de tirosina a histidina en la posición 942, que se podría mantener que es la sustitución más conservativa de las tres mutaciones, era la menos termosensible. La polimerasa L de PIV3 es un polipéptido grande, de 2233 aminoácidos de longitud, y se cree que es una proteína multifuncional que codifica múltiples dominios incluyendo los necesarios para la formación de un complejo con la proteína P, unión a ARN, poliadenilación del ARN, transcripción del ARN y replicación del ARN (Collins et al., anteriormente, (1996)). Las sustituciones de aminoácidos en L en las posiciones 942 y 992 se localizan próximas a regiones que están bien conservadas entre otros miembros de la familia de Paramyxovirus (Blumberg et al., Virology 164: 487-497 (1982); Galinski et al., Virology 165: 499-510 (1988)). La mutación en la posición 1558 está en una región de la polimerasa que parece compartir menos identidad de secuencia con otras polimerasas L. Aunque no se conoce el mecanismo por el que se confiere el fenotipo ts mediante la triple sustitución de aminoácido en L, es probable que estén afectados múltiples dominios y actividades de la proteína L, o que esté afectado un mecanismo común que implique diversas actividades de L.

EJEMPLO X

Identificación directa y reconstitución en virus vacunal recombinante de mutaciones en un virus HPIV tipo 3 vivo atenuado derivado biológicamente (cp45) que especifica los fenotipos de termosensibilidad, adaptación al frío y atenuación

[0158] Los Ejemplos anteriores demuestran que cada una de las tres sustituciones de aminoácidos en la proteína polimerasa L de cp45 confiere los fenotipos de termosensibilidad (ts) y atenuación (att), pero no el fenotipo de adaptación al frío (ca) (véase también, Skiadopoulos et al., J. Virol 72 (3): 1762-8, 1998). El cp45 contiene doce mutaciones adicionales en otras proteínas (N, C, M, F y HN) o secuencias de acción en cis potenciales (la región líder y la señal transcripcional del inicio del gen {GS} del gen de N) y su contribución a estos fenotipos no se ha definido hasta ahora. El presente Ejemplo caracteriza adicionalmente la base genética para los fenotipos ts, ca y att de cp45, para proporcionar todavía más información respecto a la base para el alto nivel de estabilidad observado de estos fenotipos después de la replicación de cp45 en seres humanos o primates no humanos. En un aspecto de este estudio, se construyó un virus cp45 recombinante (rcp45) que contenía las quince mutaciones específicas de cp45 usando un sistema genético inverso, y se descubrió que era esencialmente indistinguible del virus derivado biológicamente en base al tamaño de placa, al nivel de termosensibilidad, a la adaptación al frío y al nivel de replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres. Además, se construyeron virus recombinantes que contenían: (1) los cambios específicos de cp45 en las proteínas C, M, F o HN, (2) las mutaciones de líder y gen de N combinadas o (3) varias combinaciones de las mutaciones de cp45. El análisis de estos virus recombinantes demostró que múltiples mutaciones de cp45 distribuidas por todo el genoma contribuían a los fenotipos ts, ca y att. Las mutaciones en C y F no eran ts a 40 ºC, pero no obstante conferían el fenotipo att y, por lo tanto, son mutaciones att no ts. La mutación de HN no confería los fenotipos ca, ts o att. Los virus que poseían las mutaciones de N y líder 3’ eran ts, pero presentaban una atenuación sólo ligera en el tracto respiratorio inferior de hámsteres. Los recombinantes que poseían varias combinaciones de mutaciones presentaban un nivel superior de termosensibilidad que cp45, pero el nivel aumentado de termosensibilidad no se reflejaba en un aumento en la atenuación in vivo. Estos últimos descubrimientos indican que las múltiples mutaciones identificadas en cp45 están interaccionando para afectar a la replicación in vitro. La presencia de múltiples mutaciones atenuantes ts y no ts en cp45 contribuye probablemente a su alto nivel de atenuación y a su estabilidad fenotípica. El conocimiento de los fenotipos asociados con las diversas mutaciones de cp45 proporcionadas en la presente memoria permite un control preciso de virus PIV derivados biológicamente y una fácil manipulación de virus recombinantes para conseguir una colección grande de recombinantes vacunales útiles dentro de la invención.

Virus y células

[0159] Los virus rPIV3, PIV3 JS wt y cp45 descritos en el presente Ejemplo se cultivaron en células LLC-MK2 de simio (ATCC CCL 7.1), como se ha descrito anteriormente (véase también, Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997a; Hall et al., Virus Res. 22(3): 173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol 72 (3): 1762-8, 1998). Se proporcionó el virus vaccinia modificado Ankara como se ha descrito anteriormente. Las células HEp-2 (ATCC CCL 23) y LLCMK2 se mantuvieron en OptiMEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con FBS al 2% y sulfato

5 de gentamicina (50 g/ml), o en EMEM complementado con FBS al 10%, sulfato de gentamicina (50 g/ml) y glutamina 2 mM. Se cultivaron células L-132 (ATCC CCL 5) en MEM de Earl (Life Technologies) complementado con FBS al 10%, glutamina 2 mM, Hepes 20 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM y 100 unidades de estreptomicinaneomicina/ml.

10 Construcción de mutaciones puntuales en PIV3

[0160] Los fragmentos subgenómicos de p3/7(131)2G, el clon de ADNc antigenómico de PIV3 JS wt usado anteriormente para recuperar virus infeccioso (véase también, Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997a; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8, 1998), se clonaron en vectores pUC19 modificados para aceptar estos

15 fragmentos, usando técnicas de clonación molecular convencionales. Las mutaciones puntuales correspondientes a mutaciones identificadas en cp45, así como mutaciones que crean o suprimen secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción silenciosas (Tabla 8), se introdujeron usando el kit de mutagénesis Transformer (Clontech, Palo Alto, CA), como se ha descrito anteriormente.

20 Tabla 8: Mutaciones de PIV3 cp45 introducidas en rPIV3

sec. id nº

región afectada posición nta cambios de secuenciab marcador de restricciónc sustitución de aminoácidod

1

46 47 líder 3' 20 TTGTCTGGGAAT TTGCCTGGGAAT ninguno no codificante

2

46 48 líder 3' 20 TTGTCTGGGAAT TTGTTTGGGAAT ninguno no codificante

3

46 49 líder 3' 20 TTGTCTGGGAAT TTGTCTGGTAAT ninguno no codificante

4e

50 51 líder 3' 40 AACTTTAAATTA AACTTAAAATTA -Dra I no codificante

5e

52 53 gen N 60 inicio TTAAAGACATTG TTTAAGACATTG ninguno no codificante

6e

54 55 N 390 GCAGATGTCAAG GCAGATGCCAAG ninguno Val-96 a Ala

7e

56 57 N 1271 CGAATCTAAAGA CGAAGCTAAAGA ninguno Ser-389 a Ala

8

58 59 C 2076 GAAATATTGATC GAAACATTGATC -Ssp I Ile-96 a Thr

9

60 61 M 4341 TCTCTACCCAAC TCGTTAACCAAC +Hpa I Pro-199 a Thr

10f

62 63 F 6323 AGTACAATAGGT AGTACTGTGGGT +Sca I Ile-420 aVal

11

64 65 F 6419 GCACTTGATCCA ACACTGGATCCA +Bam HI Ala-450 a Thr

12

66 67 HN 7944 CCATCATTGTTGTTGACAA CCATCATTGTGGCTGACAA +Bst XI Val-384 a Ala

13

68 69 L 11468 TTACATGGCCA TCACATGGCGA -Eae I Tyr-942 a His

14

70 71 L 11618 TTTGGACTGGGC TTTTGATTGGGC -Bsr I Leu-992 a Phe

15r

72 73 L 13308 GGTCCTAATACT GGGCCTAATATC -Ava II Thr-1558 a Ile

a. Posición del primer nucleótido en la secuencia de PIV3 mostraba. b. La secuencia de tipo silvestre se muestra encima de la secuencia mutante. Los cambios de nucleótidos están subrayados. Las sustituciones de codones están en negrita. c. Cada secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción relevante está en cursiva; (+) indica la adición de una nueva secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción; (-) indica la supresión de una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción de origen natural. d. Las mutaciones se indican como la asignación de aminoácido de tres letras del wt, seguida por la posición del aminoácido, seguida por la asignación del cp45. e. Estas mutaciones se identificaron por Joanne Tatem (observaciones sin publicar), las otras eran de Stokes et al., Virus Res. 30 (1) : 43-52, 1993. f. Se cambiaron dos nucleótidos en el codón indicado para reducir las posibilidades de reversión a la secuencia de tipo silvestre.

completamente y se volvieron a clonar en el clon de longitud completa, p37(131)2G. Las mutaciones de N y líder 3’ se amplificaron por transcripción inversa (RT)-PCR directamente a partir de ARN de virión de PIV3 cp45 yse clonaron en el pLeft+2G (véase anteriormente), o en un vector pUC19 modificado, para una manipulación adicional. Se construyeron combinaciones de mutaciones usando técnicas de clonación molecular convencionales. El clon de plásmido de longitud completa que contenía las mutaciones de cp45, denominado pFLCcp45, se secuenció completamente para determinar si se habían introducido mutaciones extrañas durante el procedimiento de clonación, pero no se encontraron.

Recuperación de PIV3 recombinante (rPIV3)

[0162] Cada ADNc antigenómico de longitud completa que lleva mutaciones de cp45 junto con los tres plásmidos de soporte pTM(N), pTM(P no C) y pTM(L) se transfectó en células HEp-2 en placas de 6 pocillos (Costar, Cambridge, MA) usando LipofectACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y MVA-T7, como se ha descrito anteriormente. Después de la incubación a 32 ºC durante 4 días, la recolección de transfección se pasó sobre células LLC-MK2 en matraces T-25 que se incubaron a 32 ºC durante de cuatro a ocho días. Este virus recogido se denominó pase 1 y se sometió a tres rondas de purificación de placas en células LLC-MK2 como se ha descrito anteriormente. Cada virus recombinante biológicamente clonado se amplificó dos veces en células LLC-MK2 a 32 ºC para producir virus para una caracterización adicional. El virus se concentró a partir de medio aclarado mediante precipitación con polietilenglicol (véase Mbiguino y Menezes, J. Virol Methods 31: 2-3, 1991, ) y se extrajo el ARN viral (ARNv) con reactivo Trizol (Life Technologies). Se realizó la transcripción inversa en ARNv usando el sistema de preamplificación Superscript II (Life Technologies) con cebadores hexaméricos aleatorios. Se usó el kit de PCR de ADNc Advantage (Clontech) y cebadores con sentido y antisentido específicos para diversas porciones del genoma de PIV3 para amplificar fragmentos para análisis de endonucleasas de restricción. Los fragmentos de PCR se analizaron por digestión con cada una de las enzimas de restricción cuyos sitios de reconocimiento se habían creado o suprimido durante la construcción de las mutaciones (Tabla 8).

Eficacia de formación de placas (EOP) de rPIV3 que lleva mutaciones de cp45 a temperaturas permisivas y restrictivas

[0163] Se determinó el nivel de termosensibilidad de la formación de placas in vitro de virus de control y recombinantes a 32 ºC, 35 ºC, 36 ºC, 37 ºC, 38 ºC, 39 ºC, 40 ºC y 41 ºC en cultivos en monocapa de LLC-MK2, como se ha descrito anteriormente (véase también, Hall et al., Virus Res. 22 (3) : 173-184, 1992). Las placas se enumeraron por hemadsorción con eritrocitos de cobaya después de la eliminación de la capa de metilcelulosa, o como alternativa, las placas virales presentes en la monocapa se identificaron mediante tinción con inmunoperoxidasa con una mezcla de dos mAb murinos anti-HN específicos de PIV3 101/1 y 454/11 diluidos 1:250 (véase, Murphy et al., Vaccine 8 (5): 497-502, 1990; van Wyke Coelingh et al., Virology 143 (2): 569-582, 1985).

Evaluación de virus mutantes rPIV3 para el fenotipo de adaptación al frío

[0164] Se determinó el crecimiento de virus rPIV3 wt y mutantes a 32 ºC y 20 ºC en monocapas de células L-132 confluentes preparadas en placas de cultivo tisular de 24 pocillos. Se inocularon pocillos por duplicado de cada una de las dos placas con 0,2 ml de cada virus rPIV3 wt o mutante a una multiplicidad de infección de 0,01. Después de una adsorción de una hora a temperatura ambiente, el inóculo se aspiró y las monocapas se lavaron con 1 ml de PBS por pocillo. Los cultivos inoculados se cubrieron con 0,5 ml de MEM de Earl complementado con FBS al 10%, glutamina 2 mM, Hepes 20 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM y 100 unidades de estreptomicina-neomicina/ml. Se selló una placa en una bolsa impermeable (Kapak) y después se sumergió en un baño a 20 ºC durante 13 días. La placa duplicada se puso a 32 ºC en una incubadora de CO2 durante 3 días. Al final del periodo de incubación, se recogieron los virus por congelación/descongelación. El título de virus recuperado de cada pocillo se determinó por ensayo de placas en células LLC-MK2 a 32 ºC usando hemadsorción con eritrocitos de cobaya para visualizar las placas. Se usaron dos soluciones madre de referencia de cp45 y dos wt como controles.

Estudios de hámsteres

[0165] Se inocularon hámsteres sirios dorados de 5 semanas de edad en grupos de cinco por vía intranasal con 0,1 ml de OptiMEM I por animal que contenía 106,0 ufp de rPIV3 JS wt, virus PIV3 cp45 o uno de los rPIV3 mutantes. El día 4 post-infección, los hámsteres se sacrificaron, se extirparon los pulmones y los cornetes nasales, y el virus se cuantificó como se ha descrito anteriormente. Se calculó la media del log10 de la DICT50/g a 32 ºC para cada grupo de hámsteres.

RESULTADOS

Introducción de las mutaciones de PIV3 cp45 en rPIV3 JS wt

[0166] Las quince mutaciones en el líder 3’, la señal GS de N y las proteínas N, C, M, F, HN y L de cp45 (Tabla 8) se introdujeron en el ADNc antigenómico de PIV3 completo mediante mutagénesis dirigida o mediante amplificación directa por PCR de un segmento de ADNc de cp45 que lleva las mutaciones deseadas. Se generaron los ADNc antigenómicos siguientes (véase la Fig. 13): (i) rcp45 3’N, que contiene las cuatro mutaciones puntuales de la región líder, la mutación puntual en la señal GS de N y los dos cambios de aminoácidos en la proteína N; (ii) rcp45 C, que contiene un solo cambio de aminoácido en la proteína C; (iii) rcp45 M, que contiene un solo cambio de aminoácido en M, (iv) rcp45 F, que contiene los dos cambios de aminoácidos en F; (v) rcp45 HN, que contiene un solo cambio de aminoácido en HN; (vi) rcp45 L, que contiene los tres cambios de aminoácido en L, como se ha descrito anteriormente; (vii) rcp45 3’NL, que contiene las mutaciones de i. a vi. anteriores; (viii) rcp45 3’NCMFHN, que contiene todas las mutaciones excepto por las tres en L; y (ix) rcp45, que contiene las quince mutaciones de cp45 enumeradas en la Tabla 8. En la mayoría de los casos, cada cambio de cp45 se modificó por ingeniería genética para que estuviera acompañado de uno o más cambios silenciosos cercanos que introducían o eliminaban un sitio de reconocimiento de enzima de restricción (Tabla 8). Estos servían como marcadores para confirmar la presencia de la mutación en el ADNc y en el virus recuperado. Además, dos de los cambios de codificación de aminoácido (mutaciones números 10 y 15 en la Tabla 8) se realizaron usando dos cambios de nucleótidos en lugar del cambio único encontrado en cp45, reduciendo las posibilidades de reversión a wt en el mismo sitio. El ADNc de cp45, que contiene los quince cambios de cp45 en la Tabla 8, se ensambló a partir de los mismos subclones de ADNc mutado que se usaron para introducir los cambios de cp45 en otros ADNc antigenómicos; se secuenció en su totalidad, y se confirmó que contenía sólo las mutaciones deseadas. Esto indicaba que todas las regiones que se habían sometido a mutagénesis o PCR y que se habían manipulado por clonación poseían las secuencias deseadas y carecían de otras mutaciones no deseadas. Cada plásmido de longitud completa que lleva una o más de las mutaciones de cp45 se transfectó en células HEp-2 con plásmidos de soporte y MVA-T7 para producir PIV3 recombinante como se ha descrito anteriormente. El análisis de fragmentos de RT-PCR que incluía las mutaciones indicadas en la Tabla 8 que se amplificaron a partir de ARN de virión de los diversos virus recombinantes indicados en la Figura 13 confirmó la presencia de las mutaciones introducidas, y no se encontraron otras mutaciones no deseadas.

Morfología de placas

[0167] Varios de los virus recombinantes presentaban morfologías de placas distintivas cuando se ensayaban en células LLC-MK2. Las placas de rPIV3 JS wt tenían un promedio de 1mm de tamaño y eran indistinguibles en tamaño del PIV3 JS wt derivado biológicamente. Las placas de los virus cp45 y rcp45 eran mayores que las del wt, teniendo un promedio de dos a tres veces mayor en diámetro que el wt, y eran indistinguibles entre sí. Esto demostró la posibilidad de comparación de los virus cp45 recombinantes y derivados biológicamente para este fenotipo.

Eficacia de formación de placas de rPIV3 que llevan las mutaciones de cp45 en células LLC-MK2 a temperaturas permisivas y restrictivas

[0168] Los rPIV3 se ensayaron para determinar su capacidad para formar placas a temperaturas permisivas y restrictivas que variaban de 32 ºC a 41 ºC (Tabla 9). El análisis de los fenotipos ts de virus que llevan componentes individuales de cp45 puso de manifiesto que los virus rcp45 3’N y rcp45 M tenían una temperatura de interrupción de 40 ºC, y el mutante rcp45 C tenía una temperatura de interrupción de 41 ºC. La temperatura de interrupción de los mutantes rcp45 F y rcp45 HN era superior a 41 ºC. De acuerdo con los resultados anteriores, el virus rcp45 L tenía una temperatura de interrupción de 39 ºC. Se considera que un virus tiene un fenotipo ts, por ejemplo, si su reducción de la replicación a 40 ºC (es decir, título a 32 ºC menos título a 40 ºC) es de aproximadamente 100 veces la del virus wt a 40 ºC. Aplicando esta definición, los presentes resultados indicaban que al menos dos regiones de cp45 (3’N y L) contribuyen al fenotipo ts.

Tabla 9: La eficacia de formación de placas (EOP) de virus recombinantes y derivados biológicamente a temperaturas permisivas y restrictivas

Título medio de virusa (log10 ufp/ml)

Virus 32 ºC 35 ºC 36 ºC 37 ºC 38 ºC 39 ºC 40 ºC 41 ºC fenotipo ts c

rcp45 3’N 7,1 --7,0 6,4 5,4 4,2 <3,7 +

rcp45 C 6,9 ----7,0 6,7 6,6 5,9 <3,7 -

rcp45 M 7,7 --7,4 7,0 6,5 5,3 <3,7 -

rcp45 F 7,5--7,2 6,0 6,6 5,9 5,7 -

rcp45 HN 6,4--6,5 6,2 6,4 4,7 4,4 -

rcp45 L 7,3 --7,2 6,7 4,0 <0,7 <0,7 +

rcp45 3’NL 7,3 5,7 <0,7 <0,7 <0,7 <0,7 <0,7 -+

rcp45 3’NCMFHN 7,2 5,6 <0,7 2,0 2,4 <0,7 <0,7 -+

rcp45 8,5 7,5 7,1 6,4 6,0 2,0 <0,7 <0,7 +

cp45b 8,3 8,0 7,4 7,0 6,2 2,3 <0,7 <0,7 +

rPIV3 wt 7,3 7,3 7,0 7,4 7,6 7,7 6,8 6,0 -

a. Las placas se enumeraron por tinción con inmunoperoxidasa después de incubación durante 6 días a la temperatura indicada. Los valores son la media de dos experimentos, los valores en negrita son de un solo experimento. Los valores subrayados representan la temperatura no permisiva más baja a la que se produce una reducción de 100 veces de la eficacia de formación de placas en comparación con el título a 32 ºC, y éste se define como la temperatura de interrupción de la formación de placas. b. cp45 está derivado biológicamente y los otros virus son recombinantes. c. Se define que un virus lleva el fenotipo ts si su reducción de la replicación a 40 ºC (es decir, título a 32 ºC menos título a 40 ºC) es 100 veces la del virus wt a 40 ºC.

[0169] Como se muestra en la Tabla 9, el rcp45, que contiene todas las mutaciones de cp45, tenía una

5 temperatura de interrupción de 38 ºC, que era idéntica a la del cp45 derivado biológicamente. Estos resultados muestran que el fenotipo ts de cp45 se reproducía con éxito en rcp45. Además, estos resultados validan el análisis de secuencia de cp45 y la posterior reconstrucción de mutaciones en virus recombinante.

[0170] El virus rcp45 3’NCMFHN, que es idéntico al rcp45 excepto por que carece de las tres mutaciones de L,

10 presentaba una temperatura de interrupción de 36 ºC. Puesto que se sabe que las mutaciones de L confieren termosensibilidad individualmente y en combinación, es algo paradójico que el rcp45 3’NCMFHN fuera más, en lugar de menos, ts que cp45. Esto implica que existe una interacción de las mutaciones dentro de cp45 por la que las mutaciones se compensan entre sí para dar un nivel de termosensibilidad que sea inferior a la suma de los componentes individuales.

15 [0171] Se construyó el virus rcp45 3’NL para investigar si las mutaciones de L interaccionan con las mutaciones de N y/o líder, puesto que se cree que todos estos elementos interaccionan durante la síntesis de ARN. Este virus tenía una temperatura de interrupción de 36 ºC, en comparación con la de 40 ºC y 39 ºC para rcp45 3’N y rcp45 L, respectivamente. Estos resultados sugieren que existe una interacción entre las mutaciones de 3’N y L que da como

20 resultado un aumento de la termosensibilidad. Estos resultados también proporcionan otro ejemplo en el que un subconjunto de mutaciones de cp45 especifica un nivel de termosensibilidad superior al observado para rcp45, que contiene el conjunto completo de mutaciones.

Fenotipo ca de rPIV3 que llevan mutaciones de cp45

25 [0172] Los rPIV se analizaron para determinar qué elementos genéticos de cp45 especificaban el fenotipo ca (Tabla 10). Se demostró anteriormente que el rcp45 L es ts y att, pero no ca. Esto indica que los elementos genéticos que especifican la mayor parte del fenotipo ca se localizan fuera de L, y esto se confirmó en el presente estudio. Cada uno de los rPIV que poseen las mutaciones de N y líder 3’ eran ca excepto rcp45 3’NCMFHN, que

30 presentaba un fenotipo intermedio. Esto demuestra que el fenotipo ca está especificado en su mayor parte dentro de la región 3’N. El descubrimiento de que el nivel de ca de virus que contienen el segmento 3’N es inferior que el de cp45 o rcp45 indica que otras regiones de cp45 contribuyen al fenotipo ca, aun cuando esto no sea evidente a partir del análisis de las otras regiones individualmente. El virus rcp45 3’NL es más ca que el virus rcp45 3’N, sugiriendo que las mutaciones de L pueden hacer una contribución modesta. Los virus cp45 derivado biológicamente y rcp45

35 presentan niveles comparables de ca, indicando que este fenotipo, como el tamaño de placas y los fenotipos ts, se reproducía con éxito en el virus cp45 recombinante proporcionado en la presente memoria. Por lo tanto, el fenotipo ca, como el fenotipo ts, es un fenotipo compuesto que refleja contribuciones individuales al fenotipo global, así como contribuciones de elementos genéticos de interacción.

40

Tabla 10: Crecimiento de PIV3 wt y mutantes a 20 ºC en comparación con 32 ºCa

(fenotipo de adaptación al frío)

Virus 20 ºC 32 ºC Fenotipo ca

cp45b 6,72 8,49 +

rcp45 6,57 8,35 +

rcp45 3’NL 5,02 7,23 +

rcp45 3’N 4,39 8,53 +

rcp45 3’NCMFHN 3,53 8,08 +/-

rcp45 L 3,18 7,98 -

rcp45 C 2,52 8,32 -

rcp45 F 2,47 8,10 -

rcp45 HN 2,11 8,01 -

rcp45 M 1,76 8,21 -

PIV3 WT 2,57 8,43 -

a. El título de virus se expresa en log10 UFP/ml. b. cp45 está derivado biológicamente y los otros virus son recombinantes. El fenotipo ca se define como un aumento superior a 10 veces en el crecimiento a 20 ºC respecto al wt.

5 Crecimiento de los virus mutantes rcp45 en hámsteres

[0173] Se inocularon grupos de cinco hámsteres sirios dorados por vía intranasal con 106 DICT50 de virus recombinante o derivado biológicamente, y el nivel de replicación de virus en los pulmones y cornetes nasales se determinó cuatro días después (Tabla 11). Se ha demostrado anteriormente que el cuarto día post-inoculación 10 corresponde al máximo de replicación viral en hámsteres para los virus tanto wt como cp45 (véase, Crookshanks y Belshe, J. Med Virol 13 (3): 243-9, 1984). El virus rcp45 redujo su replicación aproximadamente 40 veces en los cornetes nasales y 1000 veces en los pulmones, y por lo tanto estaba tan atenuado como el virus cp45 derivado biológicamente. Estos resultados indican que el fenotipo de atenuación de cp45 se reproducía con éxito en su versión recombinante. Puesto que cada fenotipo de cp45 se reproducía totalmente en rcp45, las cinco mutaciones

15 adicionales en cp45 que no se incluyeron en este Ejemplo hacían probablemente una escasa contribución a las propiedades de cp45.

Tabla 11: Nivel de replicación en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteresa de PIV3b wt y mutantes

Título medio de virus (log10 DICT50/g  E.Ec) en:

Virus

Cornetes nasales Pulmones

rPIV3 JS wt 6,9  0,2 5,4  0,5 rcp45 3’N 6,5  0,2 3,9  1,1 rcp45 C 4,8  0,3 3,10,7 rcp45 Md 6,8  0,2 6,70,3 rcp45 F 4,60,2 3,40,6 rcp45 HN 6,30,2 5,31,0 rcp45L 4,20,1 2,10,3 rcp45 3’NL 4,70,2 2,10,3 rcp45 3’NCMFHN 5,80,3 2,90,9 rcp45 5,30,1 2,40,2 cp45 4,90,4 1,90,2

a. A grupos de cinco hámsteres cada uno se les administró por vía intranasal 106,0 DICT50 de virus por animal en un inóculo de 0,1 ml y se extirparon los pulmones y los cornetes nasales cuatro días después. b. El cp45 es un virus derivado biológicamente, los otros virus son recombinantes. c. DICT50, 50% dosis infecciosa tisular  Error Estándar. d. Se descubrió que la combinación de virus usada en este estudio contenía un fenotipo de placas mixto. El fenotipo de atenuación de este mutante se reevaluará usando preparaciones de virus adicionales.

[0174] Como se ha demostrado anteriormente, las mutaciones en el gen de L de cp45 especifican la mayoría del fenotipo de atenuación de este virus. En el presente Ejemplo, se examinó la contribución de las mutaciones de cp45 fuera de L como grupo. El mutante rcp45 3’NCMFHN reducía solo ligeramente su replicación en los cornetes nasales, pero reducía más de 100 veces su replicación en los pulmones, lo que demuestra que estaban presentes 25 mutaciones atenuantes adicionales fuera de la proteína L. De forma importante, si cada una de las tres mutaciones en el gen de L de rcp45 revertía a la secuencia de tipo silvestre, el virus resultante, rcp45 3’NCMFHN, conservaría todavía el fenotipo de atenuación. Los virus mutantes rcp45 M y rcp45 HN no eran defectuosos para la replicación en el tracto respiratorio de hámsteres, y el virus rcp45 3’N mostraba sólo una disminución ligera de la replicación en el tracto respiratorio inferior. Esto sugiere que las mutaciones presentes en el líder 3’, en el sitio de inicio del gen de

N y en las proteínas N, M y HN no eran por sí mismas atenuantes. Sin embargo, estas mutaciones podían contribuir a la atenuación global de cp45 en el contexto de las otras mutaciones de cp45. Además, mutaciones individuales dentro de la región 3’N pueden tener efectos que no sean evidentes cuando el conjunto de mutaciones se analiza en su conjunto, que pueden determinarse fácilmente de acuerdo con la presente descripción.

[0175] La replicación de los virus mutantes rcp45 C y rcp45 F se reducía aproximadamente 100 veces tanto en los cornetes nasales como en los pulmones, demostrando que las mutaciones presentes en las proteínas C y F de cp45 confieren el fenotipo de atenuación en hámsteres, aunque el nivel de atenuación no es tan grande como el conferido por las mutaciones de L de cp45. Como se ha descrito anteriormente, los virus mutantes rcp45 F y rcp45 C no poseían el fenotipo ts y, por lo tanto, las mutaciones que aparecen en las proteínas C y F se consideran mutaciones atenuantes no ts.

EJEMPLO XI

Recuperación de PIV3 quimérico recombinante en el que las glicoproteínas hemaglutinina y de fusión se han sustituido con las glicoproteínas de PIV1 correspondientes

[0176] Dentro del presente ejemplo, se genera y se selecciona un virus rPIV quimérico que incorpora uno o más genes heterólogos o secuencias polinucleotídicas grandes de un PIV en un fondo rPIV diferente. Dentro de este aspecto de la invención, los genes o segmentos génicos individuales de un PIV se sustituyen por una secuencia o secuencias homólogas de un PIV heterólogo u otra fuente. En una realización descrita en el presente Ejemplo, se proporcionan herramientas y métodos para sustituir, por ejemplo, los antígenos protectores HN y/o F del HPIV1 o HPIV2 en un HPIV3 recombinante para dar un recombinante quimérico adecuado para desarrollar vacunas vivas atenuadas.

Virus y células

[0177] La cepa de PIV1 usada en este estudio, PIV1/Washington/20993/1964 (PIV1/Wash64), se aisló en Washington DC en 1964 y se confirmó que era un virus de tipo silvestre virulento en estudios clínicos en voluntarios humanos adultos (Murphy et al. Infect. Immun. 12: 62-8 (1975)). Se propagó en células LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) en Opti-MEM I (Life Technologies) con sulfato de gentamicina 50 g/ml, glutamina 2 mM y tripsina 0,75 g/ml (Nº Catálogo 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). La cepa Greer del PIV2 humano (Nº Catálogo V-322001-020, NIAID Repository, Rockville, MD) usada en el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) se propagó de la misma forma. La cepa JS del virus PIV3 humano y su derivado recombinante a partir de ADNc (rPIV3/JS) con fenotipo de tipo silvestre se propagaron como se ha descrito anteriormente. El recombinante de vaccinia modificado Ankara (MVA) que expresa la ARN polimerasa del bacteriófago T7 se describe en Wyatt et al., Virology 210: 202-205 (1995).

[0178] Las células HEp-2 se obtuvieron de la ATCC (ATCC CCL 23) y se mantuvieron en Opti-MEM I (Life Technologies) con suero bovino fetal al 2% (FBS), sulfato de gentamicina 50 g/ml y glutamina 2 mM.

Construcción de un ADNc que codifica un antigenoma de PIV3-PIV1 quimérico completo

[0179] Se construyó un ADNc que codificaba un ARN antigenómico de PIV3 de longitud completa en el que las ORF de HN y F de PIV3 se sustituyeron por sus homólogos de PIV1, como se muestra en la Figura 14. Se prepararon clones de ADNc de los genes de HN y F de PIV1/Wash64 a partir de ARN extraído de células LLC-MK2 que se habían infectado con virus de tipo silvestre PIV1/Wash64. Se generó el ADNc usando el sistema de preamplificación SuperScript usando cebadores hexaméricos aleatorios (Life Technologies). Se amplificaron ADNc de F y HN de PIV1 con ADN polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA) usando parejas de cebadores específicos de gen basados en secuencias de consenso presentes en GenBank. Todos los cebadores descritos a continuación se anotaron de modo que las secuencias específicas de PIV están subrayadas, los sitios de restricción están en cursiva, los nucleótidos alterados a partir de secuencias de tipo silvestre están en minúsculas y los codones de inicio y de terminación están en negrita. El cebador de F de PIV1 de sentido positivo, que hibrida con los nucleótidos 69-97 cadena arriba del codón de inicio, era 5’-GGGAAAGAAtCCAGAGAGAAGAACGG-3’ (SEC ID Nº: 33). El cebador de F de PIV1 de sentido negativo, que hibrida con los nucleótidos 36-61 cadena abajo del codón de terminación de F, era 5’-GGTGAAGTGGATccATTTGATTG-3’ (SEC ID Nº: 34). Lleva un sitio BamH I. El cebador de sentido positivo para HN de PIV1 era 5’-CAACCTGTAAGGtAcCACATCCG-3’ (SEC ID Nº: 35). Hibrida con los nucleótidos 13-36 cadena arriba del codón de inicio de HN y lleva un sitio Kpn I. El cebador de HN de PIV1 de sentido negativo era 5’-GATATGGTGTTaGGcCTTGATCTGTTC-3’ (SEC ID Nº: 36). Hibrida con los últimos dos nucleótidos del codón de terminación y con 25 nucleótidos más cadena abajo y lleva un sitio Stu I. El ADNc de F de PIV1 se clonó como un fragmento BamH I y de extremo romo en pLITMUS28 digerido con BamH I-EcoR V (New England Biolabs), mientras que el ADNc de HN de PIV1 se clonó como un fragmento Kpn I-Stu I en el mismo vector. Las secuencias de nucleótidos de los plásmidos resultantes, denominados pLit.1HNwt y pLit.1Fwt (números de acceso de GenBank: AF016280, AF016279), se determinaron usando el kit de secuenciación Circumvent (New England Biolabs). Estos dos clones se modificaron usando cebadores de PCR mutagénicos para delecionar sus regiones no codificantes e introducir nuevos sitios de restricción que flanqueasen sus codones de inicio y de terminación con el fin de construir los genes de HN y F quiméricos de PIV3-1. Las secuencias de cebadores mutagénicos de F de PIV1 de sentido positivo y de sentido negativo eran 5’CgccATGgAAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3’ (SEC ID Nº: 37) y 5’-CtggatcctAATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3’ (SEC ID Nº: 38), respectivamente, los sitios de restricción introducidos son Nco I y BamH I. Las secuencias de cebadores mutagénicos de HN de PIV1 de sentido positivo y de sentido negativo eran 5’AACcATGGCTGAAAAAGGGAAAA-3’ (SEC ID Nº: 39) y 5’-GGTGAaGCTtAAGATGTGATTTTACATATTTTA-3’ (SEC ID Nº: 40), respectivamente, los sitios de restricción introducidos son Nco I y Hind III.

[0180] La segunda etapa implicaba la modificación de los genes de HN y F de PIV3 para servir como aceptores de las regiones codificantes de PIV1 generadas anteriormente. Los genes de F y HN de PIV3 se subclonaron en varias etapas a partir del clon de longitud completa de PIV3/JS, p3/7(131)2G, para generar el pLit.PIV3.HN.4 y el pLit.PIV3.F.3a (Fig. 14). Las regiones codificantes de F o HN de PIV3 se delecionaron mediante mutagénesis por PCR y se sustituyeron por sitios de restricción apropiados para aceptar el ADNc de HN y de F de PIV1 descrito anteriormente. Las secuencias de los cebadores mutagénicos de sentido positivo y de sentido negativo de F de PIV3 eran 5’-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3’ (SEC ID Nº: 41) y 5’CgcCATgGTGTTCAGTGCTTGTTG-3’ (SEC ID Nº: 42), respectivamente, los sitios de restricción introducidos eran BamHI y NcoI. Las secuencias de cebadores mutagénicos de sentido positivo y de sentido negativo de HN de PIV3 eran 5’-CCACAAgCtTAATTAACCATAATATGCATCA-3’ (SEC ID Nº: 43) y 5’TTCCATggATTTGGATTTGTCTATTGGGT-3’ (SEC ID Nº: 44), respectivamente, los sitios de restricción introducidos eran Hind III y Nco I. El codón de terminación para el HN quimérico se regeneraría tras la ligación con el casete de HN de PIV1 mutado. Los ADNc de HN o F de PIV1 descritos anteriormente se importaron como un fragmento Nco I-Hind III para HN o como un fragmento Nco I-BamH I para F, que generaban el pLit.PIV3-1.HNhc y el pLit.PIV3-1.Fhc. Estos dos ADNc se unieron después en el pSE.PIV3-1.hc, que se secuenció posteriormente en su totalidad. Después, el fragmento BspE I-Sph I se insertó en p3/7(131)2G para generar el pFLC.2G+.hc- (Fig. 14). La secuencia de nucleótidos de este fragmento BspE I-Sph I, que contiene los genes de F y HN quiméricos, está en GenBank (Nº Acceso AF016281). De forma importante, la modificación por ingeniería genética del ADNc estaba diseñada de modo que el antigenoma de rPIV3-1 final se ajustase a la regla de seis (Durbin et al. Virology 234: 74-78 (1997)). El plásmido pFLC.2G+.hc, que codifica la quimera rPIV3-1, se depositó el 17/9/97 bajo los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos.

[0181] Transfección. Se cultivaron monocapas de células HEp-2 hasta la confluencia en placas de seis pocillos (Costar Corp, Cambridge, MA) y se realizaron transfecciones como se ha descrito anteriormente. Las monocapas de células se infectaron con MVA-T7 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 en 0,8 ml de Opti-MEM I sin suero que contenía gentamicina 50 g/ml y glutamina 2 mM, y después se transfectaron con los tres plásmidos de soporte, 0,4 g de pTM(N), 0,4 g de pTM(P), 0,05 g de pTM(L) y 5 g del ADNc antigenoma de PIV3-1. Los plásmidos se mezclaron en 0,2 ml de Opti-MEM I que contenía 12 l de LipofectACE (Life Technologies) y se añadieron a cada pocillo. El plásmido de ADNc de PIV3/JS, p3/7(131)2G, que codifica el ARN antigenómico de PIV3/JS de tipo silvestre, se transfectó en paralelo como control positivo. Después de la incubación a 32 ºC durante 12 horas, el medio de transfección se sustituyó con 1,5 ml de Opti-MEM I recién preparado complementado con gentamicina 50 g/ml, y los cultivos se incubaron a 32 ºC durante dos días adicionales. Se añadió tripsina a una concentración final de 0,75 g/ml el día 3 post-transfección. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular el día 4 y se pasaron (denominado pase 1) sobre monocapas de células LLC-MK2 recién preparadas. Después de la adsorción durante una noche, el medio se sustituyó con Opti-MEM I recién preparado con tripsina 0,75 g/ml. Los cultivos del pase 1 se incubaron a 32 ºC durante 4 días y el virus amplificado se recogió y se pasó adicionalmente sobre células LLCMK2 (denominado pase 2) durante otros 4 días a 32 ºC en presencia de tripsina 0,75 g/ml. El virus recuperado se caracterizó por reacción con antisuero de PIV1 de conejo, antisuero de PIV2 de cobaya y dos anticuerpos monoclonales de HN de PIV3 en un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI), como se ha descrito anteriormente (van Wyke Coelingh et al., anteriormente, (1985)) con la excepción de que se usaron eritrocitos (RBC) de pollo para virus que poseían las glicoproteínas HN de PIV1, mientras que se usaron RBC de cobaya para PIV3. El HAI se realizó para determinar si el rPIV3 poseía la mutación de resistencia a anticuerpos monoclonales (MARM) que marcaba el virus recuperador a partir de ADNc, o si el rPIV3-1 poseía la HN de PIV1.

[0182] Análisis de secuencia de nucleótidos. La construcción de ADNc quimérica pSE.PIV3-1.hc se secuenció con el kit de secuenciación Circumvent (New England Biolabs) antes del ensamblaje final en el clon de longitud completa pFLC.2G+.hc. Para el análisis de ARN, los PIV apropiados se amplificaron en matraces T75 de células LLC-MK2. El virus se recogió el día 5 post-infección y se concentró por precipitación con polietilenglicol (Mbiguino et al., J. Virol. Methods 31: 161-70 (1991)). Se extrajo el ARN viral de los sedimentos virales y se usó en una transcripción inversa (RT) con el sistema de preamplificación Superscript (Life Technologies). Se realizó una RTPCR usando el kit de síntesis de ADNc Advantage (Clontech) y parejas de cebadores específicos de PIV1 o PIV3.

Los productos de RT-PCR se purificaron en gel mediante electroforesis sobre, y se eluyeron a partir de, tiras de membrana de DEAE nitrocelulosa NA45 (Schleicher & Schnuell, Keene, NH) y se secuenciaron.

[0183] Replicación de PIV en células LLC-MK2. Se realizó la enumeración de las placas en monocapas de LLCMK2 como se ha descrito anteriormente, excepto por que se añadió tripsina en el caso de los virus PIV1 y rPIV3-1 (Hall et al. Virus Res. 22:173-84 (1992)). En resumen, se inoculó virus diluido en serie sobre monocapas de LLCMK2 en placas de seis pocillos; el virus se adsorbió durante 1 hora a 32 ºC; los cultivos se cubrieron con medio L-15 (Life Technologies) que contenía agarosa al 0,8% con o sin tripsina añadida y se incubaron a 32 ºC durante 6 días; y las placas se identificaron por hemadsorción (HAD) con eritrocitos de cobaya después de la eliminación de la capa de agarosa.

[0184] El crecimiento de los virus PIV en cultivo tisular se evaluó infectando monocapas de LLC-MK2 confluentes en placas de doce pocillos con virus a una MOI de 0,01. Después de la adsorción a 32 ºC durante 1 hora, el inóculo se sustituyó con 1,5 ml/pocillo de Opti-MEM I complementado con gentamicina (50 g/ml) y tripsina (0,75 g/ml) y se incubaron adicionalmente a 32 ºC durante 6 días. A intervalos de 24 horas se retiraron 0,3 ml de medio de cada pocillo y se añadieron de nuevo 0,3 ml de medio recién preparado con tripsina. El título de virus se determinó a 32 ºC mediante un ensayo de hemadsorción sobre monocapas de células LLC-MK2 usando una capa de fluido como se ha descrito previamente (Hall et al. Virus Res. 22: 173-84 (1992)) y los títulos se expresaron como log10 de la DICT50/ml. [0185] Replicación de PIV en el tracto respiratorio de hámsteres. Hámsteres sirios dorados en grupos de 12 se inocularon cada uno por vía intranasal con 0,1 ml de medio L-15 que contenía 105 ufp de rPIV3/JS, rPIV3-1 o PIV1/Wash64. Los días 4 y 5 días post-inoculación se sacrificaron seis hámsteres de cada grupo y sus pulmones y cornetes nasales se extirparon y se homogeneizaron, y el virus presente en las muestras se tituló en monocapas de células LLC-MK2 a 32 ºC. Los títulos se expresaron como media del log50 de DICT50/g para cada grupo de seis hámsteres.

RESULTADOS

La construcción de un clon de ADNc que codifica un ARN antigenómico de PIV3-1 quimérico de longitud completa producía la recuperación del virus quimérico rPIV3-1

[0186] Como se ha señalado anteriormente, la construcción final del ADNc quimérico de PIV3 y PIV1 en la que las ORF de los genes de las glicoproteínas HN y F de PIV3 JS de tipo silvestre se sustituyeron por las de las secuencias codificantes de PIVI/Wash64 (Figuras 14A y 14B) codifica un ARN antigenómico quimérico de PIV3-1 de 15.516 nucleótidos que se ajusta a la regla de seis (Durbin et al., Virology 234: 74-78 (1997)). El ADNc de pFLC.2G+.hc que codifica el antigenoma de PIV3-1 quimérico se transfectó sobre células HEp-2 junto con los plásmidos de soporte N, P y L. El ADNc de p3/7(131)2G que codifica el antigenoma de PIV3 JS wt se transfectó en paralelo para generar un virus parental de control rPIV3. El virus se recuperó de cada transfección después de la segunda amplificación en células LLC-MK2 y se iniciaron estudios para confirmar que cada virus recombinante procedía de ADNc.

[0187] Los virus recombinantes rPIV3-1 y rPIVs3 se caracterizaron primero por la presencia de la glicoproteína HN de PIV1 o PIV3 mediante ensayo de HAI con anticuerpos policlonales o monoclonales anti-HN específicos de serotipo. Como se muestra en la Tabla 12, el rPIV3 reaccionaba con solo uno de los dos mAb de PIV3, como se esperaba, mientras que su PIV3/JS parental derivado biológicamente reaccionaba con ambos. Esto confirmó que el rPIV3 contenía la mutación MARM introducida que marca a este virus como derivado de ADNc. El virus rPIV3-1 reaccionó con anticuerpos específicos contra la glicoproteína HN de PIV1, pero no con los específicos contra HN de PIV3 o PIV2, demostrando que el virus contenía el gen de HN de PIV1 como se esperaba.

Tabla 12. El rPIV3-1 posee la glicoproteína HN de PIV1 Título de inhibición de la hemaglutinacióna (inversa) del antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal indicado Virus antisuero de PIV1b antisuero de PIV2b mAb 423/6 -PIV3c mAb 77/5 -PIV3c PIV1/Wash64 256 32d 50 50 rPIV3-1 64 2 50 50 rPIV3/JS 4 2 50 3.200 PIV3/JS 8 2 12.800 6.400 PIV2/Greer 8 512 50 50 aSe usaron eritrocitos (RBC) de pollo en el ensayo de HAI para PIV1, PIV2 y rPIV3-1 y se usaron RBC de cobaya para PIV3/JS y rPIV3/JS. bSe adquirió antisuero de conejo contra PIV1 de Denka Seiken Co. Ltd., Japón (Nº Catálogo 410-701) y se obtuvo antisuero de cobaya contra PIV2 del NIAID repository, Rockville, MD (Nº Catálogo V-322-50-558). cEl PIV3/JS derivado biológicamente contiene epítopos reconocidos por ambos mAb 423/6 y 77/5, mientras que el rPIV3/JS estaba modificado por ingeniería genética para que careciera de reactividad con el mAb 423/6. dEl antisuero contra PIV2 tenía cierta reactividad con el virus PIV1 y, por lo tanto, no era completamente específico de tipo.

[0188] A continuación se confirmó que el virus rPIV3-1 contenía los genes de HN y F de PIV3-1 quiméricos modificados por ingeniería genética. Según estaba diseñado, la estructura genética de rPIV3-1 era única en cuatro 5 regiones de unión en comparación con cualquiera de sus parentales, PIVl/Wash64 o rPIV3/JS (recuadrados en la Figura 15A). Estas regiones eran los puntos de transición en los que la secuencia cambia de la región no codificante de PIV3 a la región codificante de PIV1, y después de la región codificante de PIV1 de nuevo a la región no codificante de PIV3. Usando la pareja de cebadores A específica para los genes de M y L de PIV3, o la pareja de cebadores B específica para la M y el extremo más 3’ del gen de HN de PIV1, se generaron productos de RT-PCR 10 para ARN derivados de virión de rPIV3-1, rPIV3/JS y PIV1/Wash64. Las reacciones de control mostraban que la etapa de RT era necesaria para la generación de productos de RT-PCR, indicando que era necesario un molde de ARN, más que ADN contaminante, para producir el producto de RT-PCR. Un indicio temprano de que rPIV3-1 era de hecho un virus quimérico vino del descubrimiento de que sólo la pareja de cebadores A específica de PIV3 generaba el producto de ADNc de 4,6 kb esperado que abarca los genes de F y HN (Fig. 15B). Por lo tanto, mientras que el

15 virus rPIV3-1 contiene sólo la glicoproteína HN específica de HPIV1 (Véase la Tabla 12), las regiones no codificantes son específicas para PIV3. Por el contrario, la pareja de cebadores B específica de PIV1 amplificaba un producto apropiadamente dimensionado de control de PIV1, pero no de rPIV3-1. El análisis de la digestión con enzimas de restricción también demostró que el producto de RT-PCR de rPIV3-1 tenía patrones de restricción únicos diferentes de los de rPIV3/JS y PIV1/Wash64 y apropiados para su secuencia esperada.

20 [0189] La secuencia de nucleótidos del producto de RT-PCR de 4,6 kb de rPIV3-1 se determinó en sus cuatro regiones (Fig. 15 A) y se comparó con la de rPIV3/JS y PIV1/Wash64 (Fig. 16). La secuencia de rPIV3-1 concordaba completamente con el ADNc del que procedía. El examen del alineamiento de secuencia de la Región I-IV para los tres productos de RT-PCR ilustra que el rPIV3-1 contiene las ORF de las glicoproteínas F y HN de PIV1 con

25 codones de inicio y de terminación alterados y flanqueados por las regiones no codificantes 5’ y 3’ de PIV3. Se evaluaron ejemplos de escaleras de secuenciación que abarcan la Región III y IV de rPIV3-1 (Figuras 17A y 17B), comparados en paralelo con rPIV3/JS o PTV1/Wash64, y este análisis confirmó que rPIV3-1 es un virus quimérico recombinante cuya estructura concuerda completamente con el ADNc a partir del cual se generó.

30 Dependencia de tripsina y actividad citopática de rPIV3-1 in vitro

[0190] El PIV1, como el virus Sendai, pero al contrario que el PIV3, requiere tripsina para la escisión de su glicoproteína F para experimentar una replicación multicíclica en líneas continuas de células de cultivo celular (Frank et al. J. Clin. Microbiol. 10: 32-6 (1979)). Además, el PIV1 es un virus no citopático, mientras que el PIV3 produce 35 fácilmente un amplio CPE (Collins et al. en Fields Virology, 3ª ed., 1: 1205-43 (1996)). El rPIV3-1, rPIV3 y PIV1/Wash64 se compararon basándose en estas propiedades. El rPIV3-1, como el PIV1/Wash64, tenían un título de HA superior usando RBC de pollo, más que de cobaya (Tabla 13). El rPIV3-1, como su parental PIV1/Wash64, requería tripsina para una replicación eficaz en cultivos con una capa de fluido, así como para una formación de placas eficaz. El rPIV3-1 producía placas a 32 ºC, 37 ºC o 40 ºC con una eficacia similar. Por lo tanto, es evidente 40 que el rPIV3-1 posee la glicoproteína F del virus parental PIV1 y no es termosensible. Por otro lado, el CPE producido por rPIV3-1, como se indica por el redondeamiento y desprendimiento de células en las monocapas infectadas con virus, es casi en la misma medida que su PIV3 parental, sugiriendo que esta propiedad biológica está en función de sus genes de PIV3, que se encuentran fuera de las regiones codificantes de HN y F. Por lo tanto, el rPIV3-1 posee propiedades biológicas de ambos parentales que concuerdan con los descubrimientos anteriores,

45 demostrando que es un virus quimérico. Este virus quimérico recombinante ejemplar dentro de la invención se depositó el 21 de mayo de 1998 bajo los términos del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos.

Tabla 13. Comparación del título de HA y de la infectividad y actividad citopática de PIV parentales y quiméricosa Título de HA usando Título infecciosob (Log10 DICT50/ml) usando CPE UFP/mlc (Log10) los RBC indicados o HAD como criterio de valoración

Virus CPE HAD

Pollo Cobaya Tripsina Tripsina Tripsina

-+ -+ -+ PIV1/Wash64 16 8 2,5 2,5 4,8d 6,3 0,7e 5,8 rPIV3-1 64 16 2,5 5,8 5,5d 7,8 0,7e 7,1 rPIV3/JS 0 8 4,5 7,3 5,0d 7,5 5,0 6,2 aSe cultivaron reservas de virus en células LLC-MK2 que se infectaron a una MOI de 0,01 y se incubaron durante 6 días en presencia (PIV1/Wash64, rPIV3-1) o ausencia (rPIV3/JS) de tripsina 0,75 g/ml. Las reservas de virus resultantes se ensayaron mediante los ensayos a continuación en presencia o ausencia de tripsina, según se indica. bEl ensayo de la DICT50 se leyó a los 6 días por visualización directa del CPE o por hemadsorción (HAD). cLas placas se visualizaron por HAD después de seis días de incubación.dLa HAD de monocapas infectadas con PIV3 era macroscópicamente evidente, mientras que la de PIV1 y rPIV3-1 era observable sólo bajo el microscopio, en el que se observaron células individuales con RBC adsorbidos. eEl menor nivel de virus detectable era de 100,7/ml.

Comparación del nivel de replicación de rPIV3-1 y sus virus parentales en células LLC-MK2 y hámsteres

5 [0191] La replicación multicíclica de los virus rPIV3, rPIV3-1 y PIV1 Wash/64 se evaluó después de la inoculación de células de cultivo tisular LLC-MK2 a una MOI de 0,01 (Fig. 18). Puede observarse que la cinética y la magnitud de la replicación de los tres virus eran muy similares. Esto indica que la sustitución de los genes de HN y F de PIV1 en lugar de los PIV3 no atenuaba el virus para su replicación in vitro. A continuación se determinó si el rPIV3-1 se atenuaba in vivo, específicamente para la replicación en los tractos respiratorios superior e inferior de hámsteres

10 (Tabla 14). El nivel observado de replicación de rPIV3-1 era similar a, si no ligeramente superior a, cualquier parental en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres.

Tabla 14. Nivel de replicación de PIV parentales y quiméricos en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteresa

Título de virus (media en log10 de la DICT50 del tejido indicado/gramo  E.E.) Virus Cornetes Nasales Pulmones

Día 4 Día 5 Día 4 Día 5

PIV1/Wash64

5,2  0,24 5,2  0,12 5,0  0,31 5,0  0,38

rPIV3-1

4,9  0,23 6,2  0,17 5,8  0,15 6,0  0,09

rPIV3/JS

4,5  0,09 5,0  0,18 5,1  0,26 5,0  0,32

aLos hámsteres se infectaron por vía intranasal con 105,0 DICT50 por animal del virus indicado, y los pulmones y

cornetes nasales se extirparon el día 4 ó 5 después de la infección. Los títulos son las medias de seis animales por

día y se expresan como la media del log10 DICT50/gramo  error estándar.

15 [0192] En resumen, el presente Ejemplo demuestra la recuperación con éxito de un virus quimérico rPIV3-1 en el que las ORF de las glicoproteínas HN y F de PIV1 sustituyeron a las de rPIV3. Este virus quimérico se replicaba como sus virus parentales PIV1 y PIV3 de tipo silvestre in vitro e in vivo, demostrando que la sustitución de las ORF de glicoproteínas no daba como resultado la atenuación del rPIV3-1. Esta recuperación con éxito de un PIV3

20 recombinante que lleve las glicoproteínas HN y F de PIV1 es sorprendente porque los dos virus, que representan distintos serotipos, no están estrechamente relacionados. En particular, es sorprendente que el recombinante quimérico crezca tan bien como los dos parentales. Particularmente, también se han recuperado virus recombinantes quiméricos que poseen una sustitución en el gen de glicoproteína para el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Lawson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-81 (1995)). En concreto, el gen de las

25 glicoproteínas G de VSV de serotipo Indiana se sustituyó por el del serotipo New Jersey, que comparte una identidad de secuencia de aminoácidos de sólo el 50%. Al contrario que el rPIV3-1 el VSVI/NJ recombinante quimérico se replica sólo al 10% del nivel del VSVI recombinante o VSV derivado biológicamente.

[0193] En el presente Ejemplo, las glicoproteínas HN y F tienen una identidad de secuencia del 43 y del 47%,

30 respectivamente, entre PIV1 y PIV3. La transferencia de las dos glicoproteínas juntas evitaría, por supuesto, la incompatibilidad de glicoproteína con glicoproteína (Tanabayashi, K. y Compans, R. W. J. Virol. 70: 6112-18 (1996)). Por otro lado, se cree en general que las glicoproteínas interaccionan con la proteína M (que tiene una identidad del 63% entre PIV1 y PIV3) a través de sus dominios citoplasmático (CT) o transmembrana (TM), y que esta interacción es importante en la morfogénesis y la estructura del virión. A este respecto, el grado de identidad de secuencia entre

35 las proteínas HN y F de los dos serotipos en los dominios TM y CT es de hecho reducido: 30% y 22%, respectivamente, para el dominio TM, y 9 y 11%, respectivamente, para el dominio CT. A la luz de este escaso nivel de relación de secuencia los inventores también han seguido una estrategia paralela de construcción de glicoproteínas quiméricas en las que el ectodominio de PIV1 de cada glicoproteína se fusionó con los dominios TM y CT de PIV3. Respecto a la posible interacción con la proteína M u otras proteínas internas, puede ser que una estructura conservaba, tal como una constelación de aminoácidos cargados, sea importante más que una secuencia conservada. Como alternativa, podría ser que la interacción de los dominios TM y CT de las glicoproteínas con proteínas internas no sea tan crítica como se ha pensado anteriormente. Será posible examinar estos factores más de cerca usando los métodos y herramientas proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, estos factores se aclararán adicionalmente por trabajos en curso que emplean los métodos descritos anteriormente para construir un virus PIV3 que lleva HN y F de PIV2.

[0194] Se esperaba que el rPIV3-1 requiriese tripsina para una replicación eficaz en cultivo tisular, puesto que ésta es una propiedad conferida por la glicoproteína F de PIV1, y éste resultó ser el caso. Sin embargo, era interesante observar que el rPIV3-1 causaba un CPE que se parecía más al del virus parental PIV3, indicando que un gen o genes de PIV3 distintos de HN o F especifica este fenotipo. Estos papeles se aclararán también adicionalmente usando los métodos y herramientas proporcionados en la presente memoria para intercambiar un gen o genes adicionales entre el PIV1 no citopático y el PIV3 citopático.

EJEMPLO XII

Recuperación de PIV recombinante quimérico vivo atenuado que codifica las proteínas internas del PIV tipo 3 y las glicoproteínas de superficie del PIV tipo 1

[0195] En el presente Ejemplo, se muestra que un derivado de rPIV3-1 que lleva los tres cambios de codificación de aminoácidos termosensibles y atenuantes que se encuentran en el gen de L del virus vacunal candidato PIV3 cp45 vivo atenuado, denominado rPIV3-1.cp45L, presenta un fenotipo termosensible con una temperatura de interrupción de 38 ºC similar a la del rPIV3cp45L recombinante que posee las mismas tres mutaciones. El rPIV31.cp45L está atenuado en el tracto respiratorio de hámsteres en la misma medida que el rPIV3cp45L. La infección de hámsteres con rPIV3-1.cp45L genera un nivel moderado de anticuerpos de inhibición de la hemaglutación contra PIV1 wt e induce una resistencia completa a la exposición con PIV1 de tipo silvestre. Esto demuestra que el PIV quimérico atenuado de acuerdo con la invención era capaz de inducir una respuesta inmune altamente eficaz contra PIV1. Esta descripción también confirma los datos descritos anteriormente, que demuestran que las glicoproteínas de superficie de virus parainfluenza son suficientes para inducir un alto nivel de resistencia a la exposición a virus homólogo. Inesperadamente, la infección con virus quimérico recombinante rPIV3-1.cp45L o rPIV3-1, que llevan cada uno los genes de glicoproteínas de superficie de PIV1 y los genes internos de PIV3, también induce un nivel de resistencia moderado a la replicación de virus de exposición PIV3. Esto indica que los genes internos de PIV3 pueden inducir de forma independiente una inmunidad protectora frente a PIV3 en roedores. Por lo tanto, un sistema genético inverso para PIV3, como se describe en la presente memoria, produce con éxito candidatos a vacunas de PIV1 vivos atenuados que están atenuados y son protectores en sujetos de modelo aceptados.

Virus y células

[0196] La cepa PIV1 wt usada en este estudio es PIV1/Washington/20993/1964 (PIV1/Wash64) (véase, por ejemplo, Murphy et al., Infect. Immun. 12: 62, 1975). El rPIV3-1 quimérico recuperado a partir de ADNc de PIV3 quimérico, en el que las ORF de F y HN de PIV3 se sustituyen con las de PIV1/Wash64, como se ha descrito anteriormente y en Tao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998. Estos virus se propagaron en células LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) en Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) con sulfato de gentamicina 50 g/ml y tripsina 0,75 g/ml (Nº de Catálogo 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Se incluye tripsina porque la glicoproteína F de PIV1, pero no la de PIV3, depende de tripsina exógena para la escisión cuando se cultiva en un cultivo celular en estas condiciones. La cepa JS wt del virus PIV3 humano y su derivado recombinante a partir de ADNc (rPIV3/JS) se propagaron como se ha descrito anteriormente y en Durbin et al., Virology 235: 323, 1997. La propagación de cp45, un derivado atenuado de PIV3/JS wt (véase anteriormente; y Karron et al., J. Infect. Dis. 171: 1107, 1995) y rPIV3cp45L, un PIV3 recombinante que lleva las tres mutaciones ts encontradas en el gen de L de cp45, se propagaron como se ha descrito anteriormente y en Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762, 1998. El recombinante de vaccinia modificado Ankara (MVA) que expresa la ARN polimerasa del bacteriófago T7 se describe en Virology 210: 202, 1995.

[0197] Las células HEp-2 que se usaron en la transfección se obtuvieron de la ATCC (ATCC CCL 23) y se mantuvieron en Opti-MEM I con suero bovino fetal (FBS) al 2%, sulfato de gentamicina 50 g/ml.

Introducción de mutaciones de L en ADNc antigenómico de rPIV3-1

[0198] Las tres mutaciones de L de cp45 presentes en el plásmido pTM(L)942/992/1558 descrito anteriormente (véase también, Skiadopoulos et al., J. Virol 72: 1762, 1998), se introdujeron en el ADNc quimérico pFLC.2G+.hc (descrito anteriormente; véase también, Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998), como un fragmento SphI-NheI de 2,8 kb (nucleótidos 11313 a 14092 en el ADNc antigenómico de PIV3) para generar el pFLC.2G+.hc.cp45L de longitud completa que lleva las ORF de F y HN de PIV1 y las tres mutaciones del gen de L de cp45 (Fig. 19). Las mutaciones específicas presentes en el pTM(L)942/992/1558 se indican en la leyenda para la Figura 19.

[0199] Transfección. Se cultivaron monocapas de células HEp-2 en placas de seis pocillos hasta la confluencia y se realizaron transfecciones como se ha descrito anteriormente (véase también, Tao et al., J virol 72: 2955, 1998). Se añadió tripsina a una concentración final de 0,75 g/ml el día 3 post-transfección antes de la recogida el día 4. Los sobrenadantes de cultivo celular se aclararon y se pasaron (denominado pase 1) sobre monocapas de células LLC-MK2 recién preparadas. Después de la adsorción durante una noche, el medio se sustituyó con Opti-MEM I recién preparado con tripsina 0,75 g/ml. Los cultivos de pase 1 se incubaron a 32 ºC durante 4 días y el virus presente en el sobrenadante se recogió y se pasó de nuevo en las mismas condiciones (denominado pase 2). El virus presente en la recolección del pase 2 se ensayó para determinar la presencia de la proteína HN de PIV1 mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutación (HAI), como se ha descrito anteriormente (véase también Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998).

Replicación de PIV en LLC-MK2 a diversas temperaturas

[0200] Se realizó la enumeración de placas en monocapas de LLC-MK2 como se ha descrito anteriormente, añadiéndose tripsina 0,75 g/ml a la capa de agarosa en el caso de PIV1, rPIV3-1 y rPIV3-1.cp45L (véase también, Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998). Después de la incubación a diversas temperaturas durante 6 días, la capa de agarosa se eliminó y las placas se identificaron por hemadsorción (HAD) con eritrocitos (RBC) de cobaya.

Replicación de PIV en el tracto respiratorio de hámsteres

[0201] Se inocularon grupos de cinco hámsteres por vía intranasal con 0,1 ml de medio L15 que contenía 106 unidades formadoras de placas (UFP) de rPIV3/JS, rPIV3cp45L, cp45, PIV1/Wash64, rPIV3-1 o rPIV3-1.cp45L. Los hámsteres se sacrificaron el día 4 post-infección, y sus pulmones y cornetes nasales se extirparon y se homogeneizaron. El virus presente en las muestras de tejido se tituló en monocapas de células LLC-MK2 a 32 ºC, como se ha descrito anteriormente y en Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998. Los títulos se expresan como la inversa de la media del log10 de la DICT50/gramo de tejido para cada grupo.

Estudios de inmunización y exposición en hámsteres

[0202] Se inmunizaron grupos de diez hámsteres por vía intranasal con 106 UFP de virus por animal, como se ha descrito anteriormente. Se recogió suero para un ensayo de HAI antes de la infección y el día 33. El nivel de anticuerpos de HAI presentes en los sueros de cada grupo de 10 hámsteres se determinó usando PIV1/Wash64 y PIV3/JS como antígenos, y los títulos de HAI determinados se presentan como la media del log2 (véase también, Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998).

[0203] Treinta y cinco días post-inmunización, cinco hámsteres de cada grupo se expusieron por vía intranasal a 106 UFP de PIV1/Wash64 o rPIV3/JS. Los cornetes nasales y pulmones de estos hámsteres expuestos se extirparon cuatro días post-exposición. Se determinaron los títulos de virus en muestras de tejido en monocapas de LLC-MK2, como se ha descrito anteriormente y en Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998, y los títulos se presentan como la media del log10 DICT50/gramo de tejido.

RESULTADOS

Recuperación y caracterización del virus quimérico recombinante rPIV3-1.cp45L

[0204] Como se ha señalado anteriormente, el clon de ADNc pFLC.2G+.hc, un ADNc antigenómico de longitud completa de PIV3 en el que las ORF que codifican las glicoproteínas F y HN se han sustituido por las de PIV1, se modificó por introducción de tres cambios de codificación de aminoácido (denominados 942, 992 y 1558 de acuerdo con la posición de aminoácido en la proteína L) identificados en el gen de L de cp45 y que se demostró que eran mutaciones ts y atenuantes independientes (Fig. 19; véase también, Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762, 1998). Cada cambio de codificación se marcó mediante la cointroducción de sustituciones de nucleótidos silenciosas en la traducción contiguas, que suprimen un sitio de restricción de origen natural (Fig. 19; Tabla 8). La construcción de plásmido de longitud completa final pFLC.2G+.hc.cp45L (Fig. 19) codifica un ARN antigenómico quimérico de PIV3-1 de 15516 nucleótidos de longitud y se ajusta a la regla de seis (véase, Durbin et al., Virology 234: 74, 1997). La autenticidad del pFLC.2G+.hc.cp45L se confirmó mediante la digestión con enzimas de restricción apropiadas.

[0205] El ADNc de pFLC.2G+.hc.cp45L se transfectó en células HEp-2 junto con los plásmidos de soporte de N, P y L de PIV3, y se infectaron con MVA-T7 como se ha destrito anteriormente y en Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998).

El virus recuperado después de dos pases en células LLC-MK2, denominado rPIV3-1-cp45L, se clonó biológicamente por pase de placa a placa a placa, y el virus amplificado se analizó para confirmar que poseía las glicoproteínas de PIV1 y las tres mutaciones introducidas en L. En primer lugar, la presencia de la proteína HN de PIV1 en rPIV3-1.cp45L se confirmó por reactividad con anticuerpos específicos de PIV1 en un ensayo de HAI como 5 se ha descrito anteriormente y en Tao et al., J Virol 72:2955, 1998. La presencia de los genes de HN y F de PIV3-1 quiméricos, así como las mutaciones del gen de L introducidas en el ARN genómico de rPIV3-1.cp45L, se confirmó por digestión con enzimas de restricción o análisis de la secuencia de nucleótidos de productos de RT-PCR generados a partir de ARN de virión como se ha descrito anteriormente y en Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998. Estos datos confirmaron que el rPIV3-1.cp45L es un virus quimérico recombinante que lleva las tres sustituciones de

10 codones del gen L de cp45.

El rPIV3-1.cp45L es termosensible

[0206] Las tres mutaciones del gen de L de cp45 se demostró anteriormente que conferían el fenotipo ts cuando

15 se introducían en PIV3 wt (véase también, Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762, 1998). Para evaluar si su presencia en el virus quimérico tendría el mismo efecto, se determinó la eficacia de la formación de placas de rPIV3-1.cp45L a diversas temperaturas. Como se muestra en la Tabla 15, las tres mutaciones de L conferían de hecho el fenotipo ts al virus quimérico. El nivel de termosensibilidad especificado por las mutaciones de L de cp45 en los virus recombinantes rPIV3cp45L y rPIV3-1.cp45L era equivalente (Tabla 15), indicando que el efecto de las mutaciones

20 es independiente de las glicoproteínas HN y F de PIV3 o PIV1. El nivel de termosensibilidad de rPIV3cp45L y rPIV31.cp45L era comparable al del virus cp45 derivado biológicamente, a pesar del hecho de que este último virus posee mutaciones fuera de L (véase, Stokes et al., Virus Res 30: 43, 1993).

Tabla 15. El virus vacunal candidato rPIV3-1.cp45L quimérico recombinante es termosensible Virus a Título de virus b a las temperaturas indicadas (log10 UFP/ml)

32 ºC 36 ºC 37 ºC 38 ºC 39 ºC 40 ºC

rPIV3/JS 7,4 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 PIV1/Wash64 c 7,5 7,6 7,5 7,5 7,4 7,2 rPIV3-1 7,5 7,5 7,5 7,2 6,0 6,1 PIV3cp45 c 7,4 6,9 6,8 4,7 d <0,7 <0,7 rPIV3cp45L 7,9 7,4 7,7 5,3 1,2 <0,7 rPIV3-1.cp45L 8,1 8,0 8,2 6,1 <0,7 <0,7 a Nomenclatura de virus: rPIV3/JS, cepa JS de PIV3 wt recombinante; PIV1/Wash64, PIV1 wt derivado biológicamente; rPIV3-1, PIV3 quimérico recombinante en el que las ORF de F y HN se han sustituido con las de PIV1/Wash64; PIV3cp45, virus vacunal candidato cp45 derivado biológicamente; rPIV3cp45L, PIV3 recombinante que contiene las tres mutaciones de gen de L de cp45; rPIV3-1.cp45L, rPIV3-1 quimérico recombinante que contiene las tres mutaciones del gen de L de cp45.b Los títulos de virus se determinaron usando monocapas de LLC-MK2 en placas de 12 pocillos. Los títulos eran el promedio de dos ensayos. c Virus derivados biológicamente. Todos los demás son virus recombinantes. d La temperatura de interrupción, es decir, la temperatura restrictiva más baja a la que se observa una reducción de dos log10 en el título de virus, de cada virus ts se indica en negrita.

25

Nivel de replicación de rPIV3-1.cp45L en hámsteres

[0207] Las tres mutaciones del gen de L de cp45 se demostró anteriormente que conferían atenuación de la replicación de virus en el tracto respiratorio superior e inferior de hámsteres cuando se introducían en PIV3 wt (véase

30 también, Skiadopoulos et al., J Virol 72: 1762, 1998). Su efecto sobre el virus quimérico se evaluó mediante infección intranasal de hámsteres, como se muestra en la Tabla 16. Estos descubrimientos indican que el rPIV31.cp45L estaba de hecho atenuado en ambos sitios y, además, que su nivel de atenuación era comparable al de rPIV3cp45L. Por lo tanto, la capacidad de las mutaciones de L de cp45 para conferir atenuación, como la termosensibilidad, es independiente de la especificidad antigénica de las glicoproteínas de superficie.

35

Tabla 16. El virus vacunal candidato rPIV3-1.cp45L quimérico recombinante está atenuado en el tracto respiratorio de hámsteres a Título de virus en el tejido indicado (log10 DICT50/g  E.E.) b

Virus

Cornetes nasales Pulmones

rPIV3-1.cp45L 4,6  0,3 1,9  0,4 rPIV3-1 6,0  0,3 6,3  0,4 rPIV3cp45L 3,0  0,3 <1,2 rPIV3/JS 5,7  0,3 5,0  0,3 a Se infectaron grupos de cinco hámsteres por vía intranasal con los virus indicados a una dosificación de 106 UFP por hámster. El día 4 post-infección las muestras de tejido se recogieron y se ensayaron para virus. b Los títulos de virus se proporcionan como Log10 DICT50 por gramo de tejido.

La infección con rPIV3-1 o rPIV3-1.cp45L, que contienen las proteínas internas de PIV3 y las glicoproteínas 5 de PIV1, confiere resistencia a la exposición a PIV1 en hámsteres.

[0208] El virus rPIV3-1 quimérico y su derivado rPIV3-1.cp45L atenuado se evaluaron para determinar su inmunogenicidad y su eficacia protectora en hámsteres. Como se muestra en la Tabla 17, la infección con cualquier virus inducía anticuerpos de HAI contra PIV1, pero no PIV3, confirmando que estos virus quiméricos poseen la 10 glicoproteína de HN de PIV1 y son altamente inmunogénicos. El nivel de anticuerpos de HAI inducidos por rPIV31.cp45L era dos veces menor que el de por rPIV3-1, lo que indica que su atenuación daba como resultado una disminución modesta en la inmunogenicidad. De forma similar, el rPIV3 y el rPIV3cp45L inducían anticuerpos de HAI contra PIV3, pero no contra PIV1, y el nivel inducido por el virus atenuado era aproximadamente dos veces menor. A pesar de la replicación restringida en hámsteres de los virus recombinantes que llevan las mutaciones de L de cp45,

15 la infección con rPIV3cp45L o rPIV3-1.cp45L inducía una resistencia completa a la replicación de virus exposición que lleva glicoproteínas homólogas.

Tabla 17. El virus vacunal candidato rPIV3-1.cp45L quimérico recombinante induce una resistencia completa contra PIV1 y una resistencia parcial contra PIV3 tras la exposición en hámsteres a

Título de HAI post-

Título de virus en el tejido indicado c

Virus usado para la inmunización

Origen de las glicoproteínas inmunización (Inversa del log2  E.E.) -PIV1 -PIV3 (log10 DICT50/gramo  E.E.) Replicación de virus de exposición PIV1 Replicación de virus de exposición PIV3 Cornetes Pulmones Cornetes Pulmones

nasales

nasales

Control b

- 1 1 5,0  0,3 4,6  0,5 5,5  0,4 5,0  0,7

rPIV3-1.cp45L

PIV1 6,9  0,5 1 1,2 1,2 1,9  0,6 1,7  0,5

rPIV3-1

PIV1 7,9  0,4 1 1,2 1,2 2,9  0,3 2,6  0,4

rPIV3cp45L

PIV3 1 9,3  0,2 4,6  0,2 2,8  0,7 1,2 1,2

rPIV3/JS PIV3p45d

PIV3 PIV3 11 10,3  0,3 8,9  0,4 4,6  0,4 4,9  0,2 2,4  0,5 2,5  0,8 1,2 1,2 1,2 1,2

a Se inmunizaron grupos de 10 hámsteres por vía intranasal con 106 UFP de los virus indicados. Se recogieron los

sueros post-inmunización los días 33, dos días antes de la exposición (véasec).

b Los hámsteres en el grupo de control no se inocularon.

c Cinco semanas después de la inmunización, se expusieron cinco hámsteres de cada grupo por vía intranasal a

106 UFP de virus indicado. Se recogieron muestras de tejido 4 días post-exposición. Los virus presentes en

muestras de tejido se titularon en monocapas de LLC-MK2 y los datos se presentan como log10 DICT50/gramo de

tejido  error estándar.

d Virus derivado biológicamente. 20 La infección con rPIV3-1.cp45L también confiere resistencia a PIV3

[0209] La información sobre el papel de las glicoproteínas distintas de HN o F de PIV (es decir, las proteínas

internas) en la resistencia es limitada. La descripción y uso de rPIV3-1 y rPIV3-1.cp45L en la presente memoria 25 proporciona una oportunidad para examinar el papel que las proteínas internas desempeñan en la resistencia a la

exposición con PIV3, puesto que los únicos genes compartidos por los virus de inmunización y exposición son los

genes de las proteínas internas. La replicación de virus de exposición PIV3 estaba significativamente restringida en

los tractos respiratorios tanto superior como inferior por una infección previa de hámsteres con rPIV3-1 o rPIV3

1.cp45L (Tabla 17). Por lo tanto, estos datos indican que las proteínas internas de PIV3, como las proteínas HN y F, 30 son capaces de inducir una resistencia parcial a la replicación del PIV3 de exposición.

[0210] Entre los descubrimientos demostrados por los estudios de inmunogenicidad y eficacia anteriores un descubrimiento particularmente inesperado era que la infección con rPIV3 wt o atenuado inducía una reducción de 100 veces en la replicación de virus de exposición PIV1 en los pulmones. Por lo tanto, la infección con un serotipo de PIV proporcionaba una protección significativa contra un serotipo heterólogo. Esto era inesperado en parte porque estudios previos indicaban que la infección de animales con un tipo de PIV humano no inducía una protección heteróloga significativa contra un PIV que pertenece a un serotipo humano diferente, de acuerdo con la creencia general de que la inmunidad contra infecciones por PIV humano era en gran medida específica de tipo (véase, por ejemplo, Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77: 150, 1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990).

[0211] El presente Ejemplo demuestra el aprovechamiento con éxito de nuevos métodos y reactivos desarrollados para generar vacunas de PIV3 para proporcionar adicionalmente un desarrollo racional rápido de vacunas candidatas vivas atenuadas para PIV1. Un ADNc que codifica PIV3 infeccioso se modificó por sustitución de las ORF que codifican los antígenos protectores HN y F de PIV1 en el lugar de sus homólogas de PIV3. Por consiguiente, las mutaciones atenuantes, ejemplificadas por tres mutaciones atenuantes presentes en el gen de L del PIV3 cp45, se incorporaron dentro de este ADNc de PIV3-PIV1 quimérico modificado. A partir de este ADNc se recuperó un virus recombinante que llevaba los genes de HN y F de PIV1, las proteínas internas de PIV3 y las mutaciones del gen de L de PIV3 cp45. Este rPIV3-1.cp45L recombinante era termosensible, estaba altamente atenuado en hámsteres y era altamente eficaz frente a la exposición a PIV1 en hámsteres. El nivel de termosensibilidad, atenuación e inmunogenicidad presentado por rPIV3-1.cp45L era comparable al de PIV3 cp45, indicando que los fenotipos especificados por el conjunto de mutaciones del gen de L de cp45 eran independientes de las glicoproteínas de superficie HN y F. Estos descubrimientos, que representan el primer candidato a vacuna de PIV1 vivo atenuado generado por genética inversa, proporcionan un esquema generalmente exitoso para desarrollar vacunas contra PIV1.

[0212] Se conoce escasa información en relación con el papel que las proteínas internas de virus parainfluenza desempeñan en la resistencia a la reinfección con virus homólogo. La infección con recombinantes de vaccinia que expresan N, epítopos dentro de N o M se ha descrito que induce resistencia contra la replicación de virus de exposición, pero la magnitud de la resistencia descrita es menor que la inducida por recombinantes de vaccinia que llevan las glicoproteínas HN o F (véase, por ejemplo, Kast et al., Proc._Natl. Acad. Sci. USA 88: 2283, 1991; Sakaguchi et al., J. Gen. Virol. 74: 479, 1993; Thomson et al., J. Immunol. 157: 822, 1996). Estos estudios sugerían que las proteínas internas estaban haciendo sólo contribuciones minoritarias a la resistencia a la reinfección. Por lo tanto, la presente descripción presente resultados inesperados mostrando que una infección previa de hámsteres con rPIV3-1.cp45L o rPIV3-1 inducía una reducción de aproximadamente 250 a 4000 veces de la replicación de PIV3 tanto en los cornetes nasales como en los pulmones. Estos dos virus recombinantes quiméricos difieren del virus de exposición PIV3 en el sentido de que poseen las glicoproteínas HN y F de PIV1 en lugar de las de PIV3, pero comparten todos los demás genes con el virus de exposición. Las glicoproteínas HN y F de PIV1 comparten una identidad de secuencia del 47% y del 43% con las de PIV3, respectivamente. Aunque es probable que las proteínas internas compartidas estén mediando la resistencia observada, también es posible que las secuencias proteicas compartidas entre las glicoproteínas F y HN de PIV1 y PIV3 estén contribuyendo a la inmunidad observada. Por ejemplo, hay 5 extensiones en HN y 2 extensiones en F que abarcan al menos 9 restos aminoacídicos en longitud que están compartidos entre PIV1 y PIV3 y que tienen el potencial de actuar como epítopos de CTL protectores. Es razonable considerar que las proteínas internas compartidas estén contribuyendo a la restricción de la replicación de virus de exposición PIV3 wt, ya que este nivel de inmunidad cruzada no se ha observado en estudios previos (véase, por ejemplo, Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77: 150, 1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990).

[0213] El descubrimiento de que las proteínas internas de PIV3 de las quimeras rPIV3-1 y rPIV3-1.cp45L conferían resistencia a la exposición a PIV3 demuestra que pueden usarse derivados atenuados de PIV3 como vectores para antígenos protectores de PIV1 y PIV2. Siguiendo las enseñanzas de la invención, la inmunización con un virus vacunal vivo atenuado basado en PIV3 puede restringir la replicación de otros virus vacunales basados en PIV3 administrados posteriormente, disminuyendo de este modo la inmunogenicidad del segundo virus. Puesto que PIV3, como RSV, induce una enfermedad importante en la primera infancia, una vacuna de RSV-PIV3 combinada para usar en lactantes muy pequeños de 2 a 4 semanas de edad es por lo tanto un aspecto importante de la invención (véase, por ejemplo, Collins et al., Fields Virology 3ª ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1205 (1), 1996; Reed et al., J. Infect. Dis. 175: 807, 1997). De acuerdo con este aspecto de la invención, la inmunización con una vacuna de PIV1-PIV2 se iniciará de preferencia aproximadamente a los 6 meses de edad, puesto que la mayoría de las enfermedades por PIV1 y PIV2 aparecen después de la edad de seis meses. En la posible circunstancia de que la inmunización con rPIV3 cp45 inhiba significativamente la replicación de un virus vacunal PIV3-1 recombinante quimérico con el que comparte genes de proteínas internas, la inmunización con éxito con una vacuna PIV3-1 recombinante puede estar comprometida. En este caso, se administrará una vacuna de PIV trivalente simultáneamente, más que secuencialmente, previniendo de este modo la inhibición señalada anteriormente.

[0214] La descripción en la presente memoria de que la infección con una vacuna o PIV3 wt induciría una reducción de 100 veces de la replicación de virus pulmonar del PIV1 wt heterólogo era claramente inesperada, en parte porque los virus PIV humanos son serológicamente distintos por ensayo de neutralización, y estudios previos en hámsteres descubrieron que una infección previa con un tipo de PIV no inducía resistencia a la exposición con una alta dosis de un tipo de PIV diferente (véase, por ejemplo, Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77: 150, 1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990; Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 69:250, 1959). Además, hay pocos datos epidemiológicos que documenten que una infección previa con un PIV modifique significativamente una infección posterior con un PIV heterotípico.

[0215] En resumen, el presente Ejemplo muestra que el rPIV3 se convertía con éxito en una vacuna para PIV1 por sustitución de las ORF que codifican las glicoproteínas F y HN e introducción de mutaciones atenuantes conocidas en los genes internos de PIV3. Por lo tanto, los amplios métodos y reactivos proporcionados en la presente memoria pueden aplicarse directamente y de forma predecible para atenuar la cadena principal de PIV3 del virus quimérico rPIV3-1, así como para generar virus vacunales PIV2 vivos atenuados.

[0216] La descripción anterior hace posible aprovechar los reactivos y métodos proporcionados en la presente memoria para desarrollar una amplia colección de PIV y vacunas relacionadas. En este contexto, la recuperación de quimeras inmunogénicas vivas entre PIV3 y PIV2 ejemplifica nuevas herramientas poderosas para desarrollar una variedad de virus PIV recombinantes para uso vacunal. Junto con este trabajo, la identificación y caracterización de la base genética para la atenuación de mutantes de PIV de origen natural, por ejemplo, los candidatos a vacunas de cp45 y BPIV3, siguiendo las enseñanzas de la presente descripción, también permiten el desarrollo de una gran multitud de virus y partículas subvirales de vacunas recombinantes. En particular, las mutaciones deseadas presentes en virus mutantes derivados biológicamente se identificarán fácilmente y se seleccionarán para su introducción, individualmente o en combinación, en un fondo de PIV de tipo silvestre, parcialmente atenuado o quimérico, como se muestra en los Ejemplos anteriores. Estos descubrimientos ampliarán el menú de mutaciones atenuantes ejemplares dentro de la invención que pueden introducirse en clones de PIV para calibrar el nivel de atenuación e inmunogenicidad en recombinantes vacunales. También pueden introducirse mutaciones biológicamente en desventaja dentro de clones de PIV que tengan diferentes tipos de mutaciones, por ejemplo, mutaciones que impliquen alteraciones, deleciones o sustituciones de un gen o segmento génico. Dentro de este aspecto de la invención, se proporcionan PIV recombinantes que tienen una deleción, adición o sustitución génica seleccionada, tal como un rPIV que tiene una deleción de una o varias ORF C, D o V. Dichos clones mutados alternativamente pueden modificarse adicionalmente de acuerdo con la presente descripción por introducción de una

o más mutaciones que especifiquen un fenotipo ts, ca o att adoptado de un PIV mutante derivado biológicamente, como se ejemplifica por los recombinantes de PIV r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558 o r942/1558 y r942/992/1558. En aspectos adicionales de la invención, se combinarán mutaciones derivadas biológicamente con las mutaciones atenuantes de novo no encontradas en la naturaleza, como se ejemplifica por deleciones génicas atenuantes, por ejemplo, de una o varias ORF C, D y/o V. Otros tipos de mutaciones descritas en la presente memoria que confieren características fenotípicas deseadas también se combinarán con mutaciones atenuantes biológicamente derivadas similares a la variedad de mutaciones combinatorias descritas para cepas vacunales de RSV recombinantes en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de Nº de Serie 08/892.403, presentada el 15 de julio de 1997. Pueden introducirse fácilmente mutaciones comparables, por ejemplo, en un virus quimérico, para conseguir los niveles deseados de atenuación e inmunogenicidad en una cepa vacunal quimérica. De esta forma, se proporciona un amplio menú de mutaciones dentro de la invención, que son útiles para modificar por ingeniería genética una amplia colección de vacunas de rPIV vivas atenuadas que tienen un equilibro deseado de atenuación e inmunogenicidad, junto con otras características fenotípicas deseadas.

[0217] Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de la claridad de comprensión, será evidente que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS

[0218]

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: El Gobierno de los Estados Unidos

(B)

CALLE: Box OTT

(C)

CIUDAD: Bethesda

(D)

ESTADO: Maryland

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20892

(G)

TELÉFONO:

(H)

TELEFAX:

(I)

TELEX:

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE VACUNAS DE VIRUS PARAINFLUENZA ATENUADO A PARTIR DE UNA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS CLONADA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 74

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.25

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: WO

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-MAYO-1998

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/059.385

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-MAYO-1997

(vii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

(A)

NOMBRE: King, Jeffrey J.

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38.515

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 17634-000320PC

(viii) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A)

TELÉFONO: 206-467-9600

(B)

TELEFAX: 415-575-0300

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15669 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 61

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla 63

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15660 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla15 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15666 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 71

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 6843 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A)

LONGITUD: 7107 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12011 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases 95

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases 97

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 25

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 35 (A) LONGITUD: 15462 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 40 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen14

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen15

imagen1

imagen16

imagen17

imagen18

imagen1

imagen1

imagen1

imagen19

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen20

imagen1

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen1

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen1

imagen37

imagen38

30

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases 107

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases 109

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases 111

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 11 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 11 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 71:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 72:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 73:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 74:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen1

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

imagen1

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

imagen60

imagen61

imagen1

imagen62

imagen63

imagen64

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula polinucleotídica aislada que comprende un promotor de la transcripción unido operativamente, una secuencia polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un terminador de la transcripción, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

2. 2.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma incorpora un gen o segmento génico de BPIV.

3. 3.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, que incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

4. 4.

   El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica el genoma o antigenoma de PIV quimérico está modificado adicionalmente por una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótido que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV.

5. 5.

   El polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el genoma o antigenoma de PIV codifica una partícula de PIV infecciosa.

6. 6.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una o más mutaciones de JS cp45.

7. 7.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una mutación estabilizada por múltiples sustituciones de nucleótidos en un codón que especifica la mutación.

8. 8.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicho genoma o antigenoma quimérico incorpora múltiples mutaciones, especificando cada una un fenotipo seleccionado de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas o restricción del intervalo de hospedador.

9. 9.

   La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que una mutación que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV se incorpora en un fondo de PIV quimérico, que comprende un genoma o antigenoma que tiene uno o más de un gen o segmento génico de glicoproteína HN o F de PIV3 sustituido por uno o más genes o segmentos genómicos homólogos de glicoproteína HN y F de PIV1 o PIV2.

10. 10.

    La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, que incorpora una secuencia reguladora de acción en cis de HPIV1, HPIV2 o BPIV.

11. 11.

    La molécula polinucleotídica aislada de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, que incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

12. 12.

    La molécula polinucleotídica aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incorpora una secuencia polinucleotídica que codifica una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

13. 13.

    Una célula o composición sin células que incluye un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica aislada que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un vector de expresión que comprende una

    o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican proteínas N, P y L de PIV, en la que la molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico, de manera que la expresión de dicho genoma o antigenoma de PIV y proteínas N, P y L produce una partícula de PIV infecciosa.

14. 14.

    La célula o composición sin células de la reivindicación 13, en la que la partícula de PIV infecciosa es un virus.

15. 15.

    La célula o composición sin células de la reivindicación 13, en la que la partícula de PIV infecciosa es una partícula subviral.

16. 16.

    Un método para producir una partícula de PIV infecciosa a partir de una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican dicho PIV, que comprende: coexpresar en una célula o sistema sin células un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un vector de expresión que comprende una o más moléculas polinucleotídicas que codifican proteínas N, P y L, produciendo de este modo una partícula de PIV infecciosa en la que la molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

17. 17.

    El método de la reivindicación 16, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV es ADNc.

18. 18.

    El método de la reivindicación 16, en el que la partícula de PIV infecciosa es un virus.

19. 19.

    El método de la reivindicación 16, en el que la partícula de PIV infecciosa es una partícula subviral.

20. 20.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV quimérico es una quimera de secuencias de PIV humanas y bovinas.

21. 21.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora además una mutación atenuante de una cepa de PIV derivada biológicamente.

22. 22.

    El método de la reivindicación 21, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora al menos una mutación de JS cp45.

23. 23.

    El método de la reivindicación 21 ó 22, en el que dicha molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora una mutación que se estabiliza por múltiples sustituciones de nucleótidos en un codón que especifica la mutación.

24. 24.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que una secuencia heteróloga de HPIV1 o HPIV2 que codifica un gen o segmento génico de una glicoproteína HN o F sustituye a un gen o segmento génico correspondiente de HPIV3.

25. 25.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que dicho genoma o antigenoma quimérico incorpora múltiples mutaciones, especificando cada una un fenotipo seleccionado de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas o restricción del intervalo de hospedador.

26. 26.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en el que dicha molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

27. 27.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV está modificada para codificar una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

28. 28.

    Una partícula de PIV infecciosa, que comprende un genoma o antigenoma de PIV recombinante, una proteína N, una proteína P y una proteína L, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificado por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

29. 29.

    La partícula de PIV infecciosa de la reivindicación 28, que es una partícula subviral.

30. 30.

    La partícula de PIV infecciosa de la reivindicación 28, que es un virus.

31. 31.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante incorpora una secuencia heteróloga de RSV o virus del sarampión.

32. 32.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante comprende además una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótido que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV.

33. 33.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante incorpora al menos una mutación de JS cp45.

34. 34.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en la que una mutación que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV está incorporada en un fondo de PIV quimérico que comprende un genoma o antigenoma que tiene uno o más genes o segmentos génicos de glicoproteína HN o F de PIV3 sustituido por uno o más genes o segmentos génicos homólogos de glicoproteína HN y F de PIV1 o PIV2.

35. 35.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante está modificado para codificar una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

36. 36.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en la que el genoma o antigenoma de PIV quimérico comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno o epítopo de RSV que genera una inmunidad protectora contra RSV en un hospedador inmunizado.

37. 37.

    La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en la que el genoma o antigenoma de PIV quimérico comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno o epítopo del virus del sarampión.

38. 38.

    Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.