NO850758L - Proteiner, farmasoeytiske preparater, gener, vektorer, vert-organismer og fremgangsmaater for deres fremstilling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører proteiner, farmasøytiske preparater, gener, vektorer, vert-organismer og fremgangsmåter for deres fremstilling.

Lipolyse av matfett er et viktig trekk i fordøyelses-systemet for høyere dyr. Fordøyelsesprosessen muliggjøres ved enzym-katalysert hydrolyse av triglycerider til å danne en blanding av monoglycerider, diglycerider, glycerol og fri fettsyrer når fettstoffene passerer gjennom fordøyelseskanalen. Hydrolyse-produktene kan passere igjennom epitelialmembranen i mukosale celler som dekker tarmens innside. Når de først er absorbert anvendes de for resyntetisering av triglycerider som innlem-mes i chylomikronene. Chylomikronene transporteres ved hjelp av lymfesystemet bort fra absorpsjonsstedet. Enzymene som ut-fører triglycerid-hydrolysen betegnes lipaser og utskilles i mave-tarmkanalen (Desnuelle, P (1972) The Enzymes bind VII, 3. utgave, Acad. Press New York og London, sider 575-616 og Verger, R. (1980) Methods in Enzymology 64, sidene 340-392).

Et enzym som er involvert i triglycerid-hydrolysen er pankreatisk lipase (EC 3.1.1.3). Svinet er en passende kilde for enzymet og svine-pankreatisk lipase har vært grundig under-søkt. De er tilstede i en mengde på omtrent 2, 5% av de totale proteiner i svine-pankreas-saft og er blitt renset til homo-geniet (Verger, R. et al (1969) Biochim Biophys Acta 188, sidene 272-288). Den fullstendige aminosyresekvens i enzymet er blitt bestemt (De Caro, J. et al (1981) Biochem Biophys Acta 671, 129-138). Enzymet omfatter en proteindel med 449 aminosyrer (molekylvekt 49859) med en karbohydratdel (molekylvekt omtrent 2000) knyttet til en Asn-rest i posisjon 166 i aminosyresekvensen. Den totale molekylvekt av enzymet er derfor omtrent 52000. Den katalytiske aktivitet av pankreatisk lipase er komplisert da der eksisterer en faseseparasjon mellom det oppløselige enzym og det uoppløselige triglycerid-substrat. For at enzymet skal kunne komme til reaksjon med substratet er et koenzym kjent som ko-lipase nødvendig. Ko-lipase er et protein med lav molekylvekt som adsorberer til grenseflaten oppløsning/lipid og deretter virker som en for-ankring for lipasen og tillater gjensidig innvirkning mellom enzymet og dets lipid-substrat.

Pankreatisk lipase kan bestemmes ved hjelp av en rekke metoder (se Desnuelle og Verger som ovenfor) som innbefatter måling av forsvinning av triglyceridet eller tilsynekomst av fri fettsyre eller glycerol . Radioaktiv merking, proton-frigivelse under hydrolyse og innvirkning av lipase på de fysikalske egenskaper av et lipid-monolag har også vært anvendt for å be-stemme lipaseaktivitet. I alle tilfeller er pankreatisk lipase optimalt aktiv i det nøytral-alkaliske pH-området (dvs. pH 7-pH 9) (se Verger et al som ovenfor). Enzymet er meget føl-somt for sur pH og inaktiveres hurtig ved lav pH.

Et antall lipid-malabsorpsjonslidelser i menneskekroppen erkarakterisert vedreduserte nivåer for pankreatisk lipase-sekresjon.

Omtrent 80% av individer som lider av cystisk fibrosis lider av en utilstrekkelig pankreatisk funksjon. Pankreatisk-lipase-insufficiens viser seg kort etter fødselen og fortset-ter gjennom hele pasientens levetid.

Pankreatitis er en tilstand hvor virkningen av pankreas er nedsatt. Pankreatitis utvikles ofte i kroniske alkoholikere som et resultat av malabsorpsjon av fettstoffer og derav følg-ende feilernæring.

Et forster under utvikling er avhengig av høy karbohydrat-ernæring og har en dårlig utviklet pankreatisk funksjon som frembringer lave nivåer for pankreatisk lipase. Ved fødselen erstattes den høye karbohydrat-ernæring i fosterperioden med en diett med høyt fettinnhold når barnet begynner å innta morsmelken. Fett svarer for omtrent halvparten av et barns kaloriinntak. Den pankreatiske funksjon, selv i barn som er fullbåret, er ikke fullstendig produktiv og barn, spesielt dem som er for tidlig født, kan lide av utilstrekkelig fettfordøy-else som fører til en vesentlig grad av steatorrhea (passering av ufordøyet fett i avføringen) og til et resulterende energi-tap .

Den nåværende behandling av pasienter som lider av en mangel på pankreatisk lipase er oral tilførsel av meget store doser av et rått preparat av svine-pankreasenzym. Pankreatisk lipase blir inaktivert ved lave pH-betingelser i maven, med det resultat at oralt tilført pankreatisk lipase blir vesentlig inaktivert ved passering gjennom maven til tarmen. De store doser som tilføres er utilstrekkelig for de fleste pasienter, er urene og er ufordøyelige. Visse tabletter er blitt sammen-satt som passerer gjennom de sure områder av maven og frigir enzymet først i den forholdsvis alkaliske omgivelse av tynn-tarmen (Gow, R. et al (1981) The Lancet Vol. II 8255, sidene 1070-1074). Mange pasienter som lider av pankreatiske for-styrrelser har imidlertid en unormalt sur tynntarm og slike tabletter kan svikte med hensyn til å frigi enzymet og kan derfor være ineffektive.

Det er et stort behov for et preparat av en lipase som kan tilføres oralt til pasienter som lider av en mangel på pankreatisk lipase.

Den serøse tungekjertel (Von Ebner) som befinner seg bak på ryggen av tungen er funnet å utskille en kraftig lipase kjent som tungelipase. Enzymet er påvist i rotter (Hambsh, M. og Scour, R.O. (1973) J. Clin. Invest. 52, sidene 88-95) og i mennesker (Hamosh, M. og Burns,W.A. (1977) Lab. Invest. 37, sidene 603-608). Enzymet svelges med spyttet og går inn i maven hvor det utfører en delvis lipidfordøyelse. Enzymet er blitt delvis renset fra Von Ebner<1>s kjertler i rotter (Fields, R.B. et al, (1983) J. Biol. Chem. 258, sidene 14563-14569, Hamosh M. et al (1979) J. Biol. Chem. 254, sidene 12121- 12125). Tunge-lipase hydrolyserer triglycerider både in vivo og in vitro til diglycerider, monoglycerider og fri fettsyrer (Hamosh, M. (1984), "The Lipases", Borgstrøm, B. og Brockman, utgitt av Elsevier, Amsterdam). En vesentlig forskjell mellom tunge-lipase og pankreatisk lipase er at lingual lipase er stabil i sure omgivelser som dem som finnes i maven, spesielt etter spising. Det er påvist at tungelipase kan hydrolysere triglycerider ved pH i området fra 2 til 7. Tungelipase er bare tilgjengelig i ytterst små mengder fra naturlige kilder. Et preparat fra 16 rotter fremstilte f.eks. omtrent 1,5 mg urent enzym (Field et al (1983) 258, sidene 1456 3-1456 9). Rensingen av en syrestabil lipase fra human-mave-aspirat er angitt av Tiruppathi, C. et al (1982) Biochim. et Biophys. Acta 712, sidene 692-697).

Alt det arbeid som er rapportert i det foregående om tunge-lipase har vært utelukkende av akademisk natur og ikke noe forslag er fremsatt med hensyn til å anvende tungelipase for behandling av lipasemangel. Det antas at tungelipase kan anvendes slik men det er bare økonomisk å gjøre dette hvis tungelipase kan fremstilles i en stor målestokk og til forholdsvis billig pris. Det er klart ikke mulig å gjøre dette ved ekstraksjon fra dyre- eller menneske-tunger.

Oppfinnelsen tilveiebringer tungelipase i slike kommersielt brukbare mengder ved at den fremstilles i samsvar med oppfinnelsen under anvendelse av rekombinante DNA-metoder.

I henhold til et første aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes et tunge-lipaseprotein for bruk ved behandling av lipasemangel .

Som anvendt heri betegner betegnelsen "tunge-lipaseprotein" en autentisk mammal tungelipase eller en autentisk mammal tunge-lipase modifisert eller substituert til å gi et funksjonelt ekvivalent protein. Tunge-lipaseproteinet kan f.eks. inneholde en mammal tungelipase med en N-terminal med tionin- aminosyrerest (et metionin-tunge-lipaseprotein). Foretrukket er tunge-lipaseproteinet et humant eller rotte-tunge-lipaseprotein.

Tunge-lipaseproteinet fremstilles fordelaktig ved hjelp av en rekombinant DNA-metode.

Ved et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et metionin-tunge-lipaseprotein omfattende at proteinet fremstilles i en vert-organisme som er transformet med et vektor som inkluderer et gen som koder for metionin-tunge-lipaseproteinet. Foretrukket er vert-organismen en bakterie (f.eks. E.coli) eller en gjær (f.eks. Saccharomyces cerevisiae).

Ved et tredje aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et tunge-lipaseprotein omfattende at det fremstilles et tungelipase-forløper-protein i en vert-organisme transformert med en vektor som inkluderer et gen som koder for forløper-proteinet og forløper-proteinet spaltes for å frembringe tunge-lipaseproteinet.

Foretrukket er tunge-lipase-forløper-proteinet et pre-tunge-lipaseprotein og vert-organismen er en vert-organisme som kan spalte pre-tunge-lipaseproteinet for å fremstille tunge-lipaseproteinet. Mest foretrukket spalter vert-organismen pre-tungelipasen og kan sende ut tunge-lipaseproteinet til dyrkningsmediet.

Ved en alternativ utførelsesform av det tredje aspekt av oppfinnelsen er forløper-tunge-lipaseproteinet et fusjonsprotein omfattende et heterologt protein og et tunge-lipaseprotein. Det heterologe protein kan utgjør det hele eller en del av et protein som er i stand til produksjon, ønskelig i store mengder, i vert-organismen. Passende inkluderer slike proteiner /3 -galaktosidase og produktet av trpE-genet. Fusjonsproteinet inkluderer foretrukket et sete som kan underkastes selektiv kjemisk eller enzymatisk spaltning mellom det heterologe protein og tunge-lipaseproteinet. Det heterologe protein kan være en gjær-signalsekvens og vert-organismen kan være gjær. Ved denne foretrukne utførelsesform spalter gjær-vert-organismen fordelaktig fusjonsproteinet for å frembringe et ferdig tunge-lipaseprotein.

Ved et fjerde aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et pre-tunge-lipaseprotein.

Ved et femte aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et metionin-tunge-lipaseprotein.

Ved et sjette aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et fusjonsprotein omfattende et heterologt protein og et tunge-lipaseprotein .

Ved et syvende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et gen som koder for i det minste aminosyresekvensen av et tunge-lipaseprotein. Foretrukket koder genet for et protein av det fjerde, femte eller sjette aspekt av oppfinnelsen. Det tilveiebringes videre et gen som koder for i det minste aminosyrene i rotte-tungelipase som vist i fig. 5 i de vedføyde tegnigner.

Ved et åttende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en vektor som inkluderer et gen av det syvende aspekt av oppfinnelsen. Vektoren er tilpasset for bruk i en gitt vert-organisme ved tilveiebringelse av egnede selekterbare markører, promotere og andre kontrollregioner etter behov.

Ved et niende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en vert-organsime transformert med en vektor i henhold til det åttende aspekt av oppfinnelsen. Vert-organismen kan være en hvilken som helst organisme som kan transformeres ved hjelp av en vektor som inkluderer et gen som koder for et tunge-lipaseprotein slik at uttrykking av genet skjer. Paasende slike vert- organismer inkluderer bakterier (f.eks. E.coli), gjærarter (f.eks. Saccharomyces cerevisiae) og mammalceller i vevkul-turer. Foretrukket, hvor vert-organismen er en bakterie eller en gjær inkluderer vektoren et gen som koder for metionin-tungelipase eller et fusjonsprotein og når vert-organismen er en mammalcelle i vevkultur inkluderer vektoren foretrukket et gen som koder for pre-tungelipase.

Ved et tiende aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et antistoff med spesifisitet for en antigenisk determinant av et tunge-lipaseprotein. Antistoffet kan være et polyklonalt eller monoklonalt antistoff, men er foretrukket et monoklonalt antistoff. Antistoffet kan merkes med en detekterbar markør, f.eks. en radioaktiv isotop for bruk ved immuno-bestemmelse.

Ved et ellevte aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et farma-søytisk preparat omfattende et tunge-lipaseprotein og et far-masøytisk tålbart tilsetningsmiddel. Foretrukket er lipaseproteinet en human- eller rotte-tungelipase fremstilt ved fremgangsmåte i henhold til det annet eller tredje aspekt av oppfinnelsen. Det farmasøytiske preparat tilveiebringes for bruk ved behandling av lipsemangel. Foretrukket sammensettes preparatet for oral tilførsel. Preparatet kan foreligge i enhets-doseringsform, f.eks. som en tablett, kapsel eller dragee .

For fremstilling av en enhets-doseringsform, kan tungelipasen i en passende form blandes med en fast pulverformet ikke-farmasøytisk aktiv bærer som laktose, sakkarose, sorbitol, manitol, stivelse, cellulose-derivater eller gelatin eller hvilket som helst annet slikt tilsetningsmiddel . Et smøre-middel som magnesiumstearat, kalsiumstearat eller polyetylen-glykolvoks kan tilsettes. Det resulterende preparat kompri-meres til å danne en enhets-doseringsform. Enhets-doseringsformen kan være belagt med en konsentrert sukkeroppløsning som kan inneholde tilsetningsmidler som talkum, titandioksyd, gelatin eller gummiarabikum. Enhets-doseringsformen kan være belagt med lakk. Fargestoffer kan tilsettes belegget for å lette identifisering av enhets-doseringsformen. Myke eller harde kapsler kan anvendes for inkapsling av tungelipase som et flytende eller fast preparat.

Alternativt kan tungelipasen sammensettes til en flytende form. For fremstilling av en flytende form av preparatet kan tungelipasen i en egnet form tilsettes en flytende bærer. Bæreren kan f .eks. være en sirup eller suspensjon. Den flytende form kan inneholde fargeforbindelser, aromaforbindelser, søtnings-forbindelser og/eller fortykningsmiddelforbindelser.

Ved et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat omfattende at man bringer et tunge-lipaseprotein i forbindelse med en farmasøytisk tålbar bærer. Ved enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for behandling av lipasemangel omfattende tilførøing av en effektiv mengde av et tunge-lipaseprotein.

I den etterfølgende beskrivelse angis en forskrift for fremstilling av tungelipase under anvendelse av rekombinant DNA teknikk, under henvisning til følgende tegninger: Fig. 1 - viser en SDS polyakrylamingel av renset rotte-tunge- lipase, Fig. 2 - viser en SDS polyakrylamingel fra behandling av ren set rotte-tungelipase med Endonuclease H, Fig. 3 - viser et restriksjons-setekart for plasmid pLLlO, Fig. 4 - viser et restriksjonskart av rotte LL DNA (4a), inn-retting av rotte LL protein med DNA sekvensen (4b), og DNA sekvensen (med relaterte aminosyrer) av /3 -galaktosidase/pre-tungelipase-genmøtested (4c) , Fig. 5 - viser DNA sekvensen av rotte-pre-tungelipasegen og Fig. 6 - viser en SDS plyakrylamidgel som viser fremstilling av et pre-tungelipase//3-galaktosidase-fusjonsprotein med pLLlO.

Den anvendte strategi er først å rense tunge-lipase fra rotte-tunge (en mer rikelig og greiere kilde for enzymet enn mennesketunge). Det rensede rotteenzym ble underkastet en terminal aminosyre sekvensering, strukturell karakterisering og et polyklonalt antiserum ble dannet. Rotteenzymet ble klonet ved seleksjon av en uttrykt cDNA samling avledet fra von Ebner's kjertler i rotter (en rikeligere kilde for mRNA enn human tungevev) med rotte-polyklonalt antiserum. Den fullstendige nukelinsyre/proteinsekvens i rotte-tungelipase ble bestemt. Den følgende beskrivelse beskriver hvorledes rotteenzym-klonet uttrykkes i en passende mikroorganisme eller dyrecelle i vevkultur og det fremstilles en rekombinant rotte-tungelipase. Også beskrevet er fremgangsmåten hvormed human tunge-lipasegen klones, uttrykkes og en rekombinant human tunge-lipase fremstilles.

1. Rensing av tunge-lipaseenzym fra von Ebner's kjertler i rotter

Fullstendige tunger ble fjernet fra nyavlivede rotter og von Ebner's kjertel ble fjernet ved disseksjon. Omtrent 600 kjertler ble homogenisert og avfettet ved ekstraksjon med organiske løsningsmidler og en uren vakuumtørket pulvereks-trakt fremstilt som beskrevet av Verger, R. et al (1969) Biochim. Biophys. Acta. 188, sidene 272-282. En uren lipase-rik krem ble fremstilt hovedsakelig som beskrevet av Verger

(1969) og Melius, P. et al (1965) Biochim. Biophys. Acta. 105 60 med visse modifikasjoner, dvs. det initiale pulver ble sus-pendert i 2% (volum/volum) "Triton X100", 0,15M NaCl sammen med proteinase inhibitorer og renset ved sentrifugering før ekstraksjon med butanol-ammoniumsulfat. Kremen ble ekstrahert med 50 mm natriumacetat pH 5 (inneholdende proteinase inhibitorer og "Triton X100"). Suspensjonen ble dialysert mot prøvebuffer minus "Triton X100" og renset ved sentrifugering for fremstilling av en rå ekstrakt. Denne rå ekstrakt ble kromatografert på "CM-Sepharose CL6B" og eluert med 0-0,7M NaCl gradient i 50mM natriumacetat pH 5 . En enkelt topp for lipaseaktivitet eluerte med omtrent 0,27M NaCl og ble samlet, konsentrert og underkastet gelfiltrering på "Sephadex G150" i 50mM natriumacetat. En enkelt topp for lipaseaktivitet eluerte ved omtrent 1,7 ganger tomromsvolum. Prøver av fraksjoner inneholdende lipaseaktivitet ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE elektroforese og preparatet ble lagret ved -20°C.

Den lipolytiske aktivitet av enzymet ble målt under hele renseprosedyren. Tungelipase ble målt i det sure pH-området under anvendelse av en rekke forskjellige triglyceridsubstrat-er ved hjelp av teknikken med lipid-monolag utbredelse som beskrevet av Verger R. og Patton, F. (1982) Chemistry and Physics of Lipids 30, sidene 189-227, bruken av en potensio-metrisk teknikk (Verger et al (1969)), eller alternativt en radiaobestemmelse under anvendelse av tO trioleinsubstrat som beskrevet av Hamosh et al (1979), J. Biol. Chem. 254, sidene 12121-12125.Radiobestemmelsen ble modifisert ved in-klusjon av emulgert vannfri glycerol som beskrevet av Patton et al (1982) Biochim. Biophys. Acta 712, sidene 400-407 og ekstraksjon av fri fettsyrer i 0,1 N glycin pH 12,5 og organisk fase beskrevet av Belfrage og Vaughan (1969) J. Lipid. Res. 10, side 341.

De initiale ekstraksjonsprosedyrer som er beskrevet i det

foregående var tilfredsstillende ved at de rutinemessig gjen-vant mer enn 50% av den initale lipaseaktivitet i den avfett-ede ekstraherte krem. De kromatografiske trinn ble imidlertid av lave endelige lipaseaktivitetsutbytter (omtrent 10%) og tungelipase med variabel renhet mellom porsjonene.

Ved analyse med SDS-PAGE elektroforese inneholdt individuelle preparater av det endelige produkt mellom 10 og 90% av en enkel polypeptidkjede som vandret med en tilsynelatende molekylvekt på 52000 (nær den anslåtte molekylvekt av rotte-tunge-lipase (Fields, R.B. et al (1983)).

Renseprosessen ble derfor forbedret ved erstatning av de ovennevnte kromatografiske trinn med en enkel immuno-renseprose-dyre under anvendelse av et polyklonalt kanin-antirotte-tunge-lipaseantistoff koblet til "Sepharose".

Rotte-tungelipase ble delvis renset ved kromatografering på "CM Sepharose C16B" og gelfiltrering på "Sephadex G150" (som beskrevet i det foregående). 100^ug av et preparat bestå-ende av omtrent 90 vekt% protein med en molekylvekt på omtrent 52000 ble opptatt i 1 ml fullstendig Freund's tilsetningsmiddel og injisert i en kanin. Etter 14 døgn ble podingen gjen-tatt under anvendelse av ufullstendig Freund's tilsetningsmiddel. Kaninen ble tappet for blod for å fremstille antiserum etter 28 til 30 døgn og deretter med 30 døgns mellomrom. Innholdet av antiserum ble bestemt ved standardimmunologiske prosedyrer.

Immunoglobuliner ble utfelt fra kanin-antirotte-tungelipase-antiserum med høyt innhold med fast natriumsulfat (18% vekt/ volum) , oppløst på nytt i 0,1M natriumbikarbonat pH 9 og dialysert grundig mot den samme buffer. Immunoglobulinene ble koblet til bromcyan-aktivert "Sepharose" (Pharmacia) i henholc til fabrikantens instruksjoner. Affinitets-adsorpsjonsmidlet ved blokkering med IM etanolamin (innstilt til pH 8) i to timer ved romtemperatur, vasket med bikarbonat og acetat-buffere og lagret i 0,02% (vekt/volum) natriumacid ved 4°C til bruken.

Proteiner oppløseliggjort fra den lipaserike krem (som beskrevet i det foregående) ble tilført en kolonne fylt med rotte-anti-tungelipase-"Sepharose". Kolonnen ble vasket med fosfatbuffret saltløsning og 0,1M NaCl i fosfatbufferets saltløsning. Bundet protein ble eluert i 0,1M glycin HC1 pH 2,3 og dialysert mot 50mM ammoniumacetat pH 5, frysetørket og lagret som et pulver ved -20°C. Denne prosedyre frembragte ren rotte-tungelipase med en molekylvekt på omtrent 52000 be-dømt av SDS-PAGE elektroforese. Bruken av denne immunoab- sorpsjonsmiddelkolonne forbedret sterkt utbyttet, renheten og reproduserbarheten ved renseprosedyren. Omtrent 100^ug av elektroforetisk rent rotte-tungelipase ble oppnådd pr. rotte-tunge med en spesifikk aktivitet på omtrent 500 enheter/mg (enhet = mikromol fettsyre dannet pr. min. ved 37°C).

2. Karakterisering av autentisk rotte- tungelipase

2. 1 Bestemmelse av molekylvekt av rotte- tungelipase

Rotte-tungelipase, renset til homogenitet ved hjelp av immuno-affinitets-kromatografering, ble underkastet elektroforese i SDS-polyakrylamidgeler (Laemmli (1970) Nature 227, sidene 680-685) i nærvær av flere proteiner med kjent molekylvekt. 5^ug rotte-tungelipase ble innført i en 7,5% (vekt/volum) akrylamidgel. Proteinene ble gjort synlige ved hjelp av Coomassie Blue fargestoff og de resulterende geler er vist i fig. 1. En pil markerer posisjonen for vandring av enzymet i forhold til markørproteinene som omtrentlige molekylvekter er kjent for. Enzymet vandret som et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 52000. Gelfiltrering av uren tunge-lipase på "Sephadex G150" resulterte i en beregnet molekylvekt omtrent i samsvar med den som oppnås ved hjelp av polyakrylamid-gelelektroforese. En molekylvekt på 51000 er blitt an-slått av Field et al (1983) under anvendelse av gelfiltrering på "Saphadex G200". Det konkluderes derfor at den rensede rotte-tungelipase er aktiv som en monomer med molekylvekt omtrent 52000.

2. 2 Bestemmelse av nærvær av glykosylering i rotte- tungelipase

Nærvær av asparagin-tilknyttet N-glykosylering ble etablert ved behandling av renset rotte-tungelipase med Endpglykosidase H (Endo-^3-N-acetylglukosaminidase H) fra streptomyces plicatus. En 1 mg/ml oppløsning av rotte-tungelipase i 50mM natriumacetat pH 5,5, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10^uM pepstatin A inneholdende 50 enheter/ml Endoglykosidase H ble inkubert ved 37°C. Alternativt ble rotte-tungelipase kokt i 0,4% (vekt/volum) SDS og fortynnet til 0,1% (vekt/volum) SDS før inkubasjon som ovenfor. I begge tilfeller ble behandlings-produktene fra rotte-tungelipase separert på SDS-PAGE (7,5%)

(vekt/volum) akrylamid) og gjort synlige ved hjelp av Western Blot analyse (Burnette, W.N. (1981) Analyt. Biochem. 112, sidene 195-203) under anvendelse av kanin-antirotte-tunge-lipase-antiserum. Behandling av rotte-tungelipase (molekylvekt omtrent 52000) resulterte i utvikling av en rekke former med lavere molekylvekt med en minste molekylvekt på omtrent 41000 (fig. 2). Endoglykosidase H behandling resulterte i fjernelse av N-tilknyttede karbohydrat-deler fra glykoprotein-enen inneholdende disse rester. Denne spaltning frembringer en tilsynelatende nedsettelse av rnolekylvekten av det deglykosylerte protein. Denne nedsettelse av rnolekylvekten kan syn-liggjøres ved øket mobilitet av det deglykosylerte protein på SDS-PAGE. At Endoglykosidase-behandling av rotte-tungelipase medfører en tilsynelatende nedsettelse av rnolekylvekten fra 52000 til 41000 indikerer at omtrent 20% av enzymet (vekt-basis) består av karbohydrat).

2. 3 N- terminal aminosyresekvens og total aminosyre- sammenset-ning av rotte- tungelipase

Den N-terminale aminosyresekvens av renset rotte-tungelipase ble bestemt ved hjelp av metoden til Smith, M.A. et al (1982) 207, sidene 253-260.

N- terminal aminosyresekvens av rotte- tungelipase

1 10

Leu Phe Gly Lys Leu Gly Met GlyAsn Pro Glu Ala Asn Val Asn

20 30

Ile Ser Gin Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro - Gin Glu - Glu Val (en bindestrek indikerer at resten ikke er bestemt).

En delvis aminosyresammensetning ble bestemt ved hjelp av metoden til Campbell et al (1979) Biochem. J. 177, sidene 531-540 .

Cys og Trp ble ikke bestemt.

3. Kloning av rotte- tungelipase- genet

Von Ebner's kjertlerav nylig avlivede rotter ble skåret ut fra baksiden av tungene og ble frosset i flytende nitrogen (se Hamosh, M. et al (1979) J. Biol. Chem. 254, sidene 12121-12125). Kjertlene ble knust under flytende nitrogen og total mRNA ble ekstrahert under anvendelse av metoden med guanidin-ium-isotiocyanat (Maniatis et al (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory). Poly-adenylert RNA ble isolert ved hjelp av oligo-dT cellulose kromatografering (harris, T.J.R. og Wildly, P. (1975) J. Gen. Virol. 28, sidene 299-312) og mRNA integritet ble overvåket ved hjelp av in vitro translasjon i et retikulocytt-lysat (Pelham, H. og Jackson, R. ( 1976 ) Eur. J. Biochem 67, sidene 247-256). Enkelttrådet cDNA ble syntetisert hovedsakelig som beskrevet i Retzel, E.R. et al (1980) Biochemistry 19, sidene 513-518, og ble konvertert til dobbelt-trådet cDNA ved hjelp av prosedyren beskrevet i Rose, J.K. og Gallione, C.T. (1981) J. Gen. Virol. 39, sidene 519-528). Produktene fra prosedyren ble behandlet med S^nuclease for å fjerne regioner som fremdeles var enkelt-trådet og ble behandlet med T^polymerase for å frembringe butt-ender (Maniatis et al, se ovenfor).

cDNA frembragt ved hjelp av den ovennevnte prosedyre ble separert i fire like fraksjoner. Fraksjon 1 ble behandlet med Sau 3A og fraksjoner 2, 3 og 4 ble ligert til henholdsvis Bel I, Barn HI og Bgl II linkere (Maniatis et al, se ovenfor). Det linkede DNA ble behandlet med Bel I, Barn HI og Bgl II og separert fra overskudd av linkere ved hjelp av Biogel A50 kromatografering. cDNA fra hver av fraksjonene ble innskutt ved hjelp av kohesiv endeligering (Maniatis et al, se ovenfor) i Barn HI setet av en serie av ekspresjonsvektorer bestemt for å produsere enten ^-galaktosidase eller trpE fusjons-polypep-tider i alle tre utlesningsrammer. /3 -galaktosidase-fusjons-vektorene er blitt beskrevet avRuther og Muller-Hill (1983) EMBO J. 2, sidene 1791-1794 og trpE fusjonsvektorer er beskrevet i internasjonal patentansøkning PCT/GB83/00172 publisert som WO 84/00380 den 2. februar 1984.

Den ligerte DNA ble transformert inn i E.coli, DHl celler ved hjelp av prosedyren til Hanahan, D. (J. Mol Biol. 166, sidene 557-580 (1983)). De resulterende rekombinante kolonier ble formert på nitrocellulosefiltere og deretter selektert som følger for kolonier som frembringer protein med rotte-tunge-lipase antigeniske determinanter. Koloniene ble lysert på filteret med 9M urea i lOmM Tris Hel pH 7,5, ImM EDTA i en kloroformmettet atmosfære. Celleavfall ble fjernet fra filterne ved grundig vasking i buffer inneholdende 160 mM NaCl, lOmM Tris HC1 pH 7,5. DNase ved 5^ug/ml ble anvendt for å fjerne DNA. Etter ytterligere vasking ble ikke-spesi-fikke bindesteder på filterne blokkert ved inkubasjon med vaskebuffer inneholdende 0,5% kasein.

Filterne ble inkubert med kolonisiden ned i vaskebufferen inneholdende i tillegg 0,1% "Triton X100", 0,1% SDS, ImM EDTA og omtrent 2^ug/ml IgG (renset fra kanin-antirotte-tunge-lipaseserum, se ovenfor). IgG-preparatet hadde på forhånd vært preabsorbert mot en total proteinekstrakt fra E.coli DHl. Grundig vasking ble så gjennomført for å fjerne ubundet IgG fra filterne som deretter ble inkubert med 1 ,uCi/ml protein

125

A merket med I. Filterne ble til slutt vasket med den

SDS og "Triton X100" holdige buffer beskrevet ovenfor og underkastet autoradiografi. Kolonier som fremstilte protein med rotte-tungelipase antigeniske determinanter ble analysert videre for nærvær av kolonede rotte-tungelipasesekvenser ved hjelp av teknikken med hybridseleksjon (Ricciardi, R.P. et al

(1979) Proe. Nati. Sei. (USA) 76, sidene 4927-4931).

Plasmidpreparater fra kandidatkolonier ble også selektert ved hjelp av delvis DNA sekvensanalyse av klonede DNA fragmenter. DNA fragmenter ble klonet for sekvensering i M13 vektorene mp8 og mp9 (J. Messing og J. Vieira (1982) Gene 19, sidene 269-276). Sekvensene ble bestemt ved hjelp av dideoksy-sek-venseringsmetoden (Sanger F.S. et al (1977), PNAS 74, side 5463; A.J.H. Smith (1980) Methods in Enzymology, Academic Press, 65 , side 500) under anvendelse av en syntetisk enkelt-trådet universell primer som hybridiserte til et område akkurat 3' til den klonede del.

Et plasmid, betegnet pLLlO, (fig. 3) ble identifisert inneholdende et DNA-innskudd på omtrent 1350 baser og var derfor i stand til å kode for den hele aminosyresekvens i rotte-tunge-lipase .

Plasmidet pLLlO er avledet fra plasmid pUR292 (Ruther og Muller-hill, se ovenfor). Den klonede pre-tungelipase (stiplet strek) er skutt inn i Barn HI-setet av pUR292.

Et restriksjons-endonucleasekart for pLLlO ble konstruert (fig. 4 a) og den fullstendige DNA-sekvens av innskuddet bestemt (fig . 5 ) .

I fig. 4 a er posisjonen for flere restriksjons-endonuclease-spaltningsseter i rotte-tungelipase DNA-sekvensen vist ved hjelp av piler. Nummerne under linjen vedrører basetallene gitt i fig. 5. Fig. 4 b viser innretning på linje av rotte-tungelipase-proteinet ved DNA-sekvensen. Nummerne over linj-jen vedrører aminosyretallene gitt i fig. 5. Posisjon +1 er den N-terminale rest av modnet tungelipase. Posisjon 377 er den Ct-terminale aminosyre av modnet protein. Aminosyrene -1 til -18 representerer den antatte rotte-tungelipase-signalsekvens ved å gå fra en met i posisjon -18. Fig. 4 c viser

jfB -galaktosidase/pre-tungelipase-sammenknytningssekvensen . I plasmidet pLLlO er kodeområdet av pre-rotte-tungelipase fusjo-nert via en 4 aminosyre-kodende linker til resten 1021 av

/3-galaktosidase. Figuren viser DNA og deriverte aminosyre-sekvenser ved sammenføringen av /^-galaktosidase og tunge-lipasegenene. Bokstaver over DNA-sekvensen indikerer den deriverte aminosyresekvens i dette området. Tall over aminosyre-kodebokstavene indikerer aminosyretallet i Jf$ -galaktosidase eller tunge-lipasegenet. Den nedre linje indikerer opp-rinnelsene av sekvensen.

I fig. 5 er vist DNA-sekvensen av kodingstråden av pre-tunge-lipase-genet. Tall under DNA-sekvensen reprsenterer basetal-let. Base 1 er vilkårlig anbragt 6 nucleotider oppstrøms fra ATG-kodonet av den antatte intierende met-rest. "<*>" indikerer stopp-kodonet TAA som etterfølges av en 3' u-translatert region og poly A sekvens. Bokstaver umiddelbart over basene representerer den deriverte aminosyresekvens under anvendelse av den konvensjonelle enkeltbokstav-aminosyrekode (d.v.s.

A = alanin, R = arginin, N = asparagin, D = aspartinsyre, C = cysteinsyre, E = glutaminsyre, Q = glutamin, G = glycin, H = histidin, I = isoleucin, L = leucin, K = lysin, M = metionin, F = fenylalanin, P = prolin, S = serin, T = treonin, W = tryptofan, Y = tyrosin og V = valin) .

Understrekede bokstaver over den deriverte aminosyresekvens representerer den N-terminale aminosyresekvens som oppnås direkte fra renset rotte-tungelipase. Aminosyrer i hakeparente-ser representerer avvikelser mellom aminosyresekvensen deri-vert ved hjelp av DNA-sekvensering og den som oppnås ved aminosyresekvensering av renset tungelipase. Åpne rom i den direkte oppnådde aminosyresekvens representerer ubestemte aminosyrer. Aminosyrer -18 til —1 representerer en antatt signalsekvens og + 1 til 377 representerer aminosyresekvensen av det modnede protein. Stiplet understrekning indikerer den mulige glykosyleringssekvens omkring en asparaginrest.

Aminosyresekvensen forutsagt fra DNA-sekvensen indikerer at moden tungelipase består av et 377 aminosyreprotein (avsluttes med et stopp-kodon) (fig. 5). Den forutsagte molekylvekt av dette modne protein er 42,564 som er i nært samsvar med rnolekylvekten bestemt for det deglykosylerte enzym ved hjelp av SDS-PAGE. Den totale aminosyresammensetning av det modnede enzym forutsagt fra DNA-sekvensen sammenlignes med den som oppnås direkte fra det isolerte protein i tabell 1. Moden tungelipase inneholder fem mulige seter for glykosylering (av den generelle form Asn X Thr eller Ser). Rotte-tungelipase er 72 aminosyrer kortere enn svine-pankreatisk lipase og har liten sekvenshomologi eller aminosyresammensetning i likhet med dette enzym. Nær homologi foreligger imidlertid mellom rotte-tungelipase og svine-pankreatisk lipase i området av essentiell serin-152 i svine-pankreatisk lipase. Dette serin tenkes å delta i den interfasiale fiksering av pankreatisk lipase til lipid (Guidoni, A. et al 1981, Biochim, Biophys. Acta. 660, sidene 148-150) og reagerer med micellært dietyl-p-nitrofenylfosfat (Rouard, M. et al 1978, Biochim, Biophys.

Acta. 530, sidene 227-235). Det er tilstede i sekvensen:

152

Gly - His - Ser - Leu - Gly svine-pankreatisk lipase og

i en nær ekvivalent posisjon i den primære aminosyresekvens: 153

Gly - His - Ser - Gin - Gly rotte-tungelipase.

Et annet likhetspunkt nær denne essentielle serin-rest er den enkle glykosyleringsposisjon i svine-pankreatisk lipase (Asn-166) som viser å være tilstede som Asn-166 i rotte-tunge-lipase .

4 . Uttrykking av rotte-pretungelipase i E. coli som et fusjonsprotein med / 3- galktosidase

Kulturer oppnådd over natten av E.coli inneholdende pUR292 og pLLlO plasmider ble dyrket i L-væske pluss ampicillin ved 37°C. 1 ml prøver ble overført til 100 ml L-væske pluss ampicillin og dyrket ved 37°C i 5 timer til en OD^qq på omtrent 1,0. Kulturen ble avkjølt på is og celler samlet ved sentrifugering ved 4°C. Prøver av celler ekvivalent med 1 til 0,01 optisk densitetsenhet (ved 600 nanometer) ble kokt i SDS-mercaptoetanolprøve-buffer, påført en 5% polyakrylamid SDS gel og farget med Coomassie Blue fargestoff (fig. 6a). Bane 1 viser E . coli proteiner med høy molekylvekt fra celler inneholdende pUR292. Bane 2 viser totale proteiner fra celler inneholdende pLLlO. Et stort bånd omfattende 5-10% av total E . coli protein er synlig i bane 2 som vandrer med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 160,000 (nær /3 -subenheter av E . coli RNA-polymerase (omtrent 160,000 molekylvekt). Dette bånd er ikke synlig i celler inneholdende pUR292. Molekyl-vekten av tungelipase//3-galaktosidase-fusjonsprotein (forutsagt 'Tor DNA-sekvensen i tungelipase og den kjente molekylvekt av ^3-galaktosidase) er omtrent 160,000.

Proteinet uttrykt fra pLLlO har derfor en lignende molekylvekt som forutsagt for fusjonsproteinet.

Dette ble bekreftet ved hjelp av Western blot analyse av en lignende polyakrylamidgel (fig. 6b). Baner 1, 2, 3, 4 inneholder totale proteiner ekstarhert fra 1, 0,5, 0,1 og 0,01 ODgQQenhet henholdsvis av E. coli/pLLlO. Bane 5 inneholder totale proteiner fra 1 OD60Q<e>nhet av E. coli/pUR292. Baner 6 og 7 inneholder omtrent 1^ug renset autentisk rotte-tungelipase. Som det kan sees fra baner 1-4 detekteres et hovedprotein med en molekylvekt på omtrent 160,000 sammen med flere proteiner med lavere molekylvekt. Ingen immunoreaktive proteiner detekteres i en ekstrakt fremstilt fra pUR292 (bane 5). Prøver av rotte-tungelipase renset fra rotte-tunge reagerer også med antiserumet (bane 6, 7). Det konkluderes derfor at rotte-tungelipase er blitt uttrykt i høye nivåer i E. coli som et fusjonsprotein med fø -galaktosidase. 5. Uttrykking av rotte-tungelipase i (1) E.coli, (2) gjær, ( 3) Vevsdyrkede dyreceller

5. 1. E . coli

Plasmid-vektorer for uttrykking av moden rotte-tungelipase konstrueres basert på pCT54 (Emtage, J.S. et al PNAS U.S.A.

(1983), 80, sidene 3671-3675). Disse vektorer inneholder trp promoteren, optimalisert Shine-Delgarno ATG basesekvens foretrukket inntil (Met)-tungelipasegenet. Passende konstruksjon av disse vektorer vil også uttrykke pre-tungelipase eller et fusjonsprotein av trpE genprodukt og tungelipase eller pre-tungelipase. E . coli inneholdende disse plasmider frembringer ved dyrkning under optimale betingelser for lipaseuttrykking met-tungelipase, pre-tungelipase eller et fusjonsprotein i nivåer opp til 10% av totalt cellulært protein. Nærværet av enzymet i rå ekstrakter av totale celler bekreftes og kvantifiseres ved hjelp av gel-sveiping og immuno-utfelling (Emtage et al (1983) Proe.Nati.Acad. Sei. (U.S.), 80, sidene 3671- 3675).

En oppløselig proteinfraks jon fra rå E . coli ekstrakter bestemmes med hensyn til lipolytisk enzymaktivitet ved hjelp av metodene beskrevet i det foregående. En del eller hele enzymet uttrykt i E . coli kan være i en uoppløselig inaktiv form og detekteres derfor ikke ved den ovennevnte bestemmelse. Under slike omstendigheter oppløseliggjøres og aktiveres enzymet før bestemmelse og rensing som beskrevet i forhold til chymosin-produksjon i internasjonal patentansøkning PCT/GB83/00152 (publiseres som WO 83/04418) og i publisert britisk patentan-søkning GB 2100737A. Etter å ha oppnådd oppløselig, aktivt, delvis renset enzym ved hjelp av de ovennevnte metoder renses enzymet videre som beskrevet i det foregående eller ved å anvende andre standard protein-rensemetoder.

5. 2 Gjær

Plasmid-vektorer for uttrykking av moden rotte-tungelipase konstrueres basert på vektorer beskrevet i publisert euro-peisk patentansøkning EP-A2-0073635 . Disse vektorer inneholder gjær PGK promoteren og PGK genet 3' ende-flankesekvenser som sandwich-dekker en (met) tungelipase, pre-tungelipase eller et fusjonsprotein mellom PGK og met-tungelipase eller pre-tungelipase. Gjær inneholdende disse plasmider frembring-es når den dyrkes under optimale betingelser for lipase uttrykking met-tungelipase, pre-tungelipase eller et fusjonsprotein i niåver opp til 10% av totalt cellulært protein. Uttrykt lipase kvantifiseres, bestemmes og renses som beskrevet i det foregående.

5. 3 Vevdyrkede animalske celler

Plasmid-vektorer for uttrykking av rotte-pre-tungelipase konstrueres basert på vektorer beskrevet av Pavlakis, G.N. og Hamer, D.H. (1983), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80, Sidene 397-401.

Disse vektorer inneholder metallo-tionin-genpromotere og ut-trykker pre-tungelipase. Enzymet fremstilt i dette system utskilles gjennom cellemembranen og kan bestemmes i og renses fra vev-dyrkingsmediet som beskrevet i det foregående.

6. Human- tungelipase

Metodene angitt i det foregående beskriver kloning, uttrykking og rensing av rotte-tungelipase. Lignende prosedyrer gjennom-føres for å oppnå det analoge enzym fra en human kilde.

Et cDNA klon av human-tungelipase oppnås ved å gå ut fra human-tunge mRNA. RNA fremstilles fra en prøve av human-tunge ved ekstraksjon med guanidinum isotiocyanat (Chirgwin, J.M. et al (1979). Biochemistry 18, side 5294). mRNA renses fra dette ved hjelp av oligo (dT) cellulose-kromatografering (Aviv, H. og Leder, P. (1972) PNAS 69, side 1408).

Første tråd cDNA syntese gjøres ved hjelp av oligo (dT) igang-satt revers transkripsjon (Retzel et al (1980) Biochemistry 19, sidene 513-518) under utvikling av DNA/RNA hybrider. Andre tråder syntetiseres ved innvirkning av RNase H, E. coli Polymerase I (stort fragment) og E. coli ligase som beskrevet (Gubler, V. og Hoffman, B. (1983) Gene 25, sidene 263-269) og dobbelt trådet cDNA hektes på poly (dC) (Villa-Komaroff et al

(1978) PNAS 75, side 3727). Påhektede fragmenter innføres i pBR322, spaltes og poly (dG) hektes ved Pst I-setet. Disse hybrider transformeres i E . coli DH1 som er kompetente for transformasjon og selekteres på agarplater for tetracyklin-resistens. Transformantene selekteres ved hjelp av koloni-hybridisering på nitrocellulose-sidefiltere (Hanahan, D. og Meselson, M. (1980) Gene 10, sidene 63-67). Hybridiserings-prøven er et DNA-fragment inneholdende kodingsregionen for rotte-tungelipase merket ved hjelp av nick-translation (Rigby, P.W.J, et al (1977) J. Mol. Biol. 113, side 237). Den humane tungelipase er tilstrekkelig homolog med rotte-tungelipase til å tillate deteksjon ved hjelp av DNA-hybridisering. Antatte human-tungelipase-kloner kartlegges hjelp av restriksjons-endonucleaser og underkastes DNA-sekvensering som beskrevet for rotte-tungelipase. Et full-lengde cDNA-klon av human-pre-tungelipase eller met-tungelipase uttrykkes i E . coli, gjærceller eller animalske celler som beskrevet ovenfor for rotte-tungelipase. Uttrykt human-tungelipase detekteres, bestemmes, karakteriseres og renses fra E.coli, gjærceller eller animalske celler i vevkultur som beskrevet ovenfor rotte-tungelipase.

Den foreliggende oppfinnelse er beskrevet bare ved hjelp av eksempler og detaljer-modifikasjoner kan gjøres innefor rammen og tanken for oppfinnelsen.

Claims (20)

1. Tunge-lipaseprotein for bruk ved behandling av lipasedeficiens .

2. Tunge-lipaseprotein som angitt i krav 1, karakterisert ved at tunge-lipaseproteinet er et humant tunge-lipaseprotein.

3. Tunge-lipaseprotein som angitt i krav 1, karakterisert ved at tunge-lipaseproteinet er et rotte-tungelipaseprotein.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et metionin-tunge-lipaseprotein , karakterisert ved å fremstille proteinet i en vert-organisme transformert med en vektor som inkluderer et gen som koder for metionin-tungelipaseproteinet.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et tunge-lipaseprotein, karakterisert ved å fremstille et tunge-lipaseforløper-protein i en vert-organisme transformert med en vektor inklusive et gen som koder for forløper-proteinet og spalting av forløper-proteinet for å fremstille tunge-lipaseproteinet .

6 . Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at tunge-lipaseforløper-proteinet er et pre-tungelipaseprotein og vert-organismen er en vert-organisme som kan spalte pre-tungelipaseproteinet til å fremstille tunge-lipaseproteinet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at vert-organismen er en mammalcelle i vevkultur.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at tunge-lipaseforløper-proteinet omfatter et heterologt protein og et tunge-lipaseprotein .

9. Tunge-lipaseprotein.

10. Metionin-tunge-lipaseprotein.

11. Fusjonsprotein omfattende et tunge-lipaseprotein og et heterologt protein.

12. Gen som koder for et protein omfattende i det minste aminosyresekvensen av et tunge-lipaseprotein.

13. Gen som angitt i krav 12, karakterisert ved at det koder for et protein som angitt i krav 1, 2, 3, 9, 10 og 11.

14. Vektor inkluderende et gen som angitt i krav 12 eller 13.

15. Vert-organisme transformert med en vektor i henhold til krav 14.

16 . Antistoff med spesifisitet for en antigenisk determinant av et tunge-lipaseprotein.

17. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et tunge-lipaseprotein og en farmasøytisk tålbar bærer.

18. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 17, karakterisert ved at tunge-lipaseproteinet er et tunge-lipaseprotein som angitt i krav 2 eller 3 fremstilt ved hjelp av prosessen i krav 4 eller 5.

19. Preparat som angitt i krav 17 eller 18 i enhets-dose-ringsf orm .

20. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 17 eller 18 i en flytende form.