ES2377751T3 - Polipéptidos y polinucleótidos de Porfiromonas gingivalis - Google Patents

Abstract

Un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426; (ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o (iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i) .

Description

Polipéptidos y Polinucleótidos de Porfiromonas gingivalis

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con secuencias de nucleótidos p. Gingivalis, polipéptidos p. Gingivalis y sondas para la detección de p. Gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de p. Gingivalis se pueden utilizar en composiciones para uso en elevar una respuesta inmune en un sujeto contra p. Gingivalis y tratar o evitar o reducir la gravedad de la afección conocida como periodontitis.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas con bacterias de los tejidos de soporte del diente y varían desde la forma relativamente moderada de gingivitis, la inflamación reversible, no específica del tejido gingival hasta las formas más agresivas de periodontitis que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de asociación de bacterias Gram-negativas específicas que conduce a la destrucción del periodonto y es un gran problema de salud pública. Una bacteria que atrae interés considerable es P. gingivalis cuando la recuperación de este microorganismo a partir de lesiones de periodontitis de adulto puede ser de hasta 50 % de la flora subgingival cultivable anaeróbicamente, mientras que raramente se recupera de P. gingivalis, y luego en bajas cifras, de los sitios saludables. Se ha asociado un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival con un aumento grave de periodontitis y erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable acompañado de resolución de la enfermedad. Se ha demostrado la progresión de las lesiones por periodontitis en primates diferentes a los humanos con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos hallazgos en animales y humanos sugieren una función principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en adultos.

P. gingivalis es un bacilo Gram-negativo proteolítico, asacarolítico, anaeróbico, pigmentado en negro que obtiene energía del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo tiene un requerimiento absoluto de hierro para crecimiento, preferiblemente en la forma de hemo o su Fe (III).

Con el fin de desarrollar una vacuna segura y eficaz para evitar, eliminar o reducir la colonización por P. gingivalis es necesario identificar y producir antígenos que estén implicados en la virulencia que tengan utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Aunque es posible intentar aislar los antígenos directamente de los cultivos de P. gingivalis es frecuentemente difícil. Por ejemplo como se mencionó anteriormente, P. gingivalis es un anaerobo estricto y puede ser difícil de aislar y cultivar. También se sabe que, para un número de organismos, cuando son cultivados in vitro que muchos genes de virulencia se regulan por disminución y las proteínas codificadas no se expresan más. Si se aplican técnicas de química convencional para purificación no se pueden identificar los candidatos de vacuna de moléculas potencialmente importantes (protectoras). Con el secuenciamiento de ADN, cuando está presente el gen (pero no transcrito) aún cuando el organismo se cultiva in vitro se puede identificar, clonar y producir como una proteína de ADN recombinante. De forma similar, se puede expresar transitoriamente un antígeno protector u objetivo terapéutico por el organismo in vitro o producir en bajos niveles que hacen la identificación de estas moléculas extremadamente difíciles mediante métodos convencionales.

Con la identificación serológica de los objetivos terapéuticos uno se limita a aquellas respuestas que son detectables utilizando métodos estándar tales como Western Blot o ELISA. La limitación aquí es el nivel de respuesta que se genera por el animal o humano y determina si esta respuesta es protectora, dañina o irrelevante. No está presente tal limitación con un método de secuenciamiento para la identificación de los objetivos profilácticos o terapéuticos potenciales.

También se sabe que el P. gingivalis produce un rango de proteasas ampliamente activas (University of Melbourne, Solicitud de Patente Internacional No WO97/16542, Patente Estadounidense Nos 5,475,097 y 5,523,390), que hace que sea difícil la identificación de las proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han intentado aislar las secuencias de nucleótidos P. gingivalis que se pueden utilizar para producción recombinante de los polipéptidos P. gingivalis y para desarrollar sondas de nucleótido específicas para

P. gingivalis. Las secuencias de ADN mencionadas adelante se han seleccionado de un gran número de secuencias

P. gingivalis de acuerdo con su potencial indicador como candidatos de vacuna. Esta etapa intuitiva implica la comparación desde la secuencia de proteína deducida de las secuencias de ADN P. gingivalis hasta las bases de datos de secuencia de proteínas conocidas. Algunas de las características utilizadas para seleccionar los candidatos de vacuna útiles incluyen; la ubicación celular esperada, tal como proteínas de membrana externas o proteínas secretadas, las actividades funcionales particulares de proteínas similares tales como aquellas con una actividad enzimática o proteolítica, las proteínas implicadas en las rutas metabólicas esenciales que cuando se inactivan o bloquean pueden ser perjudiciales o letales para el organismo, las proteínas que se pueden esperar que cumplan una función en la patogenia del organismo por ejemplo lisis de glóbulos rojos, aglutinación celular o receptores celulares y proteínas que son parálogas a las proteínas con eficacia de vacuna mejorada.

En un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende;

5 (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426;

(ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o

(iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i).

En una realización de la presente invención, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la (i).

Como se utiliza aquí el % de identidad para los polipéptidos se calcula utilizando el algoritmo de alineación de Needleman y Munsch (9) utilizando una matriz de clasificación de proteína estándar (Blosum 50).

En una realización preferida de la presente invención el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ. ID. NO. 426 o SEQ ID NO. 301.

En un segundo aspecto la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada, la molécula de ADN 15 comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido del primer aspecto de la presente invención.

Se prefiere que la molécula de ADN aislada comprenda la secuencia de nucleótido de la SEQ. ID. NO. 162 o SEQ ID NO. 37.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN del segundo aspecto de la presente invención ligada operablemente a un elemento regulador de transcripción.

La presente invención también proporciona una célula aislada que comprende este vector de expresión recombinante.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido P. gingivalis que comprende cultivar la célula bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

25 En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad efectiva de (a) por lo menos un polipéptido del primer aspecto de la presente invención, (b) por lo menos una molécula de ADN del segundo aspecto de la presente invención, y/o (c) un polipéptido de por lo menos 40 aminoácidos que tiene una secuencia contigua de por lo menos 40 aminoácidos idénticos a una secuencia de aminoácidos contigua de la SEQ ID NO. 426, en donde el polipéptido es capaz de elevar una respuesta inmune contra P. gingivalis, y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea un adyuvante. En otros aspectos, la presente invención proporciona tal composición para uso en elevar una respuesta inmune dirigida a P. gingivalis en un sujeto, o para tratar infección por P. gingivalis. El tratamiento puede ser profiláctico o terapéutico.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo elevado contra un polipéptido del primer

35 aspecto de la invención. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. La presente invención también proporciona composiciones que incluyen estos anticuerpos. Se prefiere que estas composiciones se adapten para uso oral y puedan ser, por ejemplo, pasta dental, enjuague bucal, etc.

La presente invención también proporciona un método para detectar la presencia de una molécula de ADN del segundo aspecto de la invención en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto una muestra con una sonda de nucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de por lo menos 18 nucleótidos idénticos a una secuencia de nucleótido contigua seleccionada del grupo que consiste de la SEQ. ID. NO. 37 bajo condiciones en las que se puede formar un híbrido entre la sonda y la molécula de ADN del segundo aspecto de la invención en la muestra; y

(b) detectar el híbrido formado en la etapa (a), en donde la detección de un híbrido indica la presencia de la molécula 45 de ADN del segundo aspecto de la invención en la muestra.

Descripción detallada

Definiciones

Se utilizan intercambiablemente aquí una preparación sustancialmente pura o polipéptido aislado o purificado de un polipéptido y, como se utiliza aquí, significa un polipéptido que se ha separado de otras proteínas, lípidos, y ácidos nucleicos con los que ocurre en forma natural. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de las sustancias, por ejemplo, anticuerpos o matriz de gel, por ejemplo, poliacrilamida, que se utilizan para purificarlos. Preferiblemente, el polipéptido constituye por lo menos 10, 20, 50 70, 80 o 95 % en peso seco de la preparación purificada. Preferiblemente, la preparación contiene: suficiente polipéptido para permitir el secuenciamiento de la proteína; por lo menos 1, 10, o 100 mg del polipéptido.

Una preparación purificada de las células se refiere a, en el caso de la planta o células de animal, una preparación in vitro de células y no un animal o planta intacta completa. En el caso de células cultivadas o células microbianas, consiste de una preparación de por lo menos 10 % y más preferiblemente 50 % de las células objeto.

Un ácido nucleico sustancialmente puro o aislado o purificado, por ejemplo, un ADN sustancialmente puro, (son términos utilizados intercambiablemente aquí) es un ácido nucleico que es uno o ambos de los siguientes: no inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente contigua (es decir., uno en el extremo 5’ y uno en el extremo 3’) en el genoma que ocurre de forma natural del organismo del que se deriva el ácido nucleico; o que es sustancialmente libre de un ácido nucleico con el que ocurre en el organismo del que se deriva el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora dentro de un vector, por ejemplo, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o dentro del ADN genómico de un procariote o eucariote, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un cADN o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica la secuencia de ADN P. gingivalis adicional.

Un "contig" como se utiliza aquí es un ácido nucleico que representa un tramo contiguo de la secuencia genómica de un organismo.

Un "marco de lectura abierto", también denominado aquí como ORF, es una región del ácido nucleico que codifica un polipéptido. Esta región puede representar una porción de una secuencia codificante o una secuencia total y se puede determinar desde un codón de parada hasta el codón de parada o desde un codón de inicio hasta un codón de parada.

Como se utiliza aquí, una "secuencia codificante" es un ácido nucleico que se transcribe dentro del ARN mensajero y/o se traduce en un polipéptido cuando se pone bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio de traducción en los cinco terminales principales y un codón de parada de traducción en los tres terminales principales. Una secuencia codificante puede incluir pero no se limita al ADN sintético del ARN mensajero, y las secuencias de ácido nucleico recombinantes.

Un "complemento" de un ácido nucleico como se utiliza aquí se refiere a una secuencia anticodificante o antiparalela que participa en el par base Watson-Crick con la secuencia original.

Un "producto de gen" es una proteína o ARN estructural que se codifica específicamente por un gen.

Como se utiliza aquí, el término "sonda" se refiere a un ácido nucleico, péptido u otra entidad química que se una específicamente a una molécula de interés. Las sondas se asocian frecuentemente con o son capaces de asociarse con un marcador. Un marcador es una unidad estructural química capaz de detección. Los marcadores típicos comprenden tintes, radioisótopos, unidades estructurales luminiscentes y quimioluminiscentes, fluoróforos, enzimas, agentes de precipitación, secuencias de amplificación, y similares. De forma similar, un ácido nucleico, péptido u otra entidad química que se une específicamente a una molécula de interés e inmoviliza tal molécula se denomina aquí como un "ligando de captura". Los ligandos de captura se asocian típicamente con o son capaces de asociarse con un soporte tal como nitro-celulosa, vidrio, membranas de nylon, glóbulos, partículas y similares. La especificidad de hibridación es dependiente de condiciones tales como la composición de par base de los nucleótidos, y la temperatura y concentración de sal de la reacción. Estas condiciones son fácilmente discernibles para un experto en la técnica utilizando experimentación de rutina.

Homólogos se refieren a la similitud de secuencia o la identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando se ocupa una posición en las dos secuencias comparadas por la misma base

o subunidad de monómero de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN se ocupa por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esta posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones homólogas o coincidentes compartidas por las dos secuencias divididas por el número de posiciones comparado x 100.

Los términos péptidos, proteínas, y polipéptidos se utilizan intercambiablemente aquí.

Un "componente inmunogénico" como se utiliza aquí es una unidad estructural, tal como un polipéptido P. gingivalis, análogo o fragmento del mismo, que es capaz de provocar una respuesta inmune celular y/o humoral en un animal anfitrión.

Un "componente antigénico" como se utiliza aquí es una unidad estructural, tal como el polipéptido P. gingivalis, análogo o fragmento del mismo, que es capaz de unirse a un anticuerpo específico con afinidad suficientemente alta para formar un complejo de antígeno-anticuerpo detectable.

Como se utiliza aquí, el término "promotor específico de célula" significa una secuencia de ADN que sirve como un promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada ligada operativamente al promotor, y que afecta la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas de un tejido. El término también cubre los así llamados promotores de "fuga", que regulan la expresión de un ADN seleccionado principalmente en un tejido, pero que provocan la expresión también en otros tejidos.

Como se utiliza aquí, el término "secuencia de control" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia base que se reconoce por el organismo anfitrión para afectar la expresión de las secuencias codificadas a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrión; en procariotes, tales secuencias de control incluyen de manera general un promotor, sitio de unión ribosómico, terminadores, y en algunos casos operadores; en eucariotes, de manera general tales secuencias de control incluyen promotores, terminadores y en algunos casos, mejoradores. El término secuencia de control se pretende que incluya como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, las secuencias líder.

Como se utiliza aquí, el término "ligado operativamente" se refiere a las secuencias unidas o ligadas a la función en su forma pretendida. Por ejemplo, una secuencia de control se liga operativamente a la secuencia codificante mediante ligación en tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con la secuencia de control y la célula anfitriona.

Una "muestra" como se utiliza aquí se refiere a una muestra biológica, tal como, por ejemplo, tejido o fluido aislado de un individuo (que incluye sin limitación plasma, suero, fluido cerebroespinal, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejido) o de constituyentes de cultivo celular in vitro, así como también muestras del ambiente.

La práctica de la invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas se describen y se explican a lo largo de la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley- Interscience (1988, que incluyen todas las actualizaciones hasta ahora presentes).

Portadores Farmacéuticamente Aceptables

Los anticuerpos, polipéptidos y ADN de la presente invención se pueden incluir en composiciones que incluyen un portador o diluyente. Estas composiciones incluyen composiciones farmacéuticas en donde el portador o el diluyente serán farmacéuticamente aceptables. Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos utilizados en las composiciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (que incluye bucal y sublingual), vaginal, parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). Estos no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los ejemplos representativos de portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a; agua, soluciones isotónicas que se regulan preferiblemente en un pH fisiológico (tal como solución salina regulada con fosfato o solución salina regulada por Tris) y también pueden contener uno o más de, mannitol, lactosa, trehalosa, dextrosa, glicerol, etanol o polipéptidos (tal como albúmina de suero humana). Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia.

Como se entenderá bien por aquellos expertos en la técnica se pueden hacer alteraciones a las secuencias de aminoácidos establecidas en los Listados de Secuencias. Estas alteraciones pueden ser eliminaciones, inserciones,

o sustituciones de los residuos de aminoácidos. Los polipéptidos alterados pueden ocurrir en forma natural (es decir, purificar o aislar de una fuente natural) o sintética (por ejemplo, al realizar mutagenia dirigida a sitio en el ADN codificante). Se pretende que tales polipéptidos alterados que tiene por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 95 % de identidad con las secuencias establecidas en el Listado de Secuencias que están dentro de alcance de la presente invención. Los anticuerpos que surgen contra estos polipéptidos alterados también se unirán a los polipéptidos que tienen una de las secuencias establecidas en los Listados de Secuencias. El nivel de % de identidad se va a calcular según lo establecido anteriormente.

Las secuencias de proteínas son homólogas si se relacionan mediante divergencia de un ancestro común. Posteriormente, un homólogo de especie de la proteína será la proteína equivalente en la que ocurre en forma natural en otras especies. Dentro de cualquiera de una especie puede existir un homólogo como numerosas variantes alélicas, y estás se considerarán homólogos de la proteína. Las variantes alélicas y homólogos de especies se pueden obtener mediante las siguientes técnicas estándar conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Una variante alélica será una variante que ocurre en forma natural dentro de un organismo individual.

Mutantes, Variantes y Homología - �?cidos Nucleicos

Los polinucleótidos mutantes poseerán una o más mutaciones que son eliminaciones, inserciones, o sustituciones de los residuos de nucleótido. Los mutantes pueden ocurrir de forma natural (es decir, aislar de una fuente natural) o sintética (por ejemplo, al realizar mutagenia dirigida a sitio en el ADN). Es así evidente que los polinucleótidos de la invención pueden ocurrir en forma natural o recombinante (es decir preparar utilizando técnicas de ADN recombinante).

Una variante alélica será una variante que ocurre en forma natural dentro de un organismo individual.

Las secuencias de nucleótidos son homólogas si se relacionan mediante divergencia de un ancestro común. Posteriormente, un homólogo de especie del polinucleótido será el polinucleótido equivalente que ocurre en forma natural en otra especie. Dentro de cualquier una especie puede existir un homólogo como numerosas variantes alélicas, y estas se considerarán homólogos del polinucleótido. Las variantes alélicas y los homólogos de las especies se pueden obtener mediante las siguientes técnicas estándar conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Producción de Anticuerpo

Los anticuerpos, policlonal o monoclonal, que son específicos para un polipéptido de la presente invención se pueden producir por una persona experta en la técnica utilizando técnicas estándar tales como, pero no limitado a, aquellos descritos por Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press (1988), y D. Catty (editor), Antibodies: A Practical Approach, IRL Press (1988).

Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales a epítopos de una proteína. Para la producción de los anticuerpos policlonales, es aceptable un número de animales anfitriones para la generación de anticuerpos mediante inmunización con una o más inyecciones de preparación de un polipéptido, que incluye pero no se limita a conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica en el animal anfitrión, dependiendo de las especies anfitriones, que incluyen pero no se limitan a Freund (completo y incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones de aceite, hemocianinas ojo de lapa de cerradura, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Un anticuerpo monoclonal para un epítopo de una proteína se puede preparar al utilizar cualquier técnica que proporciona la producción de las moléculas de anticuerpo mediante estirpes celulares continuas en el cultivo. Estas incluyen pero no se limitan a la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 493-497), y la técnica de hibridoma de célula B humana más reciente (Kesber et al. 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma EBV (Cole et al. 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 7796). Adicionalmente, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" al cortar y empalmar los genes de la molécula de anticuerpo de especificidad de antígeno apropiado junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada (Morrison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al. 1984 Nature 312:604-608; Takeda et al. 1985 Nature 31: 452-454). Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente Estadounidense 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específica 4.

Las versiones humanas o humanizadas recombinantes de los anticuerpos monoclonales son una realización preferida para aplicaciones terapéuticas humanas. Se puede preparar anticuerpos humanizados de acuerdo con procedimientos en la literatura (por ejemplo Jones et al. 1986, Nature 321:522-25; Reichman et al. 1988 Nature 332:323-27; Verhoeyen et al. 1988, Science 239:1534-36). La estrategia "mutagenia de conversión de gen" recientemente descrita para la producción del anticuerpo monoclonal humanizado también se puede emplear en la producción de anticuerpos humanizados (Carter et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285-89). Alternativamente, las técnicas para generar la colección de fase recombinante de combinaciones aleatorias de las regiones pesada y ligera que se pueden utilizar para preparar anticuerpos recombinantes (por ejemplo Huse et al. 1989 Science 246:1275-81).

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula tal como Fu F(ab1) y F(ab2) se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: el fragmento F(ab) E2 que se puede producir mediante digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo intacto; los fragmentos Fab’ que se pueden generar al reducir los puentes de disulfuro del fragmento F(ab’)2, y los dos fragmentos Fab que se pueden generar al tratar la molécula de anticuerpo compuesta con papaína y un agente de reducción. Alternativamente, se pueden construir colecciones de expresión Fab (Huse et al. 1989, Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil del fragmento monoclonal Fab con la especificidad deseada para una proteína.

Adyuvantes

"Adyuvante" significa una composición comprendida de una o más sustancias que mejora la inmunogenicidad o eficacia de una composición de vacuna. Ejemplos no limitantes de los adyuvantes adecuados incluyen escualano y escualeno (u otros aceites de origen animal); copolímeros de bloque; detergentes tales como Tween®-80; Quail® A, aceites minerales tales como Drakeol® o Marcol®, aceites vegetables tales como aceite de maní; adyuvantes derivados de Corynebacterium tales como Corynebacterium parvum; adyuvantes derivados de Propionibacterium tales como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmetic y Guerinn o BCG); interleuquinas tales como interleuquina 2 y interleuquina-12; monoquinas tales como interleuquina 1; factor de necrosis de tumor; interferones tales como interferón gama; combinaciones tales como hidróxido de saponina-aluminio o hidróxido de aluminio Quil-A; liposomas; adyuvante ISCOM; extracto de pared celular micobacteriana; glicopéptidos sintéticos tales como dipéptidos muramilo u otros derivados; Avridina; Lípido A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano o DHAE-Dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno tal como Carbopol’ EMA®; emulsiones de copolímero acrílico tales como Neocryl A640 (por ejemplo Patente Estadounidense No. 5,047,238); proteínas poxvirus de animal o vaccinia; adyuvantes de partícula sub-vírica tal como toxina del cólera, o mezclas de los mismos.

Como se utiliza aquí, las condiciones exigentes son aquellas que (1) emplean resistencia iónica baja y alta temperatura para lavado, por ejemplo, 0.015 M NaCl/0.0015 M citrato de sodio/0.1 % de NaDodSO4 a 50° C; (2) emplean durante hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, 50 % (vol/vol) de formamida con 0.1 % de albúmina de suero bovino, 0.1 % de Ficoll, 0.1 % de povidona, regulador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con 750 mM NaCl, citrato de sodio 75 mM a 42° C; o (3) emplean 50 % de formamida, 5 x SSC (0.75 M NaCl, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), 0.1 % de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN sonicado de esperma de salmón (50 µg/ml), 0.1 % de SDS y 10 % de sulfato de dextrano a 42° C en 0.2 x SSC y 0.1 % de SDS

Como se entenderá la presente invención incluye dentro de su alcance la vacuna de ADN. Se puede encontrar ADN con respecto a información adicional en Donnelly et al, Journal of Immunological Methods 176(1994) 145-152.

A través de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado o entero o grupo de elementos o enteros pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero, o grupo de elementos o enteros.

Preparación de la colección P. gingivalis para secuenciamiento.

Para determinar la secuencia de ADN de P. gingivalis el ADN genómico se aísla de la cepa P. gingivalis W50 (ATCC 53978) esencialmente por el método descrito por Mamur J. (J. Mol. Biol. 3, 208-218, 1961). Se realiza la clonación de los fragmentos de ADN esencialmente como se describe por Fleischmann et al., (Science; 269, 496-512, 1995) (2). En resumen, el ADN genómico de P. gingivalis se nebuliza para el fragmento de ADN y se trata con nucleasa Bal31 para crear extremos romo luego de correr dos veces a través de 1 % de geles de agarosa preparativos. Los fragmentos de ADN de 1.6-2.0 kb se extrajeron del gel y el ADN recuperado. Este ADN luego se liga a un vector pUC18 (SmaI digerido y desfosforilado; Pharmacia) y se realiza electrofóresis a través de 1 % de gel de agarosa preparativo. El fragmento que comprende el vector lineal más un inserto se extrae, se purifica y este proceso se repite para reducir cualquier vector sin contaminación del inserto. El vector recuperado más el ADN de inserto tiene extremo romo con polimerasa de ADN T4, luego se realiza un ligado final para producir ADN circular. Se transforman alícuotas de Células Competentes para Electroporación Epicurian Coli (Stratagene) con el ADN ligado y se ponen en placas en placas de difusión antibiótica de agar SOB que contienen X-gal y se incuban a 37° C durante la noche. Las colonias con insertos aparecen blancas y aquellas sin insertos (solo vector) aparecen azules. Las placas se almacenan a 4° C hasta que se recogieron los clones blancos y se expandieron para la extracción del plásmido de ADN para secuenciamiento.

Secuenciamiento de ADN

Se prepara el plásmido de ADN al recoger colonias bacterianas en 1.5 ml de caldo de cultivo LB, TB o SOB complementado con 50-100 ug/ml de Ampicilina en placas de 96 pozos profundos. El plásmido de ADN se aísla utilizando los paquetes QIAprep Spin o QIAprep 96 Turbo miniprep (QIAGEN GmbH, Alemania). El ADN se eluye en una disposición de rejilla de 96 pozos a -20C.

Se realizan reacciones de secuenciamiento utilizando los equipos de Reacción Listos para Secuenciamiento de Ciclo Terminador de Tinte ABI PRISM y Tinte ABI PRISM BIG con polimerasa FS de ADN AmpliTaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando los cebadores de secuenciamiento traseros y delanteros M13 Universal. Se conducen reacciones de secuencia en cualquier ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems) o Hybaid PCR Express (Hybaid, UK). Se analizan las reacciones de secuenciamiento en secuenciadores de ADN ABI PRISM 377 (PE Applied Biosystems).

Las secuencias obtenidas se establecen adelante. Se nota que la presente invención se relaciona con PG21. La relación entre estas secuencias se establece en la Tabla 1. Se calcula el codón de inicio utilizando una combinación de la alineación de homología de secuencia (FASTA), predicción de la secuencia de señal (PSORT, SignalP) o predicción ORF (GeneMark).

Tabla 1: Tabla de referencia que indica las relaciones de cada secuencia ID a las proteínas seleccionadas.

Nombre de proteína

Secuencia de ADN de ORF completo Secuencia de aminoácidos de ORF completo Secuencia de ADN de proteína Secuencia de aminoácidos de proteína

PG1

1 265 122 386

PG21

37 301 162 1426

PG3

45 309 170 434

PG30

46 310 171 435

PG96

118 382 261 525

PG97

119 383 262 526

5 Análisis de secuencia de ADN

Los archivos de ADN en formato FASTA se convierten a archivos de formato GCG y se importan en una base de datos. Los archivos de ADN se traducen en archivos de aminoácido utilizando el programa Flip obtenido de ANGIS (Australian Genomic Information Service, University of Sydney, Australia). Se realiza una serie de análisis bioinformáticos en las proteínas con el fin de seleccionar candidatos de vacuna potenciales. Los programas

10 utilizados son búsqueda de homología FASTA (1), PSORT (2,3), SignalP (4), TopPred (5), y GeneMark (6). Las proteínas y sus resultados bioinformáticos se almacenan en la base de datos escrita habitual y se recupera de las proteínas con las características deseadas.

La homología FASTA resulta para estas proteínas que se examinan para cualquier alineación con una proteína que sugiere la ubicación de superficie o eficacia de vacuna. Todas las proteínas se buscan para homología contra una

15 base de datos de proteína bacteriana no redundante compilada mediante ANGIS utilizando el algoritmo FASTA. Las configuraciones utilizadas para las búsquedas FASTA son Ktup = 2, penalidad de creación de espacio = -12, penalidad de extensión de espacio = -2, ancho para derivar la alineación en opt = 16 y la matriz de clasificación Blosum 50. Se examinan resultados de búsqueda FASTA individuales para homología significativa mediante probabilidad estadística y alineaciones de aminoácido. Los resultados se establecen en la Tabla 2.

20 Los archivos de proteína luego se ajustan al primer, segundo, tercero, cuarto y quinto residuos de metionina utilizando un ajuste de proteína, programa (ANGIS). Las proteínas ajustadas luego se someten a análisis PSORT para la detección de las secuencias de señal y la predicción de la ubicación celular. Las proteínas que exhiben una probabilidad PSORT de la membrana externa >0.8 se considera que indica la ubicación de la superficie. Un segundo programa de detección de la secuencia de señal SignalP también se realiza y, en ciertos casos, este programa

25 detecta señales no identificadas con PSORT. Todas las proteínas identificadas por otros métodos también se analizan por PSORT y SignalP. Previamente, el aminoácido de terminal C de las proteínas de membrana externa bacteriana se ha mostrado que es importante para el ensamble de la proteína en la membrana externa (7). Una definición de estructura típica para las proteínas de membrana externa se ha determinado como la presencia de una secuencia de señal al terminal N y una tirosina o fenilalamina en el terminal C. Un número de las proteínas

30 seleccionadas exhibe esta estructura característica. El programa TopPred se utiliza para determinar la presencia y número de dominios periféricos de membrana (MSD) y la presencia de tales secuencias indica una preferencia que se va a unir a las membranas tal como la membrana externa. Los resultados de los análisis PSORT, SignalP y TopPred con los aminoácidos de terminal C de las proteínas seleccionados se establecen en la Tabla 3.

Los 70 aminoácidos del terminal C de un número de proteínas de membrana externas P. gingivalis comparten 50

35 100 % de identidad de secuencia de proteína. Estas proteínas incluyen RGP1, RGP2, KGP, HagA, HagC, HagD, prtH y prtT. Este motivo conservado puede estar implicado en la unión o clasificación de la proteína a la membrana externa. El conjunto de datos de proteína se busca utilizando la homología FASTA como se describió anteriormente y se identifica un número de proteínas novedosas que demuestran motivos similares en su terminal C. Los resultados se enumeran en la Tabla 4.

Tabla 2: Homología de proteína FASTA resulta de los ORF completos contra una base de datos de proteína no redundante.

Nombre de la proteína

Descripción de homología Número de acceso Genbank longitud del homólogo Longitudde la proteínaP. gingivalis Resultados de homología FASTA

% de identidad

Sobreposición Valor E

PG1

Proteína de membrana externa 48kD, Actinobacillus pleuropneumoniae U24492 449aa 451aa 32 454aa 1.40E42

PG3

Adhesina porina de membrana externa, Pseudomonas fluorescens U19743 317aa 223aa 35 187aa 1.10E10

PG21

Gen de antígeno de superficie, Methanosarcina mazei X84710 783aa 821aa 37 331aa 6.20E33

PG30

Lipoproteína putativa NlpD, Aquifexaeolicus AE000754 187aa 337aa 42 142aa 1.80E12

PG75

Porina de membrana externa clase 3 (porB), Neisseria meningitidis U07191 332aa 391aa 23 239aa 4.60E01

Tabla 3: Resultados de los análisis PSORT, SignalP y TopPred de las proteínas. La columna presente de señal indica la presencia de una secuencia de señal detectada con PSORT o SignalP. Los términos en paréntesis indican el tipo de secuencia de señal como se determina por PSORT. La ubicación de la célula & los valores deprobabilidad se generan mediante PSORT y representan la probabilidad de la proteína que está en los compartimientos celulares de la membrana externa (OM), la membrana interna (IM), el espacio periplásmico (PC) o el citoplasma (C). El número de dominios de transmembrana (TMD) se determina por TopPred y no incluye lassecuencias de señal no divisibles.

Nombrede laproteína

NúmerodeSeqIDdeproteína Longitudde laproteína Señalpresente Metioninaen ORF Sitio dedivisiónde señalIP Sitio dedivisiónPSORT Ubicación celular & probabilidad Aminoácidode terminalC Númerode losTMD

OM

IM PS C

PG1

386 451aa Y 1 14 34 0 0 0 0.22 N 0

PG3

434 223aa Y(lipoproteína) 1 - 18 0.79 0.76 0 0 K 3

PG21

426 821aa Y 2 24 27 0.34 0 0.37 0 G 1

PG30

435 337aa Y 1 21 21 0.24 0 0.4 0 K 0

PG75

493 391aa Y 1 26 26 0.94 0 0.3 0 H 1

PG96

525 563aa Y 1 23 23 0.40 0 0.33 0 K 0

PG97

526 437aa Y 1 23 23 0.32 0 0.65 0 Q 0

Tabla 4: Porcentaje de identidad y porcentaje de similitud de diversas proteínas con los 70 aminoácidos del terminal C de la proteasa 1 de arginina P. gingivalis 1 (RGP1), proteasa 2 de arginina (RGP2), y la proteasa cisteína/ hemaglutinina (prtT).

Nombre de la proteína

Porcentaje de identidad Porcentaje de similitud

RGP1

RGP2 prtT RGP1 RGP2 prtT

PG21

17 29 21 40 57 49

PG96

0 13 20 0 24 43

PG97

10 26 33 14 47 61

5 Clonación, expresión y purificación de los genes recombinantes P. gingivalis.

PG1

Los oligonucleótidos en las regiones 5’ y 3’ de la proteína deducida se utilizan para amplificar el gen de interés de

una preparación del ADN genómico P. gingivalis W50 utilizando el Sistema PCR de Precisión TaqPlus (Stratagene) y

un ciclador térmico PTC- 100 (MJ Research) o dispositivo similar. La secuencia de cebador 5’ de oligonucleótido es 10 GCGCCATATGCTGGCCGAACCGGCC, la secuencia de cebador 3’ de oligonucleótido es

GCGCCTCGAGTCAATTCATTTCCTTATAGAG. Se purifica el fragmento PCR, digerido con las enzimas de

restricción Nde I, Xho I (Promega) y se liga en los sitios correspondiente del plásmido pProEx-1 (Gibco-BRL) y se

transforma en células E. coli ER1793 (un regalo de Elizabeth Raleigh, New England Biolabs). Se selecciona un clon

resultante que expresa el inserto correcto y se induce con o sin 0.1mM IPTG (Promega) para la expresión de la 15 proteína recombinante. Se determina la expresión de la proteína recombinante mediante análisis SDSPAGE y

Western Blot utilizando un antisuero de conejo descrito anteriormente o un anticuerpo anti-hexahistidina (Clontech)

que detecta la etiqueta hexahistidina que se fusiona a la proteína recombinante P. gingivalis. Se purifica PG1

mediante la interrupción de las células E. coli mediante sonicación en regulador de unión (Novagen) y solubilización

mediante la adición de sarcosil (N-Lauroil sarcosina) a una concentración final de 1%. Después la preparación se 20 diluye a 0.1 % de sarcosil en regulador de unión, una a una columna de ácido Níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA;

Qiagen), después de lavado las proteínas unidas se eluyen con 1M imidazol en regulador de elución (Novagen) de

acuerdo con las recomendaciones Qiagen con 0.1 % de sarcosil agregado a todos los reguladores. Después de

purificación las muestras se dializan contra 500mM NaCl, 20mM Tris, 0.1 % de sarkosyl a pH 7.4 para retirar el

imidazol, concentrado cuando se requiera y se almacena a 4° C hasta que se utilizan. Se evalúan la pureza y 25 antigenicidad mediante SDSPAGE y Western blot utilizando el antisuero seleccionado (de aquellos descritos

anteriormente) y la concentración de proteína se determina por el ensayo BCA (Pierce).

PG3

Los métodos utilizados para PG3 son esencialmente iguales para PG1 con las siguientes excepciones. La secuencia

de cebador 5’ de oligonucleótido es GCGCGTATACATGAAGAAATCAAGTGTAG, la secuencia de cebador 3’ de 30 oligonucleótido es GCGCAGATCTCTTCAGCGTACCTTGCTGTG y el ADN se amplifica con polimerasa de ADN Pfu

(Stratagene). Se clona el producto PCR directamente en pCR-Blunt y se transforma en E. coli Top10F’ (In Vitrogen)

antes de subclonar en el plásmido de expresión pGex-parada RBS(IV) utilizando los sitios de restricción Bst Z171 y

Bgl II y se transforma en E. coli BL21DE3 (Pharmacia Biotech). Se hacen las siguientes modificaciones para la

purificación de PG3 del método PG1. Las células que expresan la proteína recombinante se interrumpen mediante 35 sonicación en regulador de unión y los cuerpos de inclusión insolubles se concentran mediante centrifugación.

Luego se solubilizan los cuerpos de inclusión en 6M urea (Sigma) en el regulador de unión y se eluyen con 6M urea

agregado al regulador de elución. En algunos casos se utiliza clorhidrato de guanidina 6M (Sigma) en lugar de urea

para estas etapas. Se retira la urea (o clorhidrato de guanidina cuando se sustituye) de la proteína purificada

mediante diálisis secuencial contra niveles reducidos de urea (3M luego 1.5M luego 0.5M luego 0M urea toda en 40 50mM Tris, 500mM NaCl, 8 % de glicerol, pH 7.4). La proteína purificada se almacena congelada a -80° C hasta que

se requiera. Se determina la concentración de la proteína mediante ensayo de proteína Coomassie Plus (Pierce).

PG30

Los métodos utilizados para PG30 son esencialmente iguales como para PG3 con las siguientes excepciones. Se

retira la secuencia de señal de termina N predicha de la proteína recombinante. La secuencia de cebador 5’ de 45 oligonucleótido es TACGGAATTCGTGACCCCCGTCAGAAATGTGCGC, la secuencia de cebador 3’ de

oligonucleótido es CTATGCGGCCGCTTTGATCCTCAAGGCTTTGCCCGG y se amplifica el ADN con el equipo PCR

Tth XL. El producto PCR se clona en el plásmido de expresión pET24a utilizando los sitios de restricción Eco RI y

Not I y se transforma en E. coli BL21DE3. Se llevan a cabo estudios de expresión y estudios de inmunoreactividad

en lisados completos E. coli de PG30. Se cultivan cultivos de 10 ml de E. coli recombinante en un OD de 2.0 (A600 50 nm en caldo de cultivo Terrific y las células se inducen con 0.5 mM IPTG y se toman muestras para análisis a 4

horas post inducción. No se hace purificación para estos estudios.

PG75 Los métodos utilizados para PG75 son esencialmente iguales como para PG30 con las siguientes excepciones. La secuencia de señal de terminal N predicha se retira de la proteína recombinante. La secuencia de cebador 5’ de oligonucleótido es GGCGGGATCCGCTCAGGAGCAACTGAATGTGGTA, la secuencia de cebador 3’ de oligonucleótido es GAGTGCGGCCGCTGTGGAACAAATTGCGCAATCCATC y se amplifica el ADN con el equipo de PCR Tth XL. El producto PCR se clona en el plásmido de expresión pET24a utilizando los sitios de restricción Bam HI y Not I y se transforma en E. coli BL21DE3. Se llevan a cabo estudios de inmunoreactividad y estudios de expresión en lisados E. coli completos. No se hace purificación para estos estudios.

PG96

Los métodos utilizados para PG96 son esencialmente iguales como para PG30 con las siguientes excepciones. La secuencia de señal de terminal N predicha se retira de la proteína recombinante. La secuencia de cebador 5’ de oligonucleótido es TGCTGAGCTCCAAACGCAAATGCAAGCAGACCGA, la secuencia de cebador 3’ de oligonucleótido es GAGTGCGGCCGCTTTTGAGAATTTTCATTGTCTCACG y se amplifica el ADN con el equipo de PCR Tth XL. El producto PCR se clona en el plásmido de expresión pET24a utilizando los sitios de restricción Sac I y Not I y se transforma en E. coli BL21DE3. Se llevan a cabo estudios de inmunoreactividad y estudios de expresión en lisados E. coli completos. No se hace purificación para estos estudios.

PG97

Los métodos utilizados para PG97 son esencialmente iguales como para PG30 con las siguientes excepciones. La secuencia de señal de terminal N predicha se retira de la proteína recombinante. La secuencia de cebador 5’ de oligonucleótido es GGCGGGATCCCAGTTTGTTCCGGCTCCCACCACA, la secuencia de cebador 3’ de oligonucleótido es GAGTGCGGCCGCTCTGTTTGATGAGCTTAGTGGTATA y se amplifica el ADN con el equipo de PCR Tth XL. El producto PCR se clona en el plásmido de expresión pET24a utilizando los sitios de restricción Bam HI y Not I y se transforma en E. coli BL21DE3. Se llevan a cabo estudios de inmunoreactividad y estudios de expresión en lisados E. coli completos. No se hace purificación para estos estudios.

Antisuero de animal y suero de paciente humano.

Se elevan diversos antisueros para detectar la expresión y el replegado de las proteínas P. gingivalis recombinantes. Se eleva un antisuero de célula completa al inyectar conejos Blandos de Nueva Zelanda con 3 dosis de P. gingivalis sonicados (cepa W50) que contiene aproximadamente 2 mg de proteína. La primera dosis se da en adyuvante completo de Freunds (FCA) y la segunda y tercera dosis se dan en adyuvante incompleto de Freunds (IFA) en intervalos de 3 semanas. Se suministran dosis intramusculares (1 ml) en las patas traseras y se desangran los conejos 7 días después de la última dosis, la sangre coagulada y el suero se retiran y se almacenan a -20° C hasta que se requiera. Se produce un segundo antisuero de conejo en una forma similar pero utilizando una fracción sarcosil insoluble (cada dosis tiene 0.69 mg de proteína) derivada de P. gingivalis W50 de acuerdo con el método de Doidg y Trust T. et al 1994 como el inmunógeno. Se produce un tercer antisuero de conejo en una forma similar para solo la primera fracción sarcosil soluble (1 mg de proteína por dosis) derivada de células P. gingivalis W50 de acuerdo con el método de Doidg P. y Trust TJ. (1994 Infect Immun 62:4526-33) se utiliza como el inmunógeno.

También se utiliza un grupo de "suero de rata protegido" en estos estudios y se obtiene de ratas inmunizadas con células P. gingivalis completas muertas con formalina en FIA (cepa ATCC 33277; 2 dosis de 2x109 células, 3 semanas aparte). Las ratas luego se exponen 2 semanas después de su última dosis con células P. gingivalis (cepa 33277) dada oralmente como se describió previamente (Klaussen B. et al. 1991, Oral Microbiol Immunol 6:193-201) y el suero obtenido de estas ratas 6 semanas después de la inoculación de exposición final al momento del sacrificio.

Se obtienen suero humano de pacientes adultos que experimenta tratamiento o evaluación para periodontitis en una clínica de pacientes ambulatorios. Estos pacientes tienen por lo menos 6 dientes con pérdida de adhesión de 6 mm y tienen P. gingivalis presente en su placa sub-gingival cuando se detecta utilizando una sonda de ADN específica

P. gingivalis. Se agrupa el suero de estos pacientes y se compara con un grupo de suero de pacientes periodontalmente saludables.

Inmunización y Protocolos del Modelo de Lesión de Murino

Se utiliza el modelo de absceso de ratón mouse para evaluar la eficacia de ratones inmunizados con proteínas recombinantes P. gingivalis en ratones protegidos de la formación de un absceso subcutáneo. Este modelo se ha utilizado por otros como un predictor de vacunas potenciales contra enfermedad periodontal (Bird PS, et al. 1995 J. Periodontol. 66:351-362). Se inmunizan ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad al inyectarlos subcutáneamente con 0.1 ml que contiene 10 o 20 µg de proteína recombinante P. gingivalis, 20 µg de la proteína de lisado E. coli, 2 x 109 células muertas con formalina de la cepa P. gingivalis 33277 emulsificada en adyuvante de Freund incompleto (IFA; Sigma) en el día 0. En el día 21 se inyectan ratones con la misma dosis y luego se desangran 1 semana después y se evalúan para niveles de anticuerpo. Al día 35 todos los ratones se exponen con aproximadamente 2 x 109 células de P. gingivalis vivo (ATCC 33277) mediante inyección subcutánea en el abdomen. Luego de exposición los ratones se monitorean diariamente para la pérdida de peso y el tamaño de la lesión se mide durante los siguientes 10 días. Se miden los tamaños de la lesión mediante longitud y ancho y se expresa como mm2. Los grupos se analizan estadísticamente utilizando un ANOVA de una vía Kruskal-Wallis y también se examinan individualmente utilizando la prueba t no pareada o la prueba de suma de clasificación Mann-Whitney utilizando el paquete estadístico Instat.

La Figura 1 muestra los resultados de un experimento en el día 4 después de exposición (las lesiones tienen un

5 tamaño máximo al mismo punto). Los ratones de control inmunizados con el lisado E. coli muestran lesiones grandes mientras que los ratones inmunizados con células muertas de la cepa P. gingivalis 33277 se protegen completamente. Esto indica que no se protegen las células completas que proporcionan protección contra la proteína E.coli blanca P. gingivalis de ratones inmunizados. A los ratones que se les da diversas proteínas recombinantes PG muestran niveles significativos de protección para PG2, PG22, PG24 y PG29 (p<0.05 prueba t no

10 pareada) mientras que el PG8A no es muy significativamente diferente (p=0.07) comparado con el grupo de control

E. coli.

La Figura 2 muestra los resultados de un experimento separado utilizando combinaciones de proteínas recombinantes. A los ratones que se les da PG1 + PG2 muestran un nivel significativo de protección comparado con ratones de control que da el lisado E. coli (p<0.026 prueba t no pareada).

15 Inmunodetección

Se cultivan candidatos clonados en 15 ml de caldo de cultivo Terrific, inducido con IPTG y se toman muestras 4h post-inducción. Se retira un ml de cultivo, se peletiza y las células se resuspenden en un volumen de PBS determinado al dividir el OD A600nm del cultivo mediante 8. Se agrega una alícuota de lisado (100 µl) a 100 µl de regulador de reducción de la muestra 2x (125 mM Tris pH 6.8, 20 % de glicerol, 4 % de SDS, 80mM DTT, 0.03 % de

20 azul bromofenol) y se hierve durante 10 min. Se realiza SDS-PAGE de acuerdo con el método de Laemmli UK. 1970 (Nature 227:680-685) utilizando 4-20 % de 1.0mm geles Tris-Glicina (Novex) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Las proteínas se transfieren en membranas de nitrocelulosa Hybond-C Extra (Amersham) mediante “transblotting” y las membranas luego se bloquean durante 2h a temperatura ambiente (TA) en 5 % de leche descremada en 20mM Tris, 0.5M NaCl, 0.05 % de Tween-20, pH 7.5 (TTBS).

25 Se realiza inmunodetección separadamente con el suero de célula completa anti- P. gingivalis de conejo, el suero protector de rata, un grupo de pacientes periodontales humanos, y en muchos casos un conjugado HRP de anticuerpo anti-T7-Tag (Novagen). Antes de uso, se diluyen el suero de conejo, rata y humano 1/5000, 1/1000 y 1/500 respectivamente en 5 % de leche descremada en TTBS y se absorbe con 100 µl (para el suero de conejo) o 250 µl (para el suero de rata y humano) de extracto E. coli (20 mg/ml; Promega) durante 6h a TA.

30 Se incuban durante la noche membranas a TA con el antisuero absorbido, o durante 1 hr a YA con 1/5000 de conjugado anti-T7-Tag diluido. Luego de lavados de 3x10 min con TTBS, anticuerpo anti-conejo (Silenus), anti-ratón (Silenus) o anti-humano (KPL) conjugado con HRP, se diluye 1/5000 en 5 % de leche descremada en TTBS, se agrega durante 1h a TA. Las membranas se lavan como anteriormente, antes de la adición del sustrato de peroxidasa de membrana TMB (KPL) para la detección de las proteínas inmunoreactivas. Los resultados de

35 reactividad de las proteínas P. gingivalis recombinantes se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Resultados de inmunotransferencia de las proteínas expresadas en E.coli contra suero de conejo, rata y humano. Se calcula el MW deducido de la secuencia de aminoácidos de las proteínas P. gingivalis, algunas de las cuales tienen sus secuencias de señal de terminal N retiradas. Se determina el MW evidente de geles SDS-PAGE. Las etiquetas de terminal N-y C agregan aproximadamente 2.5 KDa al PM deducido de las proteínas

40 recombinantes. Los símbolos son + positivo, - negativo, +/- positivo débil, ND no hecho.

Número de la proteína

PM deducido (KDa) PM evidente (KDa) Reactividad del antisuero

T7

Conejo Rata Humano

PG1

47.5 63 ND - - -

PG3

22.6 18.3 ND -a - -

PG30

35.1 46.9 + - - -

PG75

40.7 46.7 + - - -

PG96

59.3 70.3 + + + +

PG97

44.4 57.5 + - + +

a. Reacción positiva detectada con el antisuero de conejo al antígeno sarcosil insoluble P. gingivalis. b. La proteína purificada demuestra reacción positiva débil con el antisuero de conejo a P. gingivalis completo.

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1

(i)

SECUENCIA: CARACTER�?STICAS:

(A) LONGITUD: 1362 pares base 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO 10 (iv) ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMOHAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature 15 (B) UBICACIÓN 1...1362

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37

(i)

CARACTER�?STICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 2607 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 25 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORTPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...2607

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 690 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 15 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...690

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 1026 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 15 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA: 20 (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1026

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 118

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1689 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico 5 (C) CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1689 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 119

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1311 pares base 20 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO 5 (iv) ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROHONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature 10 (B) UBICACIÓN 1...1311

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 122

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 1353 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 20 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA: 25 (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1353

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 162

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 2463 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GUIGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA: 15 (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...2463

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 162

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 170

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 669 pares base 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO 10 (iv) ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...669

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 170

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 171 5 (i) CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1011 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTICODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS 15 (ix) CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1011 (::i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 171

20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 261

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1668 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOG�?A: circular 5 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROHONAS GINGIVALIS 10 (ix) CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1668

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 261

15 (7) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 262

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1284 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble 20 (D) TOPOLOG�?A: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTl-CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: PORYPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...1284

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 262

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 265

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 454 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 15 (A) ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...454

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 265

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 301

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 869 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...869

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 301

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 309

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 230 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...230

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 309

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 310

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 342 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 5 (iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature 10 (B) UBICACIÓN 1...342

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 310

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 382

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 563 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido 5 (D) TOPOLOG�?A: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis 10 (ix) CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...563

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 382

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 383

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 437 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...437

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 383

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 386

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido 5 (D) TOPOLOG�?A: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis 10 (ix) CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1... 451

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 386

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 426

(j)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 821 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: linear

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...821

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 426

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 434

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 223 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...223

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 434

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 435

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 337 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 15 (A) ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...337

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 435

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 525

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 556 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...556

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 525

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 526

(i)

CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 428 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOG�?A: lineal 5 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Porfiromonas gingivalis

(ix)

CARACTER�?STICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

UBICACIÓN 1...428

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 526

Referencias.

1.

Lipman DJ, Pearson WR. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 277:1435-1441.

2.

Horton, P. and Nakai, K. (1996). A probabilistic classification system for predicting the cellular localization sites of proteins. Intellig. Syst. Mol. Biol. 4: 109-115.

5 3. Nakai K, Kanehisa M. 1991. Expert systems for predicting protein localization sites in Gram-negative bacteria. Proteins: Structure, Function, and Genetics 11:95-110.

4. Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S and von Heijne G. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10, 1-6.

5. Claros MG and G von Heijne. (1994). TopPred II: an improved software for membrane protein structure 10 predictions. Comput. Appl. Biosci. 10: 685-686.

6.

Borodovsky M, Rudd KE, and EV Koonin. (1994). Intrinsic and extrinsic approaches for detecting genes in a bacterial genome. Nucleic Acids Res. 22: 4756-4767.

7.

Struvye M, Moons M, Tommassen J. 1991. Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein J. Mol. Biol. 218:141-148.

15 8. Aduse-Opoku J, Slaney JM, Rangarajan M, Muir J, Young KA, Curtis MA. 1997. The Tla receptor protein of Porfiromonas gingivalis W50: a homolog of the RI precursor (PrpRI) is an outer membrane receptor required for growth on low levels of hemin. J. Bacteriol. 179:4778-4788.

9. Needleman SB, Munsch CD. 1970. Ageneral method applicable to the search of similarity in the amino acid sequence of two proteins. J. Molec. Biol. 48: 443-453.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende:

   (i)

   la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426;

   (ii)

   la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o

   (iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i).

2. 2.

   Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i).

3. 3.

   Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO. 426.

4. 4.

   Una molécula de ADN aislada, la molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3.

5. 5.

   Una molécula de ADN aislada como se reivindica en la reivindicación 4 en la que la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO. 162.

6. 6.

   Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 o reivindicación 5 ligada operativamente a un elemento regulador de transcripción.

7. 7.

   Una célula aislada que comprende el vector de expresión recombinante como se reivindica en la reivindicación 6.

8. 8.

   Un método para producir un polipéptido P. gingivalis que comprende cultivar la célula como se reivindica en la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

9. 9.

   Una composición farmacéutica que comprende:

   (i)

   una cantidad efectiva de (a) por lo menos un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, (b) por lo menos una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 o reivindicación 5, y/o (c) un polipéptido de por lo menos 40 aminoácidos que tiene una secuencia contigua de por lo menos 40 aminoácidos idénticos a una secuencia de aminoácidos contigua de la SEQ ID NO. 426, en donde el polipéptido es capaz de elevar una respuesta inmune contra P. gingivalis; y

   (ii)

   un portador farmacéuticamente aceptable.

10. 10.

    Una composición como se reivindica en la reivindicación 9 o reivindicación 10 en la que el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

11. 11.

    Una composición como se reivindica en la reivindicación 9 o reivindicación 10 para uso en elevar una respuesta inmune dirigida a P. gingivalis en un sujeto.

12. 12.

    Una composición para uso como se reivindica en la reivindicación 11 para tratar un sujeto para infección P. gingivalis.

13. 13.

    Una composición para uso como se reivindica en la reivindicación 12, en donde el tratamiento es un tratamiento profiláctico o un tratamiento terapéutico.

14. 14.

    Un anticuerpo elevado contra un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3.

15. 15.

    Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 14 en el que el anticuerpo es policlonal o monoclonal.

16. 16.

    Una composición que comprende por lo menos un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 14 o reivindicación 15.

17. 17.

    Una composición como se reivindica en la reivindicación 16 que se adapta para uso oral.

18. 18.

    Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en una muestra que comprende:

    (a)

    poner en contacto una muestra con la sonda de nucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de por lo menos 18 nucleótidos idénticos a una secuencia de nucleótido contigua de la SEQ ID NO. 37 bajo condiciones en las que se puede formar un híbrido entre la sonda y la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en la muestra; y

    (b)

    detectar el híbrido formado en la etapa (a), en donde la detección de un híbrido indica la presencia de la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en la muestra.