JP2008512117A - 新規の治療タンパク質ベースの分子クラス - Google Patents

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Abstract

【課題】
【解決手段】
本発明は、病原体感染の防止及び治療のための新規の組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、標的細胞の表面に化合物をアンカーするアンカードメイン及びウイルス等の病原体による標的細胞の感染を防止するように細胞外で作用することができる治療ドメインを有する化合物を提供する。本発明はまた、シアリダーゼ活性を有する治療組成物（シアリダーゼ触媒ドメインを有するタンパク質ベースの化合物が含まれる）を含む。本発明の化合物を、病原体感染の治療又は防止、並びにアレルギー反応及び炎症反応の治療及び軽減のために使用することができる。本発明はまた、組換えウイルスによる標的細胞の形質導入を強化するための組成物及び方法を提供する。このような組成物及び方法を、遺伝子治療で使用することができる。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、発明の名称が「新規の治療タンパク質ベースの分子クラス（Ｎｏｖｅｌ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」である、２００４年９月１０日出願の米国特許出願番号１０／９３９，２６２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
本発明はまた、以下の特許出願のその全体を参考として援用する：発明の名称が「広範囲の抗ウイルス治療薬及び予防薬（Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」である、２００３年１１月２１日出願の米国特許出願番号１０／７１８，９８６号、発明の名称が「広範囲の抗ウイルス治療薬及び予防薬（Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」である、２００２年１１月２２日出願の米国特許出願番号６０／４２８，５３５号、発明の名称が「広範な抗ウイルスタンパク質クラス（Ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」である、２００３年４月１９日出願の米国特許出願番号６０／４６４，２１７号、発明の名称が「抗菌治療薬及び予防薬（Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」である、２００４年４月１３日出願の米国特許出願番号６０／５６１，７４９号、発明の名称が「広範囲の抗菌薬クラス（Ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ）」である、２００４年６月１６日出願の米国特許出願番号６０／５８０，０８４号。
発明の背景
本発明は、ヒト及び動物被験体の病原体による感染を予防及び治療するために使用することができる治療組成物、具体的には、ウイルス感染及び細菌感染の防止及び治療のために使用することができるタンパク質ベースの治療組成物に関する。本発明はまた、アレルギー反応及び炎症反応を防止又は改善するために使用することができるタンパク質ベースの組成物に関する。本発明はまた、遺伝子治療のために使用される組換えウイルス等の組換えウイルスの形質導入効率を増加させるためのタンパク質ベースの組成物に関する。
インフルエンザは、古代より人類を苦しめてきた感染性の強い急性呼吸器疾患である。インフルエンザは、毎年再発し、周期的な広範囲にわたる世界的規模の流行病であることを特徴とする。この疾患による罹患率及び死亡率が高いので、インフルエンザの直接的、及び間接的な社会経済的影響は甚大である。米国だけでも、この流行病により、毎年約３００，０００人が入院し、約２５，０００人が死亡している。この１世紀で４回流行し、合わせて１０００万人が死亡している。以前の流行に基づく数学モデルでは、次の流行で８９，０００人〜２０７，０００人が死亡し、１８００万人〜４２００万人が通院し、２０００万人〜４７００万人が罹患すると見積もられている（Ｍｅｌｔｚｅｒ，ＭＩ，Ｃｏｘ，ＮＪ ａｎｄ Ｆｕｋｕｄａ，Ｋ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ５：６５９−６７１）。
インフルエンザは、典型的には、２つのウイルス型（インフルエンザウイルスＡ型及びインフルエンザウイルスＢ型）の感染に起因する（第３の型であるインフルエンザウイルスＣ型は、少数の一般的な風邪様症状のみを引き起こす）。これらは、ＲＮＡウイルスのオルトミクソウイルス科に属する。Ａ型及びＢ型は共に、宿主細胞に由来する脂質エンベロープ中に封入された８つのセグメント化マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有する。ウイルスエンベロープは、以下の３つのタンパク質型から構成されるスパイクで覆われている：宿主細胞受容体にウイルスを付着させてウイルスと細胞膜との融合を媒介する血球凝集素（ＨＡ）；宿主細胞からの新規のウイルスの放出を促進するノイラミニダーゼ（ＮＡ）；及びイオンチャネルとしての機能を果たす少数のＭ２タンパク質。
インフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルスの感染は、典型的には、上気道の粘膜面で開始される。ウイルスの複製は、主に上気道に限定されるが、下気道に拡大して気管支肺炎を引き起こして死に至り得る。
インフルエンザウイルスタンパク質である血球凝集素（ＨＡ）は、主要なウイルスエンベロープタンパク質である。これは、ウイルス感染で不可欠な役割を果たす。ＨＡの重要性は、宿主免疫応答によって産生される防御中和抗体の主な標的であるという事実によって証明されている（Ｈａｙｄｅｎ，ＦＧ．（１９９６）Ｉｎ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｅｄ．Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ），ｐｐ．５９−７７．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．）。現在、ＨＡがウイルス感染において２つの異なる機能を有することが明らかである。第１に、ＨＡは、シアル酸細胞受容体へのウイルスの付着を担う。第２に、ＨＡは、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合を誘発することによって標的細胞へのウイルスの侵入を媒介する。
ＨＡは、前駆体タンパク質ＨＡ０として合成され、三量体分子複合体としてゴルジ装置によって細胞表面に輸送される。ＨＡ０は、更に切断されて、Ｃ末端のＨＡ１（ＨＡ０の残基３２８）及びＮ末端のＨＡ２が生成される。一般に、細胞表面又は放出されるウイルス上で切断されると考えられる。ＨＡＯのＨＡ１／ＨＡ２への切断はシアル酸受容体へのＨＡ結合に必要ない。しかし、ウイルス感染に必要であると考えられている（Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ，Ｒ．（１９８８）Ａｄｖ Ｖｉｒ Ｒｅｓ．３４：２４７−２８１；Ｋｉｄｏ，Ｈ，Ｎｉｗａ，Ｙ，Ｂｅｐｐｕ，Ｙ ａｎｄ Ｔｏｗａｔａｒｉ，Ｔ．（１９９６）Ａｄｖａｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ ３６：３２５−３４７；Ｓｋｅｈｅｌ，ＪＪ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，ＤＣ．（２０００）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９：５３１−５６９；Ｚａｍｂｏｎ，Ｍ．（２００１Ｊ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １１：２２７−２４１．）。
現在、インフルエンザは、ワクチン接種及び抗ウイルス化合物によって制御されている。不活化インフルエンザワクチンは、現在、世界中で使用されており、特に、高リスク群に使用されている。ワクチンウイルスを、ニワトリ受精卵中で成長させ、化学的手段によって不活化し、精製する。このワクチンは、通常、３価であり、代表的なインフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ１）及びインフルエンザＢ株を含む。このワクチン株は、効力を維持するために定期的に更新する必要があり、この更新は、世界保健機関（ＷＨＯ）で実施されている。通常、流行するまでに、更新されたインフルエンザワクチンを用意するのに８ヶ月かかる（Ｗｏｏｄ，Ｊ．（２００１）Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ ＬｏｎｄＢ ３５６：１９５３−１９６０）。しかし、歴史的に、流行病は６ヶ月以内にほとんどの大陸に拡大し、海外旅行の増加と共に流行病の拡大は更に加速すると予想される（Ｇｕｓｔ，ＩＤ，Ｈａｍｐｓｏｎ，ＡＷ．，ａｎｄ Ｌａｖａｎｃｈｙ，Ｄ．（２００１）Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １１：５９−７０）。従って、将来的に起こる流行の初期に有効なワクチンを利用できないか供給量が非常に少なくなることは避けられない。
抗ウイルス化合物は、汎流行間期の治療の要となっている。現在、これらは、ワクチンを利用できない初期の流行病の制御のための唯一の潜在的な代替法である。以下の２つのクラスの抗ウイルス化合物が現在販売されている：Ｍ２インヒビター（アマンタジン及びリマンタジン）及びＮＡインヒビター（オセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ））。両分子クラスは、インフルエンザの防止及び治療の有効性が証明されている。しかし、副作用及び薬物耐性菌が生成されるリスクが、依然として化学予防薬としての広範な使用における２つの主な懸念である（Ｈａｙｄｅｎ，ＦＧ．（１９９６）Ｉｎ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｅｄ．Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ），ｐｐ．５９−７７．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．）。最も重要なことは、更なる流行病株（生物兵器の遺伝子操作によって天然に、又は人為的に作製された株）は、全ての利用可能な抗ウイルス化合物に耐性を示す可能性があり、これが世界的に破滅的な結果をもたらす。
要約すれば、現在利用可能なワクチン接種及び抗ウイルス化合物は、いくつかの基本的な欠点によって制限されている。更なるインフルエンザ流行病に取り組むための新規の治療及び予防様式が必要である。
呼吸器感染症（ＲＴＩ）は、最も一般的且つ潜在的に最も重篤なインフルエンザ疾患型である。臨床的に、ＲＴＩには、副鼻腔炎、耳炎、喉頭炎、気管支炎、及び肺炎が含まれる。多数の病因学及び疫学的研究に基づいて、多数の微生物がＲＴＩを引き起こす可能性があり、有害な病原体のみが大部分の症例に関与することが明らかである。このような病原体には、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、ヘモフィルスインフルエンザ菌、カタル球菌、インフルエンザＡ型及びＢ型、並びにパラインフルエンザウイルスが含まれる。ＣＡＰ及びＡＥＣＢを引き起こすことに加えて、いくつかの細菌病原体（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びヘモフィルスインフルエンザ菌等）は、急性副鼻腔炎、中耳炎、並びに敗血症及び髄膜炎等を引き起こす侵襲性感染症の一般的な原因でもある。従って、これらの微生物は、臨床的に最も重要である。
全ての呼吸器病原菌の１つの共通の特徴は、これらが上気道の粘膜表面上に共生コロニーを形成することであり、このようなコロニー形成が進行して感染し、これが感染の必要条件である。新生児における細菌コロニー形成は、出生直後に起こる。一生涯、上気道（具体的には、鼻咽頭及び中咽頭）は、継続的にバクテリアが捕捉され、排除され、再捕捉される微生物種の動的な生態的貯蔵所であり続ける。ほとんどの場合、咽頭中の細菌叢は無害である。しかし、宿主の条件が変化した場合、いくつかの微生物が隣接組織又は血流に侵入して疾患を引き起こし得る。細菌及びウイルスの両方による粘膜感染及び侵襲性感染症の侵入口として作用するのに加えて、鼻咽頭は、個体間の病原微生物の主な拡散源及び抗生物質耐性菌が選択される貯蔵所でもある（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，（２００２）５０（Ｓｕｐｐｌ Ｓ２），５９−７３；Ｓｏｒｉａｎｏ ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｅｒｒａｔｏ，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，（２００２）５０ Ｓｕｐｐｌ Ｓ２，５１−５８）。ＲＴＩの傾向のある個体が病原菌の持続的及び再発性のキャリアになる傾向があることが臨床的に十分に確立されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，（２００２）５０（Ｓｕｐｐｌ Ｓ２），５９−７３；Ｍｂａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，（１９８７）１５３（２），１１１−１２１）。
ピロリ菌は、胃炎及び消化性潰瘍に関与するヒト病原体である。この細菌は、ヒトの胃に存在し、胃前庭部の上皮細胞に結合する。細菌付着がピロリ菌アドヘシンＩ及びＩＩの上皮表面上のシアル酸への結合によって媒介されることが証明されている。
シグレク（ｓｉｇｌｅｃ）（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）は、シアル酸に結合し、主に造血系細胞によって発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。少なくとも１１種のシグレクが発見されており、これらは、リガンドとして細胞表面シアル酸を排他的に認識するようである。シグレクのシアル酸への結合が細胞−細胞接着及び相互作用を媒介すると考えられている（Ｃｒｏｃｋｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１）２２（６），３３７−３４２；Ａｎｇａｔａ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎ−Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（２００２）１５７２（２−３），２９４−３１６）。シグレク８（ＳＡＦ−２）は、アレルギー状態（アレルギー性鼻炎、喘息、及び湿疹が含まれる）における中心的エフェクターである好中球、好塩基球、及び肥満細胞の表面に高度に限定される接着分子である。シグレク８は、３つのアレルギー細胞型の気道、肺、及び他のアレルギー部位への動員の媒介を担うと見なされる。シグレク１（唾液腺接着（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ））及びシグレク２（ＣＤ２２）は、マクロファージ及びＢ細胞の接着分子であり、両細胞型は、炎症を引き起こす免疫反応の中心的役割を果たす。
組換えウイルス、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、野生型嚢胞性線維症膜通過伝導制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を上皮細胞に導入し、嚢胞性線維症を引き起こす遺伝的欠損を修正することができる（Ｆｌｏｔｔｅ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９９８）２９２，７１７−７３２）。ＡＡＶベクターを使用した臨床試験により、低レベルの遺伝子導入でＣＦＴＲ遺伝子を上皮細胞に有効且つ安全に送達されることが示された（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，（１９９８）３５１（９１１７），１７０２−１７０３）。アデノウイルスベクターと比較して、ＡＡＶはより安定に遺伝子を発現し、細胞性免疫が減少する。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶの形質導入効率は、肺でむしろ低い（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，（１９９８）３５１（９１１７），１７０２−１７０３）。嚢胞性線維症の遺伝子治療で完全に治療できるようにするために、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶの形質導入効率を改善することができる方法が必要である。負電荷の炭水化物（シアル酸等）が十分に分化した気道上皮へのＡＡＶベクターの形質導入効率を抑制し、グリコシダーゼ（ノイラミニダーゼが含まれる）及びエンドグリコシダーゼＨによる気道上皮の治療によってＡＡＶベクターの形質導入効率が増強されることが示されている（Ｂａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９９９）７３（７），６０８５−６０８８）。
発明の要旨
本発明は、病原体による感染の防止及び治療のための現在の治療法が適宜得た様式で提供することがしばしば困難であり、望ましくない副作用を引き起こし、薬物耐性病原体株が生じ得ることを認識する。本発明はまた、現在のアレルギー及び炎症を治療するためのアプローチの有効性が制限されており、副作用に関連することを認識する。更に、本発明はまた、現在の組換えウイルスを投与するアプローチの形質導入効率が低く、遺伝子治療の有効性が不満足なものであることを認識する。
本発明は、病原体感染の防止及び治療のための新規の組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、病原体による細胞感染を防止するように細胞外で作用することができる化合物を提供する。本発明のいくつかの好ましい実施形態は、標的細胞の表面に化合物をアンカーするアンカードメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及びウイルス又は細菌等の病原体による標的細胞の感染を防止するように細胞外で作用することができる治療ドメインを有する治療化合物である。
１つの態様では、本発明は、病原体による感染を防止又は治療するためのタンパク質ベースの組成物を提供する。組成物は、ペプチド又はタンパク質を含む少なくとも１つの治療ドメインを含む化合物を含み、治療ドメインは、病原体による標的細胞の感染を防止することができる少なくとも１つの細胞外活性及び標的細胞の膜又は膜付近に結合することができる少なくとも１つのアンカードメインを有する。
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療ドメインは、病原体による標的細胞の感染を防止又は妨害する阻害活性を含む。好ましい実施形態では、阻害活性は、標的細胞の感染に必要なウイルスタンパク質を処理することができるプロテアーゼ活性を阻害する。特に好ましい実施形態では、化合物は、インフルエンザウイルスのＨＡドメインの処理を阻害することができる治療ドメインを含み、アンカードメインは気道上皮細胞の表面で化合物を結合することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの治療ドメインは、触媒活性を含む。好ましい実施形態では、触媒活性は、標的細胞の感染に必要な標的細胞表面由来の部分を除去する。特に好ましい実施形態では、治療ドメインは、上皮標的細胞表面上のシアル酸部分を消化することができるシアリダーゼであり、アンカードメインは、上皮細胞表面でヘパリン又はヘパラン硫酸部分に結合することができる非とタンパク質のＧＡＧ結合ドメインである。
別の態様では、本発明は、被験体の病原体感染を治療又は予防するための薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、少なくとも１つの治療ドメイン及び少なくとも１つのアンカードメインを含む本発明の化合物を含む。薬学的組成物はまた、溶液、安定剤、及び充填剤等を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物を、吸入薬として処方する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物を、鼻内噴霧として処方する。
本発明の別の態様は、少なくとも１つのシアリダーゼを含む薬学的組成物である。シアリダーゼを、任意の供給源（例えば、細菌又は哺乳動物供給源等）から単離することができるか、天然に存在するシアリダーゼと実質的に相同な組換えタンパク質であり得る。シアリダーゼを含む薬学的組成物を、鼻、気管、気管支、経口、又は局所投与のために処方することができるか、注射液又は点眼液として処方することができる。シアリダーゼを含む薬学的組成物を使用して、病原体感染を治療又は防止するか、アレルギー反応又は炎症反応を治療又は防止するか、遺伝子治療のための組換えウイルスの形質導入効率を増強することができる。
本発明の別の態様は、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質である。この態様では、シアリダーゼの触媒ドメインを含むが、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼ全体を下回るタンパク質を、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質と見なす。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、他のタンパク質配列（他のタンパク質由来の機能ドメイン等であるが、これに限定されない）を含み得る。シアリダーゼを含む薬学的組成物を、鼻、気管、気管支、経口、又は局所投与のために処方することができるか、注射液又は点眼液として処方することができる。シアリダーゼを含む薬学的組成物を使用して、病原体感染を治療又は防止するか、アレルギー反応又は炎症反応を治療又は防止するか、遺伝子治療のための組換えウイルスの形質導入効率を増強することができる。
更に別の態様では、本発明は、病原体による感染を治療又は予防するための方法を含む。好ましい実施形態では、本方法は、感染を防止又は治療するために、シアリダーゼ活性（シアリダーゼ又はシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質（シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質が含まれる）等）を被験体に投与するステップを含む。病原体は、例えば、ウイルス病原体又は細菌病原体であり得る。本方法は、薬学的有効量の本発明の化合物を被験体の少なくとも１つの標的細胞に適用するステップを含む。好ましくは、薬学的組成物を、噴霧、吸入薬、又は局所処方物の使用によって適用することができる。
本発明はまた、アレルギー及び炎症を治療するための新規の組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、炎症細胞の接着及び機能を防止又は阻害するように細胞外で作用することができる化合物を提供する。アレルギー及び炎症を治療するための化合物のいくつかの好ましい実施形態は、細胞外活性を有する少なくとも１つの治療ドメイン及び標的細胞表面に化合物がアンカーする少なくとも１つのアンカードメインを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、アレルギー反応又は炎症反応を防止又は治療するために、シアリダーゼ活性（シアリダーゼ又はシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質（シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質が含まれる）等）を被験体に投与するステップを含む。アレルギー反応又は炎症反応は、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹等の皮膚病（ｓｋｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、又は植物毒素若しくは動物毒素への曝露であり得る。本方法は、薬学的有効量の本発明の化合物を被験体の少なくとも１つの標的細胞に適用するステップを含む。好ましくは、薬学的組成物を、噴霧、吸入器、又は局所処方物の使用によって適用することができる。
本発明はまた、遺伝子治療中に組換えウイルスベクターによって遺伝子導入効率を改善するための新規の組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＡＡＶベクター等の遺伝子治療ベクターによる形質導入を妨害する物理的又は化学的障壁を減少させるように細胞外で作用することができる化合物を提供する。組換えウイルスベクターによる遺伝子導入効率を改善するための本発明のいくつかの好ましい化合物は、細胞外活性を有する少なくとも１つの治療ドメイン及び標的細胞表面に化合物がアンカーする少なくとも１つのアンカードメインを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、組換えウイルスベクターによる標的細胞の形質導入を容易にするために、シアリダーゼ活性（シアリダーゼ又はシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質（シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質が含まれる）等）を被験体に投与するステップを含む。本方法は、組換えウイルスベクターと共に有効量の本発明の化合物を少なくとも１つの標的細胞に適用するステップを含む。本発明の薬学的組成物を、噴霧、吸入薬、又は局所処方物の使用によって適用することができる。
発明の詳細な説明
定義
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語及び科学用語は、本発明に属する当業者に一般に理解されている意味を有する。一般に、本明細書中で使用した命名法及び下記の製造手順又は実験手順は、周知であり、当該分野で一般的に使用されている。これらの手順のために従来の方法（当該分野及び種々の一般的参考文献で提供されている方法）を使用する。用語を単数形で提供する場合、我々はこの用語の複数形も意図する。用語及び定義が参考として援用される参考文献と矛盾する場合、本出願で使用した用語は、本明細書中に記載の定義に従う。開示全体で使用されるように、以下の用語は、他で示さない限り、以下の意味を有すると理解すべきである。
「病原体」は、細胞、組織、又は生物に感染することができる任意のウイルス又は微生物であり得る。病原体は、ウイルス、細菌、又は原生動物であり得る。
「標的細胞」は、病原体が感染することができる任意の細胞若しくは炎症細胞と相互作用することができる任意の細胞又は組換えウイルスによって導入される外因性遺伝子の意図する目的地（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）である宿主細胞である。
「組換えウイルス」又は「組換えウイルスベクター」、「遺伝子治療ウイルスベクター」又は「遺伝子治療ベクター」を、１つ又はそれ以上の外因性遺伝子を含む遺伝子操作されたウイルスと定義する。標的細胞が組換えウイルスによって形質導入された場合、外因性遺伝子は標的細胞に導入される。標的細胞に導入された遺伝子を細胞中で発現させて、意図する治療効果を得ることができる。現在、最も一般的に使用されている遺伝子治療ウイルスベクターは、以下の４つのウイルス型に基づく：レトロウイルス（レンチウイルスが含まれる）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び単純ヘルペスウイルス１型。
「炎症細胞」は、免疫系の炎症反応を実施するか、これに関与する細胞である。炎症細胞には、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、肥満細胞、ＮＫ細胞、及び単球が含まれる。
「病原体によって標的細胞の感染を防止することができる細胞外活性」は、標的細胞の外面又は外面付近に対する作用によって病原体による標的細胞の感染を遮断又は妨害することができる任意の活性である。病原体による標的細胞の感染を防止することができる細胞外活性は、触媒活性又は阻害活性等（これらに限定されない）の活性であり得る。例えば、触媒活性は、病原体、標的細胞、又は標的細胞の周辺の１つ又はそれ以上の物質（リガンド、受容体、又は酵素等であるが、これらに限定されない）（１つ又はそれ以上の物質（ｅｎｔｉｔｙ）が感染過程に寄与する）を分解する酵素活性であり得る。触媒活性はまた、物質（ｅｎｔｉｔｙ）の感染促進特性が減少するように病原体、標的細胞、又は標的細胞の周辺の１つ又はそれ以上の物質（ｅｎｔｉｔｙ）を修飾することができる。阻害活性は、例えば、受容体又はリガンドに結合して、受容体又はリガンドが部分に結合するのを防止する活性（この結合は感染過程に必要であるかこれを促進する）であり得る。阻害活性はまた、酵素又は受容体が阻害過程に必要であるかこれを促進する機能を実施するのを防止する酵素又は受容体のインヒビターであり得る。標的細胞の外側には、標的細胞膜自体並びに標的細胞を取り巻く細胞外環境（細胞外基質が含まれる）、細胞内空間、及び管腔空間（ｌｕｍｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）が含まれる。上皮細胞について、標的細胞の外側には、管腔の内張りを形成する細胞膜の頂端又は管腔表面及び管腔表面付近の細胞外環境が含まれる。「病原体によって標的細胞の感染を防止することができる細胞外活性」は、任意の化学物質型（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機小分子、ポリマー、脂質、ステロイド、脂肪酸、及び炭水化物等（任意のこれらの組み合わせが含まれる）が含まれる）であり得る。しかし、好ましくは、活性は、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチド又はタンパク質に結合する活性を含む。
「組換えウイルスによって形質導入効率又は遺伝子導入効率を改善することができる細胞外活性」は、標的細胞の外面又はその付近での作用によって組換えウイルスによる宿主細胞の侵入を妨害する物理的又は化学的障壁を減少させるか排除する任意の活性である。組換えウイルスによって形質導入効率又は遺伝子導入効率を改善することができる細胞外活性は、触媒活性又は阻害活性等（これらに限定されない）の活性であり得る。例えば、触媒活性は、病原体、標的細胞、又は標的細胞の周辺の１つ又はそれ以上の物質（ｅｎｔｉｔｙ）（リガンド、受容体、又は酵素等であるが、これらに限定されない）（１つ又はそれ以上の物質（ｅｎｔｉｔｙ）が感染過程に寄与する）を分解する酵素活性であり得る。触媒活性はまた、物質（ｅｎｔｉｔｙ）の感染促進特性が減少するように病原体、標的細胞、又は標的細胞の周辺の１つ又はそれ以上の物質（ｅｎｔｉｔｙ）を修飾することができる。阻害活性は、例えば、受容体又はリガンドに結合して、受容体又はリガンドが部分に結合するのを防止する活性（この結合は感染過程に必要であるかこれを促進する）であり得る。阻害活性はまた、酵素又は受容体が阻害過程に必要であるかこれを促進する機能を実施するのを防止する酵素又は受容体のインヒビターであり得る。標的細胞の外側には、標的細胞膜自体並びに標的細胞を取り巻く細胞外環境（細胞外基質が含まれる）、細胞内空間、及び管腔空間が含まれる。上皮細胞について、標的細胞の外側には、管腔の内張りを形成する細胞膜の頂端又は管腔表面及び管腔表面付近の細胞外環境が含まれる。「病原体によって標的細胞の感染を防止することができる細胞外活性」は、任意の化学物質型（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機小分子、ポリマー、脂質、ステロイド、脂肪酸、及び炭水化物等（任意のこれらの組み合わせが含まれる）が含まれる）であり得る。しかし、好ましくは、活性は、ペプチド若しくはタンパク質又はペプチド若しくはタンパク質に結合する活性を含む。
「炎症細胞の接着又は機能を阻害することができる細胞外活性」は、炎症細胞が標的細胞に接触して標的細胞の正常な生理学的状態に影響を与えるのを防止することができる任意の活性である。
「細胞外アンカードメイン」又は単に「アンカードメイン」とも呼ばれる「標的細胞膜に少なくとも１つの治療ドメインをアンカーすることができるドメイン」は、細胞表面又は細胞表面上若しくは細胞表面に極めて接近した部分に安定して結合することができる化学物質をいう。細胞外アンカードメインは、１つ又はそれ以上の部分（好ましくは、１つ又はそれ以上の治療ドメイン）に可逆的、又は不可逆的に結合し、それにより、１つ又はそれ以上の付着した治療部分が真核細胞の外面又は外面に極めて接近して維持され得る。好ましくは、細胞外アンカードメインは、標的細胞表面上の少なくとも１つの分子、又は標的細胞表面と密接に会合して見出される少なくとも１つの分子に結合する。例えば、細胞外アンカードメインは、標的細胞の細胞膜に共有結合又は非共有結合した分子に結合することができるが、標的細胞の周囲の細胞外基質中に存在する分子に結合することができる。細胞外アンカードメインは、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であり、任意の更なる化学物質型（１つ又はそれ以上の更なるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、核酸、ペプチド核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機小分子、ポリマー、脂質、ステロイド、脂肪酸、炭水化物、又は任意のこれらの組み合わせも含み得る。
本明細書中で使用される場合、タンパク質配列又はペプチド配列は、基準配列と同一であるか、１つ又はそれ以上のアミノ酸欠失、１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸、又は１つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を含み、基準配列と同一又は本質的に同一の活性を保持する場合、基準配列と「実質的に相同」である。保存的置換を、以下の５つの群のうちの１つの範囲内の交換と定義することができる。
Ｉ．小さな脂肪族非極性又はわずかに極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．負電荷の極性残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＩＩ．正電荷の極性残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＶ．巨大な脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．巨大な芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ
上記群内で、以下の置換を、「高度な保存」と見なす：Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ、及びＭｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ。半保存的置換を、上記群（Ｉ）〜（ＩＶ）の２つの間の交換と定義し、上記の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）を含むスーパーグループ（Ａ）又は上記（ＩＶ）及び（Ｖ）を含むスーパーグループ（Ｂ）に制限される。更に、疎水性アミノ酸を本出願で特定する場合、これらは、Ａｌａ、ＧＩｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐをいうのに対し、親水性アミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＴｙｒをいう。
「シアリダーゼ」は、基質分子からシアル酸を除去することができる酵素である。シアリダーゼ（Ｎ−アシルノイラミノシルグリコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１８）は、シアロ複合糖質からシアル酸を加水分解によって除去する酵素群である。シアル酸は、通常、糖タンパク質及び糖脂質に付着するオリゴサッカリド鎖の最も外側の位置で見出される９炭素骨格を有するアルファ−ケト酸である。主なシアル酸型の１つは、ほとんどの他の型の生合成前駆体であるＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）である。基質分子は、制限されない例として、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、糖タンパク質、ガングリオシド、又は合成分子であり得る。例えば、シアリダーゼは、シアル酸残基と基質分子の残部（ｒｅｍａｉｎｄｅｒ）との間のアルファ（２，３）−Ｇａｌ結合、アルファ（２，６）−Ｇａｌ結合、又はアルファ（２，８）−Ｇａｌ結合を切断することができる。シアリダーゼはまた、シアル酸残基と基質分子の残部との間の任意又は全ての結合を切断する。Ｎｅｕ５Ａｃと炭水化物側鎖の最後から２番目のガラクトース残基との間の２つの主な結合は、事実上、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌで見出される。Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌ分子及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ分子の両方は、受容体としてインフルエンザウイルスによって認識され得るが、ヒトウイルスはＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌを好むようであり、トリウイルス及びウマウイルスは、主にＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを認識する。シアリダーゼは、天然に存在するシアリダーゼ、操作されたシアリダーゼ（アミノ酸配列が天然に存在するシアリダーゼに基づくシアリダーゼ（天然に存在するシアリダーゼの配列と実質的に相同な配列が含まれる）等であるが、これらに限定されない）であり得る。本明細書中で使用される、「シアリダーゼ」は、天然に存在するシアリダーゼの活性部分、又は天然に存在するシアリダーゼの活性部分に基づいた配列を含むタンパク質若しくはペプチドも意味し得る。
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なる供給源由来のアミノ酸配列を含むタンパク質である。融合タンパク質は、天然に存在するタンパク質に由来するか天然に存在するタンパク質の全部又は一部と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができ、更に、異なる天然に存在するタンパク質に由来するかその全部又は一部と実質的に相同な１つから非常に多数のアミノ酸を含むことができる。選択的に、融合タンパク質は、天然に存在するタンパク質に由来するか天然に存在するタンパク質の全部又は一部と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができ、更に、合成配列である１つから非常に多数のアミノ酸を含むことができる。
「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」は、シアリダーゼの触媒ドメインを含むタンパク質又はシアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同であるが、触媒ドメインが由来するシアリダーゼの全てのアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を含むタンパク質であり、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメインが由来するインタクトなシアリダーゼと実質的に同一の活性を保持している。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、シアリダーゼに由来しないが、これが必要ではないアミノ酸配列を含むことができる。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、１つ又はそれ以上の公知のタンパク質のアミノ酸配列に由来するかこれと実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができるか、他のタンパク質のアミノ酸配列に由来しないかこれと実質的に相同ではない１つ又はそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
Ｉ．病原体による感染を防止又は治療するための組成物
本発明は、真核細胞膜に少なくとも１つの治療ドメインをアンカーすることができる少なくとも１つのドメイン及び病原体による細胞の感染を防止することができる細胞外活性を有する少なくとも１つの治療ドメインを含むペプチド又はペプチドベースの化合物を含む。「ペプチド又はペプチドベースの」化合物は、化合物の２つの主なドメインがアミノ酸フレームワークを有し、アミノ酸がペプチド結合によって結合していることを意味する。ペプチド又はタンパク質ベースの化合物はまた、アミノ酸フレームワーク又は骨格に付着した他の化合物又は基（アンカードメインのアンカー活性に寄与する部分又は感染防止活性又は治療ドメインに寄与する部分が含まれる）を有し得る。例えば、本発明のタンパク質ベースの治療薬は、炭水化物、脂肪酸、脂質、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、核酸分子、核酸類似体、ペプチド核酸分子、有機小分子、又は更にポリマー等の化合物及び分子等（これらに限定されない）を含むことができる。本発明のタンパク質ベースの治療薬はまた、修飾アミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。化合物の非アミノ酸部分は、任意の目的（化合物の精製を容易にすること、化合物（治療処方物等）の溶解性又は分布を改良すること、化合物へのドメインの連結又は化合物への化学的部分の連結、化合物の二次元構造又は三次元構造への寄与、化合物全体のサイズの増加、化合物の安定性の増加、及び化合物のアンカー活性又は治療活性への寄与が含まれるが、これらに限定されない）に役立ち得る。
本発明のペプチド又はタンパク質ベースの化合物には、アンカードメイン又は治療ドメインを含む化合物に加えて、タンパク質配列又はペプチド配列も含まれ得る。更なるタンパク質配列は、任意の目的（上記概説の任意の目的（化合物の精製を容易にすること、化合物の溶解性又は分布を改良すること、化合物へのドメインの連結又は化合物への化学的部分の連結、化合物の二次元構造又は三次元構造への寄与、化合物全体のサイズの増加、化合物の安定性の増加、及び化合物のアンカー活性又は治療活性への寄与）が含まれるが、これらに限定されない）に役立ち得る。好ましくは、任意の更なるタンパク質配列又はアミノ酸配列は、アンカードメイン及び治療ドメインを含む１つのポリペプチド鎖又はタンパク質鎖の一部であるが、タンパク質配列の任意の実行可能な配置が本発明の範囲内に含まれる。
アンカードメイン及び治療ドメインを、治療ドメインが病原体による標的細胞の感染を防止又は妨害する細胞外活性を示すことができるように標的細胞膜又はその付近に化合物が結合することが可能な任意の適切な方法で配置することができる。化合物は、好ましくは、少なくとも１つのタンパク質又はペプチドベースのアンカードメイン及び少なくとも１つのペプチド又はタンパク質ベースの治療ドメインを有する。この場合、ドメインを、任意の順序でペプチド骨格に沿って直線的に配置することができる。アンカードメインは、治療ドメインに対してＮ末端であり得るか、治療ドメインに対してＣ末端であり得る。各末端上の少なくとも１つのアンカードメインに隣接した１つ又はそれ以上の治療ドメインを有することも可能である。或いは、１つ又はそれ以上のアンカードメインは、各末端上の少なくとも１つの治療ドメインに隣接することができる。化学的（好ましくはペプチド）リンカーを選択的に使用して、化合物のいくつか又は全てのドメインに連結することができる。
非線状の分枝配置でドメインを有することも可能である。例えば、治療ドメインを、アンカードメインも含むか、或いは、これに連結したポリペプチドの一部であるアミノ酸の誘導体化側鎖に付着させることができる。
本発明の化合物は、１つを超えるアンカードメインを有し得る。化合物が１つを超えるアンカードメインを有する場合、アンカードメインは、同一であっても異なっていても良い。本発明の化合物は、１つを超える治療ドメインを有し得る。化合物が１つを超える治療ドメインを有する場合、治療ドメインは、同一であっても異なっていても良い。化合物が複数のアンカードメインを含む場合、アンカードメインを縦列に配置するか（リンカーを使用するか使用しない）、治療ドメイン等の他のドメインの別の側面に配置することができる。化合物が複数の治療ドメインを含む場合、治療ドメインを縦列に配置するか（リンカーを使用するか使用しない）、アンカードメイン等（これに限定されない）の他のドメインの別の側面に配置することができる。
本発明のペプチド又はタンパク質ベースの化合物を、任意の適切な方法（天然に存在するタンパク質の精製、所望の機能ドメインを得るための選択的なタンパク質のタンパク質分解による切断、及び機能ドメインの他の機能ドメインとの抱合が含まれる）によって作製することができる。ペプチドを、化学合成し、選択的に他のペプチド又は化学的部分と化学的に抱合することもできる。しかし、好ましくは、本発明のペプチド又はタンパク質ベースの化合物を、連続するポリペプチド中で少なくとも１つのアンカードメイン及び少なくとも１つの治療ドメインを（リンカーを用いるか用いないで）共にコードするように核酸コンストラクトを操作することによって作製する。好ましくは、適切な発現配列を有する核酸コンストラクトを、原核細胞又は真核細胞にトランスフェクトし、治療タンパク質ベースの化合物を細胞に発現させて精製することができる。任意の所望の化学的部分を、選択的に、精製後にペプチド又はタンパク質ベースの化合物に抱合することができる。いくつかの場合、所望の翻訳後修飾（グリコシル化等であるが、これに限定されない）を実施する能力についてタンパク質ベースの治療薬を発現するための細胞株を選択することができる。
多種多様のコンストラクトをデザインし、そのタンパク質産物を、所望の活性（例えば、アンカードメインの結合活性又は治療ドメインの結合活性、触媒活性、若しくは阻害活性等）について試験することができる。核酸コンストラクトのタンパク質産物を、病原体による標的細胞の感染の防止又は妨害の有効性について試験することもできる。病原体感染力についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験（インフルエンザウイルスの感染力について実施例に記載の試験等）は、当該分野で公知である。
アンカードメイン
本明細書中で使用される、「細胞外アンカードメイン」又は「アンカードメイン」は、標的細胞の外面又は標的細胞の外面に極めて接近して存在する物質に安定に結合することができる任意の部分である。アンカードメインは、本発明の化合物を標的細胞の外面又はその付近に保持するのに役立つ。
細胞外アンカードメインは、好ましくは、１）標的細胞の表面上で発現した分子、又は標的細胞の表面上で発現した分子の一部、ドメイン、若しくはエピトープ、２）標的細胞の表面上で発現した分子に付着した化学物質、又は３）標的細胞を取り囲む細胞外基質の分子に結合する。
アンカードメインは、好ましくは、ペプチド又はタンパク質ドメイン（修飾されているか誘導体化されているペプチド又はタンパク質ドメインが含まれる）であるか、ペプチド又はタンパク質にカップリングした部分を含む。ペプチド又はタンパク質にカップリングした部分は、標的細胞表面又はその付近での物質へのアンカードメインの結合に寄与することができる任意の分子型であってよく、好ましくは、有機分子（例えば、核酸、ペプチド核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機小分子、ポリマー、脂質、ステロイド、脂肪酸、炭水化物、又は任意のこれらの組み合わせ等）である。
アンカードメインによって結合される分子、複合体、ドメイン、又はエピトープは、標的細胞に特異的であっても特異的でなくても良い。例えば、アンカードメインは、標的細胞上又はそれに極めて接近した分子上に存在するエピトープに結合することができ、標的細胞周囲以外の部位でもこれが起こる。しかし、多くの場合、本発明の治療化合物の送達が局在化されることにより、その発生が主に標的細胞表面に限定される。他の場合、アンカードメインによって結合された分子、複合体、部分、ドメイン、又はエピトープは、標的組織又は標的細胞型に特異的であり得る。
標的組織又は標的細胞型は、病原体が侵入して増幅する動物又はヒトの体内の部位を含む。例えば、標的細胞は、病原体が感染し得る内皮細胞であり得る。本発明の組成物は、例えば、内皮細胞型に特異的な細胞表面エピトープに結合することができるアンカードメインを含むことができる。別の例では、標的細胞は上皮細胞であってよく、本発明の組成物は多数の上皮細胞型の細胞表面上に存在するか異なる上皮細胞型の細胞外基質中に存在するエピトープに結合することができる。この場合、組成物の送達が局在化されることにより、その局在化が病原体の標的である上皮細胞の部位に制限され得る。
病原体による感染を防止又は治療するための方法は、上皮細胞の表面又はその付近に結合することができるアンカードメインを含むことができる。例えば、ヘパリンに密接に関連するヘパラン硫酸は、細胞膜上（気道上皮表面が含まれる）に遍在するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）型である。多数のタンパク質は、ヘパリン／ヘパラン硫酸と特異的に結合し、これらのタンパク質中のＧＡＧ結合配列が同定されている（Ｍｅｙｅｒ，ＦＡ，Ｋｉｎｇ，Ｍ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ，ＲＡ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ３９２：２２３−２３２；Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｓ．ｅｄ．，ｐｐ２３３．Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８２）。例えば、ヒト血小板因子４（ＰＦ４）（配列番号２）、ヒトインターロイキン８（ＩＬ８）（配列番号３）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）（配列番号４）、ヒトアポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（配列番号５）、ヒト血管関連遊走タンパク質（ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＭＰ）（配列番号６）、又はヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（配列番号７）のＧＡＧ結合配列は、ヘパリンに対して非常に高い親和性（ｎｍｏｌの範囲で）を示すことが示されている（Ｌｅｅ，ＭＫ ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ，ＡＤ．（１９９１）Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２７６８−２７７２；Ｇｏｇｅｒ，Ｂ，Ｈａｌｄｅｎ，Ｙ，Ｒｅｋ，Ａ，Ｍｏｓｌ，Ｒ，Ｐｙｅ，Ｄ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ ａｎｄ Ｋｕｎｇｌ，ＡＪ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１６４０−１６４６；Ｗｉｔｔ，ＤＰ ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ ＡＤ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏ ４：３９４−４００；Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ＫＨ，Ｒａｉｌ，ＳＣ，Ｍａｈｌｅｙ，ＲＷ，Ｍｉｌｎｅ，ＲＷ ａｎｄ Ｍａｒｃｅｌ，Ｙ．（１９８６）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２６１：２０６８−２０７６）。これらのタンパク質のＧＡＧ結合配列は、その受容体結合配列と異なるので、これらは全長タンパク質又は受容体結合ドメインに関連する生物活性を含まない。これらの配列又はヘパリン／ヘパラン硫酸結合配列として同定されているか将来的に同定される他の配列、又はヘパリン／ヘパラン硫酸結合活性を有する同定されたヘパリン／ヘパラン硫酸結合配列と実質的に相同な配列を、本発明の化合物中の上皮アンカードメインとして使用することができ、これを使用して、例えば、気道上皮感染ウイルス（インフルエンザウイルス等であるが、これに限定されない）を防止又は治療することができる。
アンカードメインは、特定の種の標的細胞型に特異的な部分に結合することができるか、１つを超える種の標的細胞型中で見出される部分に結合することができる。アンカードメインが１つを超える種の標的細胞の表面に存在する部分に結合することができ、且つウイルス又は病原体が１つを超える種に感染することができる場合、治療化合物は、１つを超える種で有用であり得る（治療ドメインが関連種を越えても有効である場合）。例えば、インフルエンザウイルスに対して使用することができる治療化合物（ヘパリン／ヘパラン硫酸に結合するアンカードメインを有する本発明の治療化合物）の場合、化合物を、動物（ヒトが含まれる）及びトリで使用することができる。
治療ドメイン
本発明の化合物は、病原体による細胞の感染を防止又は妨害することができるか、被験体の免役応答を調整することができるか、組換えウイルスの形質導入効率を改善することができる細胞外活性を有する少なくとも１つの治療ドメインを含む。治療活性は、非限定的な例として、結合活性、触媒活性、又は阻害活性であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、治療活性は、病原体による細胞感染に寄与する病原体の機能を修飾又は阻害するように作用する。他の実施形態では、治療ドメインは、標的細胞又は標的生物の機能を修飾するか阻害することができる。
例えば、治療ドメインは、標的細胞への病原体の結合に必要な標的細胞上の受容体に結合することができる。この方法では、治療部分は、標的細胞への病原体の結合を遮断して感染を防止することができる。別の方法では、治療ドメインは、病原体上の分子又はエピトープに結合して、分子又はエピトープの感染に必要な標的細胞との相互作用を防止することができる。治療ドメインはまた、宿主による標的細胞の感染を可能にするか促進する病原体又は宿主の分子又はエピトープを分解することができる触媒活性を有し得る。更に他の実施形態では、治療ドメインは、病原体による標的細胞感染に必要な活性のインヒビターであり得る。阻害される活性は、宿主生物又は病原体の活性であり得る。
治療ドメインは、好ましくは、細胞外で作用し、その感染防止活性、炎症反応調整活性、又は形質導入増強活性が標的細胞表面又は標的細胞を取り囲む隣接領域中（細胞外基質内の部位、細胞内空間、又は組織の管腔空間が含まれる）で起こることを意味する。
治療ドメインは、好ましくは、ペプチド又はタンパク質ドメイン（修飾されているか誘導体化されているペプチド又はタンパク質ドメインが含まれる）であるか、ペプチド又はタンパク質にカップリングした部分を含む。ペプチド又はタンパク質にカップリングした部分は、病原体による標的細胞の感染を防止又は妨害することができる任意の分子型であってよく、好ましくは、有機分子（例えば、核酸、ペプチド核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機小分子、ポリマー、脂質、ステロイド、脂肪酸、炭水化物、又は任意のこれらの組み合わせ等）である。
治療ドメインは、合成ペプチド又はポリペプチドであり得るか、ペプチド又はポリペプチドに抱合することができる合成分子を含むことができ、天然に存在するペプチド若しくはポリペプチド又は天然に存在するタンパク質のドメインであり得る。治療ドメインはまた、天然に存在するペプチド又はタンパク質と実質的に相同なペプチド又はタンパク質であり得る。
治療ドメインは、特定の種で有用であり得るか、１つを越える種中の病原体感染を防止又は妨害することができる。例えば、病原体機能を阻害する治療ドメインを、一般に、宿主が感染し得る一定の範囲の種で使用することができる一方で、宿主の特性の干渉によって宿主−病原体相互作用を遮る治療ドメインは種特異的であっても種特異的でなくてもよい。多くの場合、アンカードメイン及び治療ドメインは、１つを超える種で有効であり得るので、本発明の化合物を使用して、ヒト及び動物の健康を増進することができる一方で、ウイルスの動物宿主全体への伝播及び拡大を減少させることができる。例えば、治療ドメインがシアリダーゼである場合、シアル酸残基と基質分子の残部との間の１つを超える結合型を切断することができるシアリダーゼ（アルファ（２，６）−Ｇａｌ結合及びアルファ（２，３）−Ｇａｌ結合の両方を切断することができるシアリダーゼ）は、広範なインフルエンザウイルス（トリ、ブタ、又はウマ等の異なる種に天然に宿主とする（ｈｏｓｔｅｄ）ウイルスが含まれる）による感染からヒトを防御することができる。
リンカー
本発明の化合物は、選択的に、化合物のドメインを連結することができる１つ又はそれ以上のリンカーを含み得る。リンカーを使用して、化合物のドメインを最適に間隔をあけるか折り畳むことができる。リンカーによって連結された化合物のドメインは、治療ドメイン、アンカードメイン、又は化合物の安定性の増強、精製を容易にすること等の更なる機能を提供する化合物の任意の他のドメイン又は部分であり得る。本発明の化合物のドメインを連結するために使用されるリンカーは、化学的リンカー又はアミノ酸リンカー若しくはペプチドリンカーであり得る。化合物が１つを超えるリンカーを含む場合、リンカーは同一でも異なっていてもよい。化合物が１つを超えるリンカーを含む場合、リンカーの長さは同一でも異なっていてもよい。
種々の組成、極性、反応性、長さ、可動性、及び切断性（ｃｌｅａｖａｂｉｌｉｔｙ）を示す多数の化学的リンカーは、有機化学分野で公知である。本発明の好ましいリンカーには、アミノ酸リンカー又はペプチドリンカーが含まれる。ペプチドリンカーは、当該分野で周知である。好ましくは、リンカーは、１アミノ酸長と１００アミノ酸長との間、より好ましくは１アミノ酸長と３０アミノ酸長との間であるが、本発明の化合物のリンカーの長さは制限されない。好ましくは、リンカーは、本発明の単量体によってコードされるペプチド又はタンパク質の高次構造及び活性を干渉しないアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい本発明のリンカーは、アミノ酸グリシンを含むリンカーである。例えば、配列：
（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ（式中、ｎは１と２０との間の整数、より好ましくは１と１２との間の整数である）
を有するリンカーを使用して、本発明の治療化合物のドメインを連結することができる。
本発明はまた、少なくとも１つの治療ドメイン及び少なくとも１つのアンカードメインを含む本発明のタンパク質ベースの化合物をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、特定の細胞型（例えば、大腸菌細胞又はヒト細胞等）における発現のために至適化されたコドンを有し得る。少なくとも１つの治療ドメイン及び少なくとも１つのアンカードメインを含む本発明のタンパク質ベースの化合物をコードする本発明の核酸分子はまた、他の核酸配列（遺伝子発現を増強する配列が含まれるが、これに限定されない）を含むことができる。核酸分子は、ベクター（発現ベクター等であるが、これに限定されない）中に存在し得る。
少なくとも１つのアンカードメイン及び少なくとも１つのプロテアーゼインヒビターを含む組成物
本発明のいくつかの態様では、病原体による細胞感染を防止することができる細胞外活性を有する治療ドメインは、プロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼインヒビターは、任意の化学物質型（例えば、炭水化物又はポリマー等）であり得るが、好ましくは、酵素活性を阻害するタンパク質又はペプチドである。好ましくは、プロテアーゼインヒビターは、病原体又は宿主細胞のタンパク質のプロセシングが病原体の感染力に必要である場合、少なくとも１つの病原体又は宿主細胞のタンパク質を少なくとも部分的にプロセシングする酵素活性を阻害する。病原体の感染力に必要であるウイルスタンパク質をプロセシングすることができる酵素は、病原体酵素又は宿主細胞を起源とする酵素であり得る。好ましくは、プロセシング酵素は、標的細胞の表面又は表面付近でアンカーする本発明の化合物が酵素活性を有効に阻害することができるように、標的細胞の表面又は表面付近で作用する。
プロテアーゼ阻害ドメインを含む本発明の化合物を使用して、プロテアーゼが宿主細胞の表面又は表面付近で活性であるその生活環でプロテアーゼを必要とする任意の病原体による感染を阻害することができる。これらのタンパク質ベースの組成物は、例えば、以下の構造の１つを有し得る：
（アンカードメイン）ｎ−リンカー−（プロテアーゼインヒビター）ｎ （ｎ＝１、２、３又はそれ以上）
又は：
（プロテアーゼインヒビター）ｎ−リンカー−（アンカードメイン）ｎ （ｎ＝１、２、３又はそれ以上）。
プロテアーゼインヒビターは、ペプチド又はポリペプチドの単量体形態であり得るか、同一のポリペプチドが直接連結しているか、その間に間隔を空ける配列を使用して連結された同一のポリペプチドの複数のコピーであり得る。或いは、異なるポリペプチドベースのプロテアーゼインヒビターを互いに連結することができる（例えば、プロテアーゼ阻害機能ドメインとしてのダイズプロテアーゼと連結したアプロチニン等）。ポリペプチド又はペプチドを、直接又はペプチドリンカー配列から構成されるスペーサーを介して連結することができる。アンカードメインは、標的細胞の表面又は表面付近で結合することができる任意のペプチド又はポリペプチドであり得る。
プロテアーゼインヒビターは、天然に存在するプロテアーゼインヒビター（又はその活性部分）であり得るか、操作されたプロテアーゼインヒビターであり得る。本発明の化合物で使用されるペプチドプロテアーゼインヒビターは、天然に存在するプロテアーゼインヒビターの活性を保持するか、同一の活性を実質的に保持しながら１つ又はそれ以上の欠失、付加、又は置換を有する天然に存在するプロテアーゼインヒビターと実質的に相同な配列を有し得る。
本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の治療化合物は、ヒトのインフルエンザの防止及び治療を目的とし、治療ドメインは、インフルエンザウイルス血球凝集素前駆体タンパク質ＨＡ０をＨＡ１及びＨＡ２に切断することができるセリンプロテアーゼを阻害することができるタンパク質又はペプチドプロテアーゼインヒビターである。
多数のセリンプロテアーゼインヒビターは、培養細胞、ニワトリ胚、及び感染マウスの肺におけるＨＡ切断及びインフルエンザウイルスの活性化を減少させることが示されている。これらには、一般的に使用されている以下等の多数のトリプシンインヒビターが含まれる：アプロチニン（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８６８２−８６８９）、ロイペプチン（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８６８２−８６８９；Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ，Ｋｌｅｎｋ ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．（１９８７）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６８：２０３９−２０４３）、ダイズプロテアーゼインヒビター（Ｂａｒｂｅｙ−Ｍｏｒｅｌ ＣＬ，Ｏｅｌｔｍａｎｎ ＴＮ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＫＭ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９８７）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５５：６６７−６７２）、ｅ−アミノカプロン酸（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｔｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．１９８２．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ７３：２６３−２７２）、及びｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）（Ｂａｒｂｅｙ−Ｍｏｒｅｌ ＣＬ，Ｏｅｌｔｍａｎｎ ＴＮ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＫＭ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９８７）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５５：６６７−６７２）。これらのうち、アプロチニンのエアゾール吸入は、マウス（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８４）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６５：１９１−１９６；Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８５）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６６：１６３３−１６３８；Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．（１９８７）Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２１：１６１−１６７；Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．（１９９４）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ２３：１０７−１１８）及びヒト（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．（１９８３）Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ｖｉｒｏｌ．４：９−１２（ｉｎ Ｒｕｓｓｉａｎ））におけるインフルエンザ及びパラインフルエンザ気管支肺炎に対して決定的な治療効果を示している。
アプロチニン（配列番号１）は、５８アミノ酸ポリペプチドインヒビターである（トラジロール又はウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）とも呼ばれる）。本発明の化合物は、１つ又はそれ以上のアプロチニンドメインを有し得る。例えば、本発明の治療組成物は、１〜６つのアプロチニンポリペプチド、より好ましくは、１〜３つのアプロチニンポリペプチドを有し得る。本発明の化合物はまた、アプロチニンのアミノ酸配列と実質的に相同なポリペプチド又はペプチドを含む治療ドメインを有し得る。
プロテアーゼインヒビターを含むインフルエンザを防止又は治療するための化合物は、好ましくは、上皮細胞の表面又は表面付近に結合することができるアンカードメインを含む。いくつかの好ましい実施形態では、上皮アンカードメインは、ヒトタンパク質由来のＧＡＧ結合配列（例えば、ヒト血小板因子４（ＰＦ４）（配列番号２）、ヒトインターロイキン８（ＩＬ８）（配列番号３）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）（配列番号４）、ヒトアポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（配列番号５）、ヒト血管関連遊走タンパク質（ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＭＰ）（配列番号６）、又はヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（配列番号７）のＧＡＧ結合配列等）である（図２）。本発明の化合物はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に列挙したＧＡＧ結合ドメインのアミノ酸配列と実質的に相同なポリペプチド又はペプチドを含むアンカードメインを有し得る。
臨床的に、アプロチニン及び上皮アンカードメインを含む薬物を、気道全体を被覆するためのエアゾール吸入によって投与して、その生活環においてセリンプロテアーゼを必要とするインフルエンザウイルス又は任意の他のウイルス（パラインフルエンザウイルス等）に起因する気管支肺炎を防止又は治療することができる。或いは、アプロチニン／上皮アンカードメイン融合タンパク質を、鼻内噴霧として投与して、合併症のない初期段階のインフルエンザ又は呼吸器系ウイルスによる他の感染症治療することができる。更に、アプロチニン／上皮アンカードメイン融合タンパク質を、感染を引き起こす前のインフルエンザ又は他のウイルス感染のための予防薬として使用することができる。
少なくとも１つのアンカードメイン及び少なくとも１つの触媒活性を含む組成物
本発明のいくつかの態様では、病原体による細胞感染を防止することができる細胞外活性を有する治療ドメインは、触媒活性である。酵素活性は、病原体の感染力に寄与する宿主分子若しくは複合体又は病原体分子若しくは複合体を除去、分解、又は修飾する触媒活性であり得る。好ましくは、本発明の化合物の酵素活性によって除去、分解、又は修飾される宿主分子若しくは複合体又は病原体分子若しくは複合体は、標的細胞の表面にアンカーされた本発明の化合物が宿主、病原体分子、又は複合体を有効に阻害することができるように、標的細胞の表面上、表面上の一部、又は表面付近に存在する。
例えば、治療ドメインは、宿主−病原体結合及び病原体の標的細胞へのその後の侵入に必要な病原体又は標的細胞の分子又はエピトープを消化することができる触媒活性を有し得る。ウイルスの細胞への侵入が可能な標的細胞上の受容体は、本発明の化合物の酵素活性の標的であり得る。
受容体の除去が生物に影響を与えない限り、触媒ドメインを含む本発明の化合物を使用して、標的細胞への侵入を促進するために受容体を使用する任意の病原体による感染を阻害することができる。これらのタンパク質ベースの組成物は、例えば、以下の構造の１つを有し得る：
（アンカードメイン）ｎ−［リンカー］−（酵素活性）ｎ （ｎ＝１、２、３又はそれ以上）
又は：
（酵素活性）ｎ（ｎ＝１、２、３又はそれ以上）−［リンカー］−（アンカードメイン）ｎ
（式中、リンカーは選択的である）。
酵素活性は、ペプチド又はポリペプチドの単量体形態であり得るか、同一のポリペプチドが直接連結しているか、その間に間隔を空ける配列を使用して連結された同一のポリペプチドの複数のコピーであり得る。ポリペプチド又はペプチドを、直接又はペプチドリンカー配列から構成されるスペーサーを介して連結することができる。アンカードメインは、標的細胞の表面又は表面付近で結合することができる任意のペプチド又はポリペプチドであり得る。
本発明の１つの好ましい実施形態では、治療ドメインは、上皮細胞表面上のシアル酸レベルを排除するか大幅に減少させることができるシアリダーゼを含む。シアル酸は、インフルエンザウイルスの受容体である。従って、シアリダーゼを使用した気道上皮細胞表面の治療により、インフルエンザ感染を防止するか、初期感染を干渉することができる。治療ドメインは、完全なシアリダーゼタンパク質又はその活性部分を含むことができる。シアル酸は、インフルエンザウイルスの受容体、パラインフルエンザウイルス、いくつかのコロナウイルス、及びロタウイルス、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、カタル球菌、緑膿菌、及びピロリ菌の少なくとも１つの受容体である。従って、シアリダーゼを使用した気道上皮細胞表面の治療により、インフルエンザ又は他のウイルス感染を防止するか、初期感染を干渉することができ、そして、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、カタル球菌、及び緑膿菌等の細菌のコロニー形成を防止又は減少させることができる。シアリダーゼを使用した胃腸上皮細胞の治療により、胃内でピロリ菌のコロニー形成を防止又は減少させることができる。
シアル酸はまた、炎症細胞と標的細胞との間の細胞接着及び相互作用を媒介する。従って、シアリダーゼを使用した気道上皮細胞表面の治療により、気道表面への塩小細胞の動員を防止することができ、それにより、アレルギー反応（喘息及びアレルギー性鼻炎が含まれる）を治療することができる。
シアル酸が遺伝子治療ベクターによる細胞侵入を妨害する障壁として役立つので、シアリダーゼを使用した標的細胞の治療によって形質導入効率を増加させることができ、それにより、遺伝子療法の有効性を改善することができる。
好ましいシアリダーゼは、受容体シアル酸Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを分解することができる巨大な細菌シアリダーゼである。例えば、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ８７３６９）、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６２２７６）、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、又はミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＯ １０４５）由来の細菌シアリダーゼ酵素を使用することができる。本発明の化合物の治療ドメインは、巨大な細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部又は一部を含むことができるか、巨大な細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができる。１つの好ましい実施形態では、治療ドメインは、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）によってコードされたシアリダーゼ（配列番号１２のシアリダーゼ又は配列番号１２と実質的に相同なシアリダーゼ配列等）を含む。更に別の好ましい実施形態では、治療ドメインは、配列番号１２のアミノ酸２７４〜６６６にわたるアクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼの触媒ドメイン又は実質的に相同な配列を含む。
他の好ましいシアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ（ＮＥＵ２（配列番号８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ １６５３５；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ｒｏｓｓｉ，Ｅ．，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５７：１３７−１４３）及びＮＥＵ４（配列番号９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ０８０７４１；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ，Ｂ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６−６６３）によってコードされるヒトシアリダーゼ等）である（図３）。本発明の化合物の治療ドメインは、ヒトシアリダーゼのアミノ酸配列の全部又は一部を含むことができるか、ヒトシアリダーゼのアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、治療ドメインが天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部又は天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部と実質的に相同な配列を含む場合、一部は、ヒトシアリダーゼと本質的に同一の活性を含む。
酵素ドメインを含むインフルエンザを防止又は治療するための化合物は、好ましくは、上皮細胞の表面又は表面付近に結合することができるアンカードメインを含む。いくつかの好ましい実施形態では、上皮アンカードメインは、ヒトタンパク質由来のＧＡＧ結合配列（例えば、ヒト血小板因子４（ＰＦ４）（配列番号２）、ヒトインターロイキン８（ＩＬ８）（配列番号３）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）（配列番号４）、ヒトアポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（配列番号５）、ヒト血管関連遊走タンパク質（ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＭＰ）（配列番号６）、又はヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（配列番号７）のＧＡＧ結合アミノ酸配列等）である（図２）。上皮アンカードメインはまた、天然に存在するＧＡＧ結合配列（図２に列挙した配列等）と実質的に相同であり得る。
アンカードメインの非存在下で、病原体感染（インフルエンザ、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、及び緑膿菌感染又は細菌の感染等であるが、これらに限定されない）の治療又は防止、アレルギー反応及び炎症反応の治療又は予防でヒトシアリダーゼ又はシアリダーゼと実質的に相同なシアリダーゼを含む化合物を使用して組換えウイルスの形質導入効率を改良することも本発明の範囲内である。
本発明は、このような感染をシアリダーゼ（Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）又はＮＥＵ２及びＮＥＵ４等のヒトシアリダーゼ等であるが、これらに限定されない）の使用によって防止又は軽減することができることを認識する。シアリダーゼを、選択的に、遺伝子操作若しくは化学的操作又は製剤処方によって、気道上皮での半減期又は保持が改良されるように適合させることができる。
インフルエンザウイルスが主に上気道に感染するので、鼻腔及び鼻咽頭領域中での局所的な受容体シアル酸の除去により、感染を防止するか初期感染を妨害することができる。シアリダーゼを鼻内噴霧として上気道に送達させることができ、初期段階のインフルエンザ（又は他のインフルエンザ）における治療様式又は感染前の予防様式のいずれかで使用することができる。或いは、シアリダーゼを、吸入薬として下気道に送達させて、インフルエンザを治療し、インフルエンザの合併症（気管支肺炎等）を防止することができる。
ＩＩ．少なくとも１つのシアリダーゼ活性を含む治療組成物
本発明は、少なくとも１つのシアリダーゼ活性を含む治療組成物を含む。シアリダーゼ活性は、任意の供給源（例えば、細菌又は哺乳動物供給源等）から単離することができるか、天然に存在するシアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同な組換えタンパク質であり得る。好ましいシアリダーゼは、受容体シアル酸Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを分解することができる巨大な細菌シアリダーゼである。例えば、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ８７３６９）、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ０６８９８）、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、若しくはミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＯ １０４５）由来の細菌シアリダーゼ酵素、又は実質的に相同なタンパク質を使用することができる。
例えば、本発明の化合物の治療化合物は、巨大な細菌シアリダーゼを含むことができるか、巨大な細菌シアリダーゼのアミノ酸配列を含むタンパク質を含むことができるか、巨大な細菌シアリダーゼのアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができる。本発明の好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）を含むか、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）と実質的に相同なタンパク質を含む。
他の好ましいシアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ（ＮＥＵ２（配列番号８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ １６５３５；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ｒｏｓｓｉ，Ｅ．，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５７：１３７−１４３）及びＮＥＵ４（配列番号９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ０８０７４１；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ，Ｂ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６−６６３）によってコードされるヒトシアリダーゼ等）である（図３）。本発明の化合物の治療ドメインは、ヒトシアリダーゼのアミノ酸配列と相同なヒトシアリダーゼタンパク質を含むことができるか、ヒトシアリダーゼのアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に相同なアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、治療ドメインが天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部又は天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部と実質的に相同な配列を含む場合、一部は、ヒトシアリダーゼと本質的に同一の活性を含む。
シアリダーゼを含む薬学的組成物は、治療活性も有し得る他の化合物（他のタンパク質が含まれる）を含むことができる。シアリダーゼを含む薬学的組成物は、組成物の安定性、溶解性、パッケージング、送達、一貫性、味、又は香りを増強することができる他の化合物を含むことができる。
シアリダーゼを含む薬学的組成物は、鼻、気管、気管支、経口、又は局所投与のために処方することができるか、注射液又は点眼液として処方することができる。シアリダーゼを含む薬学的組成物を使用して、病原体感染を治療又は防止するか、アレルギー反応又は炎症反応を治療又は防止するか、遺伝子治療のための組換えウイルスの形質導入効率を増強することができる。
ＩＩＩ．シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質
本発明はまた、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質を含む。本明細書中で使用される、「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」は、シアリダーゼの触媒ドメインを含むが、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼの全てのアミノ酸配列を含まない。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％を含む。より好ましくは、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼ活性の少なくとも９０％を含む。
シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、他のアミノ酸配列（更なるシアリダーゼ配列、他のタンパク質由来の配列、又は天然に存在するタンパク配列に由来しない配列等であるが、これらに限定されない）を含むことができる。更なるアミノ酸配列は、多数の機能のいずれか（触媒ドメインタンパク質への他の活性の寄与、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質の発現、プロセシング、折り畳み、若しくは安定性の増強、又は更に、タンパク質の所望のサイズ若しくは間隔を提供すること）を実施することができる。
好ましいシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを含むタンパク質である。好ましくは、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２７０〜６６６を含む。好ましくは、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２７０〜２９０のアミノ酸のいずれかから始まり、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸６６５〜９０１のアミノ酸のいずれかで終わり、アミノ酸１からアミノ酸２６９までにわたる任意のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）タンパク質配列を欠くアミノ酸配列を含む。（本明細書中で使用される、「アミノ酸１からアミノ酸２６９までにわたる任意のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）タンパク質配列を欠く」は、指定されたタンパク質配列又はアミノ酸配列中に出現する４つ又はそれを超える連続するアミノ酸の任意のストレッチを欠くことを意味する）。
いくつかの好ましい実施形態では、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２７４〜６８１を含み、他のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列を欠く。いくつかの好ましい実施形態では、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２７４〜６６６を含み、任意の他のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列を欠く。いくつかの好ましい実施形態では、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２９０〜６６６を含み、任意の他のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列を欠く。更に他の好ましい実施形態では、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列（配列番号１２）のアミノ酸２９０〜６８１を含み、任意の他のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）配列を欠く。
本発明はまた、シアリダーゼの触媒ドメインを含む本発明のタンパク質ベースの化合物をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、特定の細胞型（例えば、大腸菌細胞又はヒト細胞等）における発現のために至適化されたコドンを有し得る。少なくとも１つの触媒ドメインを含む本発明のタンパク質ベースの化合物をコードする本発明の核酸分子はまた、他の核酸配列（遺伝子発現を増強する配列が含まれるが、これに限定されない）を含むことができる。核酸分子は、ベクター（発現ベクター等であるが、これに限定されない）中に存在し得る。
融合タンパク質
シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、少なくとも１つの触媒ドメイン及び少なくとも１つの他のタンパク質ドメイン（精製ドメイン、タンパク質タグ、タンパク質安定性ドメイン、可溶性ドメイン、タンパク質サイズ増加ドメイン、タンパク質折り畳みドメイン、タンパク質局在化ドメイン、アンカードメイン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、触媒活性ドメイン、結合ドメイン、又は触媒活性増強ドメインが含まれるが、これらに限定されない）を含む融合タンパク質であり得る。好ましくは、少なくとも１つの他のタンパク質ドメインは、別の供給源に由来する（別のタンパク質由来の配列等であるが、これに限定されない）。少なくとも１つの他のタンパク質ドメインは、任意の公知のタンパク質配列に基づく必要はないが、融合タンパク質中で任意の機能を果たすように操作し、経験的に試験することができる。
精製ドメインには、非限定的な例として、１つ又はそれ以上のｈｉｓタグ、カルモジュリン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、ストレプトアビジンドメイン、ストレプトアビジン結合ドメイン、インテインドメイン、又はキチン結合ドメインが含まれ得る。タンパク質タグは、タンパク質の抗体検出のために使用することができる配列（例えば、ｍｙｃタグ、血球凝集素タグ、又はＦＬＡＧタグ等）を含み得る。タンパク質の発現、修飾、折り畳み、安定性、サイズ、又は局在化を増強するタンパク質ドメインは、公知のタンパク質又は操作されたタンパク質の配列に基づき得る。他のタンパク質ドメインは、結合活性又は触媒活性を有し得るか、シアリダーゼ触媒ドメインの触媒活性を増強することができる。
本発明の好ましい融合タンパク質は、少なくとも１つのシアリダーゼ触媒ドメイン及び少なくとも１つのアンカードメインを含む。好ましいアンカードメインは、ＧＡＧ結合ドメイン（ＧＡＧ結合ドメイン等）又はヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（配列番号７）を含む。
本発明の融合タンパク質のシアリダーゼ触媒ドメイン及び他のドメインを、選択的に、リンカー（ペプチドリンカー等であるが、これに限定されない）によって連結することができる。種々のペプチドリンカーが当該分野で公知である。好ましいリンカーは、グリシンを含むペプチドリンカー（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ（配列番号１０））である。
本発明はまた、シアリダーゼの触媒ドメインを含む本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、特定の細胞型（例えば、大腸菌細胞又はヒト細胞等）における発現のために至適化されたコドンを有し得る。本発明の融合タンパク質をコードする本発明の核酸分子はまた、他の核酸配列（遺伝子発現を増強する配列が含まれるが、これに限定されない）を含むことができる。核酸分子は、ベクター（発現ベクター等であるが、これに限定されない）中に存在し得る。
ＩＶ．薬学的組成物
本発明は、薬学的組成物として処方された本発明の化合物を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤中に薬学的有効量の化合物を有する、保存及び好ましくはその後の投与のために調製された薬学的に許容可能なキャリアを含む。治療用の許容可能なキャリア又は希釈剤は薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））に記載されている。防腐剤、安定剤、色素、及び更に香味物質を、薬学的組成物中に含めることができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロ安息香酸のエステルを、防腐剤として添加することができる。更に、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。
標的細胞に依存して、本発明の化合物を、経口投与のための錠剤、カプセル、又はエリキシル；局所投与のための蝋膏又は軟膏；直腸投与のための座剤；吸入薬又は鼻内噴霧として使用するための滅菌溶液及び懸濁液等；として処方し、使用することができる。溶液又は懸濁液、注射前の溶液又は懸濁液に適切な固体形態、又は乳濁液のいずれかとしての従来の形態で注射液を調製することもできる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、及び塩酸システイン等である。更に、必要に応じて、注射用薬学的組成物は、少量の非毒性賦形剤（湿潤剤及びｐＨ緩衝剤）を含むことができる。
用量として必要な薬学的有効量の試験化合物は、投与経路、治療を受ける動物又は患者の型、及び検討中の特定の動物の身体特性に依存する。用量を、所望の効果をに合わせることができるが、体重、食事、同時に行う投薬等の要因及び医学分野の当業者が認識する他の要因に依存する。本発明の方法の実施では、薬学的組成物を、単独又は互いに組み合わせて使用するか、他の治療薬又は診断薬と組み合わせて使用することができる。これらの生成物を、ｉｎ ｖｉｖｏで、好ましくは、哺乳動物患者、好ましくはヒト、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの生成物の使用では、薬学的組成物を、種々の方法（局所、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、結腸、直腸、鼻腔内、又は腹腔内が含まれる）にて種々の投薬形態を使用して患者に投与することができる。このような方法を、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験化合物の活性の試験で使用することもできる。
好ましい実施形態では、これらの薬学的組成物は、経口投与可能な懸濁液、溶液、錠剤、又はロゼンジ；鼻内噴霧；吸入薬；注射液、局所噴霧、軟膏、粉末、又はゲルの形態であり得る。
懸濁液として経口投与する場合、本発明の組成物を、製剤処方の分野で周知の技術に従って調製し、嵩増しするための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、及び当該分野で公知の甘味料／香味物質を含むことができる。即効型錠剤として、これらの組成物は、当該分野で公知の微結晶性セルロース、第二リン酸カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、及び乳糖、並びに／又は他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、及び潤滑剤を含むことができる。うがい液又はリンスの処方中の成分には、当該分野で公知の抗菌薬、界面活性剤、共力剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、オイル、水、及び他の添加剤（甘味料／香味物質等）が含まれる。
飲用溶液によって投与される場合、組成物は、水に溶解され、適切なｐＨに調整され、キャリアを含む１つ又はそれ以上の本発明の化合物を含む。化合物を、蒸留水、水道水、及び湧き水等に溶解することができる。ｐＨを、好ましくは、約３．５と約８．５との間に調整することができる。甘味料（例えば、約１％（ｗ／ｖ）スクロース）を添加することができる。
米国特許第３，４３９，０８９号（これらの目的のために本明細書中で参考として援用される）に従ってロゼンジを調製することができる。
鼻エアゾール又は吸入によって投与する場合、薬学的組成物を、製剤処方分野で周知の技術に従って調製し、当該分野で公知のベンジルアルコール若しくは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の可溶化剤又は分散剤を使用した生理食塩水溶液として調製することができる。例えば、Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄ．（１９９５）を参照。好ましくは、これらの組成物及び処方物を、適切な非毒性の薬学的に許容可能な成分を使用して調製する。これらの成分は、鼻投薬形態の調製分野の当業者に公知であり、これらのいくつかは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）（本分野の標準的基準）で見出すことができる。適切なキャリアの選択は、所望の鼻投薬形態（例えば、溶液、懸濁液、軟膏、又はゲル）の性質に非常に厳密に依存する。鼻投薬形態は、一般に、有効成分に加えて、大量の水を含む。ｐＨ調整剤、乳化剤、又は分散剤、防腐剤、界面活性剤、ゲル化剤、又は緩衝剤、及び他の安定剤及び可溶化剤等の少量の他の成分も存在し得る。好ましくは、鼻投薬形態は、鼻分泌物と等張であるべきである。
鼻処方物を、点滴薬、噴霧薬、エアゾール、又は任意の他の鼻腔内投薬形態として投与することができる。選択的に、送達系は、単位用量送達系であり得る。用量あたりで送達される溶液又は懸濁液の体積は、好ましくは、約５〜約２０００ｍｌ、より好ましくは約１０〜１０００ｍｌ、更により好ましくは約５０〜約５００ｍｌのいずれかであり得る。これらの種々の投薬形態のための送達系は、単位用量又は複数回投与パッケージ中のドロッパーボトル、プラスチック製のスクイーズユニット、霧吹き、噴霧器、又は薬用エアゾールであり得る。
本発明の処方物を、以下を含めるために変化させることができる：（１）ｐＨを調整するための他の酸及び塩基、（２）ソルビトール、グリセリン、及びデキストロース等の他の等張化剤、（３）他のパラヒドロキシ安息香酸エステル、安息香酸塩、プロピオン酸塩、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウム、及び水銀剤等の他の抗菌防腐剤、（４）カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、及び他のガム等の他の増粘剤、（５）適切な吸収促進剤、（６）亜硫酸水素塩及びアスコルビン酸塩のような抗酸化剤、エデト酸ナトリウム等の金属キレート剤、並びにポリエチレングリコール等の薬物溶解促進剤等の安定剤。
Ｖ．病原体による感染を防止又は治療する方法
本発明はまた、病原体による感染を防止又は治療する方法を含む。１つの態様では、本方法は、病原体に感染した被験体又は病原体に感染するリスクのある被験体を標的細胞の表面又は表面付近に化合物をアンカーする少なくとも１つのアンカードメイン及び病原体による標的細胞の感染を防止することができる少なくとも１つの細胞外活性を有するペプチド又はタンパク質を含む少なくとも１つの治療ドメインを含む化合物を含む本発明の組成物で治療するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、治療有効量の本発明の薬学的組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。
別の態様では、本方法は、病原体に感染した被験体又は病原体に感染するリスクのある被験体をシアリダーゼ活性を含むタンパク質ベースの化合物を含む本発明の薬学的組成物で治療するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、治療有効量の本発明の薬学的組成物被験体の上皮細胞に適用するステップを含む。シアリダーゼ活性は、単離された天然に存在するシアリダーゼタンパク質又は天然に存在するシアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同な組換えタンパク質であり得る。好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）と実質的に相同なシアリダーゼを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。
更に別の態様では、本方法は、病原体に感染した被験体又は病原体に感染するリスクのある被験体をシアリダーゼ触媒ドメインを含むタンパク質ベースの化合物を含む本発明の薬学的組成物で治療するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、治療有効量の本発明の薬学的組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップを含む。シアリダーゼ触媒ドメインは、好ましくは、天然に存在するシアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同であり得る。好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）のアミノ酸２７４〜６６６と実質的に相同なシアリダーゼ触媒ドメインを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。
病原体は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、コロナウイルス、ロタウイルス、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ菌、カタル球菌、緑膿菌、及びピロリ菌であり得る。１つの好ましい実施形態では、病原体は、インフルエンザウイルスである。
本発明の化合物を、ヒト又は動物のためにデザインすることができる。本発明のいくつかの態様では、本発明の化合物を使用して、動物クラス（哺乳動物等）の病原体感染を防止することができる。本発明のいくつかの態様では、組成物をヒト及び動物のために使用することができる（しかし、処方は異なっていても良い）。これらの態様では、化合物の活性ドメインは、１つをこえる病原体の種、型、サブタイプ、又は株に対して有効であり、１つを超える宿主種で活性であり得る。例えば、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のプロセシングを防止するプロテアーゼインヒビター若しくは標的細胞からシアル酸受容体を除去するシアリダーゼ等の活性ドメイン又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸に結合するドメイン等のアンカードメインを含む本発明のいくつかの好ましい化合物を、トリ、哺乳動物、又はヒトで使用することができる。異なる宿主種に感染する能力を有する一定範囲の病原体に対して有効であり得るこのような化合物を、ヒトで使用して、他の種を天然に宿主とする病原体による感染と戦うこともできる。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物はインフルエンザによる感染を防止し、治療有効量の薬学的組成物を被験体の気道上皮細胞に適用する。吸入器の使用又は鼻内噴霧の使用によってこれを行うことができる。好ましくは、吸入器又は鼻内噴霧を、１日に１〜４回使用する。
インフルエンザウイルスが主に上気道に感染するので、鼻腔、咽頭、気管、及び気管支中での局所的な受容体シアル酸の除去により、感染を防止するか初期感染を妨害することができる。シアリダーゼを鼻内噴霧又は吸入薬として上気道に送達させることができ、初期段階のインフルエンザ（又は他のインフルエンザ）における治療様式又は感染前の予防様式のいずれかで使用することができる。或いは、シアリダーゼを、吸入薬として下気道に送達させて、インフルエンザを治療し、インフルエンザの合併症（気管支肺炎等）を防止することができる。同様に、シアリダーゼを鼻内噴霧又は吸入薬として送達させて、パラインフルエンザウイルス及びコロナウイルスによる感染を防止又は軽減することができる。吸入薬又は鼻内噴霧として送達させて、病原菌（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ菌、カタル球菌、及び緑膿菌が含まれる）による気道コロニー形成を防止又は軽減することもできる。治療化合物を、選択的に、遺伝子操作若しくは化学的操作又は製剤処方によって、気道上皮での半減期又は保持を改良するように適合させることができる。更に、典型的には、点眼液、噴霧、又は軟膏の形態で眼又は外科創傷に送達させて、細菌感染（緑膿菌による感染が含まれる）を防止及び治療することができる。経口投与してピロリ菌による感染を治療することもできる。
投薬量
当業者に容易に明らかとなるように、投与すべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投薬量及び特定の投与様式は、治療を受ける患者の年齢、体重、及び型、使用される特定の薬学的組成物、及び薬学的組成物が使用される特定の用途によって変化する。所望の結果を達成するために必要な用量レベルである有効投薬レベルを、当業者は、上記で考察された日常的方法を使用して決定することができる。非ヒト動物研究では、薬学的組成物の適用を、より高い用量レベルで開始し、所望の効果がもはや達成されなくなるか、副作用が減少又は消滅するまで投薬量を減少させる。本発明の化合物の投薬量は、所望の効果、治療指標（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、投与経路、並びに化合物の純度及び活性に広く依存した範囲であり得る。典型的には、生成物のヒト臨床適用を、より低い投薬量レベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量レベルを増加させる。或いは、許容可能なｉｎ ｖｉｖｏ研究を使用して、試験化合物の有用な用量及び投与経路を確立することができる。典型的には、投薬量は、約１ｎｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇとの間、好ましくは約１０ｎｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは約１００ｎｇ／ｋｇと約１００マイクログラム／ｋｇとの間であり得る。
正確な処方、投与経路、及び投薬量を、患者の条件を考慮して、各医師が選択することができる（Ｆｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５）を参照）。主治医は、毒性、臓器機能障害、又は他の副作用によって投与を終了、干渉、又は調整する方法及び時期を承知していることに留意すべきである。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合により高いレベルに治療を調整する方法も承知しているであろう。目的の障害の管理における投与量の規模は、治療すべき容態の重症度及び投与経路によって変化する。容態の重症度を、例えば、標準的な予後評価方法によって一部を評価することができる。更に、用量及びおそらく投与頻度も、各患者（動物への適用が含まれる）の年齢、体重、及び応答によって変化する。
従って、本発明によれば、インフルエンザウイルス感染の治療及びインフルエンザウイルス感染の防止のための治療方法及び薬学的組成物を更に提供する。治療は、このような治療を必要とする患者に薬学的キャリア及び治療有効量の本発明の任意の組成物又はその薬学的に許容可能な塩を投与するステップを含む。
１つの好ましい投与計画では、吸入器、鼻内噴霧、又は経口ロゼンジによって適切な投薬量を各患者に投与する。しかし、任意の特定の患者のために特定の投与レベル及び投薬頻度を変化させることができ、これらは、種々の要因（使用される特定の塩又は他の形態の活性、化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の容態の重症度、並びに治療を受ける宿主が含まれる）が含まれる）に依存すると理解される。
ＶＩ．アレルギー反応及び炎症反応を軽減、防止、又は治療する方法
本発明はまた、被験体のアレルギー反応及び炎症反応を軽減、防止、又は治療する方法を含む。
１つの態様では、本方法は、シアリダーゼ活性を含むタンパク質ベースの化合物を含む本発明の薬学的組成物で被験体のアレルギー反応及び炎症反応を防止又は治療するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、治療有効量の本発明の薬学的組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップを含む。シアリダーゼ活性は、単離された天然に存在するシアリダーゼタンパク質又は天然に存在するシアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同な組換えタンパク質であり得る。好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）と実質的に相同なシアリダーゼを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。
更に別の態様では、本方法は、シアリダーゼ触媒ドメインを含むタンパク質ベースの化合物を含む本発明の薬学的組成物で被験体のアレルギー反応及び炎症反応を防止又は治療するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、治療有効量の本発明の薬学的組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップを含む。シアリダーゼ触媒ドメインは、好ましくは、天然に存在するシアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同であり得る。好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）のアミノ酸２７４〜６６６と実質的に相同なシアリダーゼ触媒ドメインを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。
アレルギー反応及び炎症反応は、急性又は慢性容態であり、非限定的な例として、喘息、呼吸困難を引き起こす他のアレルギー反応、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬、植物毒素若しくは動物毒素への曝露、又は自己免疫性容態が含まれ得る。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の化合物を、吸入薬又は鼻内噴霧として送達させて、気道の炎症（喘息及びアレルギー性鼻炎が含まれるが、これらに限定されない）を防止又は治療することができる。シアリダーゼ活性を含む本発明の化合物（シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質及びシアリダーゼ融合タンパク質が含まれる）を、点眼液、点耳剤、若しくは噴霧剤、又は皮膚に適用される軟膏、ローション、若しくはゲルとして投与することもできる。別の態様では、本方法は、静脈内注射又は局所注射として投与するシアリダーゼ活性を含む本発明で炎症性疾患患者を治療するステップを含む。
投薬量
当業者に容易に明らかとなるように、投与すべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投薬量及び特定の投与様式は、治療を受ける患者の年齢、体重、及び型、使用される特定の薬学的組成物、及び薬学的組成物が使用される特定の用途によって変化する。所望の結果を達成するために必要な用量レベルである有効投薬レベルを、当業者は、上記で考察された日常的方法を使用して決定することができる。非ヒト動物研究では、薬学的組成物の適用を、より高い用量レベルで開始し、所望の効果がもはや達成されなくなるか、副作用が減少又は消滅するまで投薬量を減少させる。本発明の化合物の投薬量は、所望の効果、治療指標（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、投与経路、並びに化合物の純度及び活性に広く依存した範囲であり得る。典型的には、生成物のヒト臨床適用を、より低い投薬量レベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量レベルを増加させる。或いは、許容可能なｉｎ ｖｉｖｏ研究を使用して、試験化合物の有用な用量及び投与経路を確立することができる。典型的には、投薬量は、約１ｎｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇとの間、好ましくは約１０ｎｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは約１００ｎｇ／ｋｇと約１００マイクログラム／ｋｇとの間であり得る。
正確な処方、投与経路、及び投薬量を、患者の条件を考慮して、各医師が選択することができる（Ｆｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５）を参照）。主治医は、毒性、臓器機能障害、又は他の副作用によって投与を終了、干渉、又は調整する方法及び時期を承知していることに留意すべきである。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合により高いレベルに治療を調整する方法も承知しているであろう。目的の障害の管理における投与量の規模は、治療すべき容態の重症度及び投与経路によって変化する。容態の重症度を、例えば、標準的な予後評価方法によって一部を評価することができる。更に、用量及びおそらく投与頻度も、各患者（動物への適用が含まれる）の年齢、体重、及び応答によって変化する。
いくつかの好ましい投与計画では、吸入器、鼻内噴霧、又は局所への塗布によって適切な投薬量を各患者に投与する。しかし、任意の特定の患者のために特定の投与レベル及び投薬頻度を変化させることができ、これらは、種々の要因（使用される特定の塩又は他の形態の活性、化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の容態の重症度、並びに治療を受ける宿主が含まれる）に依存すると理解される。
ＶＩ．組換えウイルスベクターによる遺伝子送達を増強する方法
本発明はまた、組換えウイルスベクターによる遺伝子送達方法を含む。１つの態様では、本方法は、少なくとも１つの組換えウイルスベクターの投与前又は投与と組み合わせて少なくとも１つの細胞に治療有効量のシアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む本発明の化合物を投与するステップを含む。本発明の組成物を、少なくとも１つの組換えウイルスベクターとして同一の処方物中に含めることができるか、個別の処方物中に含めることができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本方歩は治療有効量の本発明の組成物及び組換えウイルスベクターを被験体の細胞に適用するステップを含む。治療すべき被験体は、動物又はヒト被験体であり得る。特に好ましい実施形態では、組換えウイルスベクターを使用して、遺伝子治療のために被験体の上皮標的細胞に形質導入する。例えば、組換えウイルスベクターを使用して、嚢胞性線維症の被験体の気道上皮細胞に形質導入することができる。この場合、本発明の化合物を、吸入器によって投与することができる。治療遺伝子を含む組換えウイルスを、同時又は個別に投与することができる。
他の実施形態では、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は「ｅｘ ｖｉｖｏ」で（すなわち、形質導入後に被験体に移植すべき被験体から取り出した細胞）、本発明の化合物及び組換えウイルスベクターで治療することができる。
シアリダーゼ活性は、単離された天然に存在するシアリダーゼタンパク質又は天然に存在するシアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同な組換えタンパク質（シアリダーゼ触媒ドメインが含まれる）であり得る。好ましい薬学的組成物は、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）と実質的に相同なシアリダーゼを含む。
本発明の化合物を、組換えウイルス投与の１日前から２時間後までに標的細胞に投与することができる。好ましくは、本発明の化合物を、組換えウイルス投与の４時間〜１０分前に標的細胞に投与する。投与は、・・・であり得る。
組換えウイルスは、好ましくは、哺乳動物細胞（好ましくは、ヒト細胞等）に遺伝子を導入するために使用することができる組換えウイルスであり得る。例えば、組換えウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスが含まれる）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は単純ヘルペスウイルス１型であり得る。組換えウイルスは、標的細胞に導入されるべき少なくとも１つの外因性遺伝子を含む。遺伝子は、好ましくは、治療遺伝子であるが、必ずしもそうではない。例えば、遺伝子は、細胞に印をつけるか、薬物耐性を付与するために使用される遺伝子であり得る。
好ましい実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターの有効性を改良する方法を含む。本方法は、同一又は個別の処方物中で組換えベクターと共にシアリダーゼ活性を含む本発明の化合物で患者を治療するステップを含む。シアリダーゼ活性を有する本発明の化合物を、組換えベクターの投与前、同時、又は更に投与後に患者に投与することができる。１つの実施形態では、シアリダーゼは、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（配列番号１２）又はその一部と実質的に相同である。１つの好ましい実施形態では、シアリダーゼは、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを含む。別の実施形態では、組換えウイルスはＡＡＶである。更に別の実施形態では、疾患は、嚢胞性線維症である。更に別の実施形態では、組換えウイルスは、嚢胞性線維症膜通過伝導制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を含む。
投薬量
当業者に容易に明らかとなるように、投与すべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投薬量及び特定の投与様式は、治療を受ける患者の年齢、体重、及び型、使用される特定の薬学的組成物、及び薬学的組成物が使用される特定の用途によって変化する。所望の結果を達成するために必要な用量レベルである有効投薬レベルを、当業者は、上記で考察された日常的方法を使用して決定することができる。非ヒト動物研究では、薬学的組成物の適用を、より高い用量レベルで開始し、所望の効果がもはや達成されなくなるか、副作用が減少又は消滅するまで投薬量を減少させる。本発明の化合物の投薬量は、所望の効果、治療指標（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、投与経路、並びに化合物の純度及び活性に広く依存した範囲であり得る。典型的には、生成物のヒト臨床適用を、より低い投薬量レベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量レベルを増加させる。或いは、許容可能なｉｎ ｖｉｖｏ研究を使用して、試験化合物の有用な用量及び投与経路を確立することができる。典型的には、投薬量は、約１ｎｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇとの間、好ましくは約１０ｎｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは約１００ｎｇ／ｋｇと約１００マイクログラム／ｋｇとの間であり得る。
正確な処方、投与経路、及び投薬量を、患者の条件を考慮して、各医師が選択することができる（Ｆｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５）を参照）。主治医は、毒性、臓器機能障害、又は他の副作用によって投与を終了、干渉、又は調整する方法及び時期を承知していることに留意すべきである。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合により高いレベルに治療を調整する方法も承知しているであろう。目的の障害の管理における投与量の規模は、治療すべき容態の重症度及び投与経路によって変化する。容態の重症度を、例えば、標準的な予後評価方法によって一部を評価することができる。更に、用量及びおそらく投与頻度も、各患者（動物への適用が含まれる）の年齢、体重、及び応答によって変化する。
いくつかの好ましい投与計画では、吸入器、鼻内噴霧、又は局所への塗布によって適切な投薬量を各患者に投与する。しかし、任意の特定の患者のために特定の投与レベル及び投薬頻度を変化させることができ、これらは、種々の要因（使用される特定の塩又は他の形態の活性、化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の容態の重症度、並びに治療を受ける宿主が含まれる）に依存すると理解される。
実施例
実施例１：アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ）の合成、アプロチニン融合タンパク質の精製及び試験
序論
インフルエンザウイルスタンパク質血球凝集素（ＨＡ）は、主なインフルエンザエンベロープタンパク質であるＨＡはウイルス感染において重要な役割を果たす。ＨＡの重要性は、ＨＡが宿主免疫応答によって産生された防御中和抗体の主な標的であるという事実によって証明されている（Ｈａｙｄｅｎ，ＦＧ．（１９９６）Ｉｎ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｅｄ．Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ），ｐｐ．５９−７７．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．）。ＨＡはウイルス感染において２つの異なる機能を有することが現在明らかである。第１に、ＨＡは、シアル酸細胞受容体へのウイルスの付着を担う。第２に、ＨＡは、ウイルスエンベロープの細胞膜との融合の誘発による標的細胞へのウイルスの侵入を媒介する。
ＨＡは、前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、これが三量体細胞複合体としてゴルジ装置を介して細胞表面に移動される。ＨＡ０は更に切断されて、Ｃ末端ＨＡ１（は０の残基３２８）及びＨＡ０のＮ末端を生成する。一般に、細胞表面又は放出されたウイルス上で切断が起こると考えられる。ＨＡＯのＨＡ１／ＨＡ２への切断は、ＨＡのシアル酸受容体への結合に必要ないが、ウイルス感染力に不可欠である（Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ，Ｒ．（１９８８）Ａｄｖ Ｖｉｒ Ｒｅｓ．３４：２４７−２８１；Ｋｉｄｏ，Ｈ，Ｎｉｗａ，Ｙ，Ｂｅｐｐｕ，Ｙ ａｎｄ Ｔｏｗａｔａｒｉ，Ｔ．（１９９６）Ａｄｖａｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ ３６：３２５−３４７；Ｓｋｅｈｅｌ，ＪＪ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，ＤＣ．（２０００）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９：５３１−５６９）。
宿主プロテアーゼに対するＨＡ０の感受性を、ＨＡ０分子の外部ループ中のタンパク質分解部位によって決定する。タンパク質分解部位は、Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒモチーフ中に１つのＡｒｇ又はＬｙｓ残基（一塩基切断部位）又はいくつかのＬｙｓ及び／又はＡｒｇ残基（多塩基切断部位）を含むことができる。インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプＨ５及びＨ７のみが、多塩基切断部位を保有するＨＡタンパク質を有する。他の全てのインフルエンザＡ型、Ｂ型、及びＣ型ウイルスは、一塩基切断部位を有するＨＡタンパク質を含む。多塩基切断部位を含むインフルエンザＡ型ウイルスは、より感染力が強く、宿主の全身感染を誘導する一方で、一塩基ＨＡ部位を有するウイルスは哺乳動物の気道又はトリ種の気道及び腸管のみで感染を開始する（概説については、Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｇａｒｔｅｎ Ｗ．１９９４．Ｔｒｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２：３９−４３）。幸いにも、多塩基切断部位を保有する強毒性トリインフルエンザＡ型Ｈ５及びＨ７サブタイプによるヒト感染は、今までのところ、ほとんどが香港で発見されたほんの一握りの症例のみで起こっている。大部分のインフルエンザ感染は、一塩基切断部位で切断されるＨＡタンパク質を有するウイルスに起因する。
多塩基切断部位を含むインフルエンザウイルスＨＡサブタイプ５及び７は、フリン（ｆｕｒｉｎ）（サブチリシン様エンドプロテアーゼメンバー又はプレタンパク質コンバターゼファミリー）によって活性化される。フリン（ｆｕｒｉｎ）はウイルスを細胞内で切断し、多数の細胞型に遍在し、このようなウイルスと共に認められる強毒性の全身感染を可能にする（Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｇａｒｔｅｎ Ｗ．１９９４．Ｔｒｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２：３９−４３；Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．１９９７．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２７：６２５−６３５）。一塩基切断部位を有するＨＡを有する全ての他のインフルエンザウイルスは、分泌されたトリプシン様セリンプロテアーゼによって活性化される。インフルエンザウイルス活性化に関与している酵素には以下が含まれる：プラスミン（Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ ＳＧ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＡＲ ａｎｄ Ｃｈｏｐｐｉｎ ＰＷ．１９７３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５６：１７２−１８０）、ミニプラスミン（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｔｏｗａｔａｒｉ Ｔ，Ｏｈｕｃｈｉ Ｍ，Ｓｈｉｏｔａ Ｍ，Ａｋａｏ Ｍ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｙ，Ｐａｒｒｙ ＭＡ ａｎｄ Ｋｉｄｏ Ｈ．（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８：２８４７−２８５５）、トリプターゼ・クララ（Ｋｉｄｏ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｙ ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ．（１９９９）Ｉｎ Ｂ．Ｄｕｎｎ（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔｓ，ｐ．２０５−２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）、カリクレイン、ウロキナーゼエ、トロンビン（Ｓｃｈｅｉｂｌａｕｅｒ Ｈ，Ｒｅｉｎａｃｈｅｒ Ｍ，Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．（１９９２）Ｊ Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ １６６：７８３−７９１）、血液凝固因子Ｘａ（Ｇｏｔｏｈ Ｂ，Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｔ，Ｔｏｙｏｄａ Ｔ，Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ Ｎ，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｍ ａｎｄ Ｎａｇａｉ Ｙ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９：４１８９−４１９５）、アクロシン（Ｇａｒｔｅｎ Ｗ，Ｂｏｓｃｈ ＦＸ，Ｌｉｎｄｅｒ Ｄ，Ｒｏｔｔ Ｒ ａｎｄ Ｋｌｅｎｋ ＨＤ．（１９８１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１５：３６１−３７４．）、ヒト呼吸器洗浄物由来のプロテアーゼ（Ｂａｒｂｅｙ−Ｍｏｒｅｌ ＣＬ，Ｏｅｌｔｍａｎｎ ＴＮ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＫＭ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９８７）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５５：６６７−６７２）、黄色ブドウ球菌由来の細菌プロテアーゼ（Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ，Ｃｉｂｏｒｏｗｓｋｉ Ｐ，Ｒｅｉｎａｃｈｅｒ Ｍ，Ｐｕｌｖｅｒｅｒ Ｇ，Ｋｌｅｎｋ ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５７：４２１−４３０）、及び緑膿菌由来の細菌プロテアーゼ（Ｃａｌｌａｎ ＲＪ，Ｈａｒｔｍａｎｎ ＦＡ，Ｗｅｓｔ ＳＥ ａｎｄ Ｈｉｎｓｈａｗ ＶＳ．（１９９７）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：７５７９−７５８５）。宿主セリンプロテアーゼによるインフルエンザウイルスの活性化は、一般に、原形質膜又は細胞からのウイルス放出後に細胞外で起こると考えられる。
トラシロール又はウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）とも呼ばれるアプロチニンは、５８アミノ酸を有するポリペプチドである。これは、Ｋｕｎｉｔｚ型インヒビターファミリーに属し、広範なセリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、及び血漿カリクレインが含まれる）を競合的に阻害する。アプロチニンは、長い間、ヒト治療薬として使用されている（膵臓炎、ショック症候群の種々の状態、高線維素溶解性出血、及び心筋梗塞等）。開心術（心肺バイパス手術が含まれる）で失血を減少させるためにも使用されている（Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．（１９８３）Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９−４９４）。
ヒトにおけるアプロチニンの安全性は、何年にもわたる臨床適用によって十分に立証されている。更に、アプロチニン特異的抗体がヒト血清でこれまで認められていないので、アプロチニンは、明らかに非常に弱い免疫原である（Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．（１９８３）Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９−４９４）。薬物候補としてのアプロチニンの別の所望の特徴は、優れた安定性である。これは、室温で少なくとも１８ヶ月間いかなる活性の喪失もなく保持することができる（（Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．（１９８３）Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９−４９４））。
実施された動物研究で有意なウイルス感染を達成するために、アプロチニンを高用量で投与した。例えば、２８０マイクログラム〜８４０マイクログラム／日のアプロチニンを各マウスに６日間腹腔内注射した（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８４）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６５：１９１− １９６）。エアゾール吸入にはより低い投薬量しか必要ないが、それでも、６３〜１２６マイクログラムを６日間投与した（Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．（１９９４）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ２３：１０７−１１８）。マウスデータからの外挿に基づいて、ヒトでは非常に高用量のアプロチニンが必要であろう。従って、ヒトでより良好な有効性を達成するために、アプロチニン分子の効力を、有意に改善する必要がある。
アプロチニンは、主に宿主気道上皮細胞の表面上に存在するセリンプロテアーゼの競合的阻害によって機能する。従って、宿主プロテアーゼ周辺のアプロチニンの局所濃度は、アプロチニンの競合的利点を決定づける重要な要因である。我々は、気道上皮表面上のアプロチニンの競合的利点を増大させるように相乗的に作用する２つのアプローチを使用する。
第１に、アプロチニンの親和力（ａｖｉｄｉｔｙ）（機能的親和性）は、リンカーを介して連結した２つ、３つ、又はそれを超えるアプロチニンタンパク質からなる多価アプロチニン融合タンパク質によって増加する。このような分子は、多価様式で膜プロテアーゼに結合することができ、アプロチニン単量体を超える有意な動態的利点を有する。単量体アプロチニンは、ウシトリプリンと非常に強固に結合し、その解離定数（Ｋｉ）は、６．０×１０−１４ｍｏｌ／ｌである。しかし、他のプロテアーゼ（キモトリプシン、プラスミン、及びカリクレイン等）と比較したインフルエンザウイルスの活性化に関与しているその親和性はより低く、Ｋｉは１０−８〜１０−９ｍｏｌ／ｌのレベルである（Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．（１９８３）Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９−４９４）。多量体化により、これらのプロテアーゼに対するアプロチニンの親和性を指数関数的に増加させることができる。
第２に、我々は、アプロチニンを気道上皮アンカードメインと融合する。アンカードメインは、アプロチニンを宿主の膜結合プロテアーゼの近傍に局在指せ、上皮表面上のアプロチニンの高局所濃度を保持する。アンカードメインはまた、気道上皮上の薬物の保持時間を増加させる。
クローニング
アプロチニンは、５８個のアミノ酸残基及び３つの鎖内ジスルフィド結合を有する一本鎖ポリペプチドである（配列番号１）。アプロチニンのアミノ酸配列を、図１に示す。アプロチニン及びアプロチニン融合タンパク質をコードする遺伝子を、テンプレートとして大腸菌発現のために至適化したコドンとの重複オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって合成する。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）にクローン化する。配列決定後、遺伝子を、発現ベクターｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローン化する。ベクターは、組換えタンパク質を容易に精製するための精製タグ（Ｈｉｓｘ６）を保有する。コンストラクトを使用して、大腸菌を形質転換する。ＬＢ−アンピシリン培地中で中対数期まで成長させた形質転換細胞を、標準的プロトコールに従ってＩＰＴＧによって誘導する。細胞をペレット化し、超音波処理によってリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解する。Ｈｉｓ６精製タグを有する酵素を、ニッケルカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。
以下のアプロチニン融合タンパク質を作製する。
１．二量体及び三量体のアプロチニン。以下のコンストラクトのように、２つ又は３つのアプロチニンを、可動性リンカーを介して連結する。
アプロチニン−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ（ｎ＝３、４、又は５）−アプロチニン；
及び
アプロチニン−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ（ｎ＝３、４、又は５）−アプロチニン−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ（ｎ＝３、４、又は５）−アプロチニン。
リンカー配列の長さにより、多量体アプロチニンの三次元可動性が決定づけられ、それにより、分子の機能的親和性に影響を与え得る。従って、種々の長さのリンカーを有するコンストラクトが作製される。
完全に機能的な組換え単量体アプロチニンが、大腸菌中でで産生されている（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ ＥＡ，Ｈｏｒｌｅｉｎ Ｄ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｇ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗ ａｎｄ Ｓｃｈｎａｂｅｌ Ｅ．（１９８８）．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｖｏｌ ３６９，Ｓｕｐｐｌ．，ｐｐ２７−３５）。従って、我々は、大腸菌細胞中で多価アプロチニンタンパク質が適切に折り畳まれると予想する。種々の一般的な大腸菌細胞株（ＢＬ２１、ＪＭ８３等）中でのタンパク質発現に加えて、多価アプロチニンタンパク質は、Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でも発現する。Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）細胞株はチオレドキシン及びグルタチオンを持たず、それにより、酸化細胞質を有する。この細胞株を使用して、ジスルフィド結合を含む多数のタンパク質が首尾よく発現されている（Ｂｅｓｓｅｔｔｅ ＰＨ，Ａｓｌｕｎｄ Ｆ，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ Ｊ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１３７０３−１３７０８；Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｍ，Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｃ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅ Ｃ．（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１５：１−８．）。
２．上皮細胞アンカーアプロチニン。上皮細胞アンカー配列を、アプロチニンと融合させる。上皮アンカー配列は、上皮細胞表面に対して親和性を有する任意のペプチド又はポリペプチド配列であり得る。我々は、以下の３つのヒトＧＡＧ結合配列を選択した：ＰＦ４（ａａ ４７〜７０；配列番号２）、ＩＬ−８（ａａ ４６〜７２；配列番号３）、及びＡＴ ＩＩＩ（ａａ １１８〜１５１；配列番号４）（図２）。これらの配列は、ナノモルレベルの親和性でヘパリン／ヘパラン硫酸に結合する（表１）。ヘパリン／ヘパラン硫酸は、機上上皮上に遍在する。個別のコンストラクトでは、ＧＡＧ結合配列は、以下のコンストラクトとして、一般的リンカー配列ＧＧＧＧＳを介してＮ末端及びＣ末端上のアプロチニン遺伝子と融合する。
（ＧＡＧドメイン−ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）−アプロチニン）；及び
（アプロチニン−ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）−ＧＡＧドメイン）
Figure 2008512117
測光トリプシン阻害アッセイ
アプロチニン及びアプロチニン融合タンパク質のトリプシン阻害活性を、以前に詳述されている測光アッセイによって測定する（Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．（１９８３）Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９−４９４）。簡単に述べれば、このアッセイでは、アプロチニンは、Ｎａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢｚＡｒｇｐＮＡ又はＬ−ＢＡＰＡ）（Ｓｉｇｍａ）のトリプシン触媒加水分解を阻害し、これを、４０５ｎｍで測光的に追跡する。他のトリプシン単位（ＵＢＡＰＡ）は、１分間あたりの１μｍｏｌの基質の加水分解に対応する。１阻害単位（ＩＵＢＡＰＡ）は、２つのトリプシン単位の活性を５０％減少させ、これは、１ＵＢＡＰＡのトリプシンの阻害に数学的に対応する。アプロチニンの比活性を、ＩＵＢＡＰＡ／ｍｇポリペプチドで示す。
表面プラズモン共鳴アッセイ
標的としてヒトプラスミンを使用した表面プラズモン共鳴アッセイ（すなわち、ＢＩＡｃｏｒｅ分析（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を使用して、種々のリンカーに対する二量体及び三量体アプロチニンの親和性を、単量体アプロチニンと比較する。同様に、標的としてヘパリンを使用したＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用して、ＧＡＧ結合アプロチニン融合タンパク質とヘパリンとの間の親和性を分析する。
標的としてプラスミンを使用する場合、精製ヒトプラスミン（Ｓｉｇｍａ）を、製造者の説明書（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従って、ＣＭ５チップ状に固定する。以前に記載のように、ヘパリンが標的である場合、ビオチン化アルブミン及びアルブミン−ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）がストレプトアビジンコーティングＢＩＡｃｏｒｅ ＳＡチップ上に捕捉される（Ｘｉａｎｇ Ｙ ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｂ．（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：２６２３−２６３０）。
実施例２：インフルエンザウイルス感染の研究のための改良された組織培養モデルの確立。
インフルエンザウイルスのストック
インフルエンザウイルス株を、ＡＴＣＣ及びＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの貯蔵所から入手する。インフルエンザウイルスに関与する全ての実験を、生物安全レベルＩＩで行う。
記載のように、９日齢のニワトリ胚の尿膜腔への注射によって、ウイルスを増殖させる（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８５）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６６：１６３３−１６３８）。或いは、ウイルスストックを、０．３％ウシ血清アルブミン及び０．５マイクログラムトリプシン／ｍｌを補足した最少基本培地（ＭＥＭ）中にてＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上で成長させる。４８〜７２時間のインキュベーション後、培養培地を低速遠心分離によって明澄化する。ウイルス粒子を、２５％スクロースクッションによる超遠心によってペレット化する。精製ウイルスを、５０％グリセロール−０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．３）に懸濁し、−２０℃で保存する。
プラークアッセイ
ウイルスストックの感染力及び力価を、２種のプラークアッセイ（従来のアッセイ及び修正したアッセイ）によって決定する（Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ，Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｃ ａｎｄ Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ｍ．（１９７５）Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｎｕｏｌ １６２：９−１４；Ｚｈｉｍｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８２）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ７１：１７７−１８３）。従来のプラークアッセイは、ウイルス滴定法として日常的に使用されている。これは、ＭＤＣＫ単層へのウイルス感染直後に外因性のトリプシンを添加した寒天を重層する必要がある（Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ，Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｃ ａｎｄ Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ｍ．（１９７５）Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｎｕｏｌ １６２：９−１４）。この方法は、非切断ＨＡを有する全てのウイルス粒子の活性化によって試験されるウイルスストックの感染力を人為的に増加させる。
Ｚｈｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．は、感染２４時間後に添加される第２の層にトリプシンを含む、二重寒天重層からなる修正プラークアッセイをデザインした（Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．（１９８２）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ７１：１７７−１８３）。感染３日後に、細胞を１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、アガロース層を除去し、ヘマトキシリン−エオシン溶液で固定細胞を染色し、プラークを計数する。修正プラークアッセイにより、切断ＨＡ及び非切断ＨＡの両方を含むウイルスストックの真の感染力が正確に決定される。従来のプラークアッセイと修正プラークアッセイの両方由来の結果を組み合わせて、切断ＨＡ又は非切断ＨＡを含むウイルスを区別し、ウイルスストックの感染力とＨＡ切断状態とを相関させることができる。
ヒト細胞培養モデル
１．初代ヒト上皮細胞の短期間培養。従来のｉｎ ｖｉｔｒｏインフルエンザウイルス感染を、主に培養培地に外因性トリプシンを添加したＭＤＣＫ細胞で行う。トリプシンがｉｎ ｖｉｖｏでインフルエンザウイルスを活性化するプロテアーゼではないので、これは生理学的にかけ離れており、本明細書中で提案した研究には不適切である。これまで報告されている外因性プロテアーゼを使用しないでインフルエンザウイルスの成長を支持することができるｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養モデルは非常に限られており、腎臓起源の霊長類細胞を含む初代培養物、孵化卵の尿膜腔及び羊膜腔を裏打ちする細胞、胎児気管臓器培養、及び初代ヒトアデノイド上皮細胞である（Ｅｎｄｏ Ｙ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＮ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５５−２０５８）。これらのうち、初代ヒトアデノイド上皮細胞を使用した最も最近の研究がヒト条件に最も近い。この場合、Ｅｎｄｏ ｅｔ．ａｌ．（Ｅｎｄｏ Ｙ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＮ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５５−２０５８）は、ヒトアデノイドの手術サンプルから上皮細胞を単離し、上皮細胞をコラーゲンマトリクス（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ １００，Ｃｅｌｔｒｉｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むトランスウェルインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ）（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）上で培養した。細胞を、成長因子及び微量元素を補足した５０％ＨａｍＦ１２及び５０％得イーグル最初基本培地中で維持した。細胞は、１０〜１４日目でコンフルエンシーに達し、大部分が単層として維持されたが、繊毛細胞の不連続なパッチも存在し、通常の繊毛活動をコンフルエンシー到達後１〜３週間維持された。この系では、インフルエンザＡ型ウイルスは１０６ＰＦＵ／ｍｌの力価且つ０．００１の感染多重度で成長した（Ｅｎｄｏ Ｙ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＮ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５５−２０５８）。感染中、進行性の細胞変性効果も認められた。この系の最も大きな欠点は、新鮮なヒトアデノイド組織が必要なことである。
この問題を解決するために、初代ヒトアデノイド上皮細胞を、市販の初代ヒト機上上皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）に置換し、細胞を同一条件下で成長させる。初代ヒト気道上皮細胞のこのような短期培養は、確立するのが比較的早く、ほとんどのｉｎ ｖｉｔｒｏ感染及び抗ウイルス実験のための最初の実験モデルとして有用である。
２．十分に分化したヒト気道上皮（ＷＤ−ＨＡＥ）。ヒト気道のｉｎ ｖｉｖｏ条件を最良に模倣するために、十分に分化したヒト気道上皮（ＷＤ−ＨＡＥ）モデルを使用する。ＷＤ−ＨＡＥは、正常なヒト気道上皮（機能的繊毛細胞及び粘液分泌細胞が含まれる）の全分化細胞を有する層状上皮である。従って、このモデル系では、インフルエンザウイルスは、生理学的に関連する宿主プロテアーゼによって活性化される可能性が最も高い。ＷＤ−ＨＡＥは、呼吸器ウイルス感染（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｐｅｅｐｌｅｓ ＭＥ，Ｂｏｕｃｈｅｒ ＲＣ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＰＬ ａｎｄ Ｐｉｃｋｌｅｓ ＲＪ．（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：５６５４−５６６６）、麻疹ウイルス（Ｓｉｎｎ ＰＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ，Ｖｏｎｇｐｕｎｓａｗａｄ Ｓ，Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｒ ａｎｄ ＭｃＣｒａｙ ＰＢ．（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：２４０３−２４０９）、又はヒトライノウイルス等）を研究するために広く使用されているが、インフルエンザウイルスを研究するためには以前に使用されていなかった。
ＷＤ−ＨＡＥの詳細なプロトコールは以前に記載されている（Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙ ＴＭ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＢＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＬＤ，Ｊｏｎｅｓ Ｎ，Ａｋｌｅｙ ＮＪ ａｎｄ Ａｄｌｅｒ ＫＢ．（２０００）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２２：６８５−６９２）。簡単に述べれば、市販の初代ヒト気管支上皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）を、ラット尾コラーゲンＩを薄くコーティングしたトランスウェル−クリア培養インサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ｃｌｅａｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ）（Ｃｏｓｔａｒ）上で培養する。細胞を、最初の５〜７日間、気管支上皮細胞成長培地（ＢＥＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）と成長因子を補足した高グルコース含有ＤＭＥＭとの１：１混合物を含む培地中に浸漬して培養する（Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙ ＴＭ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＢＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＬＤ，Ｊｏｎｅｓ Ｎ，Ａｋｌｅｙ ＮＪ ａｎｄ Ａｄｌｅｒ ＫＢ．（２０００）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２２：６８５−６９２）。培養物が７０％コンフルエントである場合（５〜７日目）、先端の培養物を除去し、細胞を培地のその基底面のみに曝露することによって大気−液体界面を作製する。細胞を、大気−液体界面で更に１４日間培養し（全部で２１日間）、その後に実験準備をする。分化した上皮を、ｉｎ ｖｉｖｏで数週間保持することができる。
上皮の形態及び分化の程度は、日常的な組織学によって立証する（Ｅｎｄｏ Ｙ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＮ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５５−２０５８）。簡単に述べれば、１０％緩衝化ホルマリンでの固定後、上皮細胞を、パラフィンに包埋し、切片にし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、粘膜分泌細胞については、定期的な酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色を行う。
分化細胞への０．００１〜１ ＭＯＩのウイルスの添加によって、インフルエンザ感染を上記の２つのモデル系で行う。上清中のウイルスの力価及び感染力は、３〜７日間にわたって続く。インフルエンザウイルスの増殖レベル及びインフルエンザウイルスの感染力を、従来のプラークアッセイ及び修正プラークアッセイを使用して評価する。
実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアプロチニン融合タンパク質機能の比較
アプロチニン融合タンパク質の抗ウイルス効果
１．感染前の処置。アプロチニン融合タンパク質を、種々の濃度で初代ヒト細胞培養物に添加し、細胞を１時間インキュベートする。細胞を新鮮な培地で洗浄し、直ちに０．０１〜１のＭＯＩのインフルエンザウイルスと共にインキュベートする。１時間後に細胞を再度洗浄し、３〜５日間培養する。種々の時点の上清中のウイルスの力価及び感染力を、２つのプラークアッセイによって測定する。ウイルス感染に起因する細胞変性効果を、生きた細胞のクリスタルバイオレットによる染色及び実験終了時の５７０ｎｍでの吸光度の測定による定量によって評価する。アプロチニン融合タンパク質による細胞防御率を、１００×｛（アプロチニン処置サンプル−非処置感染サンプル）／（非感染コントロール−非処置感染サンプル）｝によって計算する。細胞防御についての薬物有効性を、５０％の細胞保護を達成するその有効濃度（ＥＣ５０）によって記載する。ＨＡ活性化は、新規の放出されたウイルス粒子に対してのみ起こるので、最初のウイルス感染ラウンドは正常に起こり、ウイルス力価は感染後２４時間で上昇する。しかし、第２ラウンドの開始から、ウイルスの感染力は低下し、ウイルス力価はアプロチニン処置の結果として漸減する。この実験の結果により、１回の予防的処置でのその有効性によって種々の異なるアプロチニン融合タンパク質型が識別される。
或いは、最初のウイルス接種のタイミングを、アプロチニン処置直後から処置後２〜２４時間に変更する。ウイルス力価、感染力、及び細胞変性効果を、上記のように感染３〜５日後に測定する。これらの実験の結果により、１回の予防的処置後に有効期間（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗｉｎｄｏｗ）の長さによって種々のアプロチニン融合タンパク質が識別される。
２．感染後の処理。複数回投与処置のために、細胞を、最初に０．００１〜０．１ ＭＯＩで１時間のウイルス接種によって感染させる。その直後に種々の濃度のアプロチニン融合タンパク質を添加し、感染から最初の４８時間は、８時間間隔で更なる処置を適用する。感染７日後まで細胞を培養する。培地中のウイルスの力価及び感染力は、全過程で持続する。実験終了時に細胞変性効果を評価する。
単回投与処置のために、細胞を、最初に０．００１〜０．１ ＭＯＩで１時間のウイルス接種によって感染させる。種々の濃度のアプロチニン融合タンパク質処置を感染から最初の４８時間の異なる時点で適用するが、各細胞サンプルには全実験を通して１回のみ処置する。感染７日後まで細胞を培養する。培地中のウイルスの力価及び感染力は、全過程で持続する。実験終了時に細胞変性効果を評価する。これらの実験の結果により、その治療可能性について異なるアプロチニン融合タンパク質型が識別される。
アプロチニン融合タンパク質によるＨＡ切断の阻害
アプロチニン融合タンパク質がインフルエンザＨＡタンパク質の切断の阻害によってインフルエンザウイルス感染を阻害することを証明するために、ヒト初代上皮細胞培養物を、ＭＯＩ １にてインフルエンザウイルスに感染させる。アプロチニン融合タンパク質を、ウイルス接種直前又はウイルス感染直後のいずれで培養物に添加する。感染６．５時間後、培養物を、冷メチオニンを欠き、且つ１００μＣｉ／ｍｌ（パルス）の濃度の３５Ｓ標識メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むＭＥＭ中で１時間インキュベートする。その後、細胞を、１０倍濃度の冷メチオニンを含むＭＥＭで２回洗浄し、ＭＥＭ中で更に３時間インキュベートする（追跡）。標識後、細胞を放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液に溶解し、ＨＡを、感染のために使用したウイルスの特定の株に対する抗血清（抗インフルエンザ血清は、ＡＴＣＣ及びＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから入手することができる）によって沈殿させ、免疫複合体を、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって精製する。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、オートラジオグラフィを行う。アプロチニン融合タンパク質で処置されていないサンプルでは、ＨＡ１及びＨＡ２が主なＨＡ種であると予想される一方で、アプロチニン処理サンプルでは、ＨＡ０が存在する主なＨＡ型であると予想される。
実施例４：５つのシアリダーゼ遺伝子の合成並びにシアリダーゼタンパク質の発現及び精製
序論
インフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスのオルトミクソウイルス科ファミリーに属する。Ａ型及びＢ型は共に、宿主細胞に由来する脂質エンベロープ中に封入された８つのセグメント化マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有する。ウイルスエンベロープは、以下の３つのタンパク質から構成されるスパイクで覆われている：宿主細胞受容体にウイルスを付着させてウイルスと細胞膜との融合を媒介する血球凝集素（ＨＡ）；宿主細胞からの新規のウイルスの放出を促進するノイラミニダーゼ（ＮＡ）；及びイオンチャネルとしての機能を果たす少数のＭ２タンパク質。インフルエンザＡ型ウイルスについて、ＨＡ及びＮＡは共に抗原連続変異及び抗原不連続変異を受け、ウイルスサブタイプを、そのＨＡタンパク質とＮＡタンパク質との間の血清学的相違によって識別する。全部で１５のＨＡ型（Ｈ１〜Ｈ１５）及び９つのＮＡ型（Ｎ１〜Ｎ９）が存在し、これまでに３つのＨＡ（Ｈ１〜Ｈ３）及び２つのＮＡ（Ｎ１及びＮ２）のみが、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスで見出されている（Ｇｒａｎｏｆｆ，Ａ．＆ Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｄ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ ２）。インフルエンザＡ型ウイルスと対照的に、インフルエンザＢ型ウイルスでは異なる抗原サブタイプは認められない。
インフルエンザＢ型ウイルスがヒトのみにおいて循環する一方で、インフルエンザＡ型ウイルスを全動物宿主（ブタ、ウマ、ニワトリ、カモ、及び他の鳥類等）から単離することができ、これは、インフルエンザＡ型ウイルスが遺伝子再集合して抗原不連続変異を引き起こすことを示す。野生の水生鳥類は鳥類及び哺乳動物種の全インフルエンザウイルスの根源となる貯蔵所と見なされる。水生鳥類と他の種（ブタ及びウマが含まれる）との間のウイルスの伝播及びブタを介したヒトへの間接的伝播についての多数の証拠が存在する。ブタ又はニワトリからヒトへの直接伝播も立証されている（Ｉｔｏ，Ｔ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４（６）：４２３−４３０）。
インフルエンザウイルスの宿主細胞受容体は、細胞表面シアル酸である。シアル酸は、通常、糖タンパク質及び糖脂質に付着するオリゴサッカリド鎖の最も外側の位置で見出される９炭素骨格を有するアルファケト酸である。主なシアル酸型の１つは、ほとんどの他の型の生合成前駆体であるＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）である。Ｎｅｕ５Ａｃと炭水化物側鎖の最後から２番目のガラクトース残基との間の２つの主な結合は、事実上、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌで見出される。Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌ分子及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ分子の両方は、受容体としてインフルエンザＡ型ウイルスによって認識され得るが（Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８２）Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４０：１３１−２３５）、ヒトウイルスはＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌを好むようであり、トリウイルス及びウマウイルスは、主にＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを認識する（Ｉｔｏ，Ｔ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４（６）：４２３−４３０）。
インフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルスの感染は、典型的には、上気道の粘膜面で開始される。ウイルスの複製は、主に上気道に限定されるが、下気道に拡大して気管支肺炎を引き起こして死に至り得る。死亡リスクは、感染者１０，０００に１人であるが、心肺疾患を罹患した高リスク群及び流行中に免疫学的にナイーブな個体では有意に高くなる。
両方の受容体シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌ）を有効に分解することができるシアリダーゼを含む治療化合物は、最も広範囲のインフルエンザウイルス（動物ウイルスが含まれる）に対して防御することができる。ウイルス株が毎年変化する場合でも、有効性を保持し得る。シアリダーゼがウイルスよりもむしろ宿主細胞をターゲティングし、ウイルス生活環の「チョーキングポイント（ｃｈｏｋｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）」で作用するので、耐性ウイルスは生成されそうにない。タンパク質結合シアル酸は、３３時間の半減期で細胞表面上で均一に代謝回転する（Ｋｒｅｉｓｅｌ，Ｗ，ＶｏＩｋ，ＢＡ，Ｂｕｃｈｓｅｌ，Ｒ．ａｎｄ Ｒｅｕｔｔｅｒ，Ｗ．（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：１８２８−１８３１）。従って、我々は、１日１回又は１日２回のシアリダーゼの投与によってインフルエンザから十分に防御すると推定する。
シアリダーゼは高等真核生物、更に、いくつかの大部分が病原性の微生物（ウイルス、細菌、及び原生動物が含まれる）で見出される。ウイルス及び細菌シアリダーゼは十分に特徴づけられており、そのいくつかの三次元構造が決定されている（Ｃｒｅｎｎｅｌｌ，ＳＪ，Ｇａｒｍａｎ，Ｅ，Ｌａｖｅｒ，Ｇ，Ｖｉｍｒ，Ｅ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：５３５−５４４；Ｊａｎａｋｉｒａｍａｎ，ＭＮ，Ｗｈｉｔｅ，ＣＬ，Ｌａｖｅｒ，ＷＧ，Ａｉｒ，ＧＭ ａｎｄ Ｌｕｏ，Ｍ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：８１７２−８１７９；Ｐｓｈｅｚｈｅｔｓｋｙ，Ａ，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｃ，Ｍｉｃｈａｕｄ，Ｌ，Ｉｇｄｏｕｒａ，Ｓ，Ｗａｎｇ，Ｓ，Ｅｌｓｌｉｇｅｒ，Ｍ，Ｑｕ，Ｊ，Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｄ，Ｇｒａｖｅｌ，Ｒ，Ｄａｌｌａｉｒｅ，Ｌ ａｎｄ Ｐｏｔｉｅｒ，Ｍ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １５：３１６−３２０）。いくつかのヒトシアリダーゼも近年クローン化されている（Ｍｉｌｎｅｒ，ＣＭ，Ｓｍｉｔｈ，ＳＶ，Ｃａｒｒｉｌｌｏ ＭＢ，Ｔａｙｌｏｒ，ＧＬ，Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，Ｍ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＲＤ．（１９９７）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７２：４５４９−４５５８；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｎｅｓｔｉ，Ｃ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．１９９９．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ９：１３１３−１３２１；Ｗａｄａ，Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ，Ｔｏｋｕｙａｍａ，Ｓ，Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ，Ａｋｉｔａ，Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ ２６１：２１−２７；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３−３５１）。特徴づけられた全てのシアリダーゼは、アミノ末端部分に４つのアミノ酸モチーフ及びその後にタンパク質によって３〜５回反復したＡｓｐボックスを共有している（Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３−３５１；Ｃｏｐｌｅｙ，ＲＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＲＢ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ，ＣＰ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １０：２８５−２９２）。シアリダーゼスーパーファミリーの全アミノ酸同一性が約２０〜３０％と比較的低い一方で、分子（具体的には、触媒アミノ酸）の全折り畳みは著しく類似している（Ｗａｄａ，Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ，Ｔｏｋｕｙａｍａ，Ｓ，Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ，Ａｋｉｔａ，Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ ２６１：２１−２７；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３−３５１；Ｃｏｐｌｅｙ，ＲＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＲＢ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ，ＣＰ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １０：２８５−２９２）。
シアリダーゼは、一般に、以下の２つのファミリーに分類される：「小」シアリダーゼは、分子量が約４２ｋＤａであり、活性を最大にするために２価の金属イオンを必要としない；「巨大」シアリダーゼは、分子量が約６５ｋＤａであり、活性のために２価の金属イオンを必要とし得る（Ｗａｄａ，Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ，Ｔｏｋｕｙａｍａ，Ｓ，Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ，Ａｋｉｔａ，Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ ２６１：２１−２７；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３−３５１；Ｃｏｐｌｅｙ，ＲＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＲＢ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ，ＣＰ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １０：２８５−２９２）。
１５種を超えるシアリダーゼタンパク質が精製されており、これらは互いに基質特異性及び酵素動力学が非常に異なる。インフルエンザウイルスに対して広範に防御するために、シアリダーゼは、アルファ（２，６）−Ｇａｌ結合及びアルファ（２，３）−Ｇａｌ結合並びに糖タンパク質及びいくつかの糖脂質中のシアル酸を有効に分解する必要がある。ウイルスシアリダーゼ（インフルエンザＡウイルス、家禽ペストウイルス、及びニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ）は、一般に、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌに特異的であり、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌを非常に非効率的にしか分解しない。小細菌シアリダーゼは、一般に、糖タンパク質及び糖脂質中のシアル酸との反応性が低い。対照的に、巨大細菌シアリダーゼは、ほとんどの天然基質中のアルファ（２，６）−Ｇａｌ結合及びアルファ（２，３）−Ｇａｌ結合を有効に切断することができる（図４；Ｖｉｍｒ，ＤＲ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２：２７１−２７７；Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，Ｒ．（１９７３）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｊ ５：２７１−２９０；Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ，Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ，ＲＧ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９９５）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７６：５６９−５７５；Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ，Ｈｏｙｅｒ，ＬＬ ａｎｄ Ｖｉｍｒ，ＥＲ．（１９９３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂ ９：９１５−９２１）。その広い基質特異性のために、巨大細菌シアリダーゼがより良好な候補である。
図４に示す公知の基質特異性を有する巨大細菌シアリダーゼのうち、コレラ菌シアリダーゼは、活性のためにＣａ２＋が必要であり、あまり好ましくない。より好ましいシアリダーゼには、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来の７１ｋＤａの酵素、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）由来の１１３ｋＤａの酵素、及びアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼが含まれる。第３のシアリダーゼ（ミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）由来の６８ｋＤａの酵素）は、インフルエンザウイルス受容体を破壊することが公知であり（Ａｉｒ，ＧＭ ａｎｄ Ｌａｖｅｒ，ＷＧ．（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１：２７８−２８４）、これも候補である。
これらの酵素は、高い比活性をを有し（ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）については６００ Ｕ／ｍｇタンパク質（Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，ＡＰ，Ｖｅｈ，ＲＷ，Ｗｅｍｂｅｒ，Ｍ，Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８１）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ １９７：２９３−２９９）及びＡ．ビスコサス（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）については６８０ Ｕ／ｍｇタンパク質（Ｔｅｕｆｅｌ，Ｍ，Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８９）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７０：４３５−４４３））、２価の金属イオンを用いずに完全に活性であり、大腸菌由来の組換えタンパク質としてクローン化及び精製されている（Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ，Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ，ＲＧ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９９５）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７６：５６９−５７５，Ｔｅｕｆｅｌ，Ｍ，Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８９）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７０：４３５−４４３ ，Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｋ，Ｏｈｔａ，Ｔ ａｎｄ Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．（１９９２）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４：６８９６− ６９０３）。更に、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、２〜８℃の溶液中で数週間安定であり、アルブミンの存在下では４℃で２年を超えて安定である（Ｗａｎｇ，ＦＺ，Ａｋｕｌａ，ＳＭ，Ｐｒａｍｏｄ，ＮＰ，Ｚｅｎｇ，Ｌ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｒａｎ，Ｂ．（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：７５１７−２７）。Ａ．ビスコサス（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）は、凍結及び融解に対して不安定であるが、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中では４℃で安定である（Ｔｅｕｆｅｌ，Ｍ，Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．（１９８９）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７０：４３５−４４３）。
タンパク質が上気道で局所的に使用されて全身に吸収されないので、細菌シアリダーゼを使用して免疫反応を誘導する機会は非常に低いが、ヒト酵素はヒト被験体での長期使用により望ましい。
これまで、以下の４つのシアリダーゼ遺伝子がクローン化されている：ＮＥＵ１／Ｇ９／リソソームシアリダーゼ（Ｐｓｈｅｚｈｅｔｓｋｙ，Ａ，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｃ，Ｍｉｃｈａｕｄ，Ｌ，Ｉｇｄｏｕｒａ，Ｓ，Ｗａｎｇ，Ｓ，Ｅｌｓｌｉｇｅｒ，Ｍ，Ｑｕ，Ｊ，Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｄ，Ｇｒａｖｅｌ，Ｒ，Ｄａｌｌａｉｒｅ，Ｌ ａｎｄ Ｐｏｔｉｅｒ，Ｍ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １５：３１６−３２０．，Ｍｉｌｎｅｒ，ＣＭ，Ｓｍｉｔｈ，ＳＶ，Ｃａｒｒｉｌｌｏ ＭＢ，Ｔａｙｌｏｒ，ＧＬ，Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，Ｍ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＲＤ．（１９９７）．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７２：４５４９−４５５８）；ＮＥＵ３（ヒト脳から単離された膜結合シアリダーゼ）（Ｗａｄａ，Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ，Ｔｏｋｕｙａｍａ，Ｓ，Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ，Ａｋｉｔａ，Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ ２６１：２１−２７，Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３−３５１）、ＮＥＵ２（ヒト骨格筋で非常に低レベルで発現される４２ｋＤａのシアリダーゼ）（Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｎｅｓｔｉ，Ｃ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ９：１３１３−１３２１）、及びＮＥＵ４（試験した全ヒト脳で発現した４９７アミノ酸タンパク質）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ０８０７４１）（Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ，Ｂ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６−６６３）。
アミノ酸配列比較により、ＮＥＵ２（配列番号８）及びＮＥＵ４（配列番号９）が共に細胞質シアリダーゼであることが明らかである。ネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）シアリダーゼの触媒部位を形成する１２個のアミノ酸残基のうちの９残基がＮＥＵ２及びＮＥＵ４の両方で保存されている（Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｎｅｓｔｉ，Ｃ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（１９９９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ９：１３１３−１３２１、図３）。更に、ＮＥＵ４はまた、公知の哺乳動物シアリダーゼでは固有であると思われる約８０アミノ酸残基（ａａ ２９４〜３７３）のストレッチを示す（Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ，Ｂ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６−６６３。選択された巨大細菌シアリダーゼと異なり、ＮＥＵ２及びＮＥＵ４の基質特異性は未知である。ＮＥＵ２及びＮＥＵ４がインフルエンザウイルス受容体を有効に分解することができるかどうかを試験する必要がある。
シアリダーゼアッセイ
ＮＥＵ２、ＮＥＵ４、及びＭ．ビリジファシエンス（Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）の酵素をＰＢＳ及び５０％グリセロール中にて−２０℃で保存する。ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びＡ．ビスコサス（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）の酵素を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中にて４℃で保存する。タンパク質調製物（ｐｒｅｐ）を、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって特徴づける。酵素の比活性及び安定性を、シアリダーゼアッセイによってモニタリングする。
シアリダーゼの酵素活性を、基質としての２’−（４−メチルウンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４Ｍｕ−ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）の蛍光測定によって決定する。具体的には、４００マイクログラムウシ血清アルブミンの存在下での最終体積が１００マイクロリットルの０．２ｍＭ ４ＭＵ−ＮＡＮＡを含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム／リン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中における反応物を２連で準備し、３７℃で５〜１０分間インキュベートした。１ｍｌの０．２Ｍグリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．２）の添加によって反応を停止させる。４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を使用して、３６５ｎｍでの励起及び４４５ｎｍでの発光を使用した蛍光光度計で蛍光発光を測定して、検量線を得る。
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシアリダーゼ機能の比較及び更なる研究のためのシアリダーゼの選択
１．インフルエンザウイルスのストック
インフルエンザウイルス株を、ＡＴＣＣ及びＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの貯蔵所から入手する。ウイルスストックを、０．３％ウシ血清アルブミン及び０．５マイクログラムトリプシン／ｍｌを補足した最少基本培地（ＭＥＭ）中にてＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上で成長させる。４８〜７２時間のインキュベーション後、培養培地を低速遠心分離によって明澄化する。ウイルス粒子を、２５％スクロースクッションによる超遠心によってペレット化する。精製ウイルスを、５０％グリセロール−０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．３）に懸濁し、−２０℃で保存する。ウイルス力価を、プラークアッセイ（Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ，Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｃ ａｎｄ Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ｍ．（１９７５）Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｎｕｏｌ １６２：９−１４）又は５０％のＭＤＣＫ細胞が感染する必要があるウイルスの用量であるＴＣＩＤ５０によって決定する。
以下のＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ又はＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌに対する親和性を有し、且つ受容体に対して高い親和性を有する選択されたヒト及び動物のインフルエンザＡ型株を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために選択する。
１．受容体Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌを認識する株には、ヒト単離物Ａ／ａｉｃｈｉ／２／６８、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／７２、Ａ／Ｐｒｏｔ Ｃｈａｉｍｅｒｓ／１／７３、及びＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５等が含まれる（Ｃｏｎｎｏｒ，ＲＪ，Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＲＧ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ ＪＣ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：１７−２３）。
２．Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを有する株には、具体的には、動物単離物Ａ／ｄｕｃｋＵｋｒａｉｎｅ／１／６３、Ａ／ｄｕｃｋＭｅｍｐｈｉｓ／９２８／７４、Ａ／ｄｕｃｋｈｏｋｋ／５／７７、Ａ／Ｅｑ／Ｍｉａｍｉ／１／６３、Ａ／Ｅｑ／Ｕｒ／１／６３、Ａ／Ｅｑ／Ｔｏｋｙｏ／７１、Ａ／Ｅｑ／Ｐｒａｇｕｅ／７１等が含まれる（Ｃｏｎｎｏｒ，ＲＪ，Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＲＧ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ ＪＣ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：１７−２３）。
２．血球凝集アッセイ
このアッセイを使用して、各酵素が受容体Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌを破壊する効率を迅速に決定する。
具体的には、６ｍｌのニワトリ赤血球（ＳＰＡＦＡＳ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＣＴ）を、２倍体積のＰＢＳで希釈し、５００×ｇで５分間遠心分離し、元の体積のＰＢＳ中に再懸濁する。種々の濃度のシアリダーゼをニワトリ赤血球に添加し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を３回洗浄してシアリダーゼタンパク質を除去し、ＰＢＳで６ｍｌに再懸濁する。コントロール細胞をＢＳＡと共にインキュベートし、洗浄する。上記列挙の受容体としてＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）−Ｇａｌ又はＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）−Ｇａｌのいずれかを認識する種々のインフルエンザウイルス株を、元のウイルスストックのＰＢＳでの連続希釈物（１００マイクロリットル）としてマイクロタイタープレート中に調製する。シアリダーゼ処置又はコントロールのニワトリ赤血球懸濁液（上記で調製した１００マイクロリットルの０．５％溶液）を、４℃で各ウェルに添加する。２時間後にプレートを読み取る。血球を凝集させる最も低い濃度のウイルスを、１血球凝集単位と定義する。我々は、全ウイルス株による血球凝集を有効に無効にする酵素を検索する。
３．ウイルス阻害アッセイ
ＭＤＣＫ細胞のコンフルエントな単層を、種々の濃度のシアリダーゼで１時間処置し、緩衝液で２回洗浄し、種々のインフルエンザウイルス株を感染させる。１時間のインキュベーション後、細胞を再度洗浄して非結合ウイルスを除去する。細胞表面上のウイルス結合部位の減少を確立するために、細胞に寒天を重層し、３７℃でインキュベートする。シアリダーゼ処置細胞中のプラーク数を、コントロール細胞と比較する。或いは、細胞を通常の培地中で３７℃で培養し、培養培地中のウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０として種々の培養期間で測定する。
シアリダーゼ処置によって既存の感染を阻害することができることを証明するために、ＭＤＣＫ単層を、最初に低力価のウイルスで感染させる。非結合ウイルスを洗い流した後、細胞をシアリダーゼの存在下で培養する。新鮮なシアリダーゼを、細胞培養物に２４時間毎に添加する。培養培地中のウイルス力価を、７２時間にわたって測定する。
４．細胞傷害性アッセイ
初代ヒト気管支上皮細胞を購入し（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、製造者の説明書に従って、添加最少培地で培養する。種々の濃度のシアリダーゼを培養培地に添加する。７〜１０日間にわたって細胞成長を測定する。また、細胞を、微視的細胞変性効果について定期的に観察する。
実施例６：シアリダーゼ融合タンパク質の構築及び試験
１．アンカードメインとしてのＧＡＧ結合配列の選択
全ての性質（抗ウイルス活性、毒性、安定性、産生の容易さ等が含まれる）が最良である１つのシアリダーゼを選択する。次いで、我々は、これをＧＡＧ結合配列を遺伝学的に連結し、ｐＱＥベクターに融合遺伝子をサブクローン化し、大腸菌由来の融合タンパク質を発現及び精製する。
我々は、以下の６つの可能なヒトＧＡＧ結合配列を選択した：ＰＦ４（ａａ ４７〜７０）（配列番号２）、ＩＬ−８（ａａ ４６〜７２）（配列番号３）、及びＡＴ ＩＩＩ（ａａ １１８〜１５１）（配列番号４）、ＡｐｏＥ（ａａ １３２〜１６５）（配列番号５）、アンフィレグリン（ａａ ２５〜４５）（配列番号６）、及びヒト血管関連遊走タンパク質（ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＭＰ）（ａａ １４〜２５）（配列番号７）（図２）。これらの配列は、一般に、ナノモルレベルの親和性でヘパリンに結合するが、その親和性は、互いに非常に異なり得る（表１）。アンカードメインがシアリダーゼを最も有効に機能させることができるかどうかは明らかではないので、４つ全てのＧＡＧ結合配列を、以下のコンストラクトとして、一般的リンカー配列ＧＧＧＧＳを介してＮ末端及びＣ末端上のシアリダーゼ遺伝子と融合する。
（ＧＡＧ結合ドメイン−ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）−シアリダーゼ）；及び
（シアリダーゼ−ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）−ＧＡＧ結合ドメイン）
修正ウイルス阻害アッセイによって異なる融合タンパク質を比較する。具体的には、ＭＤＣＫ細胞のコンフルエントな単層を、同量の各融合タンパク質で限られた期間処理する（３０分間等）。次いで、細胞を緩衝液で２回洗浄して非結合シアリダーゼ融合タンパク質を除去し、培養培地中で更に１時間インキュベートする。その後、細胞にインフルエンザウイルス株１時間添加し、細胞を再度洗浄して非結合ウイルスを除去する。培養培地中のウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０として７２時間の培養中に測定する。このアッセイで、非融合シアリダーゼタンパク質を使用して、融合タンパク質と比較する。結果が近すぎて全ての融合タンパク質をランク付けすることができない場合、我々は、融合タンパク質の処置期間（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｎｄｏｗ）の短縮、タンパク質濃度の減少、及びウイルス攻撃誘発レベルの増加によってアッセイをよりストリンジェントにする。
２．融合タンパク質コンストラクトの至適化
初期の実験から最良の融合タンパク質を選択した後、コンストラクトを、異なるリンカー長の試験によって更に至適化する。これに関して、以下のコンストラクトを作製する。
（シアリダーゼ−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ（ｎ＝０、１、２、３、又は４）−ＧＡＧ結合ドメイン）
上記のように、タンパク質を発現及び精製し、修正ウイルス保護アッセイで比較する。
更に、初期のデータがヘパラン硫酸に対する融合タンパク質のより高い親和性によって有効性がより高くなることを示す場合、我々はまた、ＧＡＧ結合親和性の増加によって有効性を更に改良することができるかどうかを試験することを計画する。以下のようなコンストラクト中の融合タンパク質の多価ＧＡＧ結合機構の作製によってこれを行うことができる。
（シアリダーゼ−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ−ＨＳ結合ドメイン−ＧＡＧ結合ドメイン）；
又は
（ＧＡＧ結合ドメイン−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ−シアリダーゼ−（ＧＧＧＧＳ（配列番号１０））ｎ−ＧＡＧ結合ドメイン）
上記のように、精製融合タンパク質を、修正ウイルス保護アッセイでのその活性に基づいてランク付けする。
３．細胞傷害性アッセイ
正常な細胞成長及び形態に対する融合タンパク質の効果を、種々の濃度の融合タンパク質との初代ヒト気管支上皮細胞との培養、細胞の成長曲線の追跡、及び任意の微視的細胞変性効果の観察によってモニタリングする。
実施例７：他の感染性微生物に対する融合タンパク質
機能ドメイン及びアンカードメインから構成される融合タンパク質を、多数のより異なる適用のためにデザインする。多数の他の感染性微生物（パラミクソウイルス（Ｗａｓｓｉｌｅｗａ，Ｌ．（１９７７）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ５４：２９９−３０５）、コロナウイルス（Ｖｌａｓａｋ，Ｒ．，Ｌｕｙｔｊｅｓ，Ｗ．，Ｓｐａａｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４５２６−４５２９）、ロタウイルス（Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｅ，Ｏ．ａｎｄ Ｋｏｎｎｏ，Ｔ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２：１９６−２０５）、緑膿菌（Ｒａｍｐｈａｌ，Ｒ．ａｎｄ ＰｙＩｅ，Ｍ．（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４１：３３９−４４）等）も細胞受容体としてシアル酸を使用することが公知であるので、例えば、本明細書中で提案したシアリダーゼ融合タンパク質を、インフルエンザに加えて他のウイルス及び細菌による感染に対する治療薬／予防薬としても使用することができる。例えば、ヘパリン結合ドメインに融合したアプロチニンは、インフルエンザに加えて、パラインフルエンザウイルス等の活性化に宿主セリンプロテアーゼを必要とする他のウイルスの感染を防止／治療するために使用される融合タンパク質を作製することができる。
実施例８：シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質のクローニング
巨大細菌シアリダーゼに関する公開された論文によれば、５１ｋＤａのアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来の７１ｋＤａのシアリダーゼ、及びアクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）由来の１１３ｋＤａのシアリダーゼは、種々のシアル酸抱合体に対する比活性及び広範な基質特異性が類似しているようである（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ（１９９５），２７０−２７３；Ｃｏｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（１９８１）１９７（２），２９３−２９９；Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ，（１９９５）３７６（９），５６９−５７５；Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ，（１９８９）３７０（５），４３５−４４３）。第３のシアリダーゼ（ミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）由来の６８ｋＤａの酵素）は、インフルエンザウイルス受容体を破壊することも公知である（Ａｉｒ ａｎｄ Ｌａｖｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９９５）２１１（１），２７８−２８４；（１９９５），２７０−２７３）。
Ａ．ビスコサス（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）は、ヒト口腔及び胃腸管の正常な細菌叢の一部である（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，（１９８４）６ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ６２−Ｓ６６）。Ａ．ビスコサス（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ）由来のシアリダーゼが通常はヒト粘膜表面上を宿主とする細菌によって分泌されるので、ヒト粘膜免疫系に耐性を示すはずである。従って、ヒト気道表面に局所的に送達した場合、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）は免疫原性を示す可能性が低い。我々は、この特徴により、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）が治療薬として良好な候補となると考える。
我々は、アミノ酸２７４からアミノ酸６６７までにわたるＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）がシアリダーゼの触媒ドメイン（ＡｖＣＤと呼ばれる）を含むはずであり、そのままで完全に活性であるはずであると判断した。その後、我々は、ＡｖＣＤフラグメントをクローン化し、このＡｖＣＤフラグメント及びＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）タンパク質配列（配列番号１２）の少なくともアミノ酸２９０〜６６６（アミノ酸２７４からアミノ酸６８１までにわたるフラグメント、アミノ酸２７４からアミノ酸６６６までにわたるフラグメント、アミノ酸２９０からアミノ酸６６６までにわたるフラグメント、及びアミノ酸２９０からアミノ酸６８１までにわたるフラグメント等）を含む他のＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）フラグメントがシアリダーゼ活性を有することを証明した。
Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）タンパク質及び遺伝子の完全な配列を、ＧｅｎＢａｎｋから得た（Ａ４９２２７及びＬ０６８９８）。公知の三次元構造（Ｍ．ビリジファシエンス（Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）及びネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））を有するシアリダーゼとの相同性に基づいて、我々は、アミノ酸２７４〜６６７（配列番号１６）の間に局在するように、触媒ドメイン（ＣＤ）配列を割り当てた。Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）（ＡｖＣＤ）の触媒ドメインをクローン化するために、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）遺伝子のこの領域を、大腸菌における発現のために至適化されたコドン（配列番号１５）を使用して操作した。Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）のアミノ酸２７４〜６６７をコードするコドン至適化ＡｖＣＤヌクレオチド配列（配列番号１５）を、アニーリングし、ＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）にクローン化した重複オリゴヌクレオチドの化学合成によって産生した。
標準的な分子クローニング法を使用して、シアリダーゼ融合コンストラクトを作製した。Ｈｉｓ６−ＡｖＣＤコンストラクトを、ＡｖＣＤ配列のＮ末端残基への６つのヒスチジン（Ｈｉｓ６）の融合によって作製した。Ｈｉｓ６−ＡＲコンストラクトは、配列番号１７のヌクレオチド配列及び配列番号１８の翻訳アミノ酸配列を有する。これらの配列を、図７に示す。
ＡＲ−ＡｖＣＤコンストラクトを作製するために、アンカードメインを、ＡｖＣＤ配列のＮ末端残基に直接融合した。ＡＲと呼ばれるアンカードメインは、ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）前駆体のＧＡＧ結合配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ０９７９９）に由来していた。ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）前駆体のアミノ酸１２５〜１４５をコードするヌクレオチド配列（図２、配列番号７）を、２つの重複オリゴヌクレオチドとして化学合成した。ＡＲ−ＡｖＣＤコンストラクトは、配列番号１９のヌクレオチド配列及び配列番号２０の翻訳アミノ酸配列を有する。
別のコンストラクト（ＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤ）を、ＡＲ−ＡｖＣＤコンストラクトで使用したＡＲコード配列と５アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧＳ；配列番号１０）をコードする配列と融合し、その後、翻訳産物中でリンカーがＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインのＮ末端に融合するようにＡｖＣＤ配列と融合することによって作製した。このコンストラクトのヌクレオチド配列（配列番号３４）及び翻訳アミノ酸配列（配列番号３５）を図９に示す。全コンストラクトを、ｐＴｒｃ９９ａ発現ベクターにクローン化した。
更に、Ａ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインをＡＲのＮ末端（ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）のＧＡＧ結合ドメイン；配列番号７）に融合した４つのコンストラクトを作製した。コンストラクト番号４（配列番号２７）では、配列番号１２のアミノ酸２７４〜６６６からなるＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを、アンフィレグリンのＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）と融合した。コンストラクト番号５（配列番号２９）では、配列番号１２のアミノ酸２７４〜６８１からなるＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを、アンフィレグリンのＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）と融合した。コンストラクト番号６（配列番号３１）では、配列番号１２のアミノ酸２９０〜６６６からなるＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを、アンフィレグリンのＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）と融合した。コンストラクト番号７（配列番号３３）では、配列番号１２のアミノ酸２９０〜６８１からなるＡ．ビスコサスシアリダーゼ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ｓｉａｌｉｄａｓｅ）の触媒ドメインを、アンフィレグリンのＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）と融合した。全てのこれらのコンストラクトは、アッセイで類似のシアリダーゼ活性を示した。
実施例９：シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質の産生
シアリダーゼ融合タンパク質を産生するために、発現コンストラクトを、大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。１つのコロニーを、２．５ｍｌのＬＢブロスに接種し、震盪しながら３７℃で一晩成長させた。午前中に、２ｍｌの一晩培養物を５００ｍｌのＴＢ培地を含む２リットルの震盪フラスコに接種し、培養物を、ＯＤ６００＝４．０まで（２〜４時間）、震盪しながら３７℃で成長させた。最終濃度が１ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導し、撹拌しながら３時間継続した。５，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を採取した。細胞を１回洗浄し（ＰＢＳ中に再懸濁し、再度遠心分離する）、１５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。
タンパク質の発現及び精製で使用した培地及び緩衝液の組成
タンパク質発現用ＴＢ培地
溶液１
Ｂａｃｔｏ−トリプトン−１２ｇ
酵母抽出物−２４ｇ
Ｈ２Ｏで８００ｍｌにする

溶液２
ＫＨ２ＰＯ４（無水）−２．３ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４（無水）−１２．５ｇ
Ｈ２Ｏで１００ｍｌにする
溶液１及び２を個別に加圧滅菌し、冷却し、混合し、以下を添加する。
６０ｍｌの２０％グリセロール（濾過滅菌済）
２０ｍｌの２０％グルコース（濾過滅菌済）

溶解緩衝液
５０ｍＭ リン酸（ｐＨ８．０）
１０％グリセロール
３００ｍＭ ＮａＣｌ
溶解緩衝液に懸濁した細菌細胞を超音波処理によって溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去した。明澄化溶解物を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ベッド体積１５ｍｌ、流速１２０ｃｍ／時間）に通した。内毒素の除去中にフルダーゼが確実に良好に保持されるように、カラムをより低いｐＨ及び塩を含む１体積のＰＢＳに対して再馴化した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳを含む５体積のＰＢＳでのカラムの洗浄によって内毒素を除去した。３体積のＰＢＳ及び３体積の溶解緩衝液を使用して、界面活性剤を洗い流した。タンパク質を、０．８Ｍ ＮａＣｌを含む溶解緩衝液を使用してカラムから溶離した。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから溶離した画分を、１．９Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に調整し（このステップで、ほとんどの含有タンパク質が塩析される）、遠心分離によって明澄化した。上清を、ブチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした（流速１２０ｃｍ／時間）。カラムを２体積の１．３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４で洗浄し、融合物を０．６５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４で溶離した。最終ステップのために、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００にて流速２５ｃｍ／時間でサイズ排除クロマトグラフィを行った。以下の段落に記載のように、４−ＭＵ−ＮＡＮＡに対するシアリダーゼ活性を決定した。Ｂｉｏ−ＲａｄのＢｒａｄｆｏｒｄキットを使用してタンパク質濃度を決定した。タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、９８％を超えると推定された。酵素の比活性は、約９３７Ｕ／ｍｇであった。最終調製物中の内毒素を、ＬＡＬ試験（Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用して測定し、０．５ＥＵ／ｍｌ未満であると推定された。
Ｈｉｓ６含有融合タンパク質の精製のために、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる陽イオン交換を、Ｎｉ−ＮＴＡによる金属キレートアフィニティクロマトグラフィで行った。０．２５Ｍイミダゾールを含む溶解緩衝液によってＮｉ−ＮＴＡからの溶離を行ったことを除き、緩衝液は全て同一のままであった。
実施例１０：シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質の活性を測定するためのシアリダーゼアッセイ
コンストラクト番号２によってコードされたＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質のシアリダーゼ活性をアッセイし、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）から精製した天然のシアリダーゼの活性と比較した。更に、アンフィレグリンＧＡＧ配列（配列番号７）をＮｅｕ２ヒトシアリダーゼ（配列番号８）と融合したコンストラクトから産生された融合タンパク質もシアリダーゼ活性についてアッセイした。
単位／ｍｇシアリダーゼとして示したシアリダーゼ活性を、人工的な蛍光発生基質４−ＭＵ−ＮＡＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用したシアリダーゼアッセイによって測定した。１単位のシアリダーゼを、０．２ｍｌの２０ｎｍｏｌの４−ＭＵ−ＮＡＮＡを含む反応物中における３７℃で１０分間に１０ｎｍｏｌの４−ＭＵ−ＮＡＮＡから放出される酵素の量（５０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５））と定義する。１ｍｌの０．２Ｍグリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．２）の添加によって反応を停止させる。４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を使用して、３６５ｎｍでの励起及び４４５ｎｍでの発光を使用した蛍光光度計で蛍光発光を測定して、検量線を得る（Ｐｏｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９７９）９４（２），２８７−２９６）。

Figure 2008512117
我々の結果は、ＡｖＣＤ融合タンパク質（ＡＲ−ＡｖＣＤ）が試験した全てのシアリダーゼのうちで最も高い比活性を有することを示す（表２）。ＡＲ−ＡｖＣＤの比活性は、ヒトシアリダーゼ融合物（ＡＲ−ＮＥＵ２）の比活性の１００倍超であり、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）シアリダーゼの比活性の２倍超である。シアリダーゼの安定性を比較した実験結果は、ＡＲ−ＡｖＣＤが非常に高い安定性を示す。２５℃又は４℃の溶液中で２０週間後にＡＲ−ＡｖＣＤの活性の喪失は検出されなかった。比較すると、ＡＲ−ＮＥＵ２溶液は、それぞれ２５℃及び３７℃で保存した場合の半減期は５週間及び２週間であった。
実施例１１：シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質のＮ末端の至適化
ＡＲ−ＡｖＣＤ融合タンパク質のＮ末端は、一定の条件下で部分的に切断され、程度は小さいが精製ＡＲ−ＡｖＣＤ調製物中のタンパク質が不均一になる。この問題を解決するために、我々は、シアリダーゼ融合タンパク質のＮ末端を至適化するためのアプローチをデザインした。Ｎ末端に無作為なアミノ酸を有するＡＲ−ＡｖＣＤを含むライブラリーを、以下のように構築した。ＡＲ−ＡｖＣＤを、遺伝子の５’末端上にアニーリングするプライマーがアミノ酸２及び３に対応する位置に無作為化配列を含むプライマー対を使用したＰＣＲによって増幅した。プライマーのヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を以下に示す。
ｔｔｔｔｃｇｔｃｔｃｃｃａｔｇｖｎｎｖｎｎａａｇｃｇｃａａａａａａａａａｇｇｃｇｇｃａ（配列番号２１）
ＭｅｔＸｘｘＸｘｘＬｙｓＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｙｓＧｌｙＧｌｙ（配列番号２２）
配列番号２１では、「ｎ」は、任意のヌクレオチド（ａ、ｃ、ｇ、又はｔ）を示し、「ｖ」はヌクレオチドａ、ｇ、又はｃを示す。このような方法での配列デザインにより（コドンの最初の位置にヌクレオチドｔは不可能である）、我々は、終始コドン並びに芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）及びＣｙｓの移入を回避した。ＮｃｏＩ適合性オーバーハングが生成されるようにＥｓｐ３Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（太字で示す）を移入した。遺伝子の３’末端にアニーリングするプライマーは、終始コドンの後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を保有していた。Ｅｓｐ３Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９ａ発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物を、大腸菌で形質転換し、細胞を、アンピシリンを含む液体培養にて一晩成長させた。
翌日、培養物を、新鮮な培地で希釈し、ＯＤ６００＝０．８まで成長させ、ＩＰＴＧで２時間誘導した。細胞を採取し、ホモジナイズし、融合物を液体クロマトグラフィによって２ステップ精製に供した。明澄化した溶解物を、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにロードした。カラムを、０．４５Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、融合物を０．９Ｍ ＮａＣｌで溶離した。溶離物を、１０％グリセロールで希釈して、ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍにし、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。カラムを、直線勾配のＮａＣｌで展開した。シアリダーゼ活性を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングし、４３ｋＤａのバンドを、アミノ末端配列決定に供した。
単離シアリダーゼ融合タンパク質の主なＮ末端残基は、Ｖａｌ又はＧｌｙのいずれかであり、その後にＡＲタグのＮ末端残基が存在する。次いで、我々は、コンストラクト番号２及び３によってコードされる最初の６つのアミノ酸が（Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２３））であるように、ＡＲ配列の前にＶａｌを移入することによって新規のシアリダーゼ融合コンストラクト（コンストラクト番号２及び３）を合成した。これらの新規の融合コンストラクトから作製したタンパク質のＮ末端配列は１００％相同であり、開始Ｍｅｔが完全に除去されており（治療タンパク質として望ましい）、Ｖａｌは最初のＮ末端残基であり、その後のＡＲタグ配列が存在する。これらのデータは、タンパク質のＮ末端アミノ酸残基の融合物としてのＮ末端プロセシング及びタンパク質安定性の共通規則を報告した以前の刊行物と一致する（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８９）８６（２１），８２４７−８２５１；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９６）９３（２２），１２１４２−１２１４９）。
新規の融合コンストラクト番号２（至適化Ｎ末端を有するＡＲ−ＡｖＣＤ）のヌクレオチド配列（配列番号２４）及びそのアミノ酸配列翻訳物（配列番号２５）を図１０に示す。新規の融合コンストラクト番号３（至適化Ｎ末端を有するＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤ）のヌクレオチド配列（配列番号３６）及びそのアミノ酸配列翻訳物（配列番号３７）を図１１に示す。コンストラクト番号２を感染させた大腸菌から単離したプロセシングされたタンパク質のアミノ酸配列を本明細書中に配列番号３８として提供し、コンストラクト番号３を感染させた大腸菌から単離したプロセシングされたタンパク質のアミノ酸配列を本明細書中に配列番号３９として提供する。
実施例１２：アンカードメインを含むか含まないシアリダーゼコンストラクトの活性の比較
ＡＲコンストラクトが実際にシアリダーゼ融合タンパク質の細胞表面活性を改善するかどうかを評価するために、我々は、コンストラクト番号２（図７に示す配列番号２４）又はコンストラクト番号１（Ｈｉｓ６−ＡｖＣＤ、図５に示す配列番号１７）で形質転換した大腸菌から精製したタンパク質を初代ヒト気管支上皮細胞とインキュベートし、十分な洗浄後に細胞結合シアリダーゼ活性を測定した。コンストラクト番号２タンパク質（配列番号２５）とインキュベートした細胞について、１０％までのシアリダーゼが細胞に結合していることが見出され、細胞結合シアリダーゼ活性は、コンストラクト番号２タンパク質の投入濃度によって用量依存的様式で増加した。しかし、コンストラクト番号１タンパク質（配列番号１８）とインキュベートした細胞は、バックグラウンドレベルのシアリダーゼ活性しか示さなかった。更に、我々は、コンストラクト番号２タンパク質又はコンストラクト番号１タンパク質のいずれかでＭＤＣＫ細胞を処理し、細胞表面上の残存アルファ（２，６）結合シアル酸レベルを測定した（図８）。１００ｍＵ／ウェル未満の酵素活性と同一レベルで、コンストラクト番号２タンパク質は、コンストラクト番号１タンパク質より顕著に高い有効性を示した。これらの結果は、ＡＲドメインが実際にシアリダーゼ機能を増強させることを示す。
実施例１３：シアリダーゼ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
インフルエンザウイルスのストック
インフルエンザウイルス株を、ＡＴＣＣ及びＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの貯蔵所から入手する。インフルエンザウイルスに関与する全ての実験を、生物安全レベルＩＩで行う。
ウイルスを、０．３％ウシ血清アルブミン及び０．５マイクログラム トリプシン／ｍｌを補足した最少基本培地（ＭＥＭ）中にてＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上で成長させる。４８〜７２時間のインキュベーション後、培養培地を低速遠心分離によって明澄化する。ウイルス粒子を、２５％スクロースクッションによる超遠心によってペレット化する。精製ウイルスを、５０％グリセロール−０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．３）に懸濁し、−２０℃で保存する。
細胞防御アッセイ
コンストラクト番号２ＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質がインフルエンザウイルスから細胞を防御する能力を評価するために、我々は、最初にＭＤＣＫ細胞をコンストラクト番号２から作製したＡＲ−ＡｖＣＤ又はＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）から単離した広範な細菌シアリダーゼで処置し、広範囲に選択したヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）（ヒトＩＦＶ ＡのＨ１、Ｈ２、及びＨ３サブタイプ、ヒトＩＦＶ Ｂが含まれる）及びトリＩＦＶ株で細胞を攻撃した。図９に示すように、コンストラクト番号２から作製した融合タンパク質は、８０〜１００％の細胞防御を示し、これは、Ａ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの効果に匹敵していた。
アッセイを実施するために、ＭＤＣＫ細胞を、１０ｍＵのＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質（ｌコンストラクト番号２を使用して作製）又はＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）の単離シアリダーゼにて３７℃で２時間処置した。その後、細胞を、ＭＯＩ ０．１のインフルエンザウイルスで１時間攻撃した。細胞を洗浄し、０．２％ＩＴＳ（ＧＩＢＣＯ）及び０．６マイクログラム／ｍｌアセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を補足した新鮮なＤＭＤＭ：Ｆ１２中でインキュベートした。細胞を、０．５％クリスタルバイオレット及び２０％メタノールで５分間染色し、水道水で洗浄処理した。各ウェル中の生きた細胞のレベルを、７０％エタノールによるクリスタルバイオレットの抽出及び５７０ｎＭでの読み取りによって定量した。細胞防御を、１００×｛（シアリダーゼ処置サンプル−ウイルスのみ）／（非感染サンプル−ウイルスのみ）｝によって計算した。
ＩＦＶ阻害アッセイ
我々は、細胞ベースのＥＬＩＳＡ法を使用して、ＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質（コンストラクト番号２を使用して作製）及びＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤタンパク質（コンストラクト番号３を使用して作製）によってＩＦＶ増幅阻害を評価した（Ｂｅｌｓｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９８８）６２（５），１５０８−１５１２）。
アッセイを実施するために、９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ単層を、１６ｍＵのコンストラクト番号２から作製したシアリダーゼＡＲ−ＡｖＣＤ、或いはコンストラクト番号３から作製したＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤを含むＥＤＢ／ＢＳＡ緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び０．５％ ＢＳＡ）にて３７℃で２時間処置した。シアリダーゼ処置及び非処置コントロール細胞（ＥＤＢ／ＢＳＡ緩衝液のみで処置）の両方を、０．１ＭＯＩのウイルスに感染させた。１時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ＩＴＳ（ＧＩＢＣＯ）及び０．６マイクログラム／ｍｌアセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＤＭＤＭ：Ｆ１２中でインキュベートした。感染から４０時間〜４８時間後、細胞結合ウイルスレベルを、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイの使用によって決定した。具体的には、細胞を、０．０５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、５０マイクロリットルの抗インフルエンザＡ ＮＰ抗血清又は抗インフルエンザＢ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｃ．）を含む０．５％ＢＳＡの１０３希釈物並びにＰＢＳと３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルを、ＨＲＰ−タンパク質Ｇを含む０．５％ＢＳＡ及びＰＢＳと１時間インキュベートした。最終洗浄後、５０マイクロリットルの０．０２％３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸（Ｓｉｇｍａ）及び０．０１％過酸化水素を含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を、細胞と室温で５分間反応させた。５０マイクロリットルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、４５０ｎＭでの光学密度の測定によって定量した。ウイルス複製阻害率を、１００％×｛（ウイルスのみのサンプル−シアリダーゼ処置サンプル）／（ウイルスのみのサンプル−非感染サンプル）｝によって計算した。
種々のヒトインフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルス並びにウマインフルエンザウイルスにおけるコンストラクト番号２から作製された組換えシアリダーゼ融合タンパク質ＡＲ−ＡｖＣＤ及びコンストラクト番号３から作製されたＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤについてのウイルス複製阻害、細胞防御ＥＣ５０、及び選択指標に関するデータを図１２に示す。
図１０に示すように、シアリダーゼ融合タンパク質は、広範に選択されたインフルエンザウイルスの増幅を強く阻害した。とりわけ、シアリダーゼ処置では最大で７０〜８０％の細胞表面シアル酸が除去されたが（図８）、８０〜１００％のウイルス阻害（図１０）及び細胞防御（図９）が達成された。この所見により、本発明のシアリダーゼ融合タンパク質での処置による所望の治療効果を達成するために、細胞表面シアル酸を完全に排除する必要がないことが証明された。残存する２０〜３０％の表面シアル酸は、シアリダーゼ融合タンパク質が接近不可能である一方で、おそらく、インフルエンザウイルスも接近不可能である。
シアリダーゼ融合タンパク質の細胞傷害性
ＡＲ−ＡｖＣＤ又はＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤタンパク質（コンストラクト番号２及び３から作製）の細胞傷害性を評価するために、ＭＤＣＫ細胞を、低密度で９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、及び、ウェルあたり２０ＵまでのＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質、又はＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤタンパク質を含むＤＭＥＭ中で５日間培養した（両シアリダーゼは、全実験中に完全な活性を保持していた）。ＡＲ−ＡｖＣＤ又はＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤ処置ウェル又はコントロールウェル中の細胞密度を、クリスタルバイオレットでの細胞の染色及び５７０ｎＭでの吸光度の測定によって毎日決定した。最も高い濃度のＡＲ−ＡｖＣＤ又はＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤ（１００Ｕ／ｍｌ）を含む培養物でさえも、細胞成長は阻害されなかった。従って、ＡＲ−ＡｖＣＤ又はＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤのＩＣ５０（細胞成長が５０％阻害される薬物濃度である）は、約１００Ｕ／ｍｌである。
実施例１４：シアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性
フェレットに、ヒト非適合インフルエンザウイルスを感染させてヒトに匹敵する疾患の徴候を得て、ザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ）等の抗ウイルス化合物で処置することができる（Ｍｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，（１９９８）４２（３），６４０−６４６；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，（１９８８）１０（１），５６−７５；Ｒｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９８９）２４（１−２），２７−３４）。我々の化合物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価するために、我々は、フェレットモデルにおけるＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質（コンストラクト番号２から作製）を試験した。具体的には、試験によって血清中の抗血球凝集素抗体の存在について陰性であった２４匹の幼若メスフェレット（０．５〜０．８ｋｇ）（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｆａｒｍｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ，ＮＹ）を、本研究に含めた。２種の動物を各ケージに入れ、試験前に３日間馴化させた。動物を、以下の３つの群に無作為に分けた：８匹を、薬物希釈緩衝液及びウイルス攻撃で処置し、１２匹をＡＲ−ＡｖＣＤ及びウイルス攻撃で処置し、４匹をＡＲ−ＡｖＣＤのみで処置した。５００Ｕ／ｍｌのシアリダーゼ活性及び０．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したＡＲ−ＡｖＣＤの調製物を本研究で使用した。薬物処置群の動物に、合計で約１ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルに達する各用量の１ｍｌのＡＲ−ＡｖＣＤを投与した。
フェレットを麻酔し、ＡＲ−ＡｖＣＤ又はＰＢＳを鼻腔内に（各鼻孔に０．５ｍｌ）全部で７日間（ウイルス攻撃の２日前からウイルス接種の５日後まで）毎日２回（午前８時及び午後６時）接種した。フェレットを、薬物適用後に不耐性の徴候について観察した。３日目の午前１０時と１１時との間にウイルス接種を行った。１０５ＴＣＩＤ５０の用量の（１０４を超えるフェレットＩＤ５０）ヒトＡ／Ｂｚｙｅｒｎ／７／９５（Ｈ１Ｎ１）様ウイルスを使用してウイルス攻撃を行った。全動物から鼻洗浄物を回収し、これを、ＡＲ−ＡｖＣＤ処置の２日後から開始し、７日目まで続けた。鼻洗浄物を回収するために、１ｍｌのＰＢＳを鼻腔内投与し、鼻水（ｓｎｅｅｚｅｄ ｌｉｑｕｉｄ）を採取し、その体積を記録した。鼻洗浄物を遠心分離した。ペレット化した細胞を再懸濁し、血球計にて顕微鏡下で計数した。上清を回収し、等分し、−８０℃で保存した。無細胞鼻洗浄物中のタンパク質濃度を、製造者の説明書にしたがったＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の使用によって決定した。鼻洗浄物のウイルス滴定のために、接種したＭＤＣＫ細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３６℃で３日間インキュベートした。単層を、細胞変性効果（ＣＰＥ）について視覚的に検査し、各ウェル由来の細胞培養上清のアリコートを、モルモット赤血球を使用した標準的な血球凝集アッセイによってウイルスの存在について試験した。ウイルス力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ法（１９９６）によって決定した。
鼻腔内ＡＲ−ＡｖＣＤを投与した非感染動物（ｎ＝４）では、鼻洗浄物中の炎症細胞数及びタンパク質濃度に対する明らかな効果は認められなかった（図１５Ａ及びＢ）。これらの動物由来の鼻洗浄物を、７日間追跡し、ウイルス排出（ｖｉｒａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）について全て陰性であった。これらの動物において、本研究で使用した薬物用量では薬物関連毒性の徴候は検出されなかった。賦形剤処置群では、８匹の全フェレットの鼻上皮中でウイルスが複製された。ウイルス排出（ｖｉｒａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）は、攻撃から１〜２日後に４．４〜５．９ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０（平均ピーク力価は４．９）のピーク値に達し、時間と共に減少し、５日目までに陰性になった（図１３）。それに反して、１２匹のＡＲ−ＡｖＣＤ処置フェレットのうちのわずか３匹が攻撃から１日後にウイルス排出（ｖｉｒａｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）についての陽性であり（図１３）、その鼻ウイルス力価は、賦形剤動物の訳１／１００であった（平均２．４±０．３対４．４±０．４ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０）（図１３）。１日後、ＡＲ−ＡｖＣＤに対する反応は実質的に変化した。動物は、感染、疾患の徴候、及び炎症反応から完全に防御された（図１３、フェレットタグ番号８０３、８０５、８０６）。攻撃から１４日後のセロコンバージョンの欠如によっても防御を確認した。１匹のフェレット（タグ番号７８０）は、攻撃後の最初の３日間にウイルスは排出されなかったが、関連しない損傷によって感染４日目に死亡した。残りの８匹のフェレットにおける排出は、一連の感染の間に変化し、その範囲は、１日間のみウイルスを排出したフェレット番号８１２から５日間ウイルスを排出したフェレット番号７９１までであった。
少なくとも１日間ウイルスを排出したフェレットの感染を、攻撃後抗ＨＡ抗体力価（セロコンバージョン）の１６倍を超える増加によって確認した。攻撃後、血清の抗ＨＡ力価に対するＡＲ−ＡｖＣＤ処置の明らかな効果は認められなかった（３２０−１２８０対１６０−１２８０、それぞれ賦形剤処置群及び薬物処置群）。
ＡＲ−ＡｖＣＤで処置したにも関わらずウイルスを排出したフェレット（ｎ＝８）では、常に昏睡状態で熱のある未処置のフェレットと比較して、炎症反応が減少し、動物がより機敏且つ活動的なようであった。感染したこの８匹の群について（ＡＲ−ＡｖＣＤ処置動動物）、鼻タンパク質濃度について計算した平均ＡＵＣ（曲線下面積）値は、賦形剤処置感染動物と比較して、約４０％減少した（２．６８対４．４８、任意の単位）（図１１Ｂ）。賦形剤処置感染動物では、攻撃から２日後の鼻洗浄物中の炎症細胞数は、非感染動物の約１００倍に増加した。これらのレベルは、更に４日間持続した。ＡＲ−ＡｖＣＤ処置動物は、鼻洗浄物中の炎症細胞数が有意に減少した。具体的には、細胞数についてのＡＵＣ値は、賦形剤処置感染動物と比較して、ＡＲ−ＡｖＣＤ処置動物で約１／３に減少した（１９６５対６７４、任意の単位、図１１Ａ）。炎症反応で認められた減少は、感染の初期段階でのでウイルス複製の阻害の重要性を示す。
実施例１５：シアリダーゼ融合タンパク質による細菌細胞接着の阻害
細菌
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）：異なる血清型の１０種の被包性株を、ＡＴＣＣに寄託されている臨床分離株から選択する。細菌を凍結ストックとして維持し、３％ヒツジ血液（Ｄｉｆｃｏ＆Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を含むトリプシンダイズ寒天プレート上に５％ＣＯ２下にて３７℃で１８時間継代した。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を放射性同位体で標識するために、１〜２日目のプレート培養物から接種物を取り、７０μＣｉの［３Ｈ］リジン／ｍｌを含むリジン欠損トリプシンダイズブロスに添加し、５％ＣＯ２下にて３７℃でインキュベートした。各培養物の成長を、５９５ｎｍでの光の吸収によってモニタリングする。対数後期で細菌を採取し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ×３分）によって２回洗浄し、Ｌ−１５培地（フェノールレッドを含まない）＋０．１％ＢＳＡ（Ｌ−１５−ＢＳＡ）に再懸濁した（Ｃｕｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｔｕｏｍａｎｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，（１９９４）１７（６），３６１−３７４）（Ｂａｒｔｈｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，（１９９８）６６（４），１４３９−１４４４）。
インフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）：５種のｂ型株（Ｈｉｂ）及び１０種の分類不可能な株（ＮＴＨｉ）を、ＡＴＣＣに寄託されている臨床分離株から選択する。全株を、ヘミン（ＩＣＮ）及びＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）を含む脳心臓浸出物（ＢＨＩ，Ｄｉｆｃｏ）中にストックし、使用するまで凍結させ、その後、これらを、ヘミン及びＮＡＤを補足したＢＨＩ寒天上で培養し、５％ＣＯ２下にて３７℃で１４時間成長させた。（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９８）４２（１０），６９７−７０２）。［３Ｈ］で細菌を標識するために、インフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細胞を、ヘミンＮＡＤ、及び２５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］ロイシンを含むＢＨＩブロスに接種し、対数後期まで成長させ、洗浄し、Ｌ−１５−ＢＳＡに再懸濁した（Ｂａｒｔｈｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，（１９９８）６６（４），１４３９−１４４４）。
細胞接着アッセイ
全ての［３Ｈ］標識細菌を、洗浄後にＬ−１５−ＢＳＡに懸濁し、Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓｅｒチャンバーでの目視による計数によって細菌の濃度を決定し、シンチレーションカウンティングによって放射能を決定し、［３Ｈ］標識細胞の比活性を計算する。７ｃｐｍ／１０００細胞又はそれを超える細菌の調製物を使用する。細菌を、５×１０８細胞／ｍｌに希釈する。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞単層を、５×１０７細菌を含む［３Ｈ］標識細菌懸濁液と、５％ＣＯ２下にて３７℃でインキュベートした。３０分後、非結合細菌を、Ｌ−１５−ＢＳＡで５回の洗浄によって除去する。ＷＤ−ＨＡＥ組織に付着した細菌を、シンチレーションカウンティングによって定量した。
シアリダーゼ融合タンパク質によるＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の脱シアル及びインフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及び肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による細胞接着に対する効果
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、１〜５０ｍＵのＡＲ−ＡｖＣＤと２時間インキュベートする。上記のように、インフルエンザ桿菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株及び肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を使用して、細胞接着アッセイを行う。正のコントロールとして偽処置細胞を使用する。ＡＲ−ＡｖＣＤの有効性を、細菌付着に対して５０％阻害を達成するための酵素の量であるＥＣ５０として定量する。
実施例１６：シアリダーゼ融合タンパク質を使用したＡＡＶベクターの形質導入効率の改良
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
公開された手順と類似の方法で、ＡＲ−ＡｖＣＤの効果を証明する実験を行う（Ｂａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９９９）７３（７），６０８５−６０８８）。十分に分化した気道上皮（ＷＤＡＥ）細胞の単層を、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ中で維持する（Ｋａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（２００２）１８８，１１５−１３７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９９８）７２（１２），９８１８−９８２６）。細胞表面からシアル酸を排除するために、培養培地を、０．５〜１０単位のＡＲ−ＡｖＣＤが溶解された無血清培地と置換する。細胞を、３０分間〜６時間処置する。細胞単層を洗浄し、ＡＡＶで形質導入し、形質導入効率を、標準的な手順を使用して推定する。いくつかのｔｒａｎｓｗｅｌｌを、コントロールの目的で用いるために培地のみ（ＡＲ−ＡｖＣＤなし）で処置する（基本形質導入効率）。更なるコントロールには、脱シアルの細胞傷害性効果を評価するためのＡＲ−ＡｖＣＤのみで処置したｔｒａｎｓｗｅｌｌが含まれ得る。形質導入細胞の検出を容易にするためにレポーターウイルスを使用する。レポーターＡＡＶ及びその使用の例は、文献に記載されており、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２ＬａｃＺ（Ｂａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９９９）７３（７），６０８５−６０８８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，（２００４）１５（４），４０５−４１３）、及びアルカリホスファターゼ（Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２）２０（７），６９７−７０１）が含まれる。効率を、固定し、適切な基質（ｌａｃＺ又はＡＰ含有ウイルスを使用する場合）で処置した細胞の光学顕微鏡法又は生きた細胞の蛍光顕微鏡法（ＧＦＰを使用する場合）によって推定する。ＮＨＢＥ初代上皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）を使用してＮｅｘＢｉｏで行った実験に従って、ｔｒａｎｓｗｅｌｌあたり１０単位のＡＲ−ＡｖＣＤを使用した場合に１時間未満で最大量のシアル酸が除去される。使用した他の細胞株（例えば、ＭＤＣＫ）は、はるかに少ないＡＲ−ＡｖＣＤの投与量で脱シアルするようになる（１時間で０．１Ｕ）。従って、我々は、１０ＵのＡＲ−ＡｖＣＤで２時間のＷＤＡＥ処理で接近可能なシアル酸を除去し、ＡＡＶでのＷＤＡＥ細胞の形質導入を有意に増強するのに十分であると予想する。
動物モデルにおけるＡＡＶ形質導入に対するＡＲ−ＡｖＣＤ処置の効果の試験
動物モデルにおけるＡＲ−ＡｖＣＤ処置の効果を証明するために、以前に記載の実験に類似の実験を行う（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９３）９０（２２），１０６１３−１０６１７；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２）２０（７），６９７−７０１）。ＡＡＶ投与の数時間前（１〜６時間前）に、以前に公開されたプロトコールに従って、ＡＲ−ＡｖＣＤを、エアゾール又は凍結乾燥ＡＲ−ＡｖＣＤ粉末の鼻吸入によってマウスの肺に送達させる（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９３）９０（２２），１０６１３−１０６１７）。前に記載のように、レポーター遺伝子（アルカリホスファターゼ）を保有するＡＡＶを鼻吸入によって送達し、４週間後にマウスを安楽死させ、固定した肺中の形質導入細胞を検出する（Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，（１９９８）７２（１２），９７９５−９８０５）。
実施例１７：シアリダーゼ処置により、気管中の肥満細胞機能及び平滑筋収縮が阻害される。
前に記載の実験方法を使用して（Ｃｏｃｃｈｉａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９７）７５（１−２），９−１８）、本発明の化合物による処置により、肥満細胞によるヒスタミン放出を誘導する基質Ｐ（ＳＰ）を妨害することを証明する。別の実験組を使用して（Ｓｔｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，（２００２）３０２（２），４６６−４７４）、本発明の化合物による処置により、２つのＰＡＲ活性化ペプチドによって刺激された肥満細胞によるβ−ヘキソサミニダーゼ放出が阻害される（ＰＡＲは、プロテイナーゼ活性化受容体を示す）。
前に記載のように、本発明の化合物を、モルモットに気管内投与し、動物における気道反応性を評価する（Ｊａｒｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，（１９９２）１４５（４ Ｐｔ １），９０６−９１０；Ｓｔｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，（２００２）３０２（２），４６６−４７４）。シアリダーゼ処置は、複数の誘導因子との反応によって判断される非特異的気道過敏症を誘導しないはずである。更に、シアリダーゼ処置により、基質Ｐ誘導性気管支収縮が軽減されるはずである。同様に、本発明の化合物を使用して、モルモット及びラットの気管及び肺を処置及び単離する（Ｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（１９９２）２２０（２−３），１８１−１８５；Ｓｔｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，（２００２）３０２（２），４６６−４７４）。また、組換えシアリダーゼ処置は、アセチルコリン、ヒスタミン、及び５−ヒドロキシトリプタミンによって誘導された平滑筋収縮に影響を与えない。更に、これは、抗原（オボアルブミン）又は化合物４８／８０によって誘導された気管支収縮を阻害する。
引例
Ａｃｈｙｕｔｈａｎ，ＫＥ ａｎｄ Ａｃｈｙｕｔｈａｎ ＡＭ．２００１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｘｏ‐ａ‐ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓ）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ＆Ｐｈｙｓｉｏｌ ｐａｒｔ Ｂ １２９：２９‐６４．

Ａｉｒ，ＧＭ ａｎｄ Ｌａｖｅｒ，ＷＧ．１９９５．Ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｎ９ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｒｅ ｎｏｔ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎ９ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１：２７８‐２８４．

Ａｕｅｒｓｗａｌｄ ＥＡ，Ｈｏｒｌｅｉｎ Ｄ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｇ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗ ａｎｄ Ｓｃｈｎａｂｅｌ Ｅ．１９８８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｓｏｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ［Ａｒｇ１５，Ｇｌｕ５２］Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ‐Ｓｅｙｌｅｒ Ｖｏｌ ３６９，Ｓｕｐｐｌ．，ｐｐ２７‐３５．

Ｂａｒｂｅｙ‐Ｍｏｒｅｌ ＣＬ，Ｏｅｌｔｍａｎｎ ＴＮ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＫＭ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．１９８７．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５５：６６７‐６７２．

Ｂｅｓｓｅｔｔｅ ＰＨ，Ａｓｌｕｎｄ Ｆ，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ Ｊ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．１９９９．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１３７０３‐１３７０８．

Ｃａｌｌａｎ ＲＪ，Ｈａｒｔｍａｎｎ ＦＡ，Ｗｅｓｔ ＳＥ ａｎｄ Ｈｉｎｓｈａｗ ＶＳ．１９９７．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈｌ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｂｙ ｓｗｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：７５７９‐７５８５．

Ｃｏｎｎｏｒ，ＲＪ，Ｋａｗａｏｋａ，Ｙ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＲＧ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ ＪＣ．１９９４．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ，ａｖｉａｎ，ａｎｄ ｅｑｕｉｎｅ Ｈ２ ａｎｄ Ｈ３ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：１７‐２３．

Ｃｏｐｌｅｙ，ＲＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＲＢ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ，ＣＰ．２００１．Ｓｉａｌｉｄａｓｅ‐ｌｉｋｅ Ａｓｐ‐ｂｏｘｅｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｓｉｍｉｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｓ．Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ １０：２８５‐２９２．Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，ＡＰ，Ｖｅｈ，ＲＷ，Ｗｅｍｂｅｒ，Ｍ，Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．１９８１．Ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｎ‐ａｃｅｔｙｌ‐ａｎｄ Ｎ‐ｇｌｙｃｏｌｌｏｙｌ‐ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ．Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ １９７：２９３‐２９９．

Ｃｒｅｎｎｅｌｌ，ＳＪ，Ｇａｒｍａｎ，Ｅ，Ｌａｖｅｒ，Ｇ，Ｖｉｍｒ，Ｅ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．１９９４．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｕａｌ ｌｅｃｔｉｎ‐ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：５３５‐５４４．

Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，Ｒ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓ．１９７３．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｊ ５：２７１‐２９０．

Ｅｎｄｏ Ｙ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＮ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．１９９６．Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏｉｄｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５５‐２０５８．

Ｆｒｉｔｚ Ｈ ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｅｒ Ｇ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，ｔｈｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｏｒｇａｎｓ．Ａｒｚｎｅｉｍ‐Ｆｏｒｓｃｈ ３３：４７９‐４９４．

Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｅ，Ｏ．ａｎｄ Ｋｏｎｎｏ，Ｔ．１９８９．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ，ｓｉｍｉａｎ，ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７２：１９６‐２０５．

Ｇａｒｔｅｎ Ｗ，Ｂｏｓｃｈ ＦＸ，Ｌｉｎｄｅｒ Ｄ，Ｒｏｔｔ Ｒ ａｎｄ Ｋｌｅｎｋ ＨＤ．１９８１．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１５：３６１‐３７４．

Ｇｏｇｅｒ，Ｂ，Ｈａｌｄｅｎ，Ｙ，Ｒｅｋ，Ａ，Ｍｏｓｌ，Ｒ，Ｐｙｅ，Ｄ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｊ ａｎｄ Ｋｕｎｇｌ，ＡＪ．２００２．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐８：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｃｈｅｍ ４１：１６４０‐１６４６．

Ｇｏｔｏｈ Ｂ，Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｔ，Ｔｏｙｏｄａ Ｔ，Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ Ｎ，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｍ ａｎｄ Ｎａｇａｉ Ｙ．１９９０．Ａｎ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ Ｘ ａｓ ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ．ＥＭＢＯ Ｊ ９：４１８９‐４１９５．

Ｇｒａｎｏｆｆ，Ａ．＆ Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｄ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ ２．

Ｇｕｓｔ，ＩＤ，Ｈａｍｐｓｏｎ，ＡＷ．ａｎｄ Ｌａｖａｎｃｈｙ，Ｄ．２００１．Ｐｌａｎｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｐａｎｄｅｍｉｃ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １１：５９‐７０．

Ｈａｙｄｅｎ，ＦＧ．１９９６．Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ ａｎｄ ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ‐ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｉｎ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｅｄ．Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ），ｐｐ．５９‐７７．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．

Ｈｏｓｏｙａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｓ，Ｂａｂａ Ｍ，Ｓｕｓｕｋｉ Ｈ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｔａ Ｓ．１９９２．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３６：１４３２‐１４３６．

Ｉｔｏ，Ｔ．２０００．Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａ ｖｉｒｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４（６）：４２３‐４３０．

Ｊａｎａｋｉｒａｍａｎ，ＭＮ，Ｗｈｉｔｅ，ＣＬ，Ｌａｖｅｒ，ＷＧ，Ａｉｒ，ＧＭ ａｎｄ Ｌｕｏ，Ｍ．１９９４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｂ／ｌｅｅ／４０ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａ ｄｅｈｙｄｒｏ ａｎａｌｏｇ ａｔ １．８‐Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：８１７２‐８１７９．

Ｋｉｄｏ，Ｈ，Ｎｉｗａ，Ｙ，Ｂｅｐｐｕ，Ｙ ａｎｄ Ｔｏｗａｔａｒｉ，Ｔ．１９９６．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｉｍａｌ ｖｉｒｕｓｅｓ，ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ ａｎｄ ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ．Ａｄｖａｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ ３６：３２５‐３４７．

Ｋｉｄｏ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｙ ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ．１９９９．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ＨＩＶ‐Ｉ，ｐ．２０５‐２１７．Ｉｎ Ｂ．Ｄｕｎｎ （ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ，Ｒ．１９８８．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ａｄｖ Ｖｉｒ Ｒｅｓ ３４：２４７‐２８１．

Ｋｌｅｎｋ，ＨＤ ａｎｄ Ｇａｒｔｅｎ Ｗ．１９９４．Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２：３９‐４３．

Ｋｒｅｉｓｅｌ，Ｗ，Ｖｏｌｋ，ＢＡ，Ｂｕｃｈｓｅｌ，Ｒ．ａｎｄ Ｒｅｕｔｔｅｒ，Ｗ．１９８０．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈａｌｆ‐ｌｉｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ａ １１０，０００‐ｄａｌｔｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：１８２８‐１８３１．

Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙ ＴＭ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＢＭ，Ｍａｒｔｉｎ ＬＤ，Ｊｏｎｅｓ Ｎ，Ａｋｌｅｙ ＮＪ ａｎｄ Ａｄｌｅｒ ＫＢ．２０００．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＴＮＦ‐β ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＣＡＭ‐１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２：６８５‐６９２．

Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ ＳＧ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＡＲ ａｎｄ Ｃｈｏｐｐｉｎ ＰＷ．１９７３．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＡ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ：ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５６：１７２‐１８０．

Ｌｅｅ，ＭＫ ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ，ＡＤ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２７６８‐２７７２．

Ｍｅｌｔｚｅｒ，ＭＩ，Ｃｏｘ，ＮＪ ａｎｄ Ｆｕｋｕｄａ，Ｋ．１９９９．Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ５：６５９‐６７１．

Ｍｅｙｅｒ，ＦＡ，Ｋｉｎｇ，Ｍ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ，ＲＡ．，１９７５．Ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｃｕｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ３９２：２２３‐２３２．

Ｍｉｌｎｅｒ，ＣＭ，Ｓｍｉｔｈ，ＳＶ，Ｃａｒｒｉｌｌｏ ＭＢ，Ｔａｙｌｏｒ，ＧＬ，Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，Ｍ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＲＤ．１９９７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７２：４５４９‐４５５８．Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ，Ｂ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．２００２．Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６‐６６３．

Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｎｅｓｔｉ，Ｃ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．１９９９．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＮＥＵ２ ｇｅｎｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ９：１３１３‐１３２１．

Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｂａｓｓｉ，ＭＴ，Ｐａｐｉｎｉ，Ｎ，Ｒｉｂｏｎｉ，Ｍ，Ｍａｎｚｏｎｉ，Ｍ，Ｖｅｎｅｒａｎｏｄｏ，Ｂ，Ｃｒｏｃｉ，Ｇ，Ｐｒｅｔｉ，Ａ，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ，Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ，Ｇ．２０００．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＥＵ３，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂｉｃｈｅｍ Ｊ ３４９：３４３‐３５１．

Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｔｏｗａｔａｒｉ Ｔ，Ｏｈｕｃｈｉ Ｍ，Ｓｈｉｏｔａ Ｍ，Ａｋａｏ Ｍ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｙ，Ｐａｒｒｙ ＭＡ ａｎｄ Ｋｉｄｏ Ｈ．２００１．Ｍｉｎｉ‐ｐｌａｓｍｉｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｒｏａｄ‐ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８：２８４７‐２８５５．

Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．１９９７．Ｆｕｒｉｎ：ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘ２ｐ‐ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａ ｗｉｄｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２７：６２５‐６３５．

Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．１９９４．Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ａｅｒｏｓｏｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｂｒｏｎｃｈｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ ｍｉｃｅ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ２３：１０７‐１１８．

Ｐｓｈｅｚｈｅｔｓｋｙ，Ａ，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｃ，Ｍｉｃｈａｕｄ，Ｌ，Ｉｇｄｏｕｒａ，Ｓ，Ｗａｎｇ，Ｓ，Ｅｌｓｌｉｇｅｒ，Ｍ，Ｑｕ，Ｊ，Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｄ，Ｇｒａｖｅｌ，Ｒ，Ｄａｌｌａｉｒｅ，Ｌ ａｎｄ Ｐｏｔｉｅｒ，Ｍ．１９９７．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １５：３１６‐３２０．

Ｒａｍｐｈａｌ，Ｒ．ａｎｄ Ｐｙｌｅ，Ｍ．１９８３．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｃｉｎｓ ａｎｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４１：３３９‐４４．Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ，Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ，ＲＧ ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．１９９５．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｓｐｐ．．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ‐Ｓｅｙｌｅｒ ３７６：５６９‐５７５．

Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ，Ｈｏｙｅｒ，ＬＬ ａｎｄ Ｖｉｍｒ，ＥＲ．１９９３．Ｔｈｅ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｒｅａｄ ｂｙ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂ ９：９１５‐９２１．

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ａ．ｅｄ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ．１９９５．ｐｐ２７０‐２７３．

Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｋ，Ｏｈｔａ，Ｔ ａｎｄ Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．１９９２．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｄ １７４：６８９６‐６９０３．

Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｓ．ｅｄ．，ｐｐ２３３．Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ，１９８２．

Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．１９８２．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４０：１３１‐２３５．

Ｓｃｈｅｉｂｌａｕｅｒ Ｈ，Ｒｅｉｎａｃｈｅｒ Ｍ，Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．１９９２．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｊ Ｉｎｆｅｃ Ｄｉｓ １６６：７８３‐７９１．

Ｓｉｎｎ ＰＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ，Ｖｏｎｇｐｕｎｓａｗａｄ Ｓ，Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｒ ａｎｄ ＭｃＣｒａｙ ＰＢ．２００２．Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｗｅｌｌ‐ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：２４０３‐２４０９．

Ｓｋｅｈｅｌ，ＪＪ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，ＤＣ．２０００．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ：ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９：５３１‐５６９．Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ，Ｋｌｅｎｋ ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．１９８７．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６８：２０３９‐２０４３．

Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ，Ｃｉｂｏｒｏｗｓｋｉ Ｐ，Ｒｅｉｎａｃｈｅｒ Ｍ，Ｐｕｌｖｅｒｅｒ Ｇ，Ｋｌｅｎｋ ＨＤ ａｎｄ Ｒｏｔｔ Ｒ．１９８７．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｃｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５７：４２１‐４３０．

Ｔｅｕｆｅｌ，Ｍ，Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｒ．１９８９．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ ＤＳＭ４３７９８．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７０：４３５‐４４３．

Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ，Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｃ ａｎｄ Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ｍ．１９７５．Ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｌｉｎｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ（ＭＤＣＫ）ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｎｕｏｌ １６２：９‐１４．

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Ｗａｄａ，Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ，Ｔｏｋｕｙａｍａ，Ｓ，Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ，Ａｋｉｔａ，Ｈ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．１９９９．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｓｉａｌｉｄａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ ２６１：２１‐２７．Ｗａｎｇ，ＦＺ，Ａｋｕｌａ，ＳＭ，Ｐｒａｍｏｄ，ＮＰ，Ｚｅｎｇ，Ｌ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｒａｎ，Ｂ．２００１．Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ８ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｋ８．１Ａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：７５１７‐２７

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Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ＫＨ，Ｒａｉｌ，ＳＣ，Ｍａｈｌｅｙ，ＲＷ，Ｍｉｌｎｅ，ＲＷ ａｎｄ Ｍａｒｃｅｌ，Ｙ．１９８６．Ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

Ｗｉｔｔ，ＤＰ ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ ＡＤ．１９９４．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｔｏ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏ ４：３９４‐４００．

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Ｘｉａｎｇ Ｙ ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｂ．２００３．Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１８（ＩＬ‐１８）ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｓ ａ ｆｕｌｌ‐ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ ａｎｄ ａ ｆｕｒｉｎ‐ｃｌｅａｖｅｄ ｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ｏｎｌｙ ｔｈｅ ＩＬ‐１８ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：２６２３‐２６３０．

Ｚａｍｂｏｎ，Ｍ．２００１．Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ １１：２２７‐２４１．

Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｐｅｅｐｌｅｓ ＭＥ，Ｂｏｕｃｈｅｒ ＲＣ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＰＬ ａｎｄ Ｐｉｃｋｌｅｓ ＲＪ．２００２．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｃｉｌｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：５６５４‐５６６６．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｔｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．１９８２．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ７３：２６３‐２７２ Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．１９８２．Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｕｎｃｌｅａｖｅｄ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ７１：１７７‐１８３．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．１９８３．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ｖｉｒｏｌ．４：９‐１２．（Ｉｎ Ｒｕｓｓｉａｎ）．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．１９８４．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ｂｙ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６５：１９１‐１９６．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＡＶ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ＡＧ．１９８５．Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６６：１６３３‐１６３８．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ．１９８７．Ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ‐ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２１：１６１‐１６７．

Ｚｈｉｒｎｏｖ ＯＰ，Ｉｋｉｚｌｅｒ ＭＲ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ ＰＦ．２００２．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｓ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８６８２‐８６８９．

Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｊ．Ｇ．，Ｂｒｅｉｍａｎ Ｒ．Ｆ．，Ｍａｎｄｅｌｌ Ｌ．Ａ．，＆ Ｆｉｌｅ Ｔ．Ｍ．，Ｊｒ．（１９９８）Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ‐ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ：ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２６，８１１‐８３８．

Ａｎｄｒｅｗｓ Ｊ．，Ｎａｄｊｍ Ｂ．，Ｇａｎｔ Ｖ．，＆ Ｓｈｅｔｔｙ Ｎ．（２００３）Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ‐ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．９，１７５‐１８０．

Ｆｉｌｅ Ｔ．Ｍ．（２０００）Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．１５，１８４‐１９４．Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ Ｊ．（１９９４）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｗｉｔｈ ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｔｕｄｙ．Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．９，１５３‐１６５．

Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｔ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ Ｎ．，＆ Ｆｉｌｅ Ｔ．Ｍ．，Ｊｒ．（２００２）Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ‐ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ａｓｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５，１５７‐１６２．

Ｂａｌｌ Ｐ．（１９９５）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓ．

Ｆａｄｅｎ Ｈ．（２００１）Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｅｕｒ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１６０，４０７‐４１３．

Ｇａｒｃｉａ‐Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，ＪＡ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ＭＪＦ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５０［Ｓｕｐｐｌ Ｓ２］，５９‐７３．２００２．

Ｓｏｒｉａｎｏ Ｆ．＆ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ‐Ｃｅｒｒａｔｏ Ｖ．（２００２）Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｓｂ Ｓｕｐｐｌ Ｓ２，５１‐５８．

Ｍｂａｋｉ Ｎ．，Ｒｉｋｉｔｏｍｉ Ｎ．，Ｎａｇａｔａｋｅ Ｔ．，＆ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ．（１９８７）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｅａｓｏｎａｌ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３，１１１‐１２１．

Ｚｏｐｆ Ｄ．＆ Ｒｏｔｈ Ｓ．（１９９６）Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｔｉ‐ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３４７，１０１７‐１０２１．

Ｃｕｎｄｅｌｌ Ｄ．Ｒ．，Ｗｅｉｓｅｒ Ｊ．Ｎ．，Ｓｈｅｎ Ｊ．，Ｙｏｕｎｇ Ａ．，＆ Ｔｕｏｍａｎｅｎ Ｅ．Ｉ．（１９９５）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３，７５７‐７６１．

Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｋ．Ａ．（１９９８）Ｍｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９，１‐１１．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｂ．，Ｐｏｒｒａｓ Ｏ．，Ｈａｎｓｏｎ Ｌ．Ａ．，Ｌａｇｅｒｇａｒｄ Ｔ．，＆ Ｓｖａｎｂｏｒｇ‐Ｅｄｅｎ Ｃ．（１９８６）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５３，２３２‐２３７．

Ｂａｌｓ Ｒ．，Ｘｉａｏ Ｗ．，Ｓａｎｇ Ｎ．，Ｗｅｉｎｅｒ Ｄ．Ｊ．，Ｍｅｅｇａｌｌａ Ｒ．Ｌ．，＆ Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｅｌｌ‐ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｔｒｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３，６０８５‐６０８８．

Ｂａｒｔｈｅｌｓｏｎ Ｒ．，Ｍｏｂａｓｓｅｒｉ Ａ．，Ｚｏｐｆ Ｄ．，＆ Ｓｉｍｏｎ Ｐ．（１９９８）Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，１４３９‐１４４４．

Ｃｕｎｄｅｌｌ Ｄ．Ｒ．＆ Ｔｕｏｍａｎｅｎ Ｅ．Ｉ．（１９９４）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ‐ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１７，３６１‐３７４．

Ｆａｋｉｈ Ｍ．Ｇ．，Ｍｕｒｐｈｙ Ｔ．Ｆ．，Ｐａｔｔｏｌｉ Ｍ．Ａ．，＆ Ｂｅｒｅｎｓｏｎ ＣＳ．（１９９７）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｏ ｍｉｎｏｒ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５，１６９５‐１７００．

Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ．，Ａｈｍｅｄ Ｋ．，Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ Ｙ．，Ｒｉｋｉｔｏｍｉ Ｎ．，Ｈｏｒｉ Ａ．，Ｏｉｓｈｉ Ｋ．，＆ Ｎａｇａｔａｋｅ Ｔ．（１９９８）Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，６９７‐７０２．

Ｓｏｌｚｂａｃｈｅｒ Ｄ．，Ｈａｎｉｓｃｈ Ｆ．Ｇ．，ｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ Ｌ．，Ｇｉｌｓｄｏｒｆ Ｊ．Ｒ．，＆ Ｓｃｈｒｏｔｅｎ Ｈ．（２００３）Ｍｕｃｉｎ ｉｎ ｍｉｄｄｌｅ ｅａｒ ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｏ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２６０，１４１‐１４７．

Ｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ Ｌ．，Ｇｅｅｌｅｎ‐ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ Ｌ．，Ｂｌａａｓ Ｌ．，ｖａｎ Ｈａｍ Ｍ．，＆ Ｄａｎｋｅｒｔ Ｊ．（１９９１）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｆ ｆ?ｍｂｒｉａ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂｙ ｓｉａｌｙｌ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９，４４７３‐４４７７．

Ａｈｍｅｄ Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ．，Ｒｉｋｉｔｏｍｉ Ｎ．，＆ Ｎａｇａｔａｋｅ Ｔ．（１９９６）Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ｔｏ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３５，３０５‐３０９．Ｈａｚｌｅｔｔ Ｌ．Ｄ．，Ｍｏｏｎ Ｍ．，＆ Ｂｅｒｋ Ｒ．Ｓ．（１９８６）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｔｈｅ ｏｃｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５１，６８７‐６８９．

Ｂａｋｅｒ Ｎ．，Ｈａｎｓｓｏｎ Ｇ．Ｃ．，Ｌｅｆｆｌｅｒ Ｈ．，Ｒｉｉｓｅ Ｇ．，＆ Ｓｖａｎｂｏｒｇ‐Ｅｄｅｎ Ｃ．（１９９０）Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８，２３６１‐２３６６．

Ｓｃｈｕｌｔｚｅ Ｂ．，Ｇｒｏｓｓ Ｈ．Ｊ．，Ｂｒｏｓｓｍｅｒ Ｒ．，＆ Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｇ．（１９９１）Ｔｈｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ９‐Ｏ‐ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６５，６２３２‐６２３７．

Ｗｕｐｐｅｒｍａｎｎ Ｆ．Ｎ．，Ｈｅｇｅｍａｎｎ Ｊ．Ｈ．，＆ Ｊａｎｔｏｓ ＣＡ．（２００１）Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ‐ｌｉｋｅ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｉｓ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４，１８１‐１８７．

Ｂｅｓｗｉｃｋ ＥＪ．，Ｔｒａｖｅｌｓｔｅａｄ Ａ．，＆ Ｃｏｏｐｅｒ Ｍ．Ｄ．（２００３）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８７，１２９１‐１３００．

Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｉ．＆ Ｍｅｌｅｒｏ Ｊ．Ａ．（２０００）Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ．Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２７１５‐２７２２．

Ｔｈｏｍａｓ ＲＪ．＆ Ｂｒｏｏｋｓ ＴＪ．（２００４）Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｉｍｉｃｓ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３６，８３‐９２．

Ｈｉｒｍｏ Ｓ．，Ｋｅｌｍ Ｓ．，Ｓｃｈａｕｅｒ Ｒ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．，＆ Ｗａｄｓｔｒｏｍ Ｔ．（１９９６）Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏ ａｌｐｈａ‐２，３‐ｌｉｎｋｅｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ １３，１００５‐１０１１．

Ｓｉｍｏｎ Ｐ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｅ Ｐ．Ｌ．，Ｍｏｂａｓｓｅｒｉ Ａ．，＆ Ｚｏｐｆ Ｄ．（１９９７）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５，７５０‐７５７．

Ｍｉｌｌｅｒ‐Ｐｏｄｒａｚａ Ｈ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ Ｊ．，Ｍｉｌｈ Ｍ．Ａ．，＆ Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｋ．Ａ．（１９９７）Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂｙ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ １４，４６７‐４７１．Ｃｒｏｃｋｅｒ Ｐ．Ｒ．＆ Ｖａｒｋｉ Ａ．（２００１）Ｓｉｇｌｅｃｓ，ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，３３７‐３４２．

Ａｎｇａｔａ Ｔ．＆ Ｂｒｉｎｋｍａｎ‐Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｅ．（２００２）Ｉ‐ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５７２，２９４‐３１６．

Ｌｙｃｚａｋ Ｊ．Ｂ．，Ｃａｎｎｏｎ Ｃ．Ｌ．，＆ Ｐｉｅｒ Ｇ．Ｂ．（２００２）Ｌｕｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１５，１９４‐２２２．

Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ．Ｒ．＆ Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ．（１９９８）Ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９２，７１７‐７３２．

Ｗａｇｎｅｒ Ｊ．Ａ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｔ．，Ｍｏｒａｎ Ｍ．Ｌ．，Ｍｏｓｓ Ｒ．Ｂ．，Ｗｉｎｅ Ｊ．Ｊ．，Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ．Ｒ．，＆ Ｇａｒｄｎｅｒ Ｐ．（１９９８）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＡＡＶ‐ＣＦＴＲ ｉｎ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３５１，１７０２‐１７０３．

Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｉ．＆ Ｍｅｌｅｒｏ Ｊ．Ａ．（２０００）Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ．Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２７１５‐２７２２．

Ｐａｒｋ Ｐ．Ｗ．，Ｐｉｅｒ Ｇ．Ｂ．，Ｈｉｎｋｅｓ Ｍ．Ｔ．，＆ Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ Ｍ．（２００１）Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ‐１ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４１１，９８‐１０２．

Ｍｏｎｔｉ Ｅ．，Ｐｒｅｔｉ Ａ．，Ｖｅｎｅｒａｎｄｏ Ｂ．，＆ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（２００２）Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２７，６４９‐６６３．

（１９９５）Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ，２７０‐２７３．

Ｒｏｇｇｅｎｔｉｎ Ｐ．，Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ Ｒ．Ｇ．，＆ Ｓｃｈａｕｅｒ Ｒ．（１９９５）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｉａｌｉｄａｓｅ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｓｐｐ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７６，５６９‐５７５．

Ｓｕｔｔｅｒ Ｖ．Ｌ．（１９８４）Ａｎａｅｒｏｂｅｓ ａｓ ｎｏｒｍａｌ ｏｒａｌ ｆｌｏｒａ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ６２‐Ｓ６６．

Ｇａｓｋｅｌｌ Ａ．，Ｃｒｅｎｎｅｌｌ Ｓ．，＆ Ｔａｙｌｏｒ Ｇ．（１９９５）Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉａｌｉｄａｓｅ：ａ ｂｅｔａ‐ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ，ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｄｕｌｅ ａｎｄ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｊｅｌｌｙ‐ｒｏｌｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．３，１ １９７‐１２０５．Ａｌｖａｒｅｚ Ｐ．，Ｂｕｓｃａｇｌｉａ Ｃ．Ａ．，＆ Ｃａｍｐｅｔｅｌｌａ Ｏ．（２００４）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｓｉｍｐｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３３７５‐３３８１．

Ｐｏｔｉｅｒ Ｍ．，Ｍａｍｅｌｉ Ｌ．，Ｂｅｌｉｓｌｅ Ｍ．，Ｄａｌｌａｉｒｅ Ｌ．，＆ Ｍｅｌａｎｃｏｎ Ｓ．Ｂ．（１９７９）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｏｄｉｕｍ （４‐ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ‐ａｌｐｈａ‐Ｄ‐Ｎ‐ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４，２８７‐２９６．

Ｈｉｒｅｌ Ｐ．Ｈ．，Ｓｃｈｍｉｔｔｅｒ Ｍ．Ｊ．，Ｄｅｓｓｅｎ Ｐ．，Ｆａｙａｔ Ｇ．，＆ Ｂｌａｎｑｕｅｔ Ｓ．（１９８９）Ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｄｅ‐ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８６，８２４７‐８２５１．

Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ Ａ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｎ‐ｅｎｄ ｒｕｌｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｍｙｓｔｅｒｉｅｓ，ｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９３，１２１４２‐１２１４９．

Ｂｅｌｓｈｅ Ｒ．Ｂ．，Ｓｍｉｔｈ Ｍ．Ｈ．，Ｈａｌｌ Ｃ．Ｂ．，Ｂｅｔｔｓ Ｒ．，＆ Ｈａｙ Ａ．Ｊ．（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６２，１５０８‐１５１２．

Ｍｅｎｄｅｌ Ｄ．Ｂ．，Ｔａｉ Ｃ．Ｙ．，Ｅｓｃａｒｐｅ Ｐ．Ａ．，Ｌｉ Ｗ．，Ｓｉｄｗｅｌｌ Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｆｆｍａｎ Ｊ．Ｈ．，Ｓｗｅｅｔ Ｃ，Ｊａｋｅｍａｎ ＫＪ．，Ｍｅｒｓｏｎ Ｊ．，Ｌａｃｙ Ｓ．Ａ．，Ｌｅｗ Ｗ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ Ｌ．，Ｃｈｅｎ Ｍ．Ｓ．，Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ Ｎ．，＆ Ｋｉｍ ＣＵ．（１９９８）Ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＧＳ ４０７１ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｆｅｒｒｅｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４２，６４０‐６４６．

Ｓｍｉｔｈ Ｈ．＆ Ｓｗｅｅｔ Ｃ．（１９８８）Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｆｒｏｍ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｅｒｒｅｔｓ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０，５６‐７５．

Ｒｅｕｍａｎ Ｐ．Ｄ．，Ｋｅｅｌｙ Ｓ．，＆ Ｓｃｈｉｆｆ Ｇ．Ｍ．（１９８９）Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｌｌｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｒｅｔ ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４，２７‐３４．

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ．１９９６．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｂｏｓｔｏｎ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ｔｏｄｙｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｋａｒｐ Ｐ．Ｈ．，Ｍｏｎｉｎｇｅｒ Ｔ．Ｏ．，Ｗｅｂｅｒ Ｓ．Ｐ．，Ｎｅｓｓｅｌｈａｕｆ Ｔ．Ｓ．，Ｌａｕｎｓｐａｃｈ Ｊ．Ｌ．，Ｚａｂｎｅｒ Ｊ．，＆ Ｗｅｌｓｈ ＭＪ．（２００２）Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８８，１ １５‐１３７．

Ｗａｎｇ Ｇ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ．Ｌ．，Ｍｅｌｃｈｅｒｔ Ｐ．，Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎ Ｖ．Ａ．，ｖａｎ Ｅｓ Ｈ．Ｈ．，Ｂｏｄｎｅｒ Ｍ．，Ｊｏｌｌｙ ＤＪ．，＆ ＭｃＣｒａｙ Ｐ．Ｂ．，Ｊｒ．（１９９８）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ ｏｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２，９８１８‐９８２６．

Ｗａｎｇ Ａ．Ｙ．，Ｐｅｎｇ Ｐ．Ｄ．，Ｅｈｒｈａｒｄｔ Ａ．，Ｓｔｏｒｍ Ｔ．Ａ．，＆ Ｋａｙ Ｍ．Ａ．（２００４）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５，４０５‐４１３．

Ｈａｌｂｅｒｔ Ｃ．Ｌ．，Ａｌｌｅｎ Ｊ．Ｍ．，＆ Ｍｉｌｌｅｒ Ａ．Ｄ．（２００２）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ａｉｒｗａｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｐａｒｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅｒ ｇｅｎｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６９７‐７０１．

Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ．Ｒ．，Ａｆｉｏｎｅ Ｓ．Ａ．，Ｃｏｎｒａｄ Ｃ，ＭｃＧｒａｔｈ Ｓ．Ａ．，Ｓｏｌｏｗ Ｒ．，Ｏｋａ Ｈ．，Ｚｅｉｔｌｉｎ Ｐ．Ｌ．，Ｇｕｇｇｉｎｏ Ｗ．Ｂ．，＆ Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ．（１９９３）Ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９０，１０６１３‐１０６１７．

Ｈａｌｂｅｒｔ Ｃ．Ｌ．，Ｓｔａｎｄａｅｒｔ Ｔ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．Ｂ．，＆ Ｍｉｌｌｅｒ Ａ．Ｄ．（１９９８）Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２，９７９５‐９８０５．

Ｃｏｃｃｈｉａｒａ Ｒ．，Ｂｏｎｇｉｏｖａｎｎｉ Ａ．，Ａｌｂｅｇｇｉａｎｉ Ｇ．，Ａｚｚｏｌｉｎａ Ａ．，Ｌａｍｐｉａｓｉ Ｎ．，Ｄｉ Ｂｌａｓｉ Ｆ．，＆ Ｇｅｒａｃｉ Ｄ．（１９９７）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｏｎ ＳＰ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ＴＮＦ‐ａｌｐｈａ ｍＲＮＡ ｉｎ ｒａｔ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７５，９‐１８．

Ｓｔｅｎｔｏｎ Ｇ．Ｒ．，Ｎｏｈａｒａ Ｏ．，Ｄｅｒｙ Ｒ．Ｅ．，Ｖｌｉａｇｏｆｔｉｓ Ｈ．，Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ａ．，Ｗａｌｌａｃｅ Ｊ．Ｌ．，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｄ．，Ｍｏｑｂｅｌ Ｒ．，＆ Ｂｅｆｕｓ Ａ．Ｄ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＰＡＲ）‐１ ａｎｄ ‐２ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ＰＡＲ‐Ｉ ａｎｄ ＰＡＲ‐２．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０２，４６６‐４７４．Ｊａｒｒｅａｕ Ｐ．Ｈ．，Ｈａｒｆ Ａ．，Ｌｅｖａｍｅ Ｍ．，Ｌａｍｂｒｅ Ｃ．Ｒ．，Ｌｏｒｉｎｏ Ｈ．，＆ Ｍａｃｑｕｉｎ‐Ｍａｖｉｅｒ Ｉ．（１９９２）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ．Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４５，９０６‐９１０．

Ｋａｉ Ｈ．，Ｍａｋｉｓｅ Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ．，Ｉｓｈｉｉ Ｔ．，Ｔａｋａｈａｍａ Ｋ．，Ｉｓｏｈａｍａ Ｙ．，＆ Ｍｉｙａｔａ Ｔ．（１９９２）Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｒａｃｈｅａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ．ＥｕｒＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２０，１８１‐１８５．
本出願、参考文献、及び添付物で言及された全ての刊行物（特許書類が含まれる）、Ｇｅｎｂａｎｋ配列データベースエントリー（ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列並びに添付の情報が含まれる）、及び科学論文は、各刊行物が個別に参考として援用されるのと同一の範囲でその全体が参考として援用される。
全ての見出しは、読み手に便宜を図ったものであり、特記しない限り、見出しに続く文章の意味を制限するために使用すべきではない。
アプロチニンのアミノ酸の一次構造の略図である。 以下の４つのヒト遺伝子のＧＡＧ結合配列を示す図である：ＰＦ４（ヒト血小板因子４）；ＩＬ８（ヒトインターロイキン８）；ＡＴ ＩＩＩ（ヒトアンチトロンビンＩＩＩ）；ＡｐｏＥ（ヒトアポリポプロテインＥ）；ＡＡＭＰ（ヒト血管関連遊走細胞タンパク質）。 ヒトシアリダーゼＮＥＵ２とＮＥＵ４との比較を示す図である。 細菌及び真菌のシアリダーゼの基質特異性を比較した表である。 Ｈｉｓ６−ＡｖＣＤをコードするコンストラクト番号１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ｐＴｒｃ９９ａへのクローニングのために使用したＮｃｏＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を太字で示す。 Ａｒ−ＡｖＣＤをコードするコンストラクト番号２のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ｐＴｒｃ９９ａへのクローニングのために使用したＮｃｏＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を太字で示す。 Ａｒ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤをコードするコンストラクト番号３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ｐＴｒｃ９９ａへのクローニングのために使用したＮｃｏＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を太字で示す。 Ａｒ−タグがＭＤＣＫ細胞からのアルファ（２，６）結合シアル酸の除去を増強することを示す実験由来のデータのグラフを示す。Ｙ軸は、組換えＡｖＣＤ（コンストラクト番号１）（菱形）又は組換えＡＲ−ＡｖＣＤ（コンストラクト番号２）（四角）の種々の希釈物を使用した処置後のＭＤＣＫ細胞表面に残存するアルファ（２，６）結合シアル酸の比率を示す。 コンストラクト番号２又はＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）の単離シアリダーゼから作製した組換えＡＲ−ＡｖＣＤタンパク質でのＭＤＣＫ細胞の処置によって得られたインフルエンザウイルスに対する防御を示すグラフである。攻撃ウイルス株は以下である：Ａ／ＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ／Ｌｅｅ／４０；７．Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１／５９；及びＴｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓ／６６（Ｈ９Ｎ２）。 組換えＡＲ−ＡｖＣＤシアリダーゼ及び組換えＡＲ−Ｇ４Ｓ−ＡｖＣＤシアリダーゼによるインフルエンザウイルス増幅の阻害レベルを示すグラフである。攻撃ウイルス株は以下である：Ａ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／ＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７（Ｈ２Ｎ２）；Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ／Ｌｅｅ／４０；７．Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１／５９；及びＴｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓ／６６（Ｈ９Ｎ２）。 組換えＡＲ−ＡｖＣＤシアリダーゼ融合タンパク質の局所投与によってインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに感染したフェレットの炎症反応が軽減することを示すグラフである。（Ａ）感染後に表示の時間で感染動物から得た鼻洗浄サンプル由来の炎小細胞の総数。（Ｂ）感染フェレットの無細胞鼻洗浄サンプルのタンパク質濃度を決定した。感染フェレットを、賦形剤で処置するか（四角）、コンストラクト番号２から作製した組換えＡＲ−ＡｖＣＤシアリダーゼ融合タンパク質で処置した（三角）。非感染動物も組換えＡＲ−ＡｖＣＤシアリダーゼ融合タンパク質で処置した（菱形）。実質的に有意な値を、＊（ｐ＜０．０５）及び＊＊（ｐ＜０．０１）で標識する。 ２つの本発明のシアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質のウイルス複製の阻害、細胞防御ＥＣ５０、及び選択指標（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ）を示す表である。 本発明のシアリダーゼ触媒ドメイン融合タンパク質で処置したフェレット及びコントロール賦形剤で処置したフェレットの気道におけるウイルス複製を示す表である。

Claims (129)

  1. シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質であって、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸２７０〜アミノ酸２９０のアミノ酸のいずれかから始まり、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸６６５〜アミノ酸９０１のアミノ酸のいずれかで終わるアミノ酸配列を含み、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アミノ酸１〜アミノ酸２６９にわたる配列からなるアクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列を欠き、更に、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質がシアリダーゼ活性を有することを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  2. 請求項１に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  3. 発現ベクター中の請求項２に記載の核酸分子。
  4. 配列番号１４を具えることを特徴とする請求項１に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  5. 請求項４に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  6. 発現ベクター中の請求項５に記載の核酸分子。
  7. 請求項１に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質において、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸２７０〜アミノ酸２９０のアミノ酸のいずれかから始まり、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸残基６６５〜アミノ酸６８１のいずれかで終わるアミノ酸配列を具えることを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  8. 請求項７に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  9. 発現ベクター中の請求項８に記載の核酸分子。
  10. 請求項７に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質において、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が配列番号１６を具えることを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  11. 請求項１０に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  12. 発現ベクター中の請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 請求項７に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質において、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸２７４から始まり、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸残基６８１で終わるアミノ酸配列を具えることを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  14. 請求項１３に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  15. 発現ベクター中の請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 請求項７に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質において、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸２９０から始まり、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸残基６６６で終わるアミノ酸配列を具えることを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  17. 請求項１６に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  18. 発現ベクター中の請求項１７に記載の核酸分子。
  19. 請求項７に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質において、前記シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸２９０から始まり、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼタンパク質配列（配列番号１２）のアミノ酸残基６８１で終わるアミノ酸配列を具えることを特徴とするシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質。
  20. 請求項１９に記載のシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質をコードするヌクレオチド配列を具えることを特徴とする核酸分子。
  21. 発現ベクター中の請求項２０に記載の核酸分子。
  22. 融合タンパク質であって：
    少なくとも１つのシアリダーゼの触媒ドメインと；
    精製ドメイン、タンパク質タグ、タンパク質安定性ドメイン、可溶性ドメイン、タンパク質サイズ増加ドメイン、タンパク質折り畳みドメイン、タンパク質局在化ドメイン、アンカードメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、触媒活性ドメイン、結合ドメイン、又は触媒活性増強ドメインと；
    を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  23. 請求項２２に記載の融合タンパク質において、少なくとも１つのペプチドリンカーを更に具えることを特徴とする融合タンパク質。
  24. 請求項２２に記載の融合タンパク質において、前記触媒ドメインが、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）シアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同であるか、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼと実質的に相同であるか、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼと実質的に相同であるか、ミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼと実質的に相同であるか、ヒトＮｅｕ２シアリダーゼと実質的に相同であるか、ヒトＮｅｕ４シアリダーゼと実質的に相同であることを特徴とする融合タンパク質。
  25. 請求項２４に記載の融合タンパク質において、前記触媒ドメインが、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同である融合タンパク質。
  26. 請求項２５に記載の融合タンパク質において、前記触媒ドメインが配列番号１６を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  27. 請求項２６に記載の融合タンパク質において、少なくとも１つのタンパク質精製ドメインを具えることを特徴とする融合タンパク質。
  28. 請求項２７に記載の融合タンパク質において、前記少なくとも１つのタンパク質精製ドメインが、Ｈｉｓタグ、カルモジュリン結合ドメイン、マルトース結合タンパク質ドメイン、ストレプトアビジンドメイン、ストレプトアビジン結合ドメイン、インテインドメイン、又はキチン結合ドメインであることを特徴とする融合タンパク質。
  29. 請求項２８に記載の融合タンパク質において、前記タンパク質精製ドメインがＨｉｓタグであることを特徴とする融合タンパク質。
  30. 請求項２９に記載の融合タンパク質において、前記融合タンパク質が配列番号１８を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  31. 請求項３０に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
  32. 発現ベクター中の請求項３１に記載の核酸分子。
  33. 請求項３１に記載の核酸分子において、配列番号１７を具えることを特徴とする核酸分子。
  34. 発現ベクター中の請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 請求項２５に記載の融合タンパク質において、少なくとも１つのアンカードメインを具えることを特徴とする融合タンパク質。
  36. 請求項３５に記載の融合タンパク質において、前記アンカードメインがＧＡＧ結合ドメインである融合タンパク質。
  37. 請求項３６に記載の融合タンパク質において、前記アンカードメインが、ヒト血小板因子４のＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号２）と実質的に相同であるか、ヒトインターロイキン８のＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号３）と実質的に相同であるか、ヒトアンチトロンビンＩＩＩのＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号４）と実質的に相同であるか、ヒトアポタンパク質ＥのＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号５）と実質的に相同であるか、ヒト血管関連遊走タンパク質（ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号６）と実質的に相同であるか、ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）のＧＡＧ−結合ドメイン（配列番号７）と実質的に相同である融合タンパク質。
  38. 請求項３７に記載の融合タンパク質において、前記アンカードメインが、ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）ＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）と実質的に相同である融合タンパク質。
  39. 請求項３８に記載の融合タンパク質において、前記アンカードメインが、ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）ＧＡＧ結合ドメイン（配列番号７）を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  40. 請求項３９に記載の融合タンパク質において、シアリダーゼの前記触媒ドメインが、配列番号１６を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  41. 請求項４０に記載の融合タンパク質において、配列番号２０を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  42. 請求項４１に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
  43. 発現ベクター中の請求項４２に記載の核酸分子。
  44. 請求項４２に記載の核酸分子において、配列番号１９を具えることを特徴とする核酸分子。
  45. 発現ベクター中の請求項４４に記載の核酸分子。
  46. 請求項４０に記載の融合タンパク質において、配列番号２５を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  47. 請求項４６に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
  48. 発現ベクター中の請求項４７に記載の核酸分子。
  49. 請求項４７に記載の核酸分子において、配列番号２４を具えることを特徴とする核酸分子。
  50. 発現ベクター中の請求項４９に記載の核酸分子。
  51. 請求項４０に記載の融合タンパク質において、配列番号３８を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  52. 請求項４０に記載の融合タンパク質において、前記シアリダーゼの触媒ドメインに前記ヒトアンフィレグリン（ｈｕｍａｎ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）ＧＡＧ結合ドメインを連結させるペプチドリンカーを更に具えることを特徴とする融合タンパク質。
  53. 請求項５２に記載の融合タンパク質において、配列番号３５を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  54. 請求項５３に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子。
  55. 請求項５４に記載の核酸分子において、配列番号３４をことを特徴とする核酸分子。
  56. 請求項５５に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  57. 請求項５２に記載の融合タンパク質において、配列番号３７を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  58. 請求項５７に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴する核酸分子。
  59. 請求項５８に記載の核酸分子において、配列番号３６を具えることを特徴とする核酸分子。
  60. 請求項５９に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  61. 請求項５２に記載の融合タンパク質において、配列番号３９を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  62. 請求項３９に記載の融合タンパク質において、配列番号２７を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  63. 請求項６２に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴する核酸分子。
  64. 請求項６３に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  65. 請求項６３に記載の核酸分子において、配列番号２６を具えることを特徴とする核酸分子。
  66. 請求項６５に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  67. 請求項３９に記載の融合タンパク質において、配列番号２９を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  68. 請求項６７に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴する核酸分子。
  69. 請求項６８に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  70. 請求項６８に記載の核酸分子において、配列番号２８を具えることを特徴とする核酸分子。
  71. 請求項７０に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  72. 請求項３９に記載の融合タンパク質において、配列番号３１を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  73. 請求項７２に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴する核酸分子。
  74. 請求項７３に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  75. 請求項７３に記載の核酸分子において、配列番号３０を具えることを特徴とする核酸分子。
  76. 請求項７５に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  77. 請求項３９に記載の融合タンパク質において、配列番号３３を具えることを特徴とする融合タンパク質。
  78. 請求項７８に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴する核酸分子。
  79. 請求項７９に記載の核酸分子を含むことを特徴する発現ベクター。
  80. 請求項７９に記載の核酸分子において、配列番号３２を具えることを特徴とする核酸分子。
  81. 請求項８１に記載の核酸分子を具えることを特徴とする発現ベクター。
  82. シアリダーゼを具えることを特徴とする製剤処方。
  83. 請求項８３に記載の製剤処方において、前記シアリダーゼが、ウエルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であるか、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であるか、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であるか、ミクロモノスポラ・ビリジファシエンス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であるか、ヒトＮｅｕ２シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であるか、ヒトＮｅｕ４シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であることを特徴とする製剤処方。
  84. 請求項８４に記載の製剤処方において、前記シアリダーゼが、アクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）シアリダーゼの少なくとも一部と実質的に相同であることを特徴とする製剤処方。
  85. 請求項８５に記載の製剤処方において、前記シアリダーゼが配列番号１２を具えることを特徴とする製剤処方。
  86. 請求項１に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  87. 請求項７に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  88. 請求項２２に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  89. 請求項２６に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  90. 請求項４６に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  91. 請求項６２に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  92. 噴霧薬として処方されることを特徴する請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  93. 吸入薬として処方されることを特徴する請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  94. 注射液として処方されることを特徴する請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  95. 点眼液として処方されることを特徴する請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  96. クリーム、蝋膏、ゲル、又は軟膏として処方されることを特徴する請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  97. 経口投与用の丸薬、錠剤、ロゼンジ、懸濁液、又は溶液として処方されることを特徴とする請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の製剤処方。
  98. インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、又は呼吸器合胞体ウイルスによるウイルス感染を治療又は防止する方法において：
    治療有効量の請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップ；
    を具えることを特徴とする方法。
  99. 請求項９９に記載の方法において、前記適用ステップが、鼻内噴霧の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  100. 請求項９９に記載の方法において、前記適用ステップが、吸入器の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  101. 請求項９９に記載の方法において、前記適用ステップを１日に１回〜４回行うことを特徴とする方法。
  102. 病原菌による感染を治療又は防止する方法において：
    治療有効量の請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２のいずれか１項に記載の組成物を被験体に投与するステップ；
    を具えることを特徴とする方法。
  103. 請求項１０３に記載の方法において、前記病原体が、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ菌、カタル球菌、緑膿菌、又はピロリ菌であることを特徴とする方法。
  104. 請求項１０３に記載の方法において、前記投与ステップが、鼻内噴霧の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  105. 請求項１０３に記載の方法において、前記投与ステップが、吸入器の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  106. 請求項１０３に記載の方法において、前記投与ステップが、局所への塗布によるステップであることを特徴とする方法。
  107. 請求項１０３に記載の方法において、前記投与ステップが、経口投与によるステップであることを特徴とする方法。
  108. 請求項１０３に記載の方法において、前記投与ステップを１日に１回〜４回行うことを特徴とする方法。
  109. アレルギー又は炎症を治療又は防止する方法において：
    治療有効量の請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２に記載の組成物を被験体に投与するステップ；
    を具えることを特徴とする方法。
  110. 請求項１１０に記載の方法において、前記炎症が、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬、植物毒素若しくは動物毒素への曝露、又は自己免疫性容態に関連することを特徴とする方法。
  111. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップが、鼻内噴霧の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  112. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップが、吸入器の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  113. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップが、点眼液の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  114. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップが、局所への塗布によるステップであることを特徴とする方法。
  115. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップが、局所注射又は静脈内注射によるステップであることを特徴とする方法。
  116. 請求項１１０に記載の方法において、前記投与ステップを１日に１回〜４回行うことを特徴とする方法。
  117. 組換えウイルスベクターによる遺伝子送達を増強する方法であって、前記組換えウイルスベクターの投与前又は投与と同時に治療有効量の請求項８３、請求項８５、請求項８７、請求項８８、請求項８９、請求項９０、請求項９１、又は請求項９２に記載の組成物を被験体の上皮細胞に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
  118. 請求項１１８に記載の方法において、前記組換えウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする方法。
  119. 請求項１１９に記載の方法において、前記組換えウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする方法。
  120. 請求項１２０に記載の方法において、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、嚢胞性線維症膜通過伝導制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を具えることを特徴とする方法。
  121. 請求項１１９に記載の方法において、前記投与ステップが、吸入器の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  122. 請求項１１９に記載の方法において、前記投与ステップを１日に１回〜４回行うことを特徴とする方法。
  123. 請求項６２に記載の組成物を具えることを特徴とする製剤処方。
  124. 請求項１２４に記載の製剤処方において、噴霧薬として処方される製剤処方。
  125. 請求項１２４に記載の製剤処方において、吸入薬として処方される製剤処方。
  126. インフルエンザ感染を治療又は防止する方法において：
    治療有効量の請求項１２４に記載の組成物を被験体の上皮細胞に適用するステップ；
    を具えることを特徴とする方法。
  127. 請求項１２７に記載の方法において、前記適用ステップが、鼻内噴霧の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  128. 請求項１２７に記載の方法において、前記適用ステップが、吸入器の使用によるステップであることを特徴とする方法。
  129. 請求項１２７に記載の方法において、前記適用ステップを１日に１回〜４回行うことを特徴とする方法。
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