JP2020182383A - シアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び/又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
[2]Neu5Ac、Neu5Gc及びKDNからなる群から選択される1種又は2種以上の基質に作用する、[1]に記載の酵素剤。
[3]α(2→3)結合、α(2→6)結合、α(2→8)結合及びα(2→9)結合のα−グリコシド結合したシアル酸残基の遊離活性を有する、[1]又は[2]に記載の酵素剤。
[4]さらに、至適pHが6.5以上7.5以下である、[1]〜[3]のいずれかに記載の酵素剤。
[5]糖鎖含有化合物を[1]〜[4]のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
[6]前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、[5]に記載の処理方法。
[7]前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記酵素剤で処理する工程である、[5]又は[6]に記載の処理方法。
[8]糖鎖含有化合物を[1]〜[4]のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記酵素剤で処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、
を備える、糖鎖特性の決定方法。
[9]糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を[1]〜[4]のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び/又は前記シアル酸残基脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。
[10]以下の(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを備える、シアリダーゼ発現ベクター。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び/又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
[11]シアリダーゼ発現キットであって、
[10]に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
(シアリダーゼ及び酵素剤)
本明細書において、シアリダーゼとは、O−グリコシド結合により結合したシアル酸残基を、O−グリコシド結合の加水分解により遊離させる酵素をいう。また、シアリダーゼ活性とは、O−グリコシド結合の加水分解によりシアル酸残基を遊離する活性をいう。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び/又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
本シアリダーゼは、例えば、以下(1)〜(3)のいずれか1つ以上のシアリダーゼ活性を有する。
(1)Neu5Ac、Neu5Gc及びKDNからなる群から選択される1種又は2種以上のシアル酸分子種を基質とする
(2)α(2→3)結合、α(2→6)結合、α(2→8)結合及びα(2→9)結合のα−グリコシド結合したNeu5Acの遊離活性を有する
(3)至適pHが6.5以上7.5以下である
(4)至適温度が25℃以上40℃以下である
本シアリダーゼの製造方法は、特に限定するものではなく、公知のタンパク質の製造方法によって取得することができる。例えば、Sphingobacterium属細菌などを培養して、本シアリダーゼを分離精製することができるほか、化学合成により取得することもできる。
本明細書によれば、シアリダーゼ発現ベクターのほか、シアリダーゼ発現ベクターを備える、シアリダーゼ発現キットも提供される。さらに、かかるキットは、シアリダーゼの発現などに適した大腸菌などの宿主細胞も備えることができる。さらにまた、この種の発現ベクターに用いる公知の他の試薬も適宜備えることができる。
本剤は、そのシアリダーゼ活性を利用して、糖鎖含有化合物の処理、糖鎖特性の決定及び糖鎖分解産物の生産方法等に利用することができる。本剤によれば、そのシアル酸分子種特異性、結合様式特異性及び至適pHにより、より種々の糖鎖に作用して、シアル酸分子種を遊離させ、シアル酸残基が脱離させた糖鎖を調製したり、脱離したシアル酸残基の解析により糖鎖特性を決定したり、脱離したシアル酸分子種を取得したりできる。また、シアル酸の遊離前(シアル酸修飾状態)と、シアル酸遊離後の糖鎖含有化合物又はその当該化合物を提示する細胞の生理的機能の相違から、シアル酸修飾の意義について新たな知見を得ることができる。
本明細書に開示される糖鎖の処理方法は、糖鎖含有化合物を本剤で処理する処理工程を備えることができる。本処理方法によれば、糖鎖含有化合物の有する糖鎖から効率的にシアル酸残基を遊離させて、シアル酸残基が除去された糖鎖含有化合物とすることができる。
本明細書に開示される糖鎖特性の決定方法(以下、単に、本決定方法ともいう。)は、糖鎖含有化合物を本剤で処理する処理工程と、本剤の処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、を備えることができる。ここで、糖鎖特性とは、糖鎖含有化合物の有する糖鎖の構成糖の組成や順序をいう。本決定方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様で実施することができる。また、本決定方法における検出工程は、特に限定するものではないが、例えば、処理工程後の反応液中のシアル酸残基などを、各種マススペクトロメトリー、各種のクロマトグラフィー、各種NMR、各種電気泳動により分離同定する工程とすることができる。なお、分離同定に先立って、あるいは同時に、分離後に、遊離したシアル酸残基を、蛍光標識などのシグナル要素が付加された又は付加可能に形成されたレクチンや特異的抗体と結合させてもよい。こうした、糖鎖のフィンガープリントについては、適宜公知の手法を適用することができる。
本明細書に開示される糖鎖分解産物の生産方法(以下、本生産方法ともいう。)は、糖鎖含有化合物を本シアリダーゼで処理する処理工程と、前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び/又は前記シアル酸残基脱離物を回収する回収工程と、を備えることができる。本生産方法における処理工程は、既述の本処理方法における処理工程と同様の態様を採ることができる。
本明細書に開示されるキットは、本シアリダーゼを備えることができる。本キットは、本シアリダーゼを用いて糖鎖含有化合物を処理し、糖鎖特性を決定し、又は、糖鎖分解産物を生産等に用いるためのキットである。本キットは、本シアリダーゼを備えるほか、その他のシアリダーゼを含む各種グリコシダーゼをさらに備えていてもよい。また、本キットは、そのほか、本キットの目的に応じて、遊離が予定されるシアル酸残基やシアル酸脱離後の糖鎖含有化合物に特異的に結合する標識されていてもよい抗体やレクチンなどを備えることもできる。本キットは、そのほか、糖鎖研究や糖鎖解析に適用される試薬やデバイスを備えることもできる。
配列番号1で表されるアミノ酸配列から分泌シグナルと推定される疎水性領域の配列(1〜19aa(1−57bp))を除いたアミノ酸配列に対応するcDNA配列(配列番号3)を準備した。このcDNA配列を、常法に従い、pET32aベクターにクローニングし、このベクターを用いてRosetta-gami2(DE3)(メルク株式会社)を形質転換し、LAプレート上でシングルコロニーを得た。シングルコロニーを5ml LA培地に植菌し、37℃、16時間振盪培養した。この培養液を200ml LA培地に全量移し、さらに37℃、2時間振盪培養を行いOD600が0.4付近になることを確認した。
96穴プレートであるマルチプレート96F(住友ベークライト、Tokyo)に10μlの各種0.5Mバッファを加えた。0.5Mバッファは、pH4.0〜6.0の範囲で酢酸ナトリウムバッファ、pH6.0〜8.0の範囲でHEPES−NaOHバッファ、pH8.0〜10.0の範囲でトリス−塩酸バッファを用いた。次に、40μlの反応溶液としてBSA(終濃度1ng/μl)、4MU−Neu5Acまたは4MU−KDN(終濃度20μM)、5.7ngの実施例1で調製したタグなしシアリダーゼ(以下、同じ)を加え、室温で30分間遮光しながら静置した。その後、50μlの0.25Mグリシン−NaOHバッファ(pH10.4)を加えて反応を停止させ、プレートリーダーEnspire(PerkinElmer, Waltham, MS, U.S.A.)を用いて、励起波長365nm、蛍光波長437nmの条件で遊離した4MUの蛍光を測定した。蛍光強度に基づく相対酵素活性の測定結果を図4に示す。
1.5mlエッペンドルフチューブに50μl反応溶液(0.1M HEPES−NaOH(pH6.5)、1ng/μl BSA、20μM 4MU−Neu5Acまたは4MU−KDN、3.8ngシアリダーゼ)を加え、遮光条件で30分、4、15、25、30、37、50℃で静置した。その後、50μlの0.25Mグリシン−NaOH緩衝液(pH10.4)を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長365nm、蛍光波長437nmの条件で遊離した4MUの蛍光を測定した。結果を図5に示す。
シアリダーゼ3.84ng、Arthrobacter ureafaciens(A.u.)シアリダーゼ62.5μunit、Clostridium perfringens(C.p.)シアリダーゼ667μunit、Vibrio cholera (V.c.)シアリダーゼ1munit、Streptococcus pneumoniae(S.p.)シアリダーゼ8unitを含む10μlを96穴プレートに加えた。なお、ユニットの定義は各社のデータシートの定義に基づく。各ウェルに40μl反応溶液(0.1M HEPES−NaOH(pH7.0)または0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、20μM4MU−Neu5Acまたは4MU−Neu5Gcまたは4MU−KDN)を加え、遮光条件下で30分、37℃で静置した。その後、50μlの0.25Mグリシン−NaOH緩衝液(pH10.4)を加え、プレートリーダーEnspireを用いて、励起波長365nm、蛍光波長437nmの条件で遊離した4MUの蛍光を測定した。結果を図6に示す。
基質として、α2,3−シアリルラクトサミン、α2,6−シアリルラクトサミン、α2,8−ポリシアル酸、α2,9−ポリシアル酸をそれぞれ5μg(Neu5Ac換算)用いた。各基質に対し、0.1M HEPES−NaOH(pH6.5)、1ng/ml BSA、1.92μgシアリダーゼを含む反応液を50μlになるように添加し、30℃、12時間反応させた。反応液から1μg分(シアル酸換算)をTLCプレート上にスポットし、5時間展開した(1−プロパノール:アンモニア水:水=6:1:2.5)。展開後、レゾルシノール試薬(2mg/mlレゾルシノール、9.6N濃塩酸、0.25mM硫酸化銅)を噴霧し、100℃以上で熱し、展開後のスポットを検出した。結果を図7に示す。
細胞培養ディッシュ(φ10cm)上でCHO細胞を80%コンフルエントになるまで培養した。細胞を冷やしたPBSで3回洗浄し、セルスクレイパーにより細胞をはがして回収した。2,000g、5分、4℃の遠心分離により細胞を回収し、4%パラホルムアルデヒド中で8分、室温で静置し細胞膜を固定した。PBSで洗浄後、PBE(0.5%BSA、5mM EDTA含有PBS)でブロッキングを行った。次に19.2μg/mlとなるように実施例1で調製した組換え体シアリダーゼを添加し、37℃、30分間、揺らしながら反応させた。PBSで洗浄後、一次抗体として10μg/ml抗ポリシアル酸抗体(12E3)を添加し、30分、氷上で静置した。さらにPBSで洗浄後、二次抗体として抗マウスIgM抗体−Alexa488を添加し、30分、氷上で静置した。PBSで洗浄後、フローサイトメーターGallios(Beckman coulter,Tokyo)により細胞表面に抗ポリシアル酸抗体が結合した細胞数を計測した。シアリダーゼによる変化を見るため、シアリダーゼ処理をしていない細胞群、抗ポリシアル酸抗体の特異的な結合を見るため、二次抗体のみ添加した細胞群も同時に実施した。結果を図8に示す。
Claims (11)
- 以下の(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有する酵素剤。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び/又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質 - Neu5Ac、Neu5Gc及びKDNからなる群から選択される1種又は2種以上の基質に作用する、請求項1に記載の酵素剤。
- α(2→3)結合、α(2→6)結合、α(2→8)結合及びα(2→9)結合のα−グリコシド結合したシアル酸の遊離活性を有する、請求項1又は2に記載の酵素剤。
- さらに、至適pHが6.5以上7.5以下である、請求項1〜3のいずれかに記載の酵素剤。
- 糖鎖含有化合物を請求項1〜4のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程、を備える、糖鎖の処理方法。
- 前記糖鎖含有化合物は、糖タンパク質及び糖脂質から選択される、請求項5に記載の処理方法。
- 前記処理工程は、細胞表面に提示される前記糖鎖含有化合物を前記酵素剤で処理する工程である、請求項5又は6に記載の処理方法。
- 糖鎖含有化合物を請求項1〜4のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記酵素剤で処理によって脱離したシアル酸残基を検出する検出工程と、
を備える、糖鎖特性の決定方法。 - 糖鎖分解産物の生産方法であって、
糖鎖含有化合物を請求項1〜4のいずれかに記載の酵素剤で処理する処理工程と、
前記処理工程によって生じるシアル酸残基及び/又は前記シアル酸残基脱離物を回収する工程と、
を備える、生産方法。 - 以下の(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質を含むシアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを備える、シアリダーゼ発現ベクター。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及及び/又は付加されたアミノ酸を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質 - シアリダーゼ発現キットであって、
請求項10に記載のシアリダーゼ発現ベクターを備える、キット。
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NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION: ""exo-alpha-sialidase[Sphingobacterium sp. HMA12] ", WP_104384225,", [ONLINE], 2018年02月22日掲載, 2022年10月28日検索, インターネット, JPN6022052324, ISSN: 0005063411 * |
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