JP2004135679A - Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドおよび配列 - Google Patents

Abstract

【課題】　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのゲノムのポリヌクレオチド配列を提供すること。
【解決手段】　本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのゲノムのポリヌクレオチド配列、当該ポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列、対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主、ならびに、これらのアッセイおよび他の使用を提供する。本発明はさらに、コンピューター読み出し可能な媒体上に保存されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列情報、ならびに、その使用を容易にするコンピューターに基づくシステムおよび方法を提供する。
【選択図】　なし

Description

　本発明は、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、とりわけＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのヌクレオチド配列、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）、ＯＲＦ、フラグメント、プローブ、プライマー、およびそれに関連したポリヌクレオチド、その配列によりコードされるペプチドおよびポリペプチド、ならびにそのポリヌクレオチドおよび配列の使用（例えば、発酵、ポリペプチド生産、アッセイ、および薬剤の開発などにおける）に関する。

　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属は、少なくとも２０種の異なる種を包含する。（概説は、Ｎｏｖｉｃｋ，Ｒ．Ｐ．，分子遺伝系としてのＳｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，第１章、１〜３７頁，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＩ，Ｒ．Ｎｏｖｉｃｋ編，ＶＨＣ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）を参照のこと）。種は互いに、ハイブリダイゼーション動力学により８０％以上異なるが、種内の株は、同じ尺度により少なくとも９０％同一である。

　グラム陽性で、通性好気性で、凝集塊形成球菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ種は、以下に簡単に論じるように、ヒトにおける細菌性感染の中でも最も重要な病原性因子である。

　ヒトの健康とＳ．ａｕｒｅｕｓ
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓは、遍在性病原体である。（例えば、Ｍｉｍｓら，ＭＥＤＩＣＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｅｕｒｏｐｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（１９９３）を参照のこと）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓは、中程度から致死にわたる種々の重篤度の病状の病原性因子である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染により生じるより一般な病状のいくつかは、火傷、蜂窩織炎、瞼の感染、食中毒、関節感染、新生児結膜炎、骨髄炎、皮膚感染、手術創傷感染、鱗状皮膚症候群、および毒ショック症候群であり、これらの内いくつかは、以下により詳細に記載される。

　火傷
　火傷の創傷は、一般に最初は無菌である。しかし、これらは一般に、感染に対する物理的および免疫的障壁を傷つけ、体液および電解質の損失を生じ、そして局所的または全身的な生理学的機能不全となる。冷却後、生存している細菌との接触は、損傷部位における混合性の住み着き（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす。感染は、火傷表面の非生存破片（「焼痂」）に制限され得る。感染は、全皮膚感染に進行し得、そして焼痂の下の生存組織に浸襲し得、そして感染は、皮膚の下部に達し、リンパ循環および血液循環に侵入し、そして敗血症に進展する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、火傷創傷感染に代表的に見出される最も重要な病原体の１つである。感染は、肉芽組織を破壊し、そして重篤な敗血症を生じる。

　蜂窩織炎
　蜂窩織炎は、代表的には表在性の起源から皮膚層の下まで広がる皮膚の急性の感染であり、最も一般に、Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓとともにＳ．ａｕｒｅｕｓにより生じる。蜂窩織炎は、全身感染を導き得る。実際、蜂窩織炎は、相乗的な細菌壊疽の１局面であり得る。この状態は、代表的にはＳ．ａｕｒｅｕｓと微好気性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉとの混合物により生じる。これは壊死を生じ、そして処置は壊死組織の摘出に限られる。この病状はしばしば致死的である。

　瞼の感染
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、他の眼の感染の中でも新生児における麦粒腫および粘着眼の原因である。代表的には、このような感染は眼の表面に限定され、そして時々より重篤な結果を伴って表面を浸透する。

　食中毒
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓのいくつかの株は、胃および小腸の消化プロセスにより破壊されない５つの血清学的に異なる、熱および酸に安定なエンテロトキシン（エンテロトキシンＡ〜Ｅ）の１つ以上を産生する。十分量の毒素の摂取は、代表的には重篤な嘔吐をもたらすが、下痢はもたらさない。この影響は、生存細菌を必要としない。毒素は公知であるが、作用機構は理解されていない。

　関節感染
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、骨の関節に感染し、骨髄炎のような疾患を生ずる。

　骨髄炎
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、造血骨髄炎の最も一般的な原因因子である。この疾患は、大人よりも小児および未成年に生じる傾向があり、そして骨に対する非貫通性損傷に関連する。感染は、代表的に成長骨の長い末端に生じ、それゆえその発生は身体的に未成熟な集団において生じる。最も頻繁には、感染は、長い成長骨の末端において骨端成長板に隣接する出芽キャピラリーループ（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｏｏｐ）の付近に局在する。

　皮膚感染
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、膿瘍およびねぶとのような軽症の皮膚感染の最も一般的な病原体である。このような感染はしばしば、通常の宿主応答機構により消散するが、しかしこれらはまた重篤な内部感染に進展し得る。鼻管の再発感染がＳ．ａｕｒｅｕｓの鼻保菌者を悩ませる。

　手術創傷感染
　手術損傷はしばしば体内に大いに貫通する。従って、このような創傷の感染は、患者に対して重大な危険性を有する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、手術創傷における感染の最も重要な原因因子である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、手術創傷の侵入に非常に巧みである；縫合創傷は、ずっと少ないＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞により感染され得、そして正常な皮膚における感染を生ずるのに必要とされる。手術創傷の侵入は、重篤なＳ．ａｕｒｅｕｓ敗血症を導き得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる血流の侵入は、内部器官、特に心臓弁および骨の播種および感染を導き得、全身性疾患（例えば、心内膜炎および骨髄炎）を生じ得る。

　鱗状皮膚症候群
　Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、「鱗状皮膚症候群」（毒性上皮壊死、Ｒｉｔｔｅｒ病、およびＬｙｅｌｌ病とも呼ばれる）を担う。この疾患は、年長の小児において、典型的には剥離物（鱗状皮膚症候群トキシンとも呼ばれる）を産生するＳ．ａｕｒｅｕｓ株の開花により生じる突発（ｏｕｔｂｒｅａｋｓ）に生じる。細菌は、最初は小傷害のみに感染し得るが、毒素は、細胞間結合を破壊し、上皮層に広がり、そして感染を皮膚の外層に貫通させ、この疾患に特徴的である落屑を生ずる。皮膚の外層の断落は、一般に下部の正常な皮膚を現わすが、このプロセスにおける液体の損失は、適切に処置されない場合、幼児において重篤な損傷を生じ得る。

　毒ショック症候群
　毒ショック症候群は、いわゆる毒ショック症候群トキシンを産生するＳ．ａｕｒｅｕｓ株により生じる。この疾患は、任意の部位でのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染により生じ得るが、あまりにもしばしば、単にタンポンを用いる女性の疾患として排他的に誤って見られる。この疾患は、毒血症および敗血症を包含し、そして致死的であり得る。

　Ｎｏｃｏｓｏｍｉａｌ感染
　１９８４年のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｎｏｃｏｓｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　Ｓｔｕｄｙ（「ＮＮＩＳ」）において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、多くの病院施設（内科、外科、産科、小児科、および新生児を包含する）における手術創傷感染の最も優勢な病原体であった。

　Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の薬剤耐性
　ペニシリンの導入前に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに深刻に感染した患者の予後は、好ましくなかった。１９４０年代初期のペニシリンの導入後、最悪のＳ．ａｕｒｅｕｓ感染でさえ一般に首尾良く処置され得た。しかし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性株の出現は、長くかからなかった。今日病院感染において遭遇するほとんどのＳ．ａｕｒｅｕｓ株は、ペニシリンに応答しない；しかし、幸運にも、これは集団感染で遭遇するＳ．ａｕｒｅｕｓの場合には見られない。

　今日、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性株が、ペニシリンをペニシリノン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）に変換するラクタマーゼを産生し、その結果抗生活性を破壊することは周知である。さらに、ラクタマーゼ遺伝子は、しばしばエピソームで（代表的にはプラスミド上で）伝播させられ、そしてしばしばともに多剤耐性を与えるエピソーム因子上のいくつかの遺伝子の内の１つである。

　１９６０年代に導入されたメチシリンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるペニシリン耐性の問題を十分に克服した。これらの化合物は、抗生活性を担うペニシリンの部分を保存し、そしてペニシリンをラクタマーゼを不活化するための良好な基質とする他の部分を改変または変更する。しかし、この生物に対して有効な多くの他の抗生物質（アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、およびリンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）を含む）に対する耐性に伴って、メチシリン耐性がＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて出現した。実際、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株は一般に多剤耐性である。

　Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける薬剤耐性の多くのタイプの分子遺伝学が解明された（Ｌｙｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５１：　８８−１３４（１９８７）を参照のこと）。一般に、耐性は、ペニシリン耐性に関して上記で留意したようにプラスミドにより媒介される；しかし、明らかにＳ．ａｕｒｅｕｓゲノム自体への耐性因子の組込みが関与するいくつかの安定な形態の薬剤耐性が観察された。

　従って、さらにそれぞれ新しい抗生物質が、耐性株に対して生じ、多剤耐性である株が出現し、そしてますます永続的な形態の耐性が生じ始めている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の多剤耐性は、既に著しい処置の困難性を有する。これは、新しい治療剤が開発されないかぎりますますひどくなるようである。

　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ａｕｒｅｕｓの分子遺伝学
　特に、ヒトの疾患におけるその重要性にもかかわらず、この生物のゲノムについては比較的ほとんど知られていない。

　Ｓ．ａｕｒｅｕｓのほとんどの遺伝的研究が、ＮＣＴＣ８３２５株（ＮＣＴＣ８３２５株は、プロファージｐｓｉ１１、ｐｓｉ１２、およびｐｓｉ１３を含有する）、およびこの株のＵＶキュアリングした誘導体である８３２５−４（ＲＮ４５０とも呼ばれ、プロファージを含まない）を用いて行われてきた。

　これらの研究は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムが、他のｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ同様に、１つの環状の共有結合で閉環した２本鎖ＤＮＡおよびいわゆる可変付属遺伝因子の収集物（例えば、プロファージ、プラスミド、トランスポゾンなど）からなることを明らかにした。

　ゲノムの物理的特徴付けは、全く詳細に行われていない。Ｐａｔｔｅｅらは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＮＣＴＣ８３２５の染色体の低分析および不完全な遺伝地図および物理地図を出版した。（Ｐａｔｔｅｅら，Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｈｏｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＣＴＣ　８３２５，第１１章，１６３−１６９頁，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＳＴＡＰ　ＨＹＬＯＣＯＣＣＩ，Ｒ．Ｐ．Ｎｏｖｉｃｋ編，ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９０））。遺伝的地図は、主に、それぞれ、エリトロマイシン耐性およびゲンタマイシン耐性を与えるＴｎ５５１およびＴｎ４００１の挿入物をマッピングすることにより、ならびにＰｕｌｓｅｄ　Ｆｉｅｌｄ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（「ＰＦＧＥ」）によるＳｍａＩ消化ＤＮＡの分析により作製される。

　この地図は、低分解能であった；発明者らによっても、ゲノムの物理的サイズの評価でさえ困難であった。例えば、最大のＳｍａＩ染色体フラグメントのサイズは、ＰＦＧＥにより正確にサイズ分けするには大きすぎた。そのサイズを評価するために、さらなる制限部位が、ＳｍａＩ認識配列を含有するトランスポゾンを用いて染色体に導入されなければならなかった。

　要するに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのほとんどの物理的特性およびほぼ全ての遺伝子が未知である。同定されたいくつかの遺伝子の中でも、ほとんどは物理的にマッピングされていないか、または詳細に特徴付けられていない。この生物の極わずかの遺伝子が配列決定されている。（例えば、Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙ，Ｊ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２１　Ｓｕｐｐｌ　Ｃ：９−１６（１９８８）、ＧＥＮＢＡＮＫおよび他の核酸データベースの最新版、および本明細書中のいずれかに述べたＳ．ａｕｒｅｕｓのゲノムに関する参考文献を参照のこと）。

　Ｓ．ａｕｒｅｕｓにより媒介または悪化される疾患の病因が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のプログラムされた発現に関与すること、ならびに遺伝子およびそれらの発現パターンの特徴付けが、この生物とその宿主との相互作用に対する本発明者らの理解を劇的に増加することは明らかである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子およびゲノム構造の知識は、疾患の病因の理解を劇的に改善し、そして疾患を予防し、改善し、阻止し、そして逆転する改善されたそして新しい方法を導く。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの特徴付けられた遺伝子およびゲノムフラグメントが、中でもＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の検出、特徴付け、および調節のための試薬を提供する。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのゲノムならびにこの生物のポリヌクレオチドおよび配列特徴付けが必要である。

　本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのゲノムのポリヌクレオチド配列を提供することを目的とする。

　１つの局面において、本発明は、コンピューター読み出し可能な媒体であって、配列番号１〜５，１９１で表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１に表記されたヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を、この媒体上に記録されて有する、媒体を提供する。

　別の局面において、本発明は、コンピューター読み出し可能な媒体であって、表２〜３に表記された配列番号１〜５，１９１のフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体を、この媒体上に記録されて有する、媒体を提供する。

　好ましい実施態様において、本発明は、上記コンピューター読み出し可能な媒体であって、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読出し専用メモリー（ＲＯＭ）、およびＣＤ−ＲＯＭからなる群から選択される、媒体を提供する。

　さらに好ましい実施態様において、本発明は、上記コンピューター読み出し可能な媒体であって、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読出し専用メモリー（ＲＯＭ）、およびＣＤ−ＲＯＭからなる群から選択される、媒体を提供する。

　別の局面において、本発明は、商業的に重要なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントを同定するためのコンピューターに基づくシステムであって、以下の要素：
（ａ）　配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む、データ保存手段；
（ｂ）　（ａ）のデータ保存手段のヌクレオチド配列に対して標的配列を比較して、相同な配列を同定するための、検索手段；
（ｃ）　（ｂ）のこの相同な配列を入手するための、取出し手段、
を包含する、システムを提供する。

　別の局面において、本発明は、商業的に重要なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの核酸フラグメントを同定するための方法であって、配列番号１〜５，１９１に表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、この標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する（ここでこの標的配列は、ランダムには選択されない）工程を包含する、方法を提供する。

　別の局面において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの発現調整フラグメントを同定するための方法であって、配列番号１〜５，１９１に表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、この標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する（ここでこの標的配列は、遺伝子発現を調整することが知られている配列を含む）工程を包含する、方法を提供する。

　別の局面において、本発明は、単離された、タンパク質をコードする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの核酸フラグメントであって、表２〜３に表記された配列番号１〜５，１９１のフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体のヌクレオチド配列からなる、フラグメントを提供する。

　別の局面において、本発明は、表２〜３に表記された配列番号１〜５，１９１のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体を含む、ベクターを提供する。

　別の局面において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの単離されたフラグメントであって、機能可能に連結されたオープンリーディングフレームの発現を調整し、ここでこのフラグメントは、表２〜３に表記されたオープンリーディングフレームのいずれかひとつ、またはその縮重変異体に対して５’側にある、長さが約１０から２００塩基のヌクレオチド配列からなる、フラグメントを提供する。

　好ましい実施態様において、本発明は、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含む、ベクターを提供する。

　好ましい実施態様において、本発明は、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含むように改変された、生物を提供する。

　別の局面において、本発明は、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつを含むように改変された、生物を提供する。

　別の局面において、本発明は、核酸分子の発現を制御するための方法であって、この核酸分子に、配列番号１〜５，１９１ならびに表２〜３に表記されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつ、またはその縮重変異体に対して５’側である、約１０から１００塩基のヌクレオチド配列からなる核酸分子を、共有結合により付着させる工程を包含する、方法を提供する。

　別の局面において、本発明は、配列番号１〜５，１９１ならびに表２〜３のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつの相同物（ｈｏｍｏｌｏｇ）をコードする、単離された核酸分子であって、ここでこの核酸分子は、以下の工程：
（ａ）　配列番号１〜５，１９１ならびに表２〜３のいずれかにより定義される標的配列（そのフラグメントを含む）をプローブとして用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程；
（ｂ）　この標的配列にハイブリダイズする配列を含むこのライブラリーのメンバーを同定する工程；
（ｃ）　（ｂ）において同定されたこのメンバーから核酸分子を単離する工程、
を包含する方法により調製される、核酸分子を提供する。

　別の局面において、本発明は、配列番号１〜５，１９１ならびに表２〜３のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつの相同物をコードする、単離されたＤＮＡ分子であって、ここでこの核酸分子は、以下の工程：
（ａ）　生物から生産されるｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを単離する工程；
（ｂ）　核酸分子を増幅する工程（この核酸分子のヌクレオチド配列は、このＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのこのフラグメントに由来する増幅プライマーに相同であってこの増幅をプライムする）；
（ｃ）　（ｂ）において調製された、増幅されたこの配列を単離する工程、
を包含する方法により調製される、ＤＮＡ分子を提供する。

　別の局面において、本発明は、配列番号１〜５，１９１のならびに表２〜３に表記されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつによって、またはこのフラグメントの縮重変異体によってコードされる、単離されたポリペプチドを提供する。

　別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドのいずれかひとつをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。

　別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドのいずれかひとつに選択的に結合する、抗体を提供する。

　別の局面において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓに由来するポリヌクレオチドの存在についてサンプルを分析するためのキットであって：
　ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドにハイブリダイズする、表２〜３に表記された配列番号１〜５，１９１のフラグメントのいずれかひとつのヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列と９５％同一なヌクレオチド配列を含む、少なくともひとつのポリヌクレオチド；および、適切な容器、
を含む、キットを提供する。

　別の局面において、本発明は、配列番号５，１９１から５，２５５からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。

　好ましい実施態様において、上記単離されたポリペプチドは、配列番号５，１９１から５，２５５からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含み得る。

　別の局面において、本発明は、配列番号５，１９１から５，２５５からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドに由来する少なくともひとつのエピトープを含む、単離された、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチド抗原を提供する。

　別の局面において、本発明は、表４にリストされたエピトープ配列からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓアミノ酸配列によってコードされる少なくともひとつのエピトープを含む、単離されたポリペプチドを提供する。

　好ましい実施態様において、上記ポリペプチドは、固相に固定され得る。

　別の局面において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ感染を検出するための診断キットであって：
（ａ）　上記単離されたポリペプチド抗原；および、
（ｂ）　生物学的液体に含まれる抗体の、この抗原への結合を検出するための手段、
を含む、キットを提供する。

　別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に存在する上記ポリペプチドを含む、ワクチン組成物を提供する。

　別の局面において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ感染に対して個体に予防接種する方法であって、上記ワクチン組成物を個体に投与する工程を包含する、方法を提供する。

　別の局面において、本発明は、宿主細胞中でポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程：
（ａ）　異種の核酸分子（この異種の核酸分子のヌクレオチド配列は、配列番号１〜５，１９１のならびに表２〜３に表記されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのいずれかひとつからなる）を含む宿主を、この異種の核酸分子が発現されてこのタンパク質を生産する条件下でインキュベートする工程；および、
（ｂ）　このタンパク質を単離する工程、
を包含する、方法を提供する。

　本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントの配列決定に基づく。生じた一次ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５，１９１に提供される。

　本発明は、当業者により容易に使用、分析、および解釈され得る形態であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの数千のコンティグのヌクレオチド配列（これらは、以下の表に列挙され、そして本明細書に提示される配列表に示されている）およびそれらの代表的なフラグメントを提供する。１つの実施態様においては、本発明は、配列番号１〜５，１９１に示されるヌクレオチド配列に対応する一次配列情報のコンティグ群として提供される。

　本発明はさらに、配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を提供する。

　配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列が、その使用を容易にするために種々の媒体において提供され得る。本実施態様の１つの適用として、本発明の配列は、コンピューター読み出し媒体に記録される。このような媒体は、磁気保存媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープ）；光保存媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）；電気保存媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ）；およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光保存媒体）を包含するが、これらに限定されない。

　本発明はさらに、データ保存手段において保存された本明細書中に記載の配列情報を含むシステム、特にコンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシステムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するために設計される。

　本発明の別の実施態様は、特定の構造的または機能的な特性を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントに関する。本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのこのようなフラグメントは、ペプチドをコードするフラグメント（以後、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦという）、「作動可能に連結したＯＲＦの発現を調整するフラグメント（以後、発現調整フラグメントまたはＥＭＦという）」、およびサンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの存在を診断するために用いられ得るフラグメント（以後、診断フラグメントまたは「ＤＦ」という）を包含するがこれらに限定されない。

　表１〜３に開示するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメント中のＯＲＦおよびＯＲＦの５’に見出されるＥＭＦはそれぞれ、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で用いられ得る。例えば、配列は、サンプル中の特定の微生物の存在を検出または決定するための診断プローブまたは増幅プライマーとして、宿主におけるまたはポリペプチド（例えば、本発明のＯＲＦによりコードされるポリペプチド、特に薬理学的活性を有するポリペプチド）の産生における遺伝子発現を選択的に制御するために用いられ得る。

　本発明はさらに、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの１つ以上のフラグメントを含有する組換え構築物を包含する。本発明の組換え構築物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのフラグメントが挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を包含する。

　本発明はさらに、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの任意の単離フラグメントを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、高等真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）、下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）または原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。

　本発明はさらに、本発明のＯＲＦによりコードされる単離ポリペプチドおよびタンパク質に関する。当業者に周知の種々の方法が、本発明の任意のポリペプチドおよびタンパク質を得るために日常的に利用され得る。例えば、比較的短い、単純なアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドおよびタンパク質が、市販の自動ペプチド合成機を用いて容易に合成され得る。本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、天然にタンパク質を産生する細菌細胞から精製され得る。さらに別の代替法は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質をそれらの発現を改変された細胞から精製することである。

　本発明はさらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓエピトープを含むポリペプチドおよびこのようなポリペプチドを含むワクチン組成物を提供する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ感染に対して個体を予防接種するための方法もまた提供する。

　本発明はさらに、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのホモログおよび本発明のＯＲＦによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法を提供する。特に、本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をプローブまたはプライマーとして、例えば、ＰＣＲクローニングおよびコロニー／プラークハイブリダイゼーションのような技術を用いることにより、当業者はホモログを入手し得る。

　本発明はさらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質に選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を包含する。

　本発明はさらに、上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。

　本発明はさらに、本発明のＯＲＦの１つまたはそのホモログを発現する細胞由来の試験サンプルを同定する方法を提供する。このような方法は、サンプルがＯＲＦまたはそれらから産生される産物を含有するか否かを当業者が決定し得る条件下で、試験サンプルを、本発明の１つ以上の抗体とともに、あるいは本発明の１つ以上のＤＦまたは抗原とともにインキュベートする工程を包含する。

　本発明の別の実施態様では、上記アッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。

　特に、本発明は、密に詰めた状態で以下を含む１つ以上の容器を収納するための区画されたキットを提供する：（ａ）本発明の抗体、抗原、またはＤＦの１つの内の１つを含む第１の容器；および（ｂ）以下の内の１つ以上を含む１つ以上の他の容器：洗浄試薬、結合している抗体、抗原、またはハイブリダイズしたＤＦの存在を検出し得る試薬。

　本発明の単離されたタンパク質を用いて、本発明はさらに、本発明のＯＲＦの１つによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る薬剤を入手または同定する方法を提供する。特に、このような薬剤は、さらに以下に記載のように、抗体、ペプチド、炭水化物、薬学的薬剤などを包含し得る。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）薬剤を、本発明のＯＲＦの１つによりコードされる単離されたタンパク質と接触させる工程；および（ｂ）この薬剤が該タンパク質に結合するか否かを決定する工程。

　本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのゲノム配列は、この微生物について研究する全ての研究室および種々の商業的目的に対して非常に価値がある。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの多くのフラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋまたはタンパク質データベースに対する同様の調査により直ちに同定され、そしてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ研究者に直ちに価値があり、そしてタンパク質の産生または遺伝子発現の制御について直ちに商業的価値がある。

　細菌の多数のゲノム配列および他のゲノムを解明するための方法論および技術は、染色体組織を分析および理解する可能性を大いに増大する。特に、配列決定されたコンティグおよびゲノムが、染色体の構造および機能を分析するための手段を開発するためのモデルを提供する。これには、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントの中の遺伝子、制御因子の構造、位置、および間隔を同定するための能力、潜在的に工業的な応用性を有する遺伝子の同定、および比較ゲノム系統発生学および比較分子系統発生学を行うための能力が包含される。

　本発明により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのゲノムのポリヌクレオチド配列が提供される。

　本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントの配列決定およびその配列の分析に基づく。フラグメントを配列決定することにより作成した一次ヌクレオチド配列が、配列番号１〜５，１９１に提供される（本明細書で使用される「一次配列」とは、ＩＵＰＡＣ命名システムにより表されるヌクレオチド配列をいう）。

　前記のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列に加えて、本発明は、配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列、または当業者に容易に使用され、分析され、そして解釈され得る形態にあるそれらの代表的なフラグメントを提供する。

　本明細書で使用される「配列番号１〜５，１９１に示されるヌクレオチド配列の代表的なフラグメント」とは、公に入手可能なデータベース内に現在表示されていない配列番号１〜５，１９１の任意の部分をいう。本発明の好ましい代表的なフラグメントは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、発現調整フラグメント（ＥＭＦ）およびサンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの存在を診断するために使用され得るフラグメント（ＤＦ）である。好ましい代表的なフラグメントの制限されない同定例は表１〜３に提供される。

　以下で詳細に議論するように、ルーチンのクローニング、合成、配列決定およびアッセイ方法と共に、配列番号１〜５，１９１および表１〜３に提供される情報により、当業者は、広範な種々のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する、目的の全ての「代表的なフラグメント」をクローン化しそして配列決定し得る。

　本明細書に開示される配列番号１〜５，１９１の配列は、非常に正確であるが、配列決定技術は完全ではなく、そして比較的希な場合には、本発明のフラグメントまたは配列のさらなる調査は、配列番号１〜５，１９１に開示されるヌクレオチド配列に存在するヌクレオチド配列の誤りを示し得る。しかし、一旦本発明が利用可能とされると（すなわち、一旦配列番号１〜５，１９１および表１〜３の情報が利用可能となると）、配列番号１〜５，１９１中の希な配列決定の誤りを解決することは、当該技術分野の範囲内である。本開示は、任意の記載される整列群またはそれらの部分が、ルーチンの技術の簡単な適用により容易に得られ得るに十分な配列情報を入手可能にする。このようなポリヌクレオチドのさらなる配列決定は、当該技術分野において至る所で使用されている手動および自動化配列決定方法を用いて同様の手法で実施し得る。ヌクレオチド配列編集ソフトウェアは、公に入手可能である。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ）のＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒは、ヌクレオチド配列の視覚検査の間に補助として使用され得る。このようなルーチンの技術を使用することにより、潜在的な誤りは、容易に同定され得、次いで正確な配列が、ルーチンの性質のさらなる配列決定の努力を、潜在的な誤りを含む領域を標的にすることにより、確認され得る。

　たとえ配列番号１〜５，１９１中の非常に希な配列決定の誤りの全てが訂正されたとしても、得られるヌクレオチド配列は、依然として配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であり得、ほぼ全てが配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一であり得、そして大多数が配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一であり得る。

　本明細書の他で議論するように、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡをクローニングおよび配列決定するための、周知のおよび標準的手法のルーチンの適用により容易に得られ得る。ライブラリーを得るためおよび配列決定のための詳細な方法は、例えば、以下に提供される。本発明のポリヌクレオチドをクローニングするためおよび得るためのＳ　ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを調製するために使用され得る広範な種類のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のような承認された寄託研究所から公に入手可能である。

　異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ株由来のゲノムのヌクレオチド配列は、多少異なる。しかし、全てのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ株のゲノムのヌクレオチド配列は、対応する部分において、配列番号１〜５，１９１に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である。ほぼ全てが少なくとも９９％同一であり、そして大多数が９９．９％同一である。

　従って、本発明は、さらに、配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、好ましくは９９％そして最も好ましくは９９．９％同一であるヌクレオチド配列を、当業者に容易に使用され、分析されそして解釈され得る形態で提供する。

　ヌクレオチド配列が、配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％同一であるか否かを決定する方法は、ルーチンであり、そして当業者に容易に利用可能である。例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）に記載の周知のファスタアルゴリズム（ｆａｓｔａ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）が、ヌクレオチド配列の同一性のパーセントを得るために使用され得る。ＢＬＡＳＴＮプログラムもまた、互いに比較したポリヌクレオチドの同一性スコアを得るために使用され得る。

　コンピューター関連の実施態様
　配列番号１〜５，１９１に提供されるヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％および最も好ましくは少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列は、それらの使用を容易にするために種々の媒体中で「提供」され得る。本明細書で使用される「提供」とは、単離された核酸分子以外の製品について言及し、これは本発明のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１〜５，１９１に提供されるヌクレオチド配列）、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％および最も好ましくは少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。このような製品は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの大部分およびその一部分（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムまたはそのサブセットの試験には直接適用できない（それか天然に、または精製された形態で存在するため）手段を用いて、当業者がこの製品を試験することを可能にする形態で提供する。

　本発明の実施態様の１つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読み取り可能媒体に記録され得る。本明細書で使用される「コンピューター読み取り可能媒体」とは、コンピューターにより直接読み取られ得、そしてアクセスされ得る任意の媒体をいう。このような媒体には、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）；電気記憶媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ）；およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、現在公知のコンピューター読み取り可能媒体が、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を含む製品を作り出すために、どのように使用され得るかを、容易に理解し得る。同様に、開発され得るさらなるコンピューター読み取り可能媒体がまた、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録している類似の製品を作り出すためにどのように使用され得るかは、当業者に明らかである。

　本明細書で使用される「記録された」とは、コンピューター読み取り可能媒体に情報を記憶するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列の情報を含む製品を生成するために、コンピューター読み取り可能媒体に情報を記録する、現在公知の任意の方法を容易に採用し得る。

　種々のデータ記憶構造体が、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を作り出すために、当業者に利用可能である。データ記憶構造体の選択は、一般的には記憶した情報にアクセスするために選択される方法に基づく。さらに、種々のデータプロセッサープログラムおよびフォーマットが、本発明のヌクレオチド配列の情報をコンピューター読み取り可能媒体に記憶するために使用され得る。配列の情報は、市販の入手可能なソフトウェア（例えば、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏＳｏｆｔ　Ｗｏｒｄ）でフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイルに表され得るかまたは、データベースアプリケーション（例えば、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなど）に記憶された、ＡＳＣＩＩファイルの形態で表され得る。当業者は、その上に本発明のヌクレオチド配列の情報を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサー構造フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適応させ得る。

　コンピューターソフトウエアは、公的に入手可能であり、これにより、当業者がコンピューター読み取り可能媒体に提供された配列情報にアクセスすることが可能となる。従って、コンピューター読み取り可能形態に、配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１の配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％そして最も好ましくは少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を提供することにより、本発明は、当業者が広範な目的のために提供された配列情報にルーチンの作業によりアクセスすることを可能にする。

　以下の実施例は、Ｓｙｂａｓｅシステム上でＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７（１９９３））検索アルゴリズムを行うソフトウェアが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来および他の生物由来の両方のＯＲＦまたはタンパク質に対する相同性を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノム内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するためにどのように使用されたかを示す。本明細書に記載されるＯＲＦには、商業的に重要なタンパク質（例えば、発酵反応に使用される酵素）の生産および商業的に有用な代謝産物の生産に有用なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの、タンパク質をコードするフラグメントがある。

　本発明は、さらにシステム、特に本明細書に記載される配列情報を含むコンピューターベースのシステムを提供する。このようなシステムは、とりわけＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するために設計される。

　本明細書で使用される「コンピューターベースのシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列の情報を分析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウエア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を備える。当業者は、現在利用可能なコンピューターベースのシステムのいずれもが、本発明における使用に適切であることを、容易に理解し得る。

　上記のように、本発明のコンピューターベースのシステムは、その中に記憶された本発明のヌクレオチド配列を有するデータ記憶手段および必要なハードウエア手段ならびに検索手段を支持しかつ行うためのソフトウェア手段を備える。

　本明細書で使用される「データ記憶手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を記憶し得るメモリー、またはその上に本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製品にアクセスし得るメモリアクセス手段をいう。

　本明細書で使用される「検索手段」とは、標的配列または標的構造モチーフを、データ記憶手段内に記憶された配列情報と比較するために、コンピューターベースのシステムで実行される１つまたはそれ以上のプログラムをいう。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフにマッチする本発明のゲノム配列のフラグメントまたは領域を同定するために使用される。種々の既知のアルゴリズムが、公に開示され、そして検索手段を実行するための種々の市販のソフトウェアが、本発明のコンピューターベースのシステムに使用されおよび使用され得る。このようなソフトウェアの例には、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、相同性検索を実行するための利用可能なアルゴリズムまたは実行ソフトウエアパッケージのいずれもが、本発明のコンピューターベースのシステムにおける使用に適応され得ることを容易に認識し得る。

　本明細書で使用される「標的配列」とは、６個またはそれ以上のヌクレオチドあるいは２個またはそれ以上のアミノ酸の任意のＤＮＡまたはアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的配列が長くなれば、標的配列がデータベース中にランダムな事例として存在する可能性が少なくなることを容易に認識し得る。標的配列の最も好ましい配列長さは、約１０個〜１００個のアミノ酸、または約３０個〜３００個のヌクレオチド残基である。しかし、商業的に重要なフラグメント（例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセッシングに関連する配列フラグメント）の検索が、より短い長さであり得ることが十分に認識される。

　本明細書で使用される「標的構造モチーフ」、または「標的モチーフ」とは、任意の合理的に選択される配列または配列の組み合わせをいい、ここでこの配列は、標的モチーフの折りたたみに際し形成される３次元構造に基づいて選択される。当該分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは、酵素活性部位およびシグナル配列を包含するが、これらに限定されない。核酸標的モチーフは、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導性発現因子（タンパク質結合配列）を包含するが、これらに限定されない。

　入力手段および出力手段のための種々の構造フォーマットが、本発明のコンピューターベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために使用され得る。出力手段のための好ましいフォーマットは、標的配列または標的モチーフに対する多様な相同性の程度をプロセッシングしてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノム配列のフラグメントをランク付ける。このような提示は、当業者に種々の量の標的配列または標的モチーフを含む配列のランク付けを提供し、そして同定したフラグメントに含まれる相同性の程度を同定する。

　種々の比較手段が、標的配列または標的モチーフをデータ記憶手段と比較して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの配列フラグメントを同定するために使用され得る。本実施例において、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＺＥアルゴリズムを実行するソフトウェアの実行がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノム内のオープンリーディングフレームを同定するために使用された。当業者は、公に入手可能な相同性検索プログラムのいずれもが、本発明のコンピューターベースのシステムのための検索手段として使用され得ることを容易に認識し得る。当業者に公知であり得る適切なシステムもまた、当然、この観点から使用され得る。

　図１は、本発明のこの局面の実施態様の例示である、コンピューターシステムのブロック図を提供する。コンピューターシステム１０２は、バス１０４に連結したプロセッサー１０６を備える。メインメモリ１０８（好ましくはランダムアクセスメモリー、ＲＡＭとして実行される）および種々の第２の記憶装置１１０（例えば、ハードドライブ１１２および読み書き可能な媒体記憶装置１１４）もまた、バス１０４に連結される。読み書き可能な媒体記憶装置１１４は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、磁気テープドライブなどを表し得る。その中に記録された制御ロジックおよび／またはデータを含む読み書き可能な記憶媒体１１６（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなど）は、読み書き可能な媒体記憶装置１１４に挿入され得る。コンピューターシステム１０２は、一旦それが読み書き可能な媒体記憶装置１１４に挿入されると、読み書き可能媒体記憶装置１１４から制御ロジックおよび／またはデータを読み取るための適切なソフトウェアを備える。

　本発明のヌクレオチド配列は、周知の方法で、メインメモリ１０８、任意の第２の記憶装置１１０、および／または読み書き可能な記憶媒体１１６に記憶され得る。実行中に、ゲノム配列にアクセスおよびゲノム配列をプロセッシングするためのソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツールなど）が、オペレーティングシステム、ハードウエアシステムおよびソフトウエアプログラム（単数または複数）の要求および操作パラメーターに従って、メインメモリ１０８中に存在する。

　生化学的実施態様
　本発明の他の実施態様は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの単離フラグメントに関する。本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントは、ペプチドをコードするフラグメント（以下、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））、作動可能に連結されたＯＲＦの発現を調整するフラグメント（以下、発現調整フラグメント（ＥＭＦ））、およびサンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの存在を診断するために用いられ得るフラグメント（以下、診断用フラグメント（ＤＦ））を包含するが、これらに限定されない。

　本明細書中で用いられる「単離核酸分子」または「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの単離フラグメント」は、組成物に通常含まれている化合物の数をその組成物から減じる精製手段に供した、特定のヌクレオチド配列を保有する核酸分子をいう。特に、この用語は、配列番号１〜５，１９１に記載の配列を有する核酸分子、上述のそれらの代表的なフラグメント、および上述のそれらと少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、特に好ましくは少なくとも９９．９％配列上同一であるポリヌクレオチドをいう。

　種々の精製手段が、本発明の単離フラグメントを生成するために用いられ得る。これらは、電荷、溶解度、または大きさに基づいて溶液の構成要素を分離する方法を包含するが、これらに限定されない。

　１つの実施態様において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡは、機械的に剪断されて、長さ１５〜２０ｋｂのフラグメントを生成し得る。次いで、これらのフラグメントを用いて、以下の実施例に記載のようにそれらをλクローンに挿入することにより、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓライブラリーを生成する。次いで、例えば、ＯＲＦ（例えば、表１〜３に列挙されるＯＲＦ）に隣接するプライマーが、配列番号１〜５，１９１に示されるヌクレオチド配列情報を用いて生成され得る。次いで、周知の通常のＰＣＲクローニング技術を用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡのλＤＮＡライブラリーからＯＲＦを単離し得る。従って、配列番号１〜５，１９１の入手可能性、表１〜３中の情報、および上述の方法を用いる配列番号１〜５，１９１の配列の解析により容易に得られ得る情報が考えられると、当業者は、本開示により、本発明のＯＲＦ含有フラグメントまたは他の核酸フラグメントを単離することが可能になる。

　本発明の単離核酸分子は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖ＲＮＡを包含するが、これらに限定されない。

　本明細書中で用いられる「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、終止コドンを含まないアミノ酸の一連のトリプレットのコドンを意味し、タンパク質に翻訳可能な配列である。

　表１〜３は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムコンティグにおけるＯＲＦを列挙する。これらは、生物特異的二次Ｍａｒｋｏｖ確率遷移行列を用いるＧｅｎｅＭａｒｋソフトウェアにより、推定コード領域として同定された。他の基準は、周知の解析方法（例えば、本明細書中に記載される方法）に従って、より包括的な、より限定的な、またはより選択的なリストを作成するために用いられ得ることが理解される。

　表１は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓコンティグにおけるＯＲＦを記載し、このＯＲＦは、長さが少なくとも８０アミノ酸であり、そして１９９６年１１月にＧｅｎｂａｎｋを通じて入手可能なＳ．ａｕｒｅｕｓヌクレオチド配列に９５％またはそれ以上同一（ＢＬＡＳＴ分析による）である少なくとも５０塩基の連続領域に及ぶ。

　表２は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓコンティグにおけるＯＲＦを記載し、このＯＲＦは、表１に示されておらず、そしてＢＬＡＳＴＰ確率スコアが０．０１またはそれ以下で、１９９６年９月にＧｅｎｂａｎｋを通じて入手可能なポリペプチド配列と適合する。

　表３は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓコンティグにおけるＯＲＦを記載し、このＯＲＦは、ＢＬＡＳＴＰ分析により、１９９６年９月にＧｅｎｂａｎｋを通じて入手可能なポリペプチド配列と有意に適合しない。

　各表において、第１欄および第２欄はそれぞれ、コンティグ番号およびコンティグ内のＯＲＦ番号によりＯＲＦを同定している。第３欄は、リーディングフレームを示し、ここで、コンティグの最初の５’ヌクレオチドを＋１フレームの開始点とする。第４欄は、ＯＲＦの最初のヌクレオチドを示し、これは、コンティグ鎖の５’末端から数える。そして第５欄は、ヌクレオチドにおける各ＯＲＦの長さを示す。

　表１〜２において、第６欄は、Ｇｅｎｂａｎｋを通じて入手可能な最も密接に適合する配列についての参照を列挙する。これらの参照番号は、命名（ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒｓ）に精通している当業者により通常用いられる、データベース登録番号である。命名法の記載は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能である。表１〜２の第７欄は、適合配列の遺伝子名称を示す。第８欄は、ＯＲＦと相同遺伝子との比較からのＢＬＡＳＴ同一度スコアを示す。そして第９欄は、ＢＬＡＳＴ同定分析により同定された最高評価セグメント対のヌクレオチドの長さを示す。

　表３において、最後の欄（第６欄）は、アミノ酸残基における各ＯＲＦの長さを示す。

　２つのポリペプチド配列の同一度パーセントおよび類似度パーセントの概念は、当該分野において周知である。例えば、３つのアミノ酸位置（例えば１位、３位、および５位）が異なる１０アミノ酸長の２つのポリペプチドは、７０％の同一度パーセントを有するとされる。しかし、同じ２つのポリペプチドが、例えば５位のアミノ酸部分が同一ではなくても類似であれば（すなわち、同様の生化学的特徴を有していれば）、８０％の類似度パーセントを有すると考えられる。ヌクレオチド配列類似性またはアミノ酸配列類似性の分析に関する多くのプログラム（例えば、ｆａｓｔａおよびＢＬＡＳＴ）は、特に適合領域の同一度パーセントを出力パラメーターとして列挙する。従って、例えば、本明細書中の表１〜２は、各ＯＲＦおよびその列挙された関連物の最高評価セグメント対の同一度パーセントを列挙する。相同性検索のために用いられるアルゴリズムおよび基準に関するさらなる詳細を以下に示し、そしてこれは、以下に示す引用により強調される関連文献に記載される。

　他の基準は、表中に記載されるタイプのより包括的かつより独占的な表を作成するために用いられ得ることが理解される。当業者が理解するように、狭い範囲および広い範囲の両方の検索が有用である。従って、当業者は、表１〜３に列挙される以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのコンティグにおけるＯＲＦを容易に同定し得る。このＯＲＦとしては、例えば、本発明のコンピューターベースシステムを用いて確認可能なＯＲＦに加え、重複するかまたは同定ＯＲＦの対向鎖によりコードされるＯＲＦが挙げられる。

　本明細書中で用いられる「発現調整フラグメント」（ＥＭＦ）は、作動可能に連結されたＯＲＦまたはＥＭＦの発現を調整する一連のヌクレオチド分子を意味する。

　本明細書中で用いられるように、配列は、ＥＭＦの存在により配列の発現が変化するとき、「作動可能に連結された配列の発現を調整する」とされる。ＥＭＦは、プロモーター、およびプロモーター調整配列（誘導性エレメント）を包含するが、これらに限定されない。ＥＭＦの１つのクラスは、特定の調節要因または生理学的事象に応答して、作動可能に連結されたＯＲＦの発現を誘導するフラグメントである。

　ＥＭＦ配列は、表１〜３に示されるＯＲＦへの近接度により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのコンティグ内で同定され得る。表１〜３の任意のＯＲＦに由来する遺伝子間セグメントまたはその遺伝子間セグメントのフラグメント（長さ約１０〜２００ヌクレオチド）は、天然に連結されたＯＲＦ配列で見出されるのと同じ様式で、作動可能に連結されたＯＲＦの発現を調整する。本明細書中で用いられる「遺伝子間セグメント」は、本明細書中に記載される２つのＯＲＦ間にあるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントをいう。ＥＭＦはまた、既知のＥＭＦを本発明のコンピューターベースシステムにおいて標的配列または標的モチーフとして用いて、同定され得る。さらに、これら２つの方法が組み合わされ得、一緒に用いられ得る。

　ＥＭＦの存在および活性は、ＥＭＦ捕捉ベクターを用いて確認され得る。ＥＭＦ捕捉ベクターは、マーカー配列に連結されたクローニング部位を含有する。マーカー配列は、同定可能な表現型をコードする。この同定可能な表現型としては、例えば、抗生物質耐性または補足栄養要求性因子が挙げられる。この同定可能な表現型は、ＥＭＦ捕捉ベクターが適切な条件下で適切な宿主内に配置されるとき、同定またはアッセイされ得る。上記のように、ＥＭＦは、作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。種々のマーカー配列のより詳細な記載を以下に示す。

　ＥＭＦであると思われる配列は、ＥＭＦ捕捉ベクター中のマーカー配列の上流にある１つまたはそれ以上の制限部位の３つのリーディングフレームの全てにおいてクローニングされる。次いで、このベクターは、公知の手順を用いて適切な宿主に形質転換され、そして形質転換宿主の表現型が、適切な条件下で試験される。上記のように、ＥＭＦは、作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。

　本明細書中に用いられる「診断用フラグメント」（ＤＦ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ配列に選択的にハイブリダイズする一連のヌクレオチド分子を意味する。ＤＦは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのコンティグ内の独特の配列を同定することにより、容易に同定され得る。この同定は、例えば、周知のコンピューター解析ソフトウェアを用いること、および増幅またはハイブリダイゼーション選択性を決定する適切な診断フォーマットにおいて、ＤＦ配列からなるプローブまたは増幅プライマーを生成し、試験することにより行われる。

　本発明の範囲内にある配列は、本明細書中に記載の特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子変異体および種変異体もまた包含する。対立遺伝子変異体および種変異体は、配列番号１〜５，１９１に示される配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号１〜５，１９１と少なくとも９９％、そして好ましくは９９．９％同一であるヌクレオチド配列と、同じ種の別の単離体由来の配列とを比較することにより、通常決定され得る。

　さらに、コドン可変性を調節するために、本発明は、本明細書中に開示の特定のＯＲＦと同様に、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。言い換えれば、ＯＲＦのコード領域では、１つのコドンの同じアミノ酸をコードする別のコドンへの置換が、明確に意図される。

　本明細書中に開示される任意の特定の配列は、特定のフラグメント（例えば、ＯＲＦ）の両方向（すなわち、配列の両鎖）での再配列決定により、読み誤りについて容易にスクリーニングされ得る。あるいは、読み誤りスクリーニングは、問題となるフラグメントの一部または全てをプローブまたはプライマーとして用いることにより単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ起源の対応ポリヌクレオチドを配列決定することにより、行われ得る。

　表１〜３に開示されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのＯＲＦ、およびＯＲＦの５’側に見出されるＥＭＦのそれぞれは、多数の用途においてポリヌクレオチド試薬として用いられ得る。例えば、配列は、サンプルにおける特定の微生物（特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の存在を検出するために、診断用プローブまたは診断用増幅プライマーとして用いられ得る。この点において特に好ましいのは、表３のＯＲＦのような、他の生物に由来の既に特徴づけられた配列とは適合せず、従ってＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓに対して最も高度に選択的であると思われるＯＲＦである。また特に好ましいのは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの株間を識別するために用いられ得るＯＲＦ、特に医学的に重要な株（例えば、薬剤耐性株）を識別するＯＲＦである。

　さらに、本発明のフラグメントは、広範に記載されているが、三重ヘリックス形成、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して、遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの両方法は、ポリヌクレオチド配列のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。三重ヘリックス形成は、ＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を最適に生じ、一方アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。本発明の配列からの情報は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチドを設計するために用いられ得る。これらの方法における使用に適したポリヌクレオチドは、通常２０〜４０塩基の長さであり、そして三重ヘリックス形成については転写に関与する遺伝子の領域、またはアンチセンス阻害についてはｍＲＮＡ自身に相補的であるように設計される。両技術とも、モデル系において有効であることが示されており、そして必要技術は周知であり、通例の手順を包含する。三重ヘリックス技術は、一般に、例えば、Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）に記載されている。アンチセンス技術は、一般に、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）およびＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　ＡＳ　ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ　ＯＦ　ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に記載されている。

　本発明は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムフラグメントおよびコンティグの１つ以上のフラグメントを含む組換え構築物をさらに提供する。本発明の特定の好ましい組換え構築物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントが順方向または逆方向で挿入されたベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含む。本発明のＯＲＦの１つを含むベクターの場合では、ベクターは、ＯＲＦに作動可能に連結された調節配列（例えばプロモーターを包含する）をさらに含み得る。本発明のＥＭＦを含むベクターについて、ベクターは、ＥＭＦに作動可能に連結されたマーカー配列または異種ＯＲＦをさらに含み得る。

　多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、そして本発明の組換え構築物の生成のために市販により入手可能である。以下のベクターは、一例として示される。有用な細菌ベクターは、以下を包含する：ファージスクリプト、ψＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫおよびＫＳ（＋および−）、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能）。有用な真核生物ベクターは、以下を包含する：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能）。

　プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に著名な細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、およびｔｒｃを包含する。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターは、十分に当業者の水準内にある。

　本発明は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムフラグメントおよびコンティグの単離フラグメントのいずれかを含有する宿主細胞をさらに提供し、ここでこのフラグメントは、公知の方法を用いて宿主細胞に導入されている。宿主細胞はまた、高等真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）、または原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。

　本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＯＲＦを含む組換え構築物）は、当該分野で標準的な種々の十分に確立された技術により、細胞中に導入され得る。この技術としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン仲介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられる。これらの技術は、例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら，ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）に記載されている。

　本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムフラグメントおよびコンティグのフラグメントの１つを含有する宿主細胞は、単離フラグメントによりコードされる遺伝子産物を生産するために従来の様式で用いられ得る（ＯＲＦの場合）か、またはＥＭＦの制御下で異種タンパク質を生産するために用いられ得る。

　本発明は、本発明の核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重変異体によりコードされる単離ポリペプチドをさらに提供する。「縮重変異体」とは、ヌクレオチド配列が本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とは異なるが、遺伝コードの縮重によって同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドフラグメントを意図する。

　本発明の好ましい核酸フラグメントは、表２〜３に図示される、タンパク質をコードするＯＲＦである。

　当該分野で公知の種々の方法が、本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを得るために利用され得る。最も簡単には、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成機を用いて合成され得る。これは、小ペプチドおよびより大きなポリペプチドのフラグメントを生成する際に特に有用である。合成により容易に得られ得るこのような短いフラグメントは、例えば、以下にさらに記載するように、天然ポリペプチドに対する抗体を生成する際に有用である。

　別の方法では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質を天然に生産する細菌細胞から精製される。当業者は、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための周知の方法を容易に用い得、細菌株により天然に生産されるか、または他の方法により生成される本発明のポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製し得る。この点において用いられ得る単離および精製のための方法は、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含するが、これらに限定されない。

　本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように改変された細胞から精製され得る。本明細書中で用いられるように、細胞は、その細胞が、遺伝子操作を通じて、通常生産しないまたは低レベルでしか生産しないポリペプチドまたはタンパク質を生産するようになされるとき、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように改変されたとされる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の１つを生産する細胞を生成するために、真核生物細胞または原核生物細胞に組換え配列または合成配列のいずれかを導入し発現させるための手順を容易に採用し得る。

　宿主／ベクター系は、本発明のＯＲＦの１またはそれ以上を発現させるために用いられ得る。これらは、真核生物宿主（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞）、ならびに原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を包含するが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のポリペプチドまたはタンパク質を通常発現しない細胞またはポリペプチドまたはタンパク質を天然には低レベルでしか発現しない細胞である。

　本明細書中で用いられる「組換え」は、組換え（例えば、微生物性または哺乳動物性）発現系由来のポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」は、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系で作製された組換えポリペプチドまたはタンパク質をいう。産物として、「組換え微生物性」は、天然の内因性物質を含まず、そして関連の天然グリコシル化を伴わないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を含まない。酵母において発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞において発現されたポリペプチドまたはタンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有する。

　「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーをいう。一般に、本発明により提供されるポリペプチドおよびタンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、微生物性オペロンまたはウイルス性オペロン由来の調節エレメントを含む組換え転写単位において発現され得る合成遺伝子を提供する。

　「組換え発現ベヒクルまたはベクター」は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。発現ベヒクルは、以下の（１）から（３）のアセンブリを含む転写単位を含み得る：（１）宿主における遺伝子発現に必要な遺伝子調節エレメント、これは、所望のポリペプチドの適切な発現に十分なレベルで転写を開始および維持させるに必要なエレメントを包含する、そして例えば、プロモーター、および必要に応じてエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを包含する；（２）構造配列またはコード配列（これは、ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳される）；および（３）適切なシグナル（所望のコード領域の開始点で翻訳を開始させ、その末端で翻訳を終結させる）。酵母発現系または真核生物発現系において使用するための構造単位は、好ましくは、リーダー配列（宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にする）を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、それは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、最終産物を提供する発現組換えタンパク質から後で切断され得るかまたはされ得ない。

　「組換え発現系」は、組換え転写単位を染色体ＤＮＡに安定に組み込んだ宿主細胞または組換え転写単位を染色体外に有する宿主細胞を意味する。細胞は、原核生物または真核生物であり得る。本明細書中で定義される組換え発現系は、発現されるべきＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントを誘導して、異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現する。

　成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生産するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主に用いる適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されており、この開示の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。

　一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および選択マーカー（宿主細胞の形質転換を可能にし、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＲＰ１遺伝子である）、および高発現遺伝子由来のプロモーター（プロモーター下流構造配列の転写を導く）を含む。このようなプロモーターは、とりわけ解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、αファクター、酸性ホスファターゼ、またはヒートショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは、翻訳タンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を導き得るリーダー配列と、適切な相で組み立てられる。所望により、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現組換え産物の安定化または簡便な精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。

　細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと作動可能な読み取り相にある適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含み、ベクターの維持を確実にし、そして所望であれば、宿主内での増幅を提供する。

　形質転換のための適切な原核細胞宿主は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株、およびＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含する。他のものもまた、選択事項として用いられ得る。

　代表的であるが非限定的な例として、細菌での使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ　３７１０７）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。このような市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせられる。

　適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーターは、誘導性である場合、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により脱抑制または誘導され、そして細胞は、さらなる期間培養されて、誘導された遺伝子産物を発現する。その後、典型的には、細胞を集め（一般に遠心分離による）、破砕（一般に物理的手段または化学的手段による）して発現タンパク質を放出させ、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。

　種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系統（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ　２３：１７５（１９８１）に記載）、および適合性ベクターを発現させ得る他の細胞系統（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系統）を包含する。

　哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびまた任意の必要な、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺伝エレメントを提供するために用いられ得る。

　細菌培養物において生産される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常、細胞ペレットからの最初の抽出、次いで１回またはそれ以上の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、任意の好都合な方法により破砕され得る。この方法としては、例えば、凍結解凍の繰り返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用が挙げられる。必要に応じて、タンパク質再生工程が、成熟タンパク質の立体配座を完成させる際に用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製工程のために用いられ得る。

　本発明のさらなる局面は、免疫診断用抗原および／または免疫防御ワクチンとして有用であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドを包含し、これをまとめて「免疫学的に有用なポリペプチド」という。このような免疫学的に有用なポリペプチドは、当該分野において周知でありかつ本明細書の他の部分に記載される技術に基づいて、本明細書中に開示のＯＲＦから選択され得る。本発明者らは、いくつかの免疫学的に有用なポリペプチドを選択するために、以下の基準を用いた。

　当該分野において公知であるように、アミノ末端Ｉ型シグナル配列は、生成中のタンパク質（ｎａｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を、細胞質膜および外膜を横断して細菌細胞の外部に移動させる。このような外膜ポリペプチドは、免疫学的に有用であると期待される。Ｉｚａｒｄ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３，７６５−７７３；（１９９４）によると、Ｉ型シグナル配列を含有するポリペプチドは、以下の生理学的特質を有する：Ｉ型シグナル配列の長さは、ほぼ１５〜２５個の主に疎水性のアミノ酸残基であり、最遠のアミノ末端が正味の正電荷を有する；シグナル配列の中央領域は、疎水性環境においてαヘリックスコンフォメーションを採るべきである；そして実際の切断部位を取り巻く領域は、理想的には６残基長であり、小さな側鎖アミノ酸が−１位および−３位に存在する。

　当該分野でまた知られるのは、ＩＶ型シグナル配列であり、これは、すでに詳述したＩ型シグナル配列に加えて存在するいくつかの型の機能的シグナル配列の一例である。機能的に関連するが、ＩＶ型シグナル配列は、独特の生化学的特質および物理学的特質を有する（Ｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ｓ．およびＬｏｒｙ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，７３４５−７３５１；１９９２）。これらは、代表的には、正味の塩基性電荷を有する６〜８アミノ酸、続いて、さらなる１６〜３０個の主に疎水性の残基である。ＩＶ型シグナル配列の切断部位は、代表的には、最遠のアミノ末端からの最初の６〜８残基後に存在する。さらに、全てのＩＶ型シグナル配列は、切断部位に対して＋１部位にフェニルアラニン残基を含有する。

　２６の細菌リポタンパク質前駆体の切断部位の研究により、リポタンパク質切断のためのコンセンサスアミノ酸配列の特定がなされた。試験したほぼ４分の３の細菌リポタンパク質前駆体が、切断点に対して−３位〜＋１位に配列Ｌ−（Ａ，Ｓ）−（Ｇ，Ａ）−Ｃを有していた（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．およびＷｕ，Ｈ．Ｃ．Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ　Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２２，４５１−４７１；１９９０）。

　グラム陽性菌の表面上に見出されるほとんどの固着タンパク質は、高度に保存されたカルボキシ末端配列を有することが周知である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｍｕｔａｎｓ，Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどのような生物由来のこのようなタンパク質の５０より多くが、それらの細胞外位置およびカルボキシ末端アミノ酸配列に基づいて同定された（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｍｍｅｎｓａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｄｅｌｉｖｅｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｔｏ　ｅｌｉｃｉｔｅ　ｍｕｃｏｓａｌ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＡＳＭ　Ｎｅｗｓ　６２，４０５−４１０；１９９６）。保存領域は、膜貫通ドメインとして機能すると推定される１５〜２０個の疎水性アミノ酸に結合した最遠のカルボキシ末端の６個の荷電アミノ酸で構成される。試験したほぼ全てのタンパク質において、膜貫通ドメインのすぐ隣に、６アミノ酸配列が保存されている。この領域のアミノ酸配列は、Ｌ−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｇ−Ｘであり、Ｘは任意のアミノ酸である。

　ＢＬＡＳＴによる既知の機能のタンパク質に対するアミノ酸配列類似性により、新規なアミノ酸配列に推定の機能を当てはめることができ、そして細胞壁の外側で機能すると考えられるタンパク質の選択が可能になる。このようなタンパク質は当該分野で周知であり、そして「リポタンパク質」、「周辺腔」、または「抗原」を包含する。

　以下の基準を含む抗原性および免疫原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドを選択するためのアルゴリズムが、本発明者らによって開発された。免疫学的に有用なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドを選択するための本発明者らによるアルゴリズムの使用により、外膜結合タンパク質であると推定されるいくつかのＯＲＦが選択された。これらのタンパク質は、以下の表４において同定され、そして配列表において配列番号５，１９２〜５，２５５として示される。従って、表４に示されるいくつかの抗原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列は、例えば、配列表において各ＯＲＦのアミノ酸配列を突き止めることにより決定され得る。同様に、各ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド配列は、表１〜３のいずれかにおいて対応ポリヌクレオチド配列番号を突き止め、そして配列表において対応ヌクレオチド配列を見出すことにより見出され得る。

　当業者に理解されるように、全体ＯＲＦを表すポリペプチドが、インビボで見出されるタンパク質に最も密接に類似し得るが、完全なＯＲＦをインビトロで発現させることは、技術的に常に実施できるわけではない。高度に疎水性のタンパク質を通常の実験的方法により発現および精製することは、非常に挑戦的であり得る。その結果、配列番号５，１９２〜５，２５５として本明細書中に記載の免疫学的に有用なポリペプチドは、組換えタンパク質の生産を簡便にするようにわずかに改変され得、そしてこれは好ましい実施態様である。一般に、高度に疎水性のドメイン（例えば、アミノ末端シグナル配列で見出されるドメイン）をコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドのインビトロ発現の増強のために除かれる。さらに、カルボキシ末端に存在するいかなる高度に疎水性のアミノ酸配列もまた除かれる。このような短縮型ポリペプチドは、例えば、天然に存在すると予期されるポリペプチドの成熟形態を包含する。

　当業者は、表４において同定されたポリペプチドの可溶性部分を同定し得、そして配列番号５，１９２〜５，２５５として示される短縮型ポリペプチド配列の場合、表１〜３に示され、かつ配列表において見出される対応ＯＲＦの対応ポリヌクレオチド配列を翻訳することにより、各ポリペプチドの完全な推定アミノ酸配列を獲得し得る。

　従って、表４において同定されたＯＲＦによりコードされたポリペプチドの群から選択されるポリペプチドの完全アミノ酸配列を含む免疫学的に有用なポリペプチド、および配列番号５，１９１〜５，２５５として配列表に示されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫学的に有用なポリペプチドは、本発明の実施態様を形成する。さらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部を形成する。

　別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分、特に表４に同定されたエピトープ保有部分（抗原性領域）を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。エピトープ保有部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性のエピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原であるとき抗体応答を惹起するタンパク質部分として定義される。他方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。

　抗原性エピトープを有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部に類似する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に類似したタンパク質と反応する抗血清を惹起し得ることは、当該分野において周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｉｌｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｉｔｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６６６を参照のこと。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、しばしばタンパク質の一次配列で表され、一連の単純な化学的規則により特徴づけられ、そして完全タンパク質の免疫優勢領域（すなわち、免疫原性エピトープ）およびアミノ酸またはカルボキシル末端の両方ともに制限されない。従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を包含する）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ　３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。

　本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５個から約３０個の間のアミノ酸を含有する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的抗体の生成に用いられ得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの非限定的な例は、以下を包含する：以下の表４に示されるペプチドを含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原指数の分析により、表示されたＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質の抗原性エピトープを保有すると決定され、その代表的なサンプルを図３に示す。

　本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来法により生成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３１−５１３５を参照のこと。この「同時多重ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載される。本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野において周知の方法に従って、抗体を誘導するために用いられる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；Ｃｈｏｗ，Ｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。

　本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、タンパク質全体が免疫原であるとき抗体応答を惹起するタンパク質部分）は、当該分野において公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら，前出を参照のこと。さらに、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的とする抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープのトポロジー的等価物（すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的とする特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドのトポログラフィー的等価物であるモノマーの配列を検出および決定する方法を記載する。同様に、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７１号のＰｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍｉｘｔｕｒｅｓは、直鎖状Ｃ１〜Ｃ７アルキル過アルキル化オリゴペプチドおよびこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを、目的とするアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために用いる方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログもまた、これらの方法により通常的に作製され得る。

　表４は、上述されるように、新規なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ外膜タンパク質を突き止めるアルゴリズムにより同定された、免疫学的に有用なポリペプチドを列挙する。同定されたポリペプチドのそれぞれのエピトープまたは「抗原性領域」もまた列挙される。抗原性領域（またはエピトープ）は、２つの番号ｘ−ｙにより描写される。ここでｘは、オープンリーディングフレーム中のエピトープ内に含まれる最初のアミノ酸番号であり、そしてｙは、オープンリーディングフレーム中のエピトープ内に含まれる最後のアミノ酸番号である。例えば、ＯＲＦ　１６８−６の第１エピトープは、表４において記載されるように、配列番号５，１９２のアミノ酸３６から４５で構成される。本発明者らは、表４において同定された抗原性ポリペプチドのそれぞれについてのいくつかのエピトープを同定した。従って、本発明の一部を形成するのは、表４において同定された１つまたはそれ以上の抗原性領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。本発明は、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。

　本発明は、本明細書中に記載されたのと実質的に等価である単離されたポリペプチド、タンパク質、および核酸分子をさらに包含する。本明細書中で用いられる「実質的に等価である」とは、１つまたはそれ以上の置換、欠失、または付加により参照配列とは異なるが、その正味の効果が参照配列と問題の配列との間で不利な機能相違を生じさせない、核酸およびアミノ酸の両方の配列（例えば、変異体配列）をいう。本発明の目的のために、等価な生物学的活性および等価な発現特徴を有する配列は、実質的に等価であるとみなされる。等価物を決定する目的では、成熟配列の短縮は、考慮されるべきではない。

　本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの他の株から、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントのホモログおよび本発明のＯＲＦによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法をさらに提供する。本明細書中で用いられるように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの配列またはタンパク質は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントの１つまたは本発明のＯＲＦの１つによりコードされるタンパク質に対し有意な相同性を有する場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓフラグメントまたはコンティグのフラグメントまたは本発明のＯＲＦの１つによりコードされるタンパク質のホモログとして定義される。特に、本明細書中に開示の配列をプローブまたはプライマーとして用い、そしてＰＣＲクローニングならびにコロニー／プラークハイブリダイゼーションのような技術を用いることにより、当業者はホモログを入手し得る。

　本明細書中で用いられるように、２つの核酸分子またはタンパク質は、この２つが８５％より高い配列（アミノ酸または核酸）相同性を有する領域を含有する場合、「有意な相同性を有する」とされる。この点において好ましいホモログは、９０％より高い相同性を有する配列である。特に好ましいホモログは、９３％以上の相同性を有するホモログである。中でも、特に好ましいホモログは、９５％以上の相同性を有するホモログである。これらの中で非常に特に好ましいのは、９７％以上の相同性を有するホモログであり、そしてこれらの中でさらにより特に好ましいのは、９９％以上の相同性を有するホモログである。これらの中で最も好ましいホモログは、９９．９％以上の相同性を有するホモログである。相同性の尺度の中で、同一であることが、この点において特に好ましいことが理解される。

　配列番号１〜５，１９１において示されるヌクレオチド配列、または配列番号１〜５，１９１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％同一のヌクレオチド配列に由来する領域特異的プライマーまたはプローブは、ＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を開始させるために、ならびにホモログをコードするクローン化ＤＮＡを含むコロニーを同定するために用いられ得る。本発明のこの局面に適切な方法は周知であり、そして多くの刊行物に詳細に記載されている（例えば、Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））。

　配列番号１〜５，１９１、または配列番号１〜５，１９１の配列と上述の同一度を有するヌクレオチド配列に由来するプライマーを用いる場合、当業者は、高いストリンジェンシー条件（例えば、６Ｘ　ＳＳＰＣおよび５０％ホルムアミド中で５０〜６０℃でアニールし、そして０．５Ｘ　ＳＳＰＣ中で５０〜６５℃で洗浄する）を用いることにより、プライマー配列に対して７５％より高い相同性の配列のみが増幅されることを認識する。低いストリンジェンシー条件（例えば、５ＸＳＳＰＣおよび４０〜４５％ホルムアミド中で３５〜３７℃でハイブリダイズし、そして０．５ＸＳＳＰＣ中で４２℃で洗浄する）を用いることにより、プライマー配列に対して４０〜４５％より高い相同性の配列もまた増幅される。

　配列番号１〜５，１９１、または配列番号１〜５，１９１に配列と上述の同一度を有するヌクレオチド配列に由来するＤＮＡプローブを、コロニー／プラークハイブリダイゼーションのために用いる場合、当業者は、高いストリンジェンシー条件（例えば、５ＸＳＳＰＣおよび５０％ホルムアミド中で５０〜６５℃でハイブリダイズし、そして０．５ＸＳＳＰＣ中で５０〜６５℃で洗浄する）を用いることにより、プローブに対して９０％より高い相同性の領域を有する配列が得られ得、低いストリンジェンシー条件（例えば、５ＸＳＳＰＣおよび４０〜４５％ホルムアミド中で３５〜３７℃でハイブリダイズし、そして０．５ＸＳＳＰＣ中で４２℃で洗浄する）を用いることにより、プローブに対して３５〜４５％より高い相同性の配列が得られることを認識する。

　任意の生物は、その生物が、このようなタンパク質を天然に発現し、そしてそれをコードする遺伝子を含有する限り、本発明のホモログの供給源として用いられ得る。ホモログを単離するための最も好ましい生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓに密接に関連している細菌である。

　本発明の組成物の使用例
　表１〜２に提供する各ＯＲＦは、公知の遺伝子またはポリペプチドに対する相同性により機能で同定される。その結果、当業者は、本発明のポリペプチドを、ポリペプチドの推定同定のタイプに一致して、商業目的、治療目的、および工業目的のために使用し得る。このような同定によって、当業者は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＯＲＦを使用して、同定が行われる公知のタイプ配列と同様の様式で、例えば、特定の糖供給源を発酵するか、または特定の代謝産物を産生することが可能になる。本発明のこの局面の例示となる種々の総説が利用可能であり、以下の酵素の工業的利用に対する総説が挙げられる。例えば、ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ　ＡＮＤ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＨＡＮＤＢＯＯＫ、第２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄ．ＮＹ（１９９１）およびＢＩＯＣＡＴＡＬＹＳＩＳ　ＩＮ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｔｒａｍｐｅｒら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）。本発明のこの局面および他の局面を例示する多様な使用例を、以下に考察する。
１．生合成酵素
　中間代謝および高分子代謝、小分子の生合成、細胞プロセスおよび他の機能に関与する触媒反応を媒介するのに関与するオープンリーディングフレームにコードされるタンパク質は、代謝の中間産物の分解に関与する酵素、中心中間代謝に関与する酵素、呼吸（好気呼吸的および嫌気呼吸の両方）に関与する酵素、発酵に関する酵素、ＡＴＰプロトンモーター力変換（ｐｒｏｔｏｎ　ｍｏｔｏｒ　ｆｏｒｃｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）に関与する酵素、広範な調節機能に関与する酵素、アミノ酸合成に関与する酵素、ヌクレオチド合成に関与する酵素、補因子およびビタミン合成に関与する酵素を包含し、工業的生合成のために使用され得る。

　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓに存在する種々の代謝経路は、絶対的な栄養要求性に基づいて、ならびに表１〜３および配列番号１〜５，１９１に同定される種々の酵素を試験することによって同定され得る。

　特に重要なものは、中間代謝産物の分解および非高分子代謝に関与するポリペプチドである。このような酵素としては、アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼが挙げられる。

　タンパク質分解酵素は、別のクラスの商業的に重要な酵素である。タンパク質分解酵素は、亜麻および他の植物繊維を加工することを含む多くの工業プロセスにおいて、果汁の抽出、清澄化、および脱ペクチン化（ｄｅｐｅｃｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）において、植物油の抽出において、ならびに単細胞性の果実を与えるための果実および植物の浸軟において、使用が見出される。食物工業において使用されるタンパク質分解酵素の詳細な総説は、Ｒｏｍｂｏｕｔｓら、Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　２１：７９（１９８６）およびＶｏｒａｇａｎら、ＢＩＯＣＡＴＡＬＹＳＴＳ　ＩＮ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｗｈｉｔａｋｅｒら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　３８９：９３（１９８９）に提供される。

　糖代謝は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの一次代謝の重要な局面である。糖（例えば、特に、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロース）分解に関与する酵素は、工業的発酵において使用され得る。重要な糖転換酵素のいくつかは、商業的な視点から、グルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼを含む。他の代謝酵素は、ケトグロン酸（ＫＧＡ）を生成するグルコースオキシダーゼのように商業的使用を見出している。ＫＧＡは、Ｋｒｕｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６（Ａ）、Ｒｈｉｎｅら編、Ｖｅｒｌａｇ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８４）に記載されるような、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ’ｓ手順を用いるアスコルビン酸の商業的生産における中間産物である。

　グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は、市販されており、そして精製形態および固定化形態でビールの脱酸素化のために使用されている。例えば、Ｈａｒｔｍｅｉｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１：２１（１９７９）を参照のこと。最も重要なＧＯＤの適用は、グルコン酸の工業規模の発酵である。界面活性剤、布地、革、写真、医薬、食物、飼料、およびコンクリート工業において使用されるグルコン酸の市場。例えば、Ｂｉｇｅｌｉｓら、ＧＥＮＥ　ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ　ＡＮＤ　ＦＵＮＧＩの３５７頁〜；Ｂｅｎｅｔｔら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８５）に記載されている。工業的適用に加えて、ＧＯＤは、近年、スターチおよびセルロースの水和物（ｈｙｄｒｏｓｙｌａｔｅｓ）由来のシロップを分析するバイオテクノロジーにおいて、体液中のグルコースの定量測定のための薬剤における適用を見出している。この適用は、例えば、Ｏｗｕｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ．Ａｃｔａ．８７２：８３（１９８６）に記載されている。

　今日、世界で使用されている主要な甘味料は、テンサイおよびサトウキビ由来の糖である。工業的酵素の分野において、グルコースイソメラーゼプロセスは、今日、市場において最も大きな拡張を示す。初めに、可溶性酵素が使用され、その後、固定化酵素が開発された（Ｋｒｕｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｒｅｄ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９９０））。今日、グルコースから生成された高フルクトースシロップの使用は、固定化酵素を用いる断然最大の工業的商業である。これらの酵素の工業的使用の総説は、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｓｔａｒｃｈ　４０：３０７（１９８８）により提供されている。

　プロテイナーゼ（例えば、アルカリセリンプロテイナーゼ）は、界面活性剤添加物として使用され、従って工業分野で使用される最も大量の微生物酵素の規模の容量の１つを示す。それらが工業的に重要であるので、工業的プロセスにおけるこれらの酵素の使用に関する公開情報および未公開情報が非常に多く存在する。（Ｆａｕｌｔｍａｎら、Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔａｎｇ，Ｊ．，編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７７）およびＧｏｄｆｒｅｙｓら、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ（１９８３）およびＨｅｐｎｅｒら、Ｒｅｐｏｒｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂｙ　１９９０，Ｈｅｌ　Ｈｅｐｎｅｒ　＆　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８６））。

　別のクラスの本発明の商業的に使用できるタンパク質は、例えば、Ｍａｃｒａｅら、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｒａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ　３１０：２２７（１９８５）およびＰｏｓｅｒｋｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ　Ｓｏｃｉｅｔｙ）６１：１７５８（１９８４）に記載されている微生物のリパーゼである。リパーゼの主な使用は、脂質および油脂工業における、容易に入手可能なトリグリセリドのリパーゼで触媒される分子内エステル化を用いた中和グリセリドの産生についてである。リパーゼの適用としては、洗浄手順の過程における織物からの脂質の除去を容易にするための界面活性添加物としての使用が挙げられる。

　複雑な有機分子の合成における重要な工程に対する触媒としての酵素の使用、および特に微生物酵素の使用は、非常に速い速度で流行を獲得している。最も重要な１つの分野は、キラルな中間産物の調製である。キラルな中間産物の調製は、広い範囲の合成化学者、特に新規な医薬、農薬、芳香剤、および調味料の調製に従事する合成化学者の関心の的である。（Ｄａｖｉｅｓら、Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｒａｌ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９０）を参照のこと）。酵素により触媒される以下の反応は、有機化学者の関心の的である：カルボン酸エステル、リン酸エステル、アミド、およびニトリルの加水分解、エステル化反応、トランスエステル化反応、アミドの合成、アルカノンおよびオキソアルカネートの還元、アルコールのカルボニル化合物への酸化、スルフィドのスルホキシドへの酸化、およびアルドール反応のような炭素結合形成反応。

　本発明のＯＲＦの１つによりコードされる酵素の使用を、生体内変換および有機合成について考慮する場合、単離された酵素とは対照的に微生物を用いる利点およびそれぞれの不利益を考慮する必要が時々ある。一方では全細胞系を用い、または他方では単離された部分的に精製された酵素を用いる損得は、Ｂｕｄら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８７）、１２７頁により詳細に記載されている。

　アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の生合成および代謝に関与する酵素であり、アミノ酸の触媒的な生産に有用である。酵素系に基づく微生物の使用の利点は、アミノトランスフェラーゼ酵素が、Ｌ−アミノ酸のみの立体選択的合成を触媒し、そして一般に、一様に高い触媒速度を保持することである。アミノ酸生産のためにアミノトランスフェラーゼを使用する記載は、Ｒｏｓｅｌｌｅ−Ｄａｖｉｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：４７９（１９８７）によって提供されている。

　本発明のＯＲＦによってコードされる有用なタンパク質の別のカテゴリーは、核酸合成、核酸修復、および核酸組換えに関与する酵素を包含する。商業的に重要な多様な酵素は、以前にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのメンバーから単離されている。これらには、Ｓａｕ３ＡおよびＳａｕ９６Ｉが挙げられる。
２．抗体の生成
　本明細書中で記載するように、本発明のタンパク質およびそれらの相同物は、現在、他のタンパク質に適用されている当該分野において公知の多様な手順および方法において使用され得る。本発明のタンパク質は、タンパク質に選択的に結合する抗体を生成するために、さらに使用され得る。このような抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、およびヒト化形態のいずれかであり得る。

　本発明は、本発明のタンパク質の１つに選択的に結合する抗体、およびこれらの抗体を産生するハイブリドーマをさらに提供する。ハイブリドーマは、特異的なモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。

　一般的に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに所望の抗体を産生し得るハイブリドーマを調製する技術（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＩＮ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５：１−２１（１９８０）、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）の７７−９６頁）は、当該分野において周知である。

　抗体を産生することが公知の任意の動物（マウス、ウサギなど）を、偽遺伝子ポリペプチドで免疫し得る。免疫のための方法は、当該分野において周知である。このような方法は、ポリペプチドの皮下注入および腹腔内注入を包含する。当業者は、免疫に使用される本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質の量が、免疫される動物、ペプチドの抗原性、および注入の部位に基づいて変化することを理解する。

　免疫原として使用されるタンパク質は、タンパク質の抗原性を増加するためにアジュバント中で修飾および投与され得る。タンパク質の抗原性を増加させる方法は、当該分野において周知であり、そして抗原と異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンまたはガラクトシダーゼ）との結合、または免疫の間のアジュバントの封入によることを包含するが、これらに限定されない。

　モノクローナル抗体については、免疫動物由来の脾臓細胞が取り出され、ミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞）と融合されて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞となる。

　当該分野において周知の多くの方法の任意の１つが、所望の特徴を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するために使用され得る。これらは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いるハイブリドーマのスクリーニング、ウェスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ（Ｌｕｔｚら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））を包含する。

　所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、クローン化され、そして当該分野で公知の手順（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　Ａ．Ｍ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４））を用いてクラスおよびサブクラスが決定される。

　単鎖抗体の産生について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のタンパク質に対する単鎖抗体を産生するために適応される。

　ポリクローナル抗体については、抗体を含有する抗血清は、上記の手順の１つを用いて、免疫した動物から単離され、そして所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングされる。

　本発明は、さらに、検出可能な標識形態で上記抗体を提供する。抗体を、放射性同位体、親和標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはロダミンなど）、常磁性原子などの使用によって直接標識し得る。このような標識を達成するための手順は、当該分野において周知であり、例えば、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。

　本発明の標識抗体を、インビトロ、インビボ、およびインサイチュアッセイに使用し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントが発現される細胞または組織を同定し得る。

　本発明は、さらに、固体支持体上に固定化された上記抗体を提供する。このような固体支持体の例としては、プラスチック（例えば、ポリカーボネート）、複雑な炭水化物（例えば、アガロースおよびセファロース）、アクリル樹脂（例えば、ポリアクリルアミド）、およびラテックスビーズが挙げられる。抗体をこのような固体支持体に結合させる技術は、当該分野において周知である（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．ら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，第１０章（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固体化抗体は、インビトロ、インビボ、およびインサイチュアッセイに、ならびに本発明のタンパク質のイムノアフィニティー精製に使用され得る。
３．診断アッセイおよびキット
　本発明は、さらに試験サンプル中での本発明のＯＲＦの１つ、またはそれらの相同物の発現を、本発明のＤＦ、抗原、または抗体を用いて、同定する方法を提供する。

　詳細には、このような方法は、試験サンプルを、本発明の１つ以上の抗体、または１つ以上のＤＦ、または１つ以上の抗原とインキュベートする工程、およびＤＦ、抗原、または抗体の試験サンプル内の成分への結合をアッセイする工程を包含する。

　ＤＦ、抗原、または抗体と試験サンプルとをインキュベートする条件は、変化する。インキュベーション条件は、アッセイに用いられる形式、用いる検出方法、およびアッセイにおいて使用されるＤＦまたは抗体のタイプまたは性質に依存する。当業者には、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、または免疫学的アッセイ形式の任意の１つが、本発明のＤｆ、抗原、または抗体を用いることに容易に適応され得ることを認識する。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ　第１巻（１９８２）、第２巻（１９８３）、第３巻（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２２９１号、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見出され得、これらの全ては本明細書中に参考として援用されている。

　本発明の試験サンプルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物、または細胞の膜抽出物、または生体液（例えば、唾液、血液、血清、血漿、または尿）を含む。上記の方法において使用される試験サンプルは、アッセイ形式、検出方法の性質、およびアッセイされるべきサンプルとして使用される組織、細胞、または抽出物に基づいて変化する。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当該分野において周知であり、そして利用する系と適合するサンプルを得るために容易に適応され得る。

　本発明の別の実施態様において、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。

　具体的には、本発明は、密封容器中に、（ａ）本発明のＤｆ、抗原、または抗体の１つを含有する第１の容器；および（ｂ）洗浄試薬、結合Ｄｆ、結合抗原、または結合抗体の存在を検出し得る試薬を１つ以上含有する１つ以上の他の容器を含む１つ以上の容器を得るための区分されたキットを提供する。

　詳細には、区分されたキットは、別々の容器中に試薬を含む任意のキットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチック片および紙片を含む。このような容器で、一方の区分から他方の区分に試薬を効率的に移すことが可能になり、その結果サンプルと試薬が相互に混入せず（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ）、そして各容器の薬剤および溶液は、一方の区分から他方の区分に定量形式で添加され得る。このような容器は、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイにおいて使用される抗体を含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を含む容器、および結合抗体、結合抗原またはＤＦを検出するために使用される試薬を含む容器を含む。

　検出試薬のタイプは、標識核酸プローブ、標識二次抗体、あるいは、一次抗体が標識されている場合、標識抗体と反応し得る酵素試薬または抗体結合試薬を含む。当業者は、本発明の開示されるＤｆ、抗原、および抗体が、当該分野において周知の確立されたキット形式の１つにキットに容易に組み込まれ得ることが、容易に認識する。
４．結合剤についてのスクリーニングアッセイ
　本発明の単離されたタンパク質を用いて、本発明はさらに、本発明のＯＲＦの１つによってコードされるタンパク質、またはフラグメントならびに本明細書中で開示するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓフラグメントおよびコンティグの１つに結合する薬剤を得るための方法および同定するための方法を提供する。

　一般的に、このような方法は以下の工程を包含する：
　（ａ）薬剤を、本発明のＯＲＦの１つによってコードされる単離されたタンパク質、または単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントと接触させる工程；
　（ｂ）薬剤が上記タンパク質または上記フラグメントに結合するか否かを決定する工程。

　上記アッセイにおいてスクリーニングされた薬剤は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の製剤であり得るがこれらに限定されない。薬剤は、ランダムに選択およびスクリーニングされ得るか、あるいはタンパク質モデリング技術を用いて合理的に選択または設計され得る。

　ランダムスクリーニングについては、薬剤（例えば、ペプチド、炭水化物、製剤など）は、ランダムに選択され、そして本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質に結合するそれらの能力についてアッセイされる。

　あるいは、薬剤は、合理的に選択または設計され得る。本明細書で使用されるように、薬剤は、薬剤が特定のタンパク質の配置に基づいて選択される場合、「理論的に選択または設計される」という。例えば、当業者は、現在利用可能な手順を、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えば、Ｈｕｒｂｙら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，「Ｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ（１９９２），２８９−３０７頁、およびＫａｓｐｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９２３０−８（１９８９）を参照のこと）、製剤などを生成するために特異的なペプチド配列に結合し得るペプチド、または製剤などを生成することに容易に適応させ得る。

　前述に加えて、本発明の薬剤の１つのクラスは、広範に記載されるように、本発明のＯＲＦまたはＥＭＦの１つへの結合により介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。上記のように、このような薬剤は、ランダムにスクリーニングまたは合理的に設計／選択され得る。ＯＲＦまたはＥＭＳを標的化することで当業者は、配列特異的な薬剤またはエレメント特異的な薬剤を設計して発現制御の同じＥＭＦに依存する単一のＯＲＦまたは複数のＯＲＦのいずれかの発現を調節することが可能になる。

　ＤＮＡ結合薬剤の１つのクラスは、ハイブリダイズするかまたはＤＮＡまたはＲＮＡへの結合により三重ヘリックスを形成する塩基残基を含む薬剤である。このような薬剤は、典型的なリン酸ジエステル、リボ核酸骨格に基づき得、または塩基付着能力を有する種々のスルフヒドリル誘導体またはポリマー誘導体であり得る。

　これらの方法における使用に適切な薬剤は、通常、２０〜４０塩基を含み、そして転写に関与する遺伝子の領域（三重ヘリックス−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｒｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））に相補的になるように設計される。三重ヘリックス形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡの転写の阻止（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）を生じ、一方アンチセンスＲＮＡハイブリダーゼーションは、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。両方の技術が、モデル系において有効であることが示されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、ならびに他のＤＮＡ結合薬剤を設計するために使用され得る。
５．薬学的組成物およびワクチン
　本発明はさらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓまたは別の関連生物体の、インビボまたはインビトロでの、増殖および病原性を調節するために使用される製剤を提供する。本明細書で使用されるように、「製剤」は、薬学的組成物を提供するための公知の技術を用いて処方され得る物質の組成物として定義される。本明細書で使用されるように「本発明の製剤」は、本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質に由来する製剤、または本明細書で記載のアッセイを用いて同定される薬剤をいう。

　本明細書中で使用されるように、製剤は、製剤が問題の生物体の増殖速度、分裂速度、または生存力を減少する場合、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓまたは関連生物体の、インビボおよびインビトロでの、増殖および病原性を調節する」といわれる。本発明の製剤は、多くの様式で生物体の増殖および病原性を調節し得るが、しかし、作用の基礎となる機構を理解することは、本発明の製剤の使用を実行するために必要ではない。ある製剤は、重要なタンパク質に結合し、従ってタンパク質の生物学的活性をブロックすることにより増殖および病原性を調節するが、別の薬剤は生物体の外表面の成分に結合し得、付着をブロックするかまたは身体の天然の免疫系にさらに作用しやすい生物体を与え得る。あるいは、製剤は、本発明のＯＲＦの１つによってコードされるタンパク質を含み得、そしてワクチンとして供され得る。膜結合ポリペプチドに由来するワクチンの開発および使用は、当該分野において周知である。本発明者らはワクチンとして使用するために特に好ましい免疫厳正Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓポリペプチドを同定した。このような免疫原性ポリペプチドは、上記に記載されており、そして下記の表４にまとめられている。

　本明細書中で使用されるように、「関連生物体」は、その増殖および病原性が、本発明の製剤の１つによって調節され得る任意の生物体をいう広い用語である。一般的に、このような生物体は、ワクチンとして使用される製剤またはタンパク質の標的であるタンパク質の相同物を含む。このように、関連生物体は、細菌である必要はなく、菌類またはウイルス病原体であり得る。

　本発明の製剤および組成物は、簡便な様式（例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、または皮内経路）で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候の処置および／または予防に有効である量で投与される。一般的に、薬学的組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、薬学的組成物は、１日当たり約１ｇ／ｋｇ体重を超えないで投与される。ほとんどの場合において、投薬量は、投与経路、徴候などを考慮して、毎日、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇ体重である。

　本発明の薬剤は、天然の形態で使用され得るか、または化学誘導体を形成するために修飾され得る。本明細書中で使用されるように、分子は、通常は分子の一部分ではない付加的な化学部分を含有する場合、別の分子の「化学誘導体」であるといわれる。このような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、この部分は分子の毒性を減少し得、分子の任意の非所望の副作用を排除または弱めるなどし得る。このような効果を媒介し得る部分は、他の情報源の中でも本明細書中でいずれかに引用されるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１９８０）に開示されている。

　例えば、このような部分は、機能的誘導体の免疫学的特徴（例えば、所定の抗体に対する親和性）を変化し得る。免疫調節活性におけるこのような変化は、適切なアッセイ（例えば、競合型イムノアッセイ）によって測定される。このようなタンパク質特性（例えば、酸化還元安定性、熱安定性、生物学的半減期、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、またはキャリアとともにまたはマルチマーへ凝集する傾向）の改変はまた、この方法において達成され得、そして当業者に周知の方法によってアッセイされ得る。

　本発明の薬剤の治療効果は、任意の適切な手段（例えば、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、腸、または非経口）によって患者に薬剤を提供することによって得られ得る。生物の増殖が、制御されるべき血液および組織内で有効濃度を達成するように、本発明の薬剤を投与することが好ましい。有効な血液濃度を達成するために、好ましい方法は、注入によって薬剤を投与することである。投与は、連続注入、または単回または複数回注入によって行われ得る。

　本発明の薬剤の１つを患者に与える際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的医療条件、以前の治療歴などのような因子に依存して変わる。一般に、レシピエントに約１ｐｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ（患者の体重）の範囲の薬剤の用量を与えるのが好ましいが、より低いまたはより高い用量が投与され得る。治療に有効な用量は、本発明の薬剤または別の薬剤の組み合わせを使用することにより、低下され得る。

　本明細書中で使用されるように、２つまたはそれ以上の化合物または薬剤は、（１）各化合物の生理学的効果、または（２）各化合物の血清濃度のいずれかが同時に測定され得る場合、互いに「組み合わせて」投与されるといわれる。本発明の組成物は、他の薬剤と同時に投与され得るか、その前に投与され得るか、またはその後で投与され得る。

　本発明の薬剤は、レシピエント被験者に標的生物の増殖速度（上記のように定義されている）を低下させるに十分な量で投与されることが意図される。

　本発明の薬剤の投与は、「予防用」または「治療用」のいずれかのためであり得る。予防用で投与される場合、この薬剤は、生物増殖を表す任意の症候の前に投与される。この薬剤の予防用の投与は、結果として起こるいずれの感染の発症の速度を防ぐか、弱めるか、または減少させるのに有用である。治療用に投与される場合、この薬剤は感染の症候の発症（または発症後にすぐ）時に投与される。この化合物の治療用の投与は、感染の病理的症候を弱めるに役に立つか、または回復の速度を増加させるに役に立つ。

　本発明の薬剤は、薬学的に受容可能な形態および治療用に有効な濃度で被験体、例えば、哺乳類、または患者に投与される。組成物は、その投与がレシピエント患者に耐えられるならば、「薬学的に受容可能」であるといわれる。投与される量が生理学的に有意であるならば、このような薬剤は「治療的に有効な量」で投与されるといわれる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理学に検出可能な変化を生じるなら、生理学的に有意である。

　本発明の薬剤は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方され得、それによって、これらの物質、またはこれらの機能的誘導体は、薬学的に受容可能なキャリアベヒクルと混合して組み合わせられる。他のヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む適切なベヒクルおよびそれらの処方は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ　ＰＡ（１９８０）に記載されている。有効な投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、適切な量のキャリアベヒクルと共に有効量の１つまたはそれ以上の本発明の薬剤を含有する。

　さらなる薬学的な方法は、作用の継続期間を制御するために使用され得る。制御放出調製物は、１種またはそれ以上の本発明の薬剤と複合体化するか、または吸収するポリマーの使用により達成され得る。制御される送達は、高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、硫酸塩）を用いて処方し、そして処方中の高分子および薬剤の濃度を調整することを含む種々の周知の技術により、および放出の所望の時間経過をなし遂けるために操作される取り込み方法の適切な使用により、なし遂けられ得る。制御放出調製物によって作用の継続期間を制御する別の可能な方法は、本発明の薬剤をポリマー性物質（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマー）の粒子に取り込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー性粒子に取り込む代わりに、これらの物質は、例えば、コアセルベーション技術により、または例えばヒドロメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルとそれぞれ界面重合により調製したマイクロカプセルに取り入れ、またはコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに取り入れられ得る。このような技術は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１９８０）に記載されている。

　本発明はさらに、本発明の薬学的組成物の１種またはそれ以上の成分で充填される１種またはそれ以上のコンテナーを含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このようなコンテナーと関連するのは、薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関によって定められた形態の通知であり、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による認可を反映する。

　さらに、本発明の薬剤は他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。

　６．メガ塩基のＤＮＡ配列決定のためのショットガンアプローチ
　本発明はさらに、大きな配列がランダムなショットガンアプローチを用いて配列決定され得ることを示す。以下の実施例に詳細に記載されているこの手順は、配列決定するプロトコルの開始の前に、重複サブクローンまたは隣接するサブクローンを単離および分類する最初のコストを削減した。

　本発明のある局面は、以下の実施例でより詳細に記載されている。これらの実施例は、例示によって提供される。当業者が本願の開示を読むと明らかであるように、本発明の他の局面および実施態様が、本発明者らにより意図される。

　ライブラリーおよび配列決定
　１．ショットガン配列決定確率の分析
　全ゲノム配列決定へのショットガンアプローチのための全ストラテージは、ポアソン分布に関する方程式のＬａｎｄｅｒおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ＬａｎｄｅｒｍａｎおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２：２３１（１９８８））適用に基づく。この処理によれば、ヌクレオチド中のサイズＬの配列中の任意の所定の塩基が、ヌクレオチド中の決定されたランダムな配列の一定の量ｎ後に配列決定されない確率Ｐ_０は、方程式Ｐ_０＝ｅ^−ｍ、ここで、ｍはＬ／ｎ（折りたたみ範囲）により計算され得る。例えば、２．８Ｍｂのゲノムの場合は、２．８Ｍｂの配列がランダムに生成されているとき（１Ｘ範囲）、ｍ＝１である。この時点では、Ｐ_０＝ｅ^−１＝０．３７である。任意の所定の塩基が配列決定されていない確率は、全配列Ｌの任意の領域が決定されていない確率と同じであり、そしてそれゆえ、この確率はいまだ決定されていない全配列の画分に等しい。従って、１折りたたみ範囲では、ヌクレオチド中のサイズＬの約３７％のポリヌクレオチドが配列決定されていない。１４Ｍｂの配列が生成される場合、範囲は２．８Ｍｂについて５Ｘであり、そして配列未決定の画分は０．００６７または０．６７％まで下がる。２．８Ｍｂ配列の５Ｘ範囲は、４１０ｂｐの平均配列読み取り長さを有する挿入物末端の両方由来の約１７，０００のランダムなクローンを配列決定することにより達成され得る。

　同様に、全ギャップ長さＧが方程式Ｇ＝Ｌｅ^−ｍにより決定され、そして平均ギャップ
Ｍｂのポリヌクレオチドの配列中で平均して約８２ｂｐサイズの２４０ギャップを残す。

　上記処理は、本質的にＬａｎｄｅｒおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２：２３１（１９８８）と同じである。

　２．ランダムライブラリーの構築
　正確な配列決定の間に上記のランダムなモデルに近づくために、クローン化されたゲノムフラグメントのほぼ理想に近いライブラリーが必要される。以下のライブラリー構築手順は、この目的を達成するために開発された。

　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡをフェノール抽出により調製した。３．３ｍｌの３００ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ　Ｎａ−ＥＤＴＡ、３０％グリセロール中に６００μｇのＤＮＡを含有する混合物を、Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　４５０ソニケーターにおいて、最も低いエネルギーセッティングで３ｍｍプローブを用い、０℃で１分間音波処理した。音波処理されたＤＮＡをエタノールで沈澱させ、そして５００μｌのＴＥ緩衝液に再溶解した。

　平滑末端を作り出すために、１００μｌアリコットの再懸濁されたＤＮＡを、５単位のＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で２００μｌのＢＡＬ３１緩衝液中において、３０℃で１０分間消化した。消化されたＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、１００μｌのＴＥ緩衝液に再溶解し、続いて、１．０％の低融点のアガロースゲルによる電気泳動によりサイズ分画した。サイズ１．６〜２．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含有する断片をゲルから切断し、ＬＧＴアガロースを融解させ、そして得られた溶液をフェノールで抽出して、アガロースをＤＮＡから分離した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、そしてベクターへの連結のために２０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解した。

　２段階連結手順を、９７％の挿入物（そのうち、９９％以上は単一の挿入物であった）を有するプラスミドライブラリーを産生するために使用した。第１の連結混合物（５０μｌ）は、２μｇのＤＮＡフラグメント、ＳｍａＩで切断しかつ細菌アルカリホスホターゼで脱リン酸化した２μｇのｐＵＣ１８ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および１０単位のＴ４リガーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含有し、そして１４℃で４時間インキュベートした。続いて、連結混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、そして沈澱したＤＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１．０％の低融点アガロースゲル上で電気泳動した。梯子状の不連続のバンドを、臭化エチジウム染色およびＵＶ照射により観察し、そして挿入物（ｉ）、ベクター（ｖ）、ｖ＋ｉ、ｖ＋２ｉ、ｖ＋３ｉなどとしてサイズにより同定した。ｖ＋ｉ　ＤＮＡを含有するゲルの部分を切断し、そしてｖ＋ｉ　ＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥに再懸濁した。続いて、このｖ＋ｉ　ＤＮＡを、推薦された緩衝液条件下、直鎖状ｖ＋ｉ、４種のｄＮＴＰそれぞれ５００μＭ、および９単位のＴ４ポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を含有する反応混合物（５０μｌ）において３７℃で５分間のＴ４ポリメラーゼ処置により、末端平滑化した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、修復された直鎖状ｖ＋ｉを２０μｌのＴＥに溶解した。環状を生成するための最終の連結を、５μｌの直鎖状ｖ＋ｉおよび５単位のＴ４リガーゼを含有する５０μｌの反応物において、１４℃で一晩行った。翌日、７０℃で１０分の後、反応混合物を−２０℃貯蔵した。

　この２段階手順により、二重挿入物キメラ（＜１％）または遊離ベクター（＜３％）による汚染が最小限の単一挿入物プラスミド組換え体の分子的にランダムな収集を得た。

　ランダムさからの偏差は、宿主中のＤＮＡ増殖から生じ得るため、全ての組換え機能および制限機能が欠損したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　３（１）：５（１９９０））を、再配列、欠失および制限によるクローンの損失を防ぐために使用した。さらに、トランスフォームされた細胞を抗生物質拡散プレート上に直接プレートして、最も迅速に増殖する細胞の扱いおよび選択を可能にする通常のブロース回収相を避けた。

　プレーティングを以下のように行った。１００μｌのアリコットのＥｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＳＵＲＥ　ＩＩ　Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　２００１５２）を氷上で解凍し、そして氷上で冷却したファルコン２０５９チューブに移した。１．７μｌアリコットの１．４２Ｍβ−メルカプトエタノールをこのアリコットの細胞に加え、最終濃度２５ｍＭとした。細胞を氷上で１０分間インキュベートした。１μｌアリコットの最終連結物をこの細胞に加え、そして氷上で３０分間インキュベートした。細胞に４２℃で３０分間の加熱パルスを与え、そして氷上に戻して２分間放置した。液体培地中の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を、任意の所定のトランスフォームされた細胞の優先的増殖を最小限にするためにこのプロトコルから除去した。代わりに、トランスフォーメーション混合物を、５ｍｌのＳＯＢ寒天の底部層（５％ＳＯＢ寒天：培地リットルあたり、２０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、０．５ｇのＮａＣｌ、１．５％のＤｉｆｃｏ　Ａｇａｒ）を含有する栄養分に富むＳＯＢプレートに直接プレートした。５ｍｌの底部層は、ＳＯＢ寒天１００ｍｌあたり、０．４ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンで補充する。１５ｍｌのＳＯＢ寒天の上層を１ｍｌのＸ−Ｇａｌ（２％）、１ｍｌのＭｇＣｌ_２（１Ｍ）、および１ｍｌのＭｇＳＯ_４／１００ｍｌＳＯＢ寒天で補充する。１５ｍｌの上層をプレーティングの直前に注いだ。本発明者らの力価は、約１００コロニー／１０μｌアリコットトランスフォーメーションであった。

　サイズをいとわずに、全てのコロニーをテンプレート調製のために採集した。それゆえ、「毒性」ＤＮＡまたは有害遺伝子生成物に起因するクローンの損失だけがこのライブラリーから欠失され、それにより、ギャップ数が予想を超えて僅かに増加し得る。

　３．ランダムなＤＮＡ配列決定
　高い品質の二本鎖ＤＮＡプラスミドテンプレートを５Ｐｒｉｍｅ−−−→３Ｐｒｉｍｅ　Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）と共同で開発したアルカリ溶解法を用いて調製した。プラスミド調製を、９６ウェルフォーマットで、細菌増殖から最終のＤＮＡ精製までのＤＮＡ調製の全段階について行った。平均テンプレート濃度を、アガロースゲル上で２５％の試料を泳動することにより測定した。ＤＮＡ濃度は調整しなかった。

　テンプレートもまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓλゲノムライブラリーから調製した。未増幅のライブラリーをλＤＡＳＨ　ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において構築した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓＤＮＡ（＞１００ｋｂ）を、５０μｇのＤＮＡ、１Ｘ　Ｓａｕ３ＡＩ緩衝液、２０単位Ｓａｕ３ＡＩを含有する反応混合物（２００μｌ）で２３℃で６分間部分的に消化した。消化されたＤＮＡをフェノールで抽出し、そして１０〜４０％のスクロースグラジエント上で遠心分離した。１５〜２５ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する画分を沈澱により回収した。１μｌのフラグメントを１μｌのＤＡＳＨ　ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともに推薦された連結反応で使用した。パッケージング反応あたり１μｌの連結混合物を使用し、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　ＸＬ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｐｈａｇｅを用いる推薦されたプロトコルに従って（５００μｌの推薦されたＳＭ緩衝液で希釈し、そしてクロロホルムで処理した後に）このパッケージング混合物からの増幅なしで直接プレートした。収率は約２．５×１０^９ｐｆｕ／μｌであった。

　増幅されたライブラリーを製造業者のプロトコルに従って、最初のパッケージング混合物から調製した。この増幅されたライブラリーを７％ジメチルスルフォキシド中で凍結して貯蔵する。ファージ力価は約１×１０^９ｐｆｕ／ｍｌである。

　ミニ液体溶解物（０．１μｌ）をランダムに選択されたプラーグから調製し、そしてテンプレートを長範囲ＰＣＲにより調製する。試料を修飾したＴ３およびＴ７プライマー、およびＥｌｏｎｇａｓｅ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＬＴＩ）を用いてＰＣＲ増幅する。

　配列決定反応を、２つのワークステーション（ＢＩＯＭＥＫ　１０００およびＨａｍｉｌｔｏｎ　Ｍｉｃｒｏｌａｂ　２２００）、およびＭ１３順方向（Ｍ１３−２１）プライマーおよびＭ１３逆方向（Ｍ１３ＲＰ１）プライマーのためのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔｓを用いたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　９６００　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒの組み合わせを用い、プラスミドテンプレート上で実施する。ダイターミネーター配列決定反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔｓを使用するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　９６００　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上のλテンプレート上で実施する。修飾されたＴ７およびＴ３プライマーを使用して、λＤＡＳＨ　ＩＩライブラリーからの挿入物の末端を配列決定する。配列決定反応ＡＢ　３７３　ＤＮＡ　ＳｅｑｕｅｎｃｅｒおよびＡＢＩ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｑｕｅｎｃｅｒの組み合わせ上で行う。全てのダイターミネーター配列決定反応を、ＡＢ　３７７上の２Ｘ９時間モジュールを用いて分析する。ダイプライマー反応を、ＡＢＩ　３７３およびＡＢＩ　３７７　ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒの組み合わせ上で分析する。全体の配列決定成功率はほぼ同じであり、Ｍ１３−２１およびＭ１３ＲＰ１配列について約８５％であり、そしてダイターミネーター反応について６５％である。平均の使用可能な読み取り長さは、Ｍ１３−２１配列について４８５ｂｐであり、Ｍ１３ＲＰ１配列について４４５ｂｐであり、そしてダイターミネーター反応について３７５ｂｐである。

　４．自動化サイクル配列決定のプロトコル
　配列決定を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｔａｔｉｏｎ　２２００，Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイクラー、ＡＢＩ３７３およびＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて実施した。このＨａｍｉｌｔｏｎは、予め少量に分けたテンプレート、およびデオキシ−ならびにジデオキシヌクレオチド、熱安定性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、蛍光標識された配列決定プライマー、および反応緩衝液からなる反応ミックスを組み合わせる。反応ミックスおよびテンプレートを９６ウェルの熱サイクリングプレートのウェル中に組み合わせ、そしてＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイクラーに移した。３０の連続するサイクルの直線上増幅（即ち１つのプライマー合成）工程を、変性、プライマーとテンプレートのアニーリング、および伸長即ちＤＮＡ合成を含めて実施した。熱サイクリングプレート上のゴムガスケットを有する加熱されたふたは、油重層の必要性なしに蒸発を防ぐ。

　２つの配列決定プロトコルを用いた：１つは色素標識プライマーであり、第２番目は色素標識ジデオキシ鎖ターミネーターである。ショットガン配列決定は、４つのターミネーターヌクレオチドの各々に対するプライマーである４つの色素標識配列決定プライマーの使用を含む。ダイプライマーの各々は、異なる蛍光色素で標識し、４つの個々の反応を、電気泳動、検出、および塩基呼び出しのために３７３または３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ中の１つのレーンに組み合わせることを可能にした。ＡＢＩは、現在、配列決定に必要なすべてのテンプレート以外の試薬を含むバルクパッケージ中の予め混合された反応ミックスを供給している。配列決定は、プラスミドテンプレートは一般により長い使用可能な配列を与えるが、プラスミドおよびＰＣＲ生成テンプレートの両方をほぼ等しい厳密さを有するダイプライマーおよびダイターミネーターの両方とともに用いてなされ得る。

　ＡＢＩ　３７３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒあたり１日あたり３２の反応を行い、そして１日あたりＡＢＩ　３７７に９６の試料が処理され得る。電気泳動は、製造者のプロトコルに従って、一晩（ＡＢＩ　３７３）または２．５時間（ＡＢＩ　３７７）行った。電気泳動および蛍光検出の後、ＡＢＩ　３７３またはＡＢＩ　３７７は、自動的にレーン追跡および塩基呼び出しを実施する。レーン追跡は肉眼で確認した。各配列の電気泳動図（または蛍光レーントレース）を肉眼で検査しそして品質を評価した。低品質の引かれてつらなる配列は除き、そして配列自身は、ソフトウェアを介してＳｙｂａｓｅデータベースにロードした（毎日８ｍｍテープにアーカイブ記録した）。先導ベクターポリリンカー配列は、ソフトウェアプログラムにより自動的に除かれた。標準のＡＢＩ　３７３またはＡＢＩ　３７７からの配列の平均編集長さは、約４００ｂｐであり、そして配列決定反応に用いられたテンプレートの品質に大部分依存する。

　情報科学
　１．データ管理
　大規模配列決定ラボ用の多くの情報管理システムが開発されている（レビューのために、例えば、Ｋｅｒｌａｖａｇｅら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｈａｗａｉｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩＥＥＥ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．，５８５（１９９３）を参照のこと）。配列データを収集およびアセンブルするために用いたシステムは、Ｓｙｂａｓｅリレーショナルデータベース管理システムを用いて開発され、そしてデータフローを可能な限りに自動化しそしてユーザーエラー（ｕｓｅｒ　ｅｒｒｏｒ）を低減するように設計した。このデータベースは、テンプレート調製からゲノムの最終分析までの全操作の間に収集されたすべての情報を記憶し、そして相互関係をもたせた。ＡＢＩ　３７３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒの生の出力は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈプラットホームに基づき、そして選択されたデータ管理システムは、Ｕｎｉｘ（登録商標）プラットホームに基づいたので、生データおよび分析結果を、最少のユーザー努力で、継ぎ目なくデータベース中に流させる、種々の複数ユーザーの、クライアントサーバーアプリケーション（ｃｌｉｅｎｔ−ｓｅｒｖｅｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を設計および実行する必要があった。

　２．アセンブリ
　数千の配列フラグメントの迅速および正確なアセンブリのために開発されたアセンブリエンジン（ＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）を用いてコンティグを生成した。ＴＩＧＲアセンブラーは、ゲノムのフラグメントを同時にクラスター化およびアセンブルする。１０^４以上のフラグメントをアセンブルするために必要な速度を得るために、アルゴリズムは、１２ｂｐオリゴヌクレオチドサブ配列の寄せ集めの表（ｈａｓｈ　ｔａｂｌｅ）を作り、可能な配列フラグメント重複のリストを作成する。フラグメントの各々に対する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になりそうであるかを決定する。単一のシード配列フラグメントから始めて、ＴＩＧＲアセンブラーは、現在のコンティグを、オリゴヌクレオチドの内容に基づき最もマッチするフラグメントを付加する試みにより拡張する。このコンティグおよび候補フラグメントを、最適間隙のアラインメントを提供するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの改変版（Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１６４：７６５（１９８８））を用いて並べる。コンティグは、マッチする品質について厳格な規準が満たされる場合にのみフラグメントにより拡張される。マッチする規準は、重複の最小長さ、マッチしない末端の最大長さ、およびマッチする最小百分率を含む。これらの規準は、最小区域の領域におけるアルゴリズムにより自動的に低下し、そして可能な反復要素の領域で高められる。各フラグメントに対する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になりそうであるかを決定する。反復要素の境界を示すフラグメントおよび可能なキメラフラグメントは、しばしば、アラインメントの末端で部分的なミスマッチに基づいてはねのけられ、そして現在のコンティグから排除される。ＴＩＧＲアセンブラーは、各テンプレートの両末端からの配列決定とカップルしたクローンサイズ情報を利用するよう設計されている。それは、同じテンプレートの２つの末端からの配列フラグメントが、上記コンティグにおいて、互いに向かって照準し、そして塩基対の特定の範囲内に位置される（与えられたライブラリーについて既知のクローンサイズ範囲を基に各クローンについて規定され得る）するという束縛を増強する。

　３．遺伝子の同定
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓゲノムの推定コード領域は、最初、最少長さのＯＲＦを見
出すブログラムｚｏｒｆを用いて規定した。推定されるコード領域配列は、少なくとも９５％の同一性で５０またはそれ以上のヌクレオチドの重複を同定するＢＬＡＳＴＮ検索方法を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ（リリース９２．０）からのすべてのＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓヌクレオチド配列のデータベースに対する検索に用いた。これらのＯＲＦを、マッチするヌクレオチド配列とともに表１に示す。このようなマッチのないＯＲＦは、タンパク質配列に翻訳し、そしてＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ、ＰＩＲおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースを組み合わせることにより生成された既知のタンパク質の過多でないデータベースと比較した。０．０１に等しいまたはそれ未満のＢＬＡＳＴＰ確率でデータベースタンパク質とマッチした少なくとも８０のアミノ酸のＯＲＦを表２に示す。この表はまた、データベースにおいて最も緊密にマッチすることに基づいて割り当てた機能を列挙する。これらのレベルでデータベース中のタンパク質またはヌクレオチド配列とマッチしない少なくとも１２０のアミノ酸のＯＲＦを表３に示す。

　応用例
　１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓタンパク質に対する抗体の産生
　実質的に純粋なタンパク質あるいはポリペプチドが、当該分野で公知の任意の方法によって、トランスフェクションあるいは形質転換された細胞から単離される。タンパク質はまた、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核発現系で組み換え産生され得るか、あるいは、化学合成され得る。最終調製物中のタンパク質濃度は、例えば、Ａｍｉｃｏｎ濾過装置での濃縮によって、１ｍｌあたり数マイクログラムのレベルに調整される。次に、タンパク質に対するモノクローナルあるいはポリクローナルの抗体が、以下のように調製され得る。

　２．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
　記載のように同定および単離された任意ペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体が、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）の古典的な方法あるいはその変法に従って、マウスハイブリドーマから調製され得る。簡単に述べれば、マススに、数週間にわたって、数マイクログラムの選択タンパク質を繰り返し接種する。次に、そのマウスを殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾細胞は、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞と融合され、過剰の非融合細胞は、アミノプテリン含有の選択培地（ＨＡＴ培地）で、その系を増殖して破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、希釈物の一部を、マイクロタイタープレートウェルに播種して培養増殖を継続する。抗体産生クローンを、基本的にＥｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９（１９８０）に記載のＥＬＩＳＡ、およびその変法のようなイムノアッセイ法によって、ウェルの上清中の抗体を検出して同定する。選択されたポジティブクローンを増殖して、それらのモノクローナル抗体産物を、使用のために回収し得る。モノクローナル抗体産生の詳細な方法は、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．２１−２章（１９８９）に記載されている。

　３．免疫によるポリクローナル抗体の産生
　１つのタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、上記の発現タンパク質で適切な動物を免疫することによって調製され得、それは、免疫原性を増大するように修飾されないか、あるいは修飾され得る。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主の種の両方に関連する多くの因子に影響される。例えば、低分子はその他のものより免疫原性に劣り、キャリアおよびアジュバントの使用を必要とし得る。さらに、宿主動物は、低力価抗血清をもたらす不十分なあるいは過剰の抗原投与量によって、接種部位および投与量に対する応答を多様にする。少投与量（ｎｇレベル）での複数皮内部位への抗原投与が、最も確実であるようだ。ウサギに対する有効な免疫プロトコルが、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９９１（１９７１）に認められ得る。

　追加免疫注射が通常間隔で与えられ得、例えば、抗原既知濃度に対する寒天での二重免疫拡散法によって、半定量的に測定されるように、それらの抗体力価が降下し始めるときに、抗血清が回収され得る。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｅｒ，Ｄ．編　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）のＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．ら、１９章を参照のこと。抗体の定常濃度は、通常０．１から０．２ｍｇ／ｍｌ血清（約１２Ｍ）の範囲である。抗血清の抗原に対する親和性は、例えば、Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第二版、ＲｏｓｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）中のＦｉｓｈｅｒ，Ｄ．第４２章に記載されているように、競合結合曲線を作製して決定される。

　いずれかのプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物学的試料中の抗原を有する物質の濃度を測定する、定量的イムノアッセイに有用であり；これはまた、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために、半定量的あるいは定量的に使用される。さらに、当該分野で公知のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ疾患の種々の動物モデルにおいて、有効なワクチン標的としての抗体を作成するために用いるタンパク質を評価する手段、あるいは有効な免疫療法剤として抗体を評価する手段として、有用である。

　４．ＰＣＲプライマーの調製およびＤＮＡ増幅
　表１〜３、および配列番号１−５、１９１に記載のようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムの種々のフラグメントが、本発明に従って、様々な使用のためのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得る。ＰＣＲプライマーは、その長さは好ましくは少なくとも１５塩基であり、より好ましくは少なくとも１８塩基である。プライマー配列を選択するとき、プライマーペアーは、ほぼ同じＧ／Ｃ比を有し、従って融解温度はほぼ同じであることが好ましい。この例のＰＣＲプライマーおよび増幅ＤＮＡは、以下の実施例で用いられる。

　５．ＯＲＦに対応するＤＮＡ配列からの遺伝子発現
　表１〜３に記載されているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのフラグメントは、従来方法によって発現ベクターに導入される。哺乳類、酵母、昆虫、あるいは細菌の発現系で、タンパク質を翻訳する発現ベクター中にクローン化配列を導入する方法は、当該分野で周知である。商業的に入手可能なベクターおよび発現系は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む種々の供給業者から、入手可能である。必要であれば、発現を増大し、そして適切なタンパク質折り畳みを促進するために、配列のコドンの前後関係およびコドンペアリングが、本明細書に参考として援用されている、Ｈａｔｆｉｅｌｄらの米国特許第５，０８２，７６７号に説明されているように、特定の発現生物について最適化され得る。

　下記は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムフラグメントのクローン化ＯＲＦからのポリペプチドを調製する方法の一例として提供される。細菌ＯＲＦは、一般に、ポリＡ付加シグナルを欠如している。付加シグナル配列は、例えば、ＢｇｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からスプライシングによりポリＡ付加配列を取り出し、それを真核発現系での使用のための哺乳類発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ取り込んで、構築物に付加され得る。ｐＸＴ１は、ＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のｇａｇ遺伝子の一部を有する。構築物中のＬＴＲ位置は、有効で安定なトランスフェクションを可能にする。ベクターは、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて細菌ベクターからＰＣＲよって得られ、５’プライマーに取り込まれたＰｓｔＩ、および対応Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ３’プライマーの５’末端にＢｇｌＩＩを有し、これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡが、ポリＡ付加配列が後続するように配置されることを確実にする。得られたＰＣＲ反応物からの精製フラグメントは、ＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端化され、ＢｇｌＩＩで消化され、精製され、ｐＸＴ１に連結されて、そして、ポリＡ付加配列および消化ＢｇｌＩＩを有する。

　連結された産物は、産物仕様の項に概説されている条件下で、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を使用して、マウスＮＩＨ　３Ｔ３細胞へトランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞を６００ｕｇ／ｍｌ　Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で増殖後に、ポジティプなトランスフェクション物を選択する。そのタンパク質は、好ましくは上清中に放出される。しかし、タンパク質が膜結合ドメインを有するときは、タンパク質は、さらに細胞内に維持されるか、あるいは、発現が細胞表面に制限され得る。トランスフェクションされた産物の精製および位置づけることが必要であり得るので、推定されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ配列から合成された、合成１５量体ペプチドを、マウスに注射して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡにコードされるポリペプチドに対して抗体を生成する。

　代替的あるいは抗体産生が不可能なときに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ配列はさらに、真核発現ベクターに取り込まれて、例えば、グロビン融合として発現される。次に、グロビン部分に対する抗体が、キメラタンパク質を精製するために使用される。対応プロテアーゼ切断部位が、グロビン部分とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドとの間で、後者が簡単なプロテアーゼ消化によって、形成物から遊離し得るように加工される。グロビンキメラを生成するための１つの有用な発現ベクターは、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。このベクターは、ウサギグロビンをコードする。ウサギグロビン遺伝子のイントロンＩＩは、発現された転写物のスプライシングを促進し、そして構築物に取り込まれたポリアデニル化シグナルは、発現レベルを増加する。これらの方法は、分子生物学の当業者に周知である。標準的な方法は、本明細書の他に引用されているＤａｖｉｓらのような方法教本に記載されていて、多くの方法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌｉｆｅ　Ｔｃｈｅｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，あるいはＰｒｏｍｅｇａからの技術援助見本から入手可能である。本発明のポリペプチドはまた、インビトロ発現ＴＭ翻訳キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような、インビトロ翻訳系で産生され得る。

　本発明は、明快さおよび理解を目的に詳細に記載されてきたが、当業者は、形態および細部の多様な改変が、本発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることを正しく理解する。

　上記引用の全特許、特許出願、および刊行物は、本明細書に参考として援用されている。

図１は、本発明のコンピューターに基づくシステムを実行するために用いられ得るコンピューターシステム（１０２）のブロック図である。 図２は、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓゲノムのコンティグを収集、アセンブル、編集、および注釈するために用いられるデータの流れおよびコンピュータープログラムを示す模式図である。ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘ（登録商標）　ｐｌａｔｆｏｒｍが、ＡＢ３７３および３７７配列のデータファイルを扱うために用いられる。主としてＫｅｒｌａｖａｇｅら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｈａｗａｉｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５８５，ＩＥＥＥ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．（１９９３）。Ｆａｃｔｕｒａ（ＡＢ）は、自動的な配列ファイルのベクター配列除去および末端トリミングのために設計されたＭａｃｉｎｔｏｓｈプログラムである。プログラムＬｏａｄｉｓはＭａｃｉｎｔｏｓｈ　ｐｌａｔｆｏｒｍ上で作動し、そしてＦａｃｔｕｒａにより配列ファイルから抽出された特徴データをＵｎｉｘ（登録商標）に基づくＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ関連データベースに移す。コンティグ（およびゲノム配列全体）のアセンブリは、配列検索用のＵｎｉｘ（登録商標）ユーティリティーであるｅｘｔｒｓｅｑを用いてＳＱＬデータベースから特定の配列ファイルのセットを検索すること、およびそれらの関連する特徴を検索することによって達成される。得られた配列ファイルは、ｓｅｑ−ｆｉｌｔｅｒにより処理され、２％よりも多い不明瞭なヌクレオチドを有する配列部分が取り除かれる。配列ファイルを、数千の配列フラグメントの迅速で正確なアセンブリのためにＴｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ”）で設計されたアセンブリエンジンであるＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを用いてアセンブリした。このアセンブリ工程により作製されたコンティグの収集は、ｌａｓｓｉｅプログラムを有するデータベースにロードされる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定は、ｚｏｒｆでコンティグを加工することにより達成される。ＯＲＦは、Ｇｅｎｂａｎｋ由来のＳ．ａｕｒｅｕｓ配列に対して検索され、そしてＡｌｔｓｃｈｕｌらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて全てのタンパク質配列に対して検索される。ＯＲＦ決定および同様の検索工程の結果を、データベースにロードした。以下に記載のように、決定および検索のいくつかの結果を表１〜３に示す。

Claims (1)

1. 単離されたポリヌクレオチドであって、該単離されたポリヌクレオチドは、表４に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。

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