CN101426906A - 一类新颖的以蛋白质为基础的治疗用分子 - Google Patents

一类新颖的以蛋白质为基础的治疗用分子 Download PDF

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Abstract

本发明提供了预防和治疗病原感染的新的组合物和方法。具体而言,本发明提供的化合物具有将此化合物锚定到靶细胞表面的锚定域和能在细胞外作用以防止病原体(例如病毒)对靶细胞的感染的治疗域。本发明也包括具有唾液酸酶活性的治疗组合物,此组合物含具有唾液酸酶催化域的基于蛋白的化合物。本发明化合物可用于治疗或者预防病原体感染,并且可用于治疗和减少过敏及发炎反应。本发明也提供了用于提高重组病毒向靶细胞转导的组合物和方法。这些组合物和方法可在基因治疗中得以运用。

Description

一类新颖的以蛋白质为基础的治疗用分子
相关申请的交叉引用
本申请要求美国专利申请序列号为10/939,262的专利的优先权,该专利申请日期为2004年9月10日,名称为“一类新颖的治疗用蛋白质分子(Novel Class of Therapeutic Protein Based Molecules)”,且已通过引用整体结合到本文中。
以下专利申请也通过引用整体结合到了本申请中:申请日期为2003年11月21日的第10/718,986号美国专利申请,名称为“一种广谱抗病毒治疗方法和预防方法(Broad soectrum anti-viral therapeutics andprophylaxis)”;申请日期为2002年11月22日的第60/428,535号美国临时专利申请,名称为“一种广谱抗病毒治疗方法和预防方法(Broad soectrumanti-viral therapeutics and prophylaxis)”;申请日期为2003年4月19日的第60/464,217号美国临时专利申请,名称为“一类广谱抗病毒蛋白(Class ofbroad spectrum anti-viral protein)”;申请日期为2004年4月13日的第60/561,749号美国临时专利申请,名称为“一种抗微生物治疗方法和预防方法(Anti-microbial therapeutics and prophylaxis)”;申请日期为2004年6月16日的第60/580,084号美国临时专利申请,名称为“一类广谱抗微生物剂(Class of broad spectrum anti-microbial agents)”。
发明背景
本发明涉及可用于预防和治疗病原体对人类和动物患者的治疗用组合物,特别涉及可用于预防和治疗病毒或病菌感染的基于蛋白的治疗用组合物。本发明也涉及用于预防或者改善过敏及发炎反应的基于蛋白的治疗用组合物。本发明也涉及用于提高重组病毒转导效率的基于蛋白的组合物,如用于基因治疗的重组病毒。
流行性感冒自从远古时期就在人类中传播,是一个具高度传染力的急性呼吸道疾病。其特性是分年度周期性发生,并定期发生世界性大流行。因流感具有高发病率和死亡率,它对社会经济直接或者间接的影响很巨大。每年仅在美国的流行就导致几乎有300,000人住院治疗和25,000人死亡。在上一世纪发生的4次大流行总共导致了数亿人死亡。基于早期流行历史的数学模型估计,下次大流行时可能将有89,000-207,000人死亡,出现1,800-4,200万个就诊病人和另外2,000-4,700个病人(Meltzer,MI,Cox,NJ和Fukuda,K.(1999)Emerg Infect Dis 5:659-671)。
流感主要是由两种类型的病毒感染导致:流感病毒A和流感病毒B(第三种类型流感病毒C仅能导致轻微的类似普通感冒的症状)。他们属于RNA病毒的正粘病毒科。A和B两种类型的病毒均具有8个分节负链RNA基因组,包被在源自宿主细胞的脂质膜中。此病毒包膜上覆盖着由三种类型的蛋白质组成的刺突:负责将病毒附着到宿主细胞受体和介导病毒和细胞膜融合的血凝素(HA)、负责从寄主细胞释放新病毒的唾液酸苷酶(NA)和数量不多的作为离子通道的M2蛋白质。
流感A和B类型病毒的感染一般开始于上呼吸道粘膜的表面。病毒的复制主要限于上呼吸道,但可扩展到下呼吸道并导致支气管肺炎,这可能致死。
流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的病毒包膜蛋白。它在病毒感染过程中起着重要的作用。HA的重要性已被它是宿主免疫反应产生的保护性的中和抗体的主要作用目标的事实证实(Hayden,FG.(1996)In Antiviraldrug resistance(ed.D.D.Richma),59-77页.Chichester,UK:JohnWilev&Sons Ltd.)。现在较清楚的是HA对病毒感染具有两个不同的功能。第一,HA负责将病毒附着到唾液酸细胞的受体上;第二,HA介导病毒进入靶细胞,引发病毒包膜和细胞膜的融合。
HA作为前体蛋白HA0合成,HA0以三聚体分子形式从细胞器高尔基体转移到细胞表面,然后被剪切成C端HA1(HA0的第328个残基)和N端HA2。一般认为此剪切发生在细胞表面或在已释放的病毒上。HAO被剪切成HA1/HA2对于HA结合到唾液酸受体上不是必需的。然而,一般认为这对于病毒的感染性来说是必要的(Klenk,HD和Rott,R.(1998)AdvVir Res.34:247-281;Kido,H,Niwa,Y,Beppu,Y和Towatari,T.(1996)Advan Enzyme Regul 36:325-347;Skehel,JJ和Wiley,DC.(2000)Annu RevBiochem 69:531-569;Zambo,M.(2001)Rev Med Virol 11:227-241.)。
目前,流感通过流感疫苗和抗病毒化合物控制。灭活的流感疫苗目前用于全世界,特别是用在高危人群中。这些疫苗病毒在受精鸡蛋中生长,通过化学手段灭活并纯化。这些疫苗通常为三价的,包括典型的流感A病毒(H1N1和H3N2)和流感B病毒株。这些疫苗株需要经常更新以保持功效,世界健康组织(WHO)在协调这一工作。在流感流行期间,更新流感疫苗并供给市场通常需要8个月时间(Wood,J.(2000)PhilTrans R Soc LondB 356:1953-1960)。然而,历史上流行流感曾在6个月内传播到大多数大洲,并且预期未来流感会由于国际旅行增加而传播更快(Gust,ID,Hampson,AW.,和Lavanchy,D.(2001)Rev Med Virol 11:59-70)。所以,在未来的流感大流行的第一波中,不能得到一种有效的疫苗或者其很短缺的情况是不可避免的。
抗病毒化合物已成为治疗两次流感暴发之间的病症的首选药物。目前,它们也是人们在疫苗不可用之前的控制流感的最初的时期内的仅有选择。市场上目前有两类抗病毒化合物:M2抑制剂,如金刚烷胺和金刚烷乙胺;NA抑制剂,包括奥斯他韦(达菲)和扎那米韦(乐瑞沙)。两种分子均被证实在预防和治疗流感上有效。然而,将它们广泛用于化学预防时仍需顾虑的两个因素是其副作用和产生抗药病毒的风险(Hayden,FG.(1996)InAntiviral drug resistance(ed.D.D.Richman),59-77页.Chichester,UK:John Wiley&Sons Ltd)。最重要的是,未来自然进化的或者在生物战争中通过基因工程人工创造的流感病毒株可能对所有可用的抗病毒化合物有抗性,并且这将导致全球性的破坏。
总之,目前可用的疫苗和抗病毒化合物受限于一些其本质上的缺陷。将来的流感大流行需要使用新颖的治疗和预防的药物形式。
呼吸道感染(RTI)是易传染疾病的最常见且最有潜在危险的典型症状。临床上RTI包括窦炎、耳炎、咽喉炎、支气管炎和肺炎。根据病因学和流行病学研究,现已较明白,虽然许多微生物可能导致RTI,但在大多数情况下,仅有少数的病原体是RTI发生的病因。这些病原体包括肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他摩拉菌、流感病毒A及B和副流感病毒。除了导致CAP和AECB外,许多细菌病原体,如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌,也通常引起急性窦炎和中耳炎并导致脓毒症、脑膜炎等侵袭性感染。因此这些微生物在临床上最具重要性。
所有的呼吸道病原细菌的普遍特征之一是在上部气管粘膜表面建立共生群,这些集群在感染前形成并且是感染发生的先决条件。细菌群在婴儿出生后不久就出现了。人的一生中,在上部气管,特别是鼻咽和口咽中,维持一个动态的微生物生态保留地,它获得细菌,消灭细菌,继而又重新获得细菌。在大多数情况下,咽内细菌群落是无害的。然而,当寄主的情况发生变化时,一些微生物可能侵犯相邻的组织或者血流而导致疾病。鼻咽除了作为细菌和病毒进入粘膜及侵袭性感染的港口外,也是个体间病原微生物传播的主要源头,并也是具抗生素抗性的细菌被选择的地方(Garcia-Rodriguez和Martinez,J Antimicrob Chemother,(2002)50(SupplS2),59-73;Soriano和Rodriguez-Cerrato,J Antimicrob Chemother,(2002)50Suppl S2,51-58)。临床上很确信,易感RTI的个体易成为病原细菌的持续的和循环的携带者(Garcia-Rodriguez和Martinez,J Antimicrob Chemother,(2002)50(Suppl S2),59-73;Mbaki等,Tohku J Exp.Med.,(1987)153(2),111-121)。
幽门螺杆菌是导致胃炎和胃溃疡的人类病原体。此细菌寄生于人胃并附着在胃窦的上皮细胞。已被证实此细菌的粘附是以幽门螺杆菌连接素I和II为媒介而结合到上皮表面的唾液酸上。
Siglecs(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素)是结合于唾液酸上的免疫球蛋白(Ig)超家族,主要在造血系统细胞中表达。已发现至少有11种Siglecs,且它们似乎作为配基专门识别细胞表面的唾液酸。人们相信Siglecs结合到唾液酸介导细胞-细胞粘附和相互作用(Crocker和Varki,Trends Immunol.,(2001)22(6),337-342;Angata和Brinkman-Van der Linden,Biochim.Biophys.Acta,(2002)1572(2-3),294-316)。Siglec-8(SAF-2)是一种粘附分子,严格限于嗜曙红细胞、嗜碱细胞、肥大细胞表面,这些细胞是过敏症状,包括过敏性鼻炎、哮喘和湿疹的主要效应细胞。人们认为Siglec-8负责介导将三种类型过敏细胞补充到气管、肺和其它过敏位点。Siglec-1(唾液酸糖蛋白)和Siglec-2(CD22)是巨噬细胞和B细胞上的粘附分子,两种细胞类型在免疫反应中起中心作用,导致发炎。
重组病毒,尤其是腺病毒伴随病毒(AAV),可用于转移野生型囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因到上皮细胞,以纠正导致囊肿性纤维化的基因缺陷(Flotte和Carter,Methods Enzymol.,(1998)292,717-732)。临床上用AAV载体试验,已显示其能够将CFTR基因有效地转移到上皮细胞上并安全释放,伴随有低水平的基因转移(Wagner等,Lancet,(1998)351(9117),1702-1703)。与腺病毒载体相比,AAV使基因表达更稳定并降低了细胞免疫性。然而,体内AAV在肺中的转导效率相当低(Wagner等,Lancet,(1998)351(9117),1702-1703)。需要一种可以提高体内AAV转导效率的方法,以在囊肿纤维化的治疗方面充分挖掘基因疗法的治疗潜力。已证实带负电荷的碳水化合物,例如唾液酸,抑制AAV载体向高度分化的气管上皮细胞的转导效率,并且通过用糖苷酶,包括一种唾液酸苷酶和内糖苷酶H,处理气管上皮细胞,增强了此AAV载体的转导效率(Bals等,J Virol.,(1999)73(7),6085-6088)。
发明概述
本发明认识到目前的预防和治疗病原体感染的疗法常常很难及时供利用,可能带来不需要的副作用,并可能产生抗药病原菌株。本发明也认识到目前治疗过敏和发炎的方式效果有局限,并且具有副作用。此外,本发明也认识到目前重组病毒的方法所具有的转导效率低和基因治疗的效果不令人满意。
本发明提供预防和治疗病原感染的新的组合物和方法。具体而言,本发明提供可以在细胞外活动的化合物以预防病原对细胞的感染。本发明的一些优选实施方案为治疗用化合物,其具有将自身锚定到靶细胞的表面的锚定域,并且具有可在细胞外活动以防止病毒和细菌等病原感染靶细胞的治疗域。
一方面,本发明提供一种基于蛋白的组合物,用于预防或者治疗病原感染。此组合物由一种化合物组成,此化合物含有至少一个治疗域和至少一个可附着到或者接近靶细胞的细胞膜的锚定域,其中治疗域含有至少一种能防止病原感染靶细胞的具有细胞外活性的肽或蛋白质。
本发明在此方面的实施方案中,此至少一治疗域具有预防或者阻止病原对靶细胞的感染的抑制活性。在一优选的实施方案中,此活性可抑制一种蛋白酶的活性,这种蛋白酶可加工感染靶细胞必需的病毒蛋白。在一个特别优选的实施方案中,此化合物包括一个治疗域,其可以抑制流感病毒的HA蛋白的加工,并且此锚定域可将此化合物附着到呼吸上皮细胞的表面。
在本发明的一些实施方案中,至少一个治疗域具催化活性。在一个优选实施方案中,此催化活性移走感染靶细胞所必需的靶细胞表面的一部分。在一个特别优选的实施方案中,此治疗域是唾液酸酶,其可在上皮靶细胞的表面消化唾液酸成分,并且此锚定域是人类蛋白的GAG结合域,它可在上皮细胞的表面结合肝素或者硫酸乙酰肝素成分。
在另一方面,本发明包括治疗或者防止病原在生物体内的感染的药物组合物。药物组合物包括本发明中的一种化合物,该化合物包括至少一个治疗域和至少一个锚定域。此药物组合物也可包括溶液、稳定剂、填充物和类似物。在某些优选的实施方案中,此药物组合物以吸入剂的形式配成。在一些优选的实施方案中,此药物组合物配成鼻喷雾剂。
本发明的另一个方面是此药物组合物含至少一种唾液酸酶。此唾液酸酶可为从任何来源中分离出的蛋白,举例说来,如一种细菌或者哺乳动物源的,或可以是与一种自然中存在的唾液酸基本同源的重组蛋白。含唾液酸酶的药物组合物可调制成鼻、气管、支气管、口腔或者局部用药,或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含唾液酸酶的药物组合物可用于治疗或防止病原感染,用于治疗或者预防过敏或发炎反应,或用于增强基因治疗时重组病毒的转导效率。
本发明的另一个方面是一种唾液酸催化域蛋白。在这一方面,此蛋白质所含的唾液酸酶催化域并非整个唾液酸酶,其来源于被认为是唾液酸酶催化域的蛋白质。唾液酸酶催化域蛋白可包括其他蛋白质序列,例如(但不局限于)源于其他蛋白的功能结构域。含这种唾液酸酶的药用组合物可被调制成鼻子、气管、支气管、口腔或者局部用药,或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含这种唾液酸酶的药物化合物可用于治疗或预防病原感染,用于治疗或者预防过敏或发炎反应,或用于增强基因治疗时重组病毒的转导效率。
在另一方面,本发明包括治疗或者预防病原感染的方法。在优选的实施方案中,此方法包括赋予生物体唾液酸酶活性,例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白,包括唾液酸酶催化域融合蛋白,以便预防或者治疗感染。病原体可以是病毒或者细菌。此方法包括应用本发明化合物的有效药量到至少一种生物体靶细胞。优选地,药物组合物可通过喷雾剂、吸入剂或者局部用药药剂而得以应用。
本发明也提供新的治疗过敏和发炎的组合物和方法。尤其是,本发明提供可以在细胞外活动以预防或阻止发炎细胞粘附和活动的化合物。一些优选的实施方案中的用于治疗过敏或发炎的化合物包括至少一个具有所述的细胞外活性的治疗域和至少一个锚定此化合物到靶细胞表面的锚定域。在一些优选的实施方案中,此方法包括赋予生物体唾液酸酶活性,例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白,包括唾液酸酶催化域融合蛋白,以便预防或者治疗过敏或者发炎反应。过敏或者发炎反应可以是哮喘、过敏性鼻炎、皮肤情况如湿疹,或对植物或动物毒素的反应。此方法包括应用本发明化合物的有效药量到至少一个生物体的靶细胞。更优选地,药物组合物可通过喷雾剂、吸入剂或者局部用药药剂而得以应用。
本发明也提供在基因治疗中通过重组的病毒载体提高基因转移效率的新的组合物和方法。特别是本发明提供可在细胞外活动的化合物以便减少物理或化学障碍对基因治疗载体(如AAV载体)的转导的阻碍。本发明通过重组病毒载体提高基因转导效率的一些优选的化合物包括至少一个具有细胞外活性的治疗域和至少一个锚定此化合物到靶细胞表面的锚定域。在一些优选的实施方案中,此方法包括赋予生物体唾液酸酶活性,例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白,包括唾液酸酶催化域融合蛋白,以通过重组的病毒载体促进向靶细胞的转导。此方法包括应用本发明的化合物的有效量和可一种重组病毒载体到至少一种靶细胞。本发明的药物组合物可通过喷雾剂、吸入剂或者局部用药药剂而得以应用。
附图说明
图1是抑肽酶氨基酸一级结构的示意图。
图2显示4个人类基因的GAG结合序列:PF4,人血小板因子4;IL8,人白细胞介素8;ATIII,人抗凝血酶III;ApoE,人载脂蛋白E;AAMP-人脉管关联迁移蛋白。
图3是人唾液酸酶NEU2和NEU4序列比对。
图4是比较细菌和真菌唾液酸酶底物特异性的表格。
图5显示编码His6-AvCD的构建体#1的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位点以粗体显示。
图6显示编码AR-AvCD的构建体#2的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位点以粗体显示。
图7显示ARG4S-AvCD的构建体#3的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的Nco I和HindIII位点以粗体显示。
图8为一实验数据图,显示AR-标签促进α(2,6)-连接的唾液酸移出MDCK细胞。Y坐标为用各种重组的AvCD(构建体#1)(菱形)或重组的AvCD(构建体#2)(方形)的稀释剂处理后MDCK细胞表面上的α(2,6)-连接的唾液酸的百分率。
图9是显示用来自构建体#2重组AR-AcCD蛋白或从产尿素节杆菌分离的唾液酸酶处理的MDCK细胞得到的对流感病毒的抗感染效果。供试病毒株有:A/WS/33(H1N1);A/PR/8(H1N1);A/日本/305/57(H2N2);A/维多利亚/504/2000(H3N3);A/香港/8/68(H3N2);B/Lee/40;7.B/马里兰/1/59和土耳其/Wis/66(H9N2)。
图10为重组AR-AvCD唾液酸酶和重组AR-G4S-AvCD唾液酸酶对流感病毒扩增的抑制水平图。供试病毒株有:A/PR/8(H1N1);A/WS/33(H1N1);A/日本/305/57(H2N2);A/香港/8/68(H3N2);B/Lee/40;7.B/马里兰/1/59和土耳其/Wis/66(H9N2)。
图11显示重组AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白局部用药减少了流感病毒A(H1N1)病毒感染的雪貂的发炎反应。(A)感染后在显示的时间内来自受感染的动物的鼻分泌物的发炎细胞总数。(B)测定了受感染的雪貂的无细胞鼻分泌物中的蛋白质浓度。受感染的雪貂用配药液处理(方块)或者用来自构建体#2的重组AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白(三角形)。未受感染的动物也用重组AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白处理(菱形)。统计学显著值用*(p<0.05)和**(p<0.01)标记。
图12以表格显示本发明中两种唾液酸酶催化域融合蛋白对病毒复制的抑制,细胞保护EC50’C值和选择指数。所有的EC50值单位为mU/ml。
图13以表格显示用本发明中的唾液酸酶催化域融合蛋白处理的雪貂和用对照配药液处理的雪貂呼吸道中病毒的复制情况。
发明详述
定义
除有特别定义外,所有在此用到的技术和科学术语具有的含义和本发明所属领域普通技术人员普遍理解的一致。一般来说,在此用到的术语和产品或描述的实验过程为大家熟知并且通常在所属领域应用。这些流程用的是常规的方法,如在所属领域各种一般的文献中所提供。当一个术语以单数形式规定出来,发明者也提出此属于的复数形式。当和部分的参考文献中用到的术语和定义意思有分歧时,本专利申请用到的此术语使用在此给出的定义意思。在公开过程中使用的下列术语,除非另有规定,可被理解为下面的含义:
“病原体”可为任何病毒或者微生物体,其可感染细胞、组织或者有机体。病原体可为病毒、细菌或者原生动物。
“靶细胞”可为任何可被病原体感染的细胞,或者可与发炎细胞作用的任何细胞,或者是通过重组病毒转移外源基因的预计的宿主细胞。
“重组病毒”或者“重组病毒载体”,“基因治疗病毒载体”或者“基因治疗载体”的定义是遗传工程化的病毒,其包括一个或更多的外源基因。当靶细胞被重组病毒转导时,外源基因被转移到靶细胞。转移到靶细胞的基因可在细胞中表达以便提供预计的治疗效果。目前,大多数普遍应用的基因治疗病毒载体都基于4种病毒类型:逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和单纯疱疹I型病毒。
“发炎细胞”为那些执行或者参与免疫系统发炎反应的细胞。发炎细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和单核细胞。
“可预防病原体感染靶细胞的细胞外活性”是任何一种能通过作用靶细胞或者在靶细胞外表面附近阻碍或者阻止病原体感染靶细胞的活性。可预防病原体感染靶细胞的细胞外活性可为一种活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如,催化活性可为一种酶活性,其可降解病原体、靶细胞或者在靶细胞附近的一个或者更多的实体(例如连接子、受体或者酶,但不限于此),此实体对感染过程有贡献。催化活性也可修饰病原体、靶细胞或者在靶细胞附近的一个或者更多的实体,导致此实体的促进感染能力被削弱。抑制活性可为这样一种活性,其可结合到受体或者连接子,防止此受体或者连接子结合到某部位,在此部位结合对于促进感染过程是必需的。抑制活性也可是一种防止酶或者受体行使对于促进感染过程必需的功能的一种酶或者受体的抑制因子。靶细胞的外部包括靶细胞膜本身,也包括包围靶细胞的细胞外环境,包括细胞外基质、细胞间隙和鲁米诺空间。对上皮细胞而言,靶细胞外部也包括形成鲁米诺内衬的细胞膜顶端或鲁米诺表面,以及鲁米诺表面的细胞外环境。“可预防病原体对靶细胞的感染的细胞外活性”可为任何化学实体,包括蛋白质、多肽、肽、核酸和肽核酸、核酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、小的有机分子、聚合体、脂质、类固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括这成分的任意组合。优选地,此活性由肽或者蛋白质组成,或与肽或蛋白质偶联。
“可提高重组病毒的转导效率或基因转化效率的细胞外活性”可为任何一种可减少或消除重组病毒进入寄主细胞的物理或化学障碍的,作用于靶细胞或者靶细胞外表面附近的活性。可提高重组病毒的转导效率或基因转化效率的细胞外活性可为一种活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如,催化活性可为一种降解病原体上、靶细胞上或临近靶细胞处一个或多个实体(如配体、受体或酶)的酶活性,此实体对感染过程有贡献。催化活性也可修饰病原体、靶细胞或者在靶细胞附近的一个或者更多的实体,导致此实体的促进感染能力被削弱。抑制活性可为这样一种活性,其可结合到受体或者连接子,防止此受体或者连接子结合到某部位,在此部位结合对于促进感染过程是必需的。抑制活性也可是一种防止酶或者受体行使对于促进感染过程必需的功能的酶或者受体的抑制因子。靶细胞的外部包括靶细胞膜本身,也包括包围靶细胞的细胞外环境,包括细胞外基质、细胞间隙和鲁米诺空间。对上皮细胞而言,靶细胞外部也包括形成鲁米诺内衬的细胞膜顶端或鲁米诺表面,以及鲁米诺表面的细胞外环境。“可预防病原体对靶细胞的感染的细胞外活性”可为任何化学实体,包括蛋白质、多肽、肽、核酸和肽核酸、核酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、小的有机分子、聚合体、脂质、类固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括这成分的任意组合。特别是,此活性由肽或者蛋白质组成,或与肽或蛋白质偶联。
“可阻止发炎细胞粘连或者发挥功能的细胞外活性”可为任何能预防发炎细胞接触靶细胞和影响靶细胞的正常物理状态的活性。
“能锚定所述至少一种治疗域到靶细胞的细胞膜上的结构域”,也称为“细胞外锚定域”,简单地说,“锚定域”指可稳定结合在细胞表面或者位于细胞表面外部的或者非常接近细胞表面的一部分的化学实体。细胞外锚定域可逆或不可逆地的连接到一个或多个部位,例如,优选地是可结合于一个或多个治疗域,因此导致一个或多个被粘附的治疗用部分居留在或非常接近真核细胞的外表面。优选地,细胞外锚定域结合至少一个靶细胞表面的分子或者至少一个与靶细胞表面非常紧密联系的分子。例如,细胞外锚定域可结合一个与靶细胞细胞膜共价或非共价联系的分子,或者结合围绕靶细胞的细胞外基质中的分子。细胞外锚定域优选是肽、多肽或者蛋白质,也可包含任何化学实体的附加类型,包括一个或多个附加蛋白、多肽或肽,核酸、肽核酸、核酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、小的有机分子、聚合物、脂质、类固醇、脂肪酸、碳水化合物和任意这些成分的结合物。
此处用到的蛋白质或者肽序列与引用序列“充分同源”是指其与参照序列一致或缺失一个或更多的氨基酸、多一个或更多氨基酸以及保守性替换一个或更多氨基酸,但保留了与参照序列相同的或者基本上相同的活性。保守性替换可定义为发生于下列五组情况下的置换:
I小的、脂肪族的、无极性或者极性很小的残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II极性的,带负电的残基和其酰胺化合物:Asp、Asn、Glu、Gln
III极性的,带正电的残基:His、Arg、Lys
IV大的、脂肪族的非极性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys
V大的芳香族的残基:Phe、Try、Trp
在下列组中,下列替换被认为是“高度保守”的:Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/Tyr/Trp和Met/Leu/Ile/Val。半保守替换定义为(I)-(IV)组内其中两组间的置换,其限于包括上述的(I)、(II)和(III)组的超组(A)的或者限于包括上述的(IV)和(V)组的超组(B)。此外,本专利申请中指定的疏水的氨基酸为Ala、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys、Phe和Trp,而亲水的氨基酸为Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Lys和Tyr。
“唾液酸酶”是能将唾液酸残基从底物分子移出的酶。此唾液酸酶(N-酰基神经氨甘油水解酶,EC3.2.1.18)是一组酶,其能将唾液酸残基从唾液酸结合糖中移出。唾液酸是具有9-碳骨架的α酮酸,经常被发现粘附于糖蛋白和糖脂的寡糖链的突出端。唾液酸的一种主要类型是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),它是其他大多数类型唾液酸的生物合成前体。底物分子可为以下例子但不限于此:寡糖、多聚糖、糖蛋白、神经节苷脂或者合成的分子。例如,唾液酸酶可剪切唾液酸残基和底物分子的残余物之间的,具有α(2,3)-半乳糖、α(2,6)-半乳糖或α(2,8)-半乳糖连接的键。唾液酸酶也可剪切唾液酸残基和底物分子残余物的任何连接。Neu5Ac和碳水化合物侧链的倒数第二个半乳糖残基的两个主要连接,Neu5Ac α(2,3)-半乳糖和Neu5Ac α(2,6)-半乳糖,已在自然界中发现。Neu5Ac α(2,3)-半乳糖和Neu5Ac α(2,6)-半乳糖两种分子均可被流感病毒作为受体而识别,虽然人类病毒似乎更易识别Neu5Ac α(2,6)-半乳糖,但是鸟和马病毒主要是识别Neu5Ac α(2,3)-半乳糖。唾液酸酶可为自然发生的酶、人工酶(如氨基酸序列基于自然发生的唾液酸酶的序列的酶,其包括与自然发生的唾液酸的序列基本同源的序列,但不限于此)。在此用到的“唾液酸酶”也可指自然发生的唾液酸酶的活性部分,或者包含基于自然发生的唾液酸酶的活性部分的肽或蛋白质。
“融合蛋白”是包括来自至少两种不同来源的氨基酸序列的蛋白质。融合蛋白可包括来自自然产生的蛋白的或者与自然产生蛋白的全部或一部分基本同源的氨基酸序列,除此外可包括从一到非常多数目的来源不同的自然产生的蛋白的或者与其全部或者部分基本同源的氨基酸。另一选择为,融合蛋白可包括来自自然产生的氨基酸序列或者是与自然产生的蛋白的全部或者部分基本同源的,或者此外可包含人工合成的一个到很多的氨基酸。
“唾液酸酶催化域蛋白”为含唾液酸酶催化域的蛋白,或者是包含与唾液酸酶催化域充分同源的氨基酸序列,但不包括此催化域来源的唾液酸酶的全部氨基酸序列,其中此唾液酸酶催化域蛋白具有与其来源唾液酸酶催化域相同的完整的活性。唾液酸酶催化域可包括全部来自于唾液酸酶的氨基酸序列,但不是必要的。唾液酸酶催化域蛋白可包括来自或者与一个或多个其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列,或者可包括一个或多个不来自或者与一个或多个其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。
I 预防或者治疗病原体感染的组合物
本发明包括基于肽或者蛋白的化合物,包括可锚定至少一个治疗域到真核细胞的细胞膜的至少一个结构域和至少一个具有可预防病原体感染细胞的细胞外活性的治疗域。“基于肽或者蛋白”化合物指此化合物的两个主要的结构域有通过肽键结合氨基酸的氨基酸框架。基于肽或者蛋白的化合物也可具有其他化学混合物或者组群粘附到此氨基酸框架或者骨架,其包括对于此锚定域的锚定活性有贡献的成分,或者对于此治疗域的防感染活性有贡献的成分。例如,本发明的基于蛋白的治疗剂可包括如下化合物和分子,但不限于此:碳水化合物、脂肪酸、脂质、类固醇、核苷酸、核苷酸类似物、核酸分子、核酸类似物、肽核酸分子、小的有机分子或甚至是聚合体。本发明的基于蛋白的治疗剂也可包括修饰了的或者非自然产生的氨基酸。可能用于任何目的的此化合物的非氨基酸部分包括(但不限于此):保持此化合物纯度,增强此化合物溶解度、分布(例如在治疗制剂中),连接此化合物的结构域或化学成分于化合物,维持此化合物的二维或三维结构,增加此化合物的总体积,增加化合物的稳定性和对此化合物的锚定活性或治疗活性有贡献。
本发明的此基于肽或蛋白的化合物也可包括含锚定域和结构域的那些以外的蛋白质或者肽序列。此附加的蛋白质序列可用作任何目的,包括但不受限于上述的任何目的(提纯此化合物,增强此化合物的溶解或分布,连接此化合物的结构域或者连接此化合物的化学成分,维持此化合物的二维或者三维的结构,增加此化合物的总大小,增加此化合物的稳定性,和提高此化合物的锚定活性和治疗活性)。优选地,任何附加的蛋白或者氨基酸序列是一个多肽或者蛋白质链的一部分,其包括一个或多个此锚定域或者此治疗域,但是任何可行的蛋白质序列的排列是在本发明范围之内。
此锚定域和治疗域可以任何合适的方法排序,其允许此化合物结合到或者临近靶细胞膜,这样此治疗域可显示预防或者阻止病原体对靶细胞的感染的细胞外活性。此化合物优选地具有至少一个基于蛋白质或肽的锚定域和至少一个基于肽或者蛋白的治疗域。在这种情况下,此结构域可以任何顺序线性排序。此锚定域可为此治疗域的N末端,或者可是此治疗域的C末端。一个或者多个治疗域在每一末端接有至少一个锚定域是可能的。另一选择是,一个或者多个锚定域可在每一末端接有至少一个治疗域。化学的或优选地肽的连接子可任选地用于连接一些或者所有的此化合物的结构域。
结构域非线性的枝状的排列也是可能的。例如,此治疗域可粘附于氨基酸的衍生侧链,其也包括或者连接到此锚定域的多肽链的一部分。
本发明的化合物可具有多于一个的锚定域。在化合物具有多于一个的锚定域的情况下,此锚定域可是相同的或者不同的。本发明的化合物可具有多于一个的治疗域。在化合物具有多于一个的治疗域的情况下,此治疗域可是相同的或者不同的。当化合物包括多个锚定域时,此锚定域可被一前一后地排列(有或者没有连接子)或者在其它结构域,例如治疗域的交替侧。当一化合物包括多个治疗域,此治疗与可被一前一后地排列(有或者没有连接子)或者在其它结构域,例如但不限于锚定域的交替侧。
本发明的基于肽或蛋白的化合物可通过任何合适的方法制造,包括纯化自然发生的蛋白,任选的水解剪切此蛋白以获得想要的功能域,并将此功能域与其他功能域接合。肽也可化学合成,并且任选的化学接合到其他肽或者化学成分。然而,本发明的基于肽或者蛋白的化合物的制造优选地是通过加工核酸构建体以在一个连续的多肽中同时编码至少一个锚定域和至少一个治疗域(有或没有核酸连接子)。此核酸构建体,优选地具有合适的表达序列,可被转染到原核和真核细胞,并且此治疗用的基于蛋白的化合物可在这些细胞中表达并纯化。任何想要的化学成分在提纯后可被任选地接合到基于肽或蛋白的化合物。在某些情况下,可选择细胞株系以表达具备进行想要的翻译后修饰(例如,但不受限于糖基化)的能力的基于蛋白的治疗剂。
可设计多种构建体并且可测试它们的基于蛋白的产物的想要的活性(例如,举例来说,锚定域的结合活性,或者治疗域的结合、催化或者抑制活性)。可测试核酸构建体的蛋白产物的防止或者阻止病原体对靶细胞的感染的效率。病原体在体外或体内感染能力的测试已为所属领域所熟知,例如在实施例中描述的流感病毒的感染能力那样。
锚定域
在此用到的“细胞外锚定域”或者“锚定域”是可稳定结合在处于靶细胞外表面或者与靶细胞外表面非常接近的实体的任何分子。锚定域的作用是将本发明的化合物保留在靶细胞的外表面或者接近靶细胞。
细胞外锚定域优选地结合1)在靶细胞表面表达的分子,或者成分、结构域、或者在靶细胞表面表达的分子的表位,2)粘附于在靶细胞表面表达的分子的化学实体,或者3)围绕靶细胞的细胞外基质的分子。
优选的锚定域是肽或者蛋白质结构域(包括修饰了的或者衍生的肽或者蛋白域),或者包括偶连肽或蛋白质的成分。偶连肽或蛋白质的成分可为任何分子类型,其可帮助锚定域结合到位于或接近靶细胞表面的任何实体,并且有机分子是优选的,例如核酸,肽核酸、核酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、小有机分子、聚合物、脂质、类固醇、脂肪酸、碳水化合物,或者任何这些物质的任何组成物。
通过锚定域结合的分子、复合物、结构域、或表位对于靶细胞可能或者可能不会具有专一性。举例来说,锚定域可结合位于分子上或者与靶细胞非常接近的表位,并且此结合也发生在不是在靶细胞的周围的位点上。然而在许多情况下,本发明中的治疗化合物的局部释放会限制它主要在靶细胞表面出现。在其它情况下,被锚定域结合的分子、复合物、部分、结构域、或表位可能对于靶组织或者靶细胞类型是专一的。
靶组织或者靶细胞类型包括病原体入侵或者扩增的动物或者人体的位点。举例来说,靶细胞可为能被病原体感染的内皮细胞。本发明的组合物可包括能结合到细胞表面表位的锚定域,举例说来,对内皮细胞类型专一的化合物。再举一例,靶细胞可为内皮细胞,本发明的组合物可结合位于许多内皮细胞类型的细胞表面的,或者位于内皮细胞不同类型的细胞外基质的表位。在这种情况下组合物的局部释放位点限制于作为病原体攻击目标的内皮细胞上。
预防或者治疗病原体导致的感染的化合物可包括可结合在或者接近上皮细胞表面的锚定域。举例来说,与肝素紧密相关的硫酸乙酰肝素是一种在细胞膜上(包括呼吸上皮细胞的表面)普遍存在的糖胺聚糖(GAG)。许多蛋白特异地结合到肝素/硫酸乙酰肝素,并且在这些蛋白质中此GAG结合序列已被鉴定(Meyer,Fa,King,M和gelman,RA.(1975)Biochimicaet Biophysica Acta 392:223-232;Achauer,S.ed.,223页.Sialic AcidsChemistry,Metabolism and Function.Springer-Verlag,1982)。举例来说,此人血小板因子4PF4的G A G结合序列(SEQ ID NO:2),人白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO:3),人抗凝血酶III(ATIII)(SEQ ID NO:4);人载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO:5);人脉管关联迁移蛋白(AAMP)(SEQ ID NO:6);人双调蛋白(SEQ ID NO:7)(图2)已显示对肝素具有非常高亲和力(纳摩尔级)(Lee,MK和Lander,AD(1991)Pro Natl AcadSci USA 88:2768-2772;Goger,B,Halden,Y,Rek,A,Mosl,R,Pye,D.Gallagher,J和Kungl,AJ.(2002)Biochem.41:1640-1646;Witt,DP和LanderAD(1994)Curr Bio 4:394-400;Weisgraber,KH,Rall,SC,Mahley,RW,Milne,Rw和Marcel,Y.(1986)J Bio Chem 261:2068-2076)。这些蛋白质的G A G结合序列与它们的受体结合序列明显不同,因此它们不能诱导与全长蛋白或者此受体结合结构域相关的生物活性。这些序列或者其它序列已被鉴定或者将来要被鉴定为肝素/硫酸乙酰肝素结合序列,或具有肝素/硫酸乙酰肝素结合活性的与已被鉴定为肝素/硫酸乙酰肝素结合序列同源的序列,在本发明的化合物中可用作上皮细胞锚定域,用于预防或者治疗如呼吸道上皮细胞感染病毒,此类病毒包括但不局限于流感病毒。
锚定域可结合靶细胞中的实体,该实体可特异存在于一种物种的靶细胞中,也可在多个物种的靶细胞中均能发现。在锚定域可结合存在于多于一种靶细胞类型的表面的成分,并且病毒和病原体可感染多于一种的细胞类型的情况下,治疗化合物可用于多于一种细胞类型(假定此治疗域也对相关物种有效)。举例来说,在治疗用化合物可用于抗流感病毒的情况下,本发明的治疗用化合物具有结合肝素/硫酸乙酰肝素的锚定域,此化合物就如用于鸟类一样也可用于哺乳动物(包括人类)。
治疗域
本发明的化合物包括至少一个治疗域,其具有可防止或者阻止病原体感染的细胞外活性,可调节受体的免疫反应,或者可以提高重组病毒的转导效率。此治疗活性可以是,作为非限制性例子,结合活性、催化活性或者抑制活性。在本发明的一些实施方案中,此治疗活性修饰或者抑制病原体的帮助病原体感染细胞的功能。在另外一些实施方案中,治疗域可修饰或者抑制靶细胞或者靶生物体的功能。
举例来说,此治疗域可结合靶细胞上的受体,其对于病原体结合到靶细胞来说是必需的。在这个意义上,治疗成分可阻碍病原体结合到靶细胞并预防感染。可供选择的是,治疗域可结合病原体上的分子或者表位以阻止分子或者表位与靶细胞的相互作用,其对感染是必需的。治疗域也可具有降解病原体或者寄主的分子或表位的催化活性,其允许或者提高寄主对靶细胞的感染。在其它的实施方案中,治疗域可为对病原体感染靶细胞必需的活性的抑制物。受抑制的活性可为寄主生物体或者病原体的活性。
此治疗域优选地在细胞外作用,意为其感染的预防、发炎反应的调节或者增强转导的活性发生在靶细胞表面或者在此靶细胞周围的介质中,包括细胞外基质内位点、细胞外空间或者组织的鲁米诺空间。
肽或者蛋白域(包括修饰了的或者衍生的肽或者蛋白域)是优选的治疗域,或包括偶连肽或蛋白质的分子。偶连肽或者蛋白质的分子可为任何可预防或者阻止病原体对靶细胞的感染的分子,并且优选地是有机分子,如,举例来说,核酸、肽核酸、核酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、小的有机分子、聚合物、脂质、类固醇、脂肪酸、碳水化合物或任何这些物质的组合物。
治疗域可为合成肽或者多肽,或者可包括可被接合到肽或者多肽上的合成分子,可为自然发生的肽或者蛋白质或者自然发生蛋白的结构域。治疗域也可为肽或蛋白质,其基本上与自然发生的肽或者蛋白质同源。
治疗域可用于一个特定物种,或者可预防或者阻止病原体对多于一种物种的感染。举例来说,阻止病原体的功能的治疗域可普遍用于一定范围的物种,其可被宿主感染,然而通过宿主的特性干扰而打断宿主病原体相互作用的治疗域可或者不可为一种特定物种。在许多情况下,锚定域和治疗域可在多于一个物种上有效,因而本发明的化合物在减少病毒在动物宿主中的繁殖和传播时可用于提高人类和动物的健康。举例说来,当治疗域为唾液酸酶时,唾液酸酶可剪切多于一种类型的唾液酸残基和基质残留物的连接,特别是,唾液酸酶可同时剪切α(2,6)-半乳糖、α(2,3)-半乳糖联接,可包括人类不受广谱流感病毒感染,包括在不同物种如鸟、猪或者马自然寄生的病毒。
连接子
本发明的化合物可任选的包括一个或者多个连接子,其可连接此化合物的结构域。连接子可用于提供最佳的化合物结构域间距或者折叠。连接子连接的化合物的结构域可为治疗域、锚定域或者此化合物的任何其他的结构域或者成分,其提供附加的功能例如增强化合物稳定性、有助于纯化等。用于连接本发明化合物结构域的连接子可为化学连接子或者氨基酸或肽连接子。在化合物包括多于一个连接子时,连接子可为相同的或者不同的。在化合物包括多于一个连接子时,连接子可为相同的或者不同的长度。
有机化学领域已熟知许多连接子的各种组成、极性、反应性、长度、柔性和可裂解性。本发明优选的连接子包括氨基酸或者肽连接子。肽连接子为所属领域所熟知。优选的连接子长为1到100个氨基酸,且更优选的是长为1到30个氨基酸,尽管长度不是本发明的化合物的连接子的限制因素。优选的连接子包括不干扰本发明的单体编码的肽或蛋白质的形成和活性的氨基酸系列。本发明的一些优选的连接子为包括氨基乙酸的类型。举例来说,连接子含有下列序列:
(GGGGS(SEQ ID NO:10))n,n为1到20间的整数,或者优选地为1到12,可用于连接本发明的治疗化合物的结构域。
本发明也包括编码本发明的基于蛋白的化合物的核酸分子,其包括至少一个治疗域和至少一个锚定域。此核酸分子可有在特定细胞类型中如大肠杆菌或者人类细胞表达的优化的密码子。编码本发明的基于蛋白的化合物的本发明的核酸分子包括至少一个治疗域和至少一个锚定域,也可包括其它核苷酸序列,包括但不限于增强基因表达的序列。此核酸分子可为载体,例如但不限于表达载体。
包括至少一个锚定域和至少一个蛋白酶抑制剂的组合物
本发明的一些方面,具有细胞外活性的可阻止病原体对细胞的感染的治疗域为蛋白酶抑制剂。此蛋白酶抑制剂可为任何类型的化学实体,如,举例来说,碳水化合物或者聚合体,但是抑制酶活性的蛋白或肽优选。优选地,此蛋白酶抑制剂抑制至少部分地加工至少一个病原体或宿主细胞蛋白的酶的活性,病原体或者宿主细胞蛋白在其上的加工对于病原体感染是必需的。此加工对病原体的感染是必需的病毒蛋白的酶可为一种病原体酶或者来自宿主有机体的一种酶。优选地,此加工酶在靶细胞表面或附近起作用,因此本发明的一种粘附在或者位于靶细胞表面的化合物可有效地阻止此酶的活性。
本发明的包括蛋白酶抑制剂结构域的化合物可用于抑制任何病原体的感染,在其生命周期需要蛋白酶的,在其中蛋白酶在或者位于宿主细胞表面附近是有活力的。此基于蛋白的组合物可包括,例如,一种下列的结构:
(锚定域)n-连接子-(蛋白酶抑制剂)n(n=1,2,3或者更多)
(蛋白酶抑制剂)n-连接子-(锚定域)n(n=1,2,3或者更多)
此蛋白酶抑制剂可为肽或多肽的单体形式或可为相同多肽的多个拷贝,其直接地连接或者在其间有间隔序列。另一选择是,当蛋白酶抑制功能域时,不同的基于多肽的蛋白酶抑制剂可相互连接,比如,举例来说,与大豆蛋白酶抑制剂连接的抑蛋白酶肽。此多肽或者肽可直接地连接或者通过一个由肽连接序列组成的间隔子。此锚定域可为任何可结合到处于靶细胞表面附近的肽或者多肽。
此蛋白酶抑制剂可为自然发生的蛋白酶抑制剂(或者其活性部分)或者可为加工的蛋白酶抑制剂。在本发明的化合物中用到的肽蛋白酶抑制剂可含有与自然发生的蛋白酶抑制剂基本上同源的序列,具有一个或多个删除、附加或者替换,保持与自然发生的蛋白酶抑制剂的相同的或者基本相同的活性。
在本发明的一优选实施方案中,本发明的治疗化合物用于预防或者治疗人类流感,且此治疗域是可抑制丝氨酸蛋白酶的可剪切流感病毒血凝素前体蛋白HA0为HA1和HA2的蛋白或肽的蛋白酶抑制剂。
很多丝氨酸蛋白酶抑制剂已显示可减少培养细胞、鸡胚和受感染的小鼠肺中的HA的剪切或者流感病毒的活化。这些抑制剂包括许多经常应用的胰岛素抑制剂,例如抑肽酶(Zhiron OP,Ikizler MR和Wright PF.(2002)JVirol 76:8682-8689),亮抑肽酶(Zhiron OP,Ikizler MR和Wright PF.(2002)J Virol 76:8682-8689;Tashiro M,Klenk HD和Rott R.(1987)J Gen Virol68:2039-2043),大豆蛋白酶抑制剂(Barbey-Morel CL,OeltmannTN,Edwards KM和Wright PF.(1987)JInfect Dis 155:667-672),6-氨基己酸(Zhiron OP,Ovchartenko AV和Bukrinskaya AG.1982.Arch Virol 73:263-272)和正对甲苯磺酰基-L-赖氨酸(TLCK)(Barbey-Morel CL,OeltmannTN,Edwards KM和Wright PF.(1987)J Infect Dis 155:667-672)。在这些当中,抑肽酶的雾化吸入和其在人类的表现一样(Zhiron OP.(1983)ProblemsVirol.4:9-12(以俄语出版)),已在小鼠上显示确定的对流感和支气管肺炎的治疗效果(Zhiron OP,Ovchartenko AV和Bukrinskaya AG.(1984)J GenVirol 65:191-196;Zhiron OP,Ovchartenko AV和Bukrinskaya AG.(1985)JGen Virol 66:1633-1638;Zhiron OP.(1987)J MedVirol 65:161-167;Ovchartenko AV和Zhiron OP.(1994)Antiviarl Res 23:107-118)。
抑肽酶(SEQ ID NO:1;图1)是一个58氨基酸多肽抑制剂(也称为特斯乐或牛胰抑肽酶(BBTI))。本发明的化合物可具有一个或多个抑肽酶结构域;例如,本发明的治疗域可具有1到6个抑肽酶多肽,更优选地1到3个抑肽酶多肽。本发明的化合物可有包括与抑肽酶氨基酸序列基本同源的多肽或者肽的治疗域。
预防或者治疗流感的化合物包括抑肽酶,优选地包括可结合在或者到上皮细胞表面附近的锚定域。在一些优选地实施方案中,此上皮锚定域是来自人类蛋白的GAG-结合序列,例如,人血小板因子4(PF4)的(SEQID NO:2)、人白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO:3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQ ID NO:4)、人载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO:3),人脉管关联迁移蛋白(AAMP)(SEQ ID NO:6)或者人双调蛋白(SEQ ID NO:7)(图2)的GAG-结合序列。本发明的化合物也可具有包括多肽或者肽的锚定域,其基本与列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID和NO:7中的GAG-结合域的氨基酸序列同源。
临床上,包括抑肽酶和上皮的锚定域的药物通过雾化吸入给药而覆盖整个呼吸道以预防或者阻止由在其生命周期中需要丝氨酸蛋白酶的流感病毒或者其他病毒如副流感病毒导致的支气管肺炎。另一选择是,抑肽酶/上皮的锚定域融合蛋白可被用作鼻喷雾剂以治疗未并发的早期流感病或者其他呼吸病毒的感染。此外,抑肽酶/上皮的锚定域融合蛋白可在感染发生前用作流感或者其他病毒感染的预防药物。
包括至少一个锚定域和至少一个催化活性的组合物
在本发明的一些方面,具细胞外活性的治疗域可阻止病原体对细胞的感染是催化活性。此酶活性可为移除、降低或者修饰对病原体感染有用的宿主分子或联合体或者病原体分子或联合体的催化活性。优选地,被本发明的化合物的酶活性移出、降低或者修饰的此宿主分子或联合体或者病原体分子或联合体附于、向着或者靠近靶细胞的表面,以便锚定于靶细胞表面的本发明的化合物可有效地抑制宿主或者病原分子或联合体。
举例说来,治疗域可有可消化病原体或靶细胞的分子或表位的催化活性,其是宿主-病原体结合,进而病原体进入到靶细胞所需要的。靶细胞上允许病毒进入细胞的受体可为本发明化合物酶活性的靶。
本发明包括催化域的化合物可用于阻止任何用受体来帮助其进入靶细胞的病原体的感染,只要此受体的移除不削弱此有机体。这些基于蛋白的组合物可含有,例如,一种下列的结构:
(锚定域)n-[连接子]-(酶活性)n(n=1,2,3或者更多)
(酶活性)n(n=1,2,3或者更多)-[连接子]-(锚定域)n,在此连接子是任选的。
此酶活性可为肽或者多肽的单体形式或者可为相同多肽的多个拷贝,其或者直接地或者在其间以间隔序列连接。此多肽或肽可直接或者通过由肽连接子序列组成的间隔子连接。此锚定域可为任何可结合到或者接近靶细胞表面的肽或者多肽。
在本发明的一优选实施方案中,治疗域包括可除去或者大大的减少上皮细胞表面地唾液酸水平的唾液酸酶。唾液酸为流感病毒的受体。这样,用唾液酸酶处理呼吸上皮细胞表面可阻止流感感染或者干扰早期感染。此治疗域可包括完整的唾液酸酶蛋白但表或者其活性部分。唾液酸为流感病毒的受体,并且至少为至少一个下列病毒的受体:副流感病毒、一些冠状病毒和轮状病毒、肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌。这样,用唾液酸酶处理呼吸上皮细胞可预防流感或者其他病毒感染或者干扰早期感染,也预防或者减少如下细菌的繁殖:肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌。用唾液酸酶处理胃肠上皮细胞可预防或减少胃部幽门螺杆菌的定居。
唾液酸也介导细胞粘附和发炎细胞和靶细胞间的相互作用。因此,用唾液酸酶处理呼吸上皮细胞的表面可预防发炎细胞在气管表面的增长,并且因此可治疗包括哮喘和过敏性鼻炎的过敏反应。
唾液酸作为屏障可通过基因治疗载体阻止细胞进入,用唾液酸酶处理靶细胞可增加转导效率,且因此提高基因治疗的效果。
优选的唾液酸酶为大的细菌唾液酸酶,其可降解受体唾液酸Neu5ACα(2,6)-半乳糖和Neu5ACα(2,3)-半乳糖。举例来说,来自产气荚膜梭菌(GenBank注册号X87369)、粘性放线菌(GenBank注册号X62276)、产尿素节杆菌或生绿小单孢菌(GenBank注册号D01045)的细菌唾液酸酶可被应用。本发明化合物的治疗域可包括大的细菌唾液酸酶的氨基酸序列全部或部分,或者可包括与大的细菌唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。在一优选实施方案中,治疗域包括由粘性放线菌编码的唾液酸酶,例如SEQ ID NO:12中的或者例如与SEQ ID NO:12基本同源的唾液酸酶序列。在另一优选实施方案中,治疗域包括此粘性放线菌唾液酸酶的包括SEQ ID NO:12的274到666的氨基酸的催化域,或者基本同源的序列。
其他的优选的唾液酸酶为人唾液酸酶,例如由基因NEU2(SEQ IDNO:8;Genebank登记号Y16535;Monti,E,Preti.Rossi,E.,Ballabio,A和BoraniG.(1999)Genomics 57:137-143)编码的那些和NEU4(SEQ IDNO:9;Genebank登记号NM080741;Monti,E,Preti,A,Venerando,B和Borsani,G.(2002)Neurochem Res 27:646-663)(图3)。本发明化合物的治疗域可包括人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分或者可包括与人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。优选地,当治疗域包括自然发生的唾液酸酶的氨基酸序列的一部分,或者与自然发生的氨基酸序列的一部分基本同源的序列,此部分具与人唾液酸酶基本相同的活性。
包括一个酶域的预防或治疗流感的化合物优选地包括可结合到或者接近上皮细胞表面的锚定域。在一些优选地实施方案中,此上皮-锚定域是来自人蛋白的GAG-结合序列,如,举例来说,人血小板因子4(PF4)的(SEQ ID NO:2)、人白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO:3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQ ID NO:4)、人载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO:3),人脉管关联迁移蛋白(AAMP)(SEQ ID NO:6)或者人双调蛋白(SEQ ID NO:7)(图2)的GAG-结合序列。上皮锚定域也可基本同源于自然发生的GAG-结合序列,例如在图2中列出的那些。
在例如但不受限于流感病毒、副粘病毒、冠状病毒、轮状病毒和铜绿假单胞菌和细菌感染等病原体的感染的治疗或预防和在治疗和预防过敏和发炎反应时,用包括人唾液酸酶或者包括与唾液酸酶基本同源的没有锚定域的化合物以便提高重组病毒的转导效率也在本发明的范围内。
本发明认识到可通过例如但不受限于粘性放线菌唾液酸酶或者如NEU2和NEU4的人唾液酸酶等唾液酸酶的运用来预防或者消除这些感染。此唾液酸酶可任选地应用,通过基因或化学加工,或者通过制备药剂,以便提高它们的半衰期或者其在呼吸上皮细胞的保留时间。
因为流感病毒主要是感染上呼吸道,局部地去除鼻孔和鼻咽部的受体唾液酸可预防感染或者干扰早期感染。此唾液酸酶可以鼻喷雾剂的形式到达上呼吸道,且其可在流感(或其它感染)早期以治疗方式或者在感染发生前以预防方式应用。另一选择是,其可以吸入剂形式到达下呼吸道以预防流感的并发症,如支气管肺炎。
II 包括至少一个唾液酸酶活性的治疗组合物
本发明包括含至少一个唾液酸酶活性的治疗组合物。此唾液酸酶活性可为从任何来源分离的唾液酸酶,如,举例来说,细菌或哺乳动物来源,或者可为与自然发生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重组蛋白。优选的唾液酸酶为大的细菌唾液酸酶,其可降解受体唾液酸Neu5Ac α(2,6)-半乳糖和Neu5Ac α(2,3)-半乳糖。例如,可应用来自产气荚膜梭菌(GenBank注册号X87369)、粘性放线菌(GenBank注册号L06898)、产尿素节杆菌或生绿小单孢菌(GenBank注册号D01045)的细菌唾液酸酶或者基本同源的蛋白。
举例来说,本发明的治疗化合物可包括大的细菌唾液酸酶或者可包括具大的细菌唾液酸酶的氨基酸序列的蛋白质或者可包括与大的细菌唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。本发明一优选的治疗组合物包括粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12),或者包括与粘性放线菌唾液酸酶基本同源的蛋白质。
其他的优选的唾液酸酶为人唾液酸酶,例如为NEU2基因(SEQ IDNO:8;Genebank登记号Y16535;Monti,E,Preti.Rossi,E.,Ballabio,A和BoraniG.(1999)Genomics 57:137-143)编码的那些和NEU4(SEQ IDNO:9;Genebank登记号NM080741;Monti,E,Preti,A,Venerando,B和Borsani,G.(2002)Neurochem Res 27:646-663)(图3)编码的唾液酸酶。本发明的化合物的治疗域可包括与人唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的人唾液酸酶蛋白或者可包括与人唾液酸酶的氨基酸序列的全部和部分基本同源的氨基酸序列。优选地,当治疗域包括与自然发生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分,或与自然发生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分大致同源的序列,此部分具与人唾液酸酶基本相同的活性。
含唾液酸酶的药用组合物可包括其它化合物,包括但不受限于也具治疗活性的其它蛋白。由唾液酸酶组成的药用组合物可包括可提高此组合物的稳定性、溶解性、包装、传输、坚固性、口感或者气味的其它化合物。
含唾液酸酶的药用组合物可配成鼻、气管、支气管、口腔或者局部用药,或者可配成注射液或滴眼液。包括唾液酸酶的药用组合物可用于治疗或者预防病原体感染,用于治疗或预防过敏和发炎反应,或用于增强基因治疗中重组病毒的转导效率。
III 唾液酸酶催化域蛋白
本发明也包括唾液酸酶催化域蛋白。在此用到的“唾液酸酶催化蛋白”包括唾液酸酶的催化域,但是不包括为此催化域来源的此唾液酸酶的整个氨基酸序列。唾液酸酶催化域蛋白具有唾液酸酶活性。优选地,唾液酸酶催化域蛋白包括为催化域序列来源的此唾液酸酶的至少10%、至少20%、至少50%、至少70%的活性。更优选地,唾液酸酶催化域蛋白包括催化域序列来源的此唾液酸酶的至少90%的活性。
唾液酸酶催化域蛋白可包括其它氨基酸序列,例如但不受限于另外的唾液酸酶序列、源自其它蛋白质的序列或者不来自自然发生的蛋白质的序列的序列。附加的氨基酸序列可执行许多功能,包括对催化域蛋白的其它活性作贡献,增强唾液酸酶催化域蛋白的表达、加工、折叠或者稳定性,或者甚至提供蛋白质需要的大小或者间隔。
一优选的唾液酸酶催化域蛋白是包括粘性放线菌唾液酸酶的催化域的蛋白质。优选地,粘性放线菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第270-666个氨基酸。优选地,粘性放线菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的从第270到290个氨基酸的任何氨基酸开始的,到所述粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的从第665到901个氨基酸的任何氨基酸结束的氨基酸序列,并且缺少任何粘性放线菌唾液酸酶蛋白质序列的第1到269个氨基酸。(在此用到的“缺少任何粘性放线菌唾液酸酶蛋白质序列的第1到269个氨基酸”指当它们出现在指定的蛋白质或者氨基酸序列时缺少4到更多的连续氨基酸。)
在一些优选实施方案中,粘性放线菌唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第274-681个氨基酸并且缺少其它粘性放线菌唾液酸酶序列。在一些优选实施方案中,唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第274-666个氨基酸并缺其它任何粘性放线菌唾液酸酶序列。在一些优选实施方案中,唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的第290-666个氨基酸并缺其它任何粘性放线菌唾液酸酶序列。在另一优选实施方案中,唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放线菌唾液酸酶序列(SEQ IDNO:12)的第290-681个氨基酸并缺其它任何粘性放线菌唾液酸酶序列。
本发明也包括编码本发明基于蛋白的化合物的核苷酸序列,其包括唾液酸酶的催化域。此核酸分子可具有在特殊细胞类型表达的优化的密码子,如,举例来说,大肠杆菌或者人类细胞。本发明的编码基于蛋白的化合物的,包括唾液酸酶的至少一个催化域的此核酸分子或本发明也可包括其它的核酸分子,包括但不受限于增强基因表达的序列。此核酸分子可在载体中,例如但不受限于表达载体。
融合蛋白
唾液酸酶催化域蛋白可为融合蛋白,其中此融合蛋白包括至少一个唾液酸催化域和至少一个其它蛋白质结构域,包括但不限于:纯化结构域、蛋白质标签、蛋白质稳定性结构域、溶解度结构域、增加蛋白质大小的结构域、蛋白质折叠域、蛋白质定位域、锚定域、N-末端结构域、C-末端结构域、催化活性结构域、结合域或者增强催化活性结构域。优选地,此至少一个的其它蛋白质结构域来自其他来源,例如,但不受限于,来自其他蛋白质的序列。此至少一个的其它蛋白质结构域不需要基于任何已知的蛋白质序列,但是可被加工和根据经验测试以便在融合蛋白中执行任何功能。
纯化域可包括,作为非限制性例子,一个或多个组氨酸标签、钙调蛋白结合域、麦芽糖结合蛋白质结构域、链霉亲和素结构域、链霉亲和素结合域、内蛋白结构域或者几丁质结合域。蛋白质标签可包括可用于蛋白质抗体的探测的序列,如,举例说来,myc标签、血球凝集素标签或者FLAG标签。增强蛋白质表达、修饰、折叠、稳定性、大小或者定位的蛋白域可基于已知或者加工的蛋白质的序列。其他蛋白域可具有结合或催化活性,或可增强此唾液酸酶催化域的催化活性。
本发明的优选的融合蛋白包括至少一个唾液酸酶催化域和至少一个锚定域。优选的锚定域包括GAG-结合域如GAG-结合域或人双调蛋白(SEQ ID NO:7)。
本发明的融合蛋白的唾液酸酶催化域和其他结构域可任选地被连接子连接,如但不受限于肽连接子。多种肽连接子为所属领域熟知。优选的连接子是由氨基乙酸组成的肽连接子,如G-G-G-G-S(SEQ ID NO:10)。
本发明也包括核酸分子和由唾液酸酶的催化域组成的本发明的融合蛋白。此核酸分子可具有在特别的细胞类中表达的优化的密码子,如,举例来说,大肠杆菌和人类细胞。编码本发明的融合蛋白的此核酸分子或者本发明也可包括其它核苷酸序列,包括但不受限于增强基因表达的序列。此核酸分子可为载体,如但不受限于表达载体。
IV 药用组合物
本发明包括配成药用组合物的本发明的化合物。此药用组合物包括用作药用的可接受的载体而储藏并且优选地进而用药,其在治疗用的可接受的载体或者稀释液中具有药用的有效性。治疗用的可接受的载体或者稀释液为所属药用领域熟知、描述,例如在Remington’s Pharmaceutical art(第18版Mack出版公司,Easton,PA,(1990))。防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味料可用于此药用组合物。举例来说,安息香酸钠、山梨酸和对羟基丁酸酯可作为防腐剂加入。此外,也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
依赖靶细胞,本发明的此化合物可被做成口服的药片、胶囊或者酏剂,局部应用的药膏或软膏,直肠用的栓剂,消毒液、悬浮液或者用作吸入剂或者鼻喷雾剂的类似物来使用。注射剂也可以常规的形式制备或者是液体溶液或悬浮液,或者是适合在注射之前可制成液相溶液或悬浮液的固体形式,或者是乳剂。合适的赋形剂是,举例来说,水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸氢氯化物或其类似物。此外,如果想要,此注射用药用组合物可包括少量的无毒的辅助物质,例如润湿剂、pH缓冲剂和其类似物。
受试化合物的药用有效剂量依赖于用药的途径、接受治疗的动物或病人的类型和此特定的动物目前的身体状况。此剂量可被制定以达到想要的效果,但是会依赖这些因素如体重、饮食、正在服用的药物和其他因素,这些在所属医学领域的技术人员会加以考虑。在使用本发明的方法时,本药用组合物也可单独使用或者与其它的物质组合,或者与其它治疗或者诊断剂组合。这些产品可用在活的有机体内,优选地,用在哺乳动物病人,优选地用在人类,或者用在体外。在体内使用时,此药用组合物可以以各种方式,包括于局部、注射用药、静脉、皮下、肌肉、结肠、直肠、鼻或腹膜内等的各种药剂形式用给病人。这些方法可用于测试受试化合物在有机体内的活性。
在优选地实施方案中,这些药用组合物可以为口腔用药的悬浮液、溶液、药片或者锭剂,鼻喷雾剂,吸入剂,注射剂,局部喷雾剂,药膏,粉末或者凝胶的形式。
当以悬浮液口腔用药时,本发明的组合物根据所述药剂制备领域所熟知的技术调制并且可能包括所述领域已知的微晶纤维素以适用于散装,褐藻酸或者藻酸钠作为悬浮剂,甲基纤维素作为增粘剂,且调味用甜料/芳香剂。用作快速释放的药片时,这些组合物可能包括所属领域已知的微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖/或其他赋形剂、结合剂、混合剂、分解质、稀释液和润滑剂。漱口剂或冲洗剂制剂的成分包括抗菌剂、表面活性剂、助表面活性剂、油、水和其他添加剂如本领域已知的甜味剂/香料。
当用作饮用溶液时,此组合物包括一个或多个本发明的化合物,溶解在水中,调节到合适的pH值,并且具备载体。此化合物可溶于蒸馏水、自来水、泉水和其类似物。此pH优选地被调节到约3.5到约8.5之间。可添加调节用甜料,例如,1%(w/v)的蔗糖。
锭剂可根据美国专利号3,439,089制备,在此因这些目的而被包含在参考文献中。
当用作鼻喷雾剂或者吸入剂时,此药用组合物根据所述药剂制备领域所熟知的技术制备,并且可制备在所属领域已知的盐溶液、碳氟化合物和/或其他溶解或分散剂,用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以增加药物利用率。见,举例来说,Ansel,H.C.等Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems第6版(1995)。优选的这些组合物和药剂用合适的无毒的药物可接受的成分制备。这些成分的和一些可在Remingtong’sPharmaceutical Sciences(第18版,Mack出版公司,Easton,PA(1990),此领域的权威参考书)中发现的鼻腔给药剂型的这些物质的制备为这些技术人员所知。选择适合的载体高度依赖于想要的鼻腔给药剂型的确切特性,例如溶液、悬浮液、药膏或者凝胶。鼻腔给药剂型一般包括除此活性成分外的大量的水。少量的其他成分如pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂或缓冲和其它稳定和溶解剂也可能存在。优选地,鼻腔给药剂应与鼻分泌物是等浓度的。
鼻腔制剂可用滴剂、喷雾剂、吸入剂给药或者用任何其他的鼻腔内给药形式用药。任选地,传递系统可为单位剂量传递系统。每剂药传递的溶液或悬浮液的体积可优选地为任何从约5到约2000毫升,更优选地从约10到1000毫升,并且再更加优选地从约50到约500毫升。这些各种剂型的传递系统可为或者是以单位剂量或者是多单位剂量包装的滴剂瓶、塑料挤压瓶、喷雾瓶、雾化器或者药物吸入剂。
本发明的药物的配备可改变为包括;(1)其它的酸或碱以调整pH(2)其它的张度赋予剂包括山梨醇、甘油和葡萄糖;(3)其它的抗微生物的防腐剂如其它的对羟基苯甲酸酯、山梨酸酯、安息香酸酯、丙酸酯、三氯丁醇、苯甲醇、杀藻胺和汞;(4)其它的粘度剂如羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其它的树脂;(5)合适的吸收增强剂;(6)稳定剂如抗氧化剂,象重亚硫酸盐和抗坏血酸盐;金属螯合剂如依地钠;和药物溶解增强剂如聚乙二醇。
V 预防或者治疗病原体感染的方法
本发明也包括预防或治疗病原体感染的方法。在一方面,此方法包括:用本发明的药用组合物处理被一病原体感染的或者有被一病原体感染的危险的受体,其包括含至少一个可锚定此化合物到或者接近靶细胞表面的锚定域和由具有至少一个可阻止病原体对靶细胞感染的胞外活性的肽或者蛋白的至少一个治疗域的化合物。在一些优选的实施方案中,此方法包括应用本发明的药用组合物的有效治疗剂量到受体的上皮细胞。需处理的此受体可为动物或者人类。
在另一方面,此方法包括:用本发明的药用组合物处理病原体感染了的或者有被病原体感染的危险的生物体,其包括具唾液酸酶活性的基于蛋白质的化合物。在一些优选的实施方案中,此方法包括应用本发明的药用组合物的治疗有效剂量到一个生物体的上皮细胞。此唾液酸酶活性可为一个分离的自然发生的唾液酸酶蛋白,或者至少与自然发生的唾液酸酶的一部分基本同源的重组蛋白。一优选药用组合物包括与粘性放线菌唾液酸酶基本同源的唾液酸酶(SEQ ID NO:12)。要处理的此生物体可为动物或者人类。
在另一方面,此方法包括:用本发明药用组合物处理病原体感染了的或者有被病原体感染的危险的生物体,其包括含唾液酸酶催化域的基于蛋白质的化合物。在一些优选的实施方案中,此方法包括应用本发明的药用组合物的治疗有效剂量到一个生物体的上皮细胞。此唾液酸酶催化域优选地可与自然发生的唾液酸酶的催化域基本同源。一个优选的药用组合物包括一个与粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)的第274-666个氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。
病原体可为病毒、细菌或者原生细菌。在一些实施方案中,此病原体为下列的一种:流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠状病毒、轮状病毒、肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、绿脓杆菌和幽门螺杆菌。在一优选实施方案中,此病原体为流感毒。
本发明的化合物可被设计以用于人类或者动物。在本发明的一些方面,本发明的化合物可用于预防病原体对一类动物的感染,例如哺乳动物。在本发明的一些方面,组合物可用于人类或者动物(虽然药剂可能不同)。在一些方面,化合物的此活性域对多于一个种类、类型、亚型或者菌株的病原体有效并且对多于一种的寄主种类有活性。举例来说,包括,举例来说,例如防止流感病毒的HA蛋白加工的抑肽酶的活性域的,或包括将唾液酸受体从靶细胞移出的唾液酸酶的,或包括例如结合肝素或乙酰肝素的锚定域的,本发明的一些优选的化合物,可用于鸟类、哺乳动物或者人类。可对一定范围的有能力感染不同的寄主种类的病原体有效的这样的化合物也可用于人类以对抗自然寄生在其他种类的病原体的感染。
在本发明的一些优选的实施方案中,药用组合物预防流感的感染,并且此药用组合物的药用有效剂量用到一生物体的呼吸上皮细胞。这可通过应用吸入剂或者通过鼻喷雾剂而实现。优选地,此吸入剂或鼻喷雾剂一天用一到四次。
因为流感病毒主要感染上呼吸道,定位地移出鼻孔、咽、气管或支气管的此受体唾液酸可预防或者干扰早期感染。此唾液酸酶可以鼻喷雾剂或者吸入剂的形式传递到上呼吸道,并且其可在流感(或其他感染)的早期以治疗方式或者在流感发生前以预防的方式应用。另一选择是,其可以吸入剂的形式传递到下呼吸道以治疗流感并且预防流感并发症,例如支气管肺炎。相似地,此唾液酸酶可以鼻喷雾剂或吸入剂的形式传递以预防或减少副流感病毒和冠状病毒的感染。其也可以吸入剂或鼻喷雾剂的形式传递以预防或减少病原细菌在呼吸道的定植,包括肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和绿脓杆菌。此治疗与可通过基因或者化学加工任选地用于提高它们的半衰期或者在呼吸上皮细胞的居留。此外,其可以滴剂、喷雾剂或药膏的形式局部地传递到眼睛或到外伤以预防和治疗包括绿脓杆菌的细菌感染。其也可局部地用药到口腔以治疗幽门螺杆菌的感染。
剂量
所属领域的技术人员显而易见,体内有用的用药剂量和用药的特殊方式会根据年龄、体重、接受治疗的病人的类型、施用的特殊的药用组合物和施用此药用组合物的特殊用途来决定。有效剂量水平的确定,其为达到想要的结果的需要的药剂水平,可为所属领域的技术人员用上述的程序方法完成。在不用人的动物研究中,药用组合物的施用以一个高的剂量水平开始,随着剂量降低,直到不再达到想要效果或者相反的副作用减少或者消失。根据想要的药效、治疗指征、用药程序、纯度和此化合物的活性,本发明的化合物的剂量可在大范围内变动。典型说来,产品在人类临床上的应用以低剂量水平开始,并逐渐增加剂量水平直到想要的效果达到了。另一选择是,可接受的体外研究可用于建立受试化合物的有用剂量和用药程序。典型说来,剂量可在约1ng/kg到约10mg/kg之内,优选地在在约10ng/kg到约1mg/kg之内,且更优选地在约100ng/kg到约100mg/kg之内。
专人医师可根据病人的情况选择确切的药剂、程序和剂量(见,Fingle等The Pharmacological Basis of Therapeutics(1975))。需要注意的是,由于不恰当的用药也有导致毒性、器官功能紊乱或者其他相反的效果的可能性,此参与医师应该知道如何和什么时候来终止、打断或者调节用药。相反地,此参与医师也应知道当临床反应不足够时应调整到高剂量水平。处理需关注的系统紊乱的最高用药量随被治疗者的情况的严重性和用药程序变化。情况的严重性可能部分地,举例来说,用标准的预后评估方法评估。再者,此剂量和多半剂量的频率,也会随年龄、体重和此个别的病人的反应而变化,也包括兽医用药。
这样,根据本发明,进一步提供了一种治疗的方法和治疗和预防流感病毒感染的药用组合物。此治疗包括给需要此处理的病人施用药物载体和本发明的任何组合物的治疗有效量,或者其药用的可接受的盐。
在一优选的治疗方案中,合适的剂量以吸入剂、鼻喷雾剂或者口服锭剂用于每一个病人。但是可以理解的是,此特殊的剂量水平和用药水平对于每一个特定的病人来说可能会变化,且依赖于包括此特殊的盐或其他施用形式的物质的活性、代谢稳定性和此化合物的活动长度、年龄、体重、健康程度、性别、饮食、用药的方式和时间、排泄速率、药物组成、此特别疾患的严重性和寄主正在实施的治疗。
VI 减少、预防或者治疗过敏和发炎反应的方法
本发明也包括减少、预防或者治疗生物体过敏和发炎反应的方法。
在一方面,此方法包括:用本发明的药用的组合物预防或者治疗生物体的过敏或者发炎反应,其包括一个具一个唾液酸酶活性的基于蛋白的化合物。在一些优选的实施方案中,此方法包括应用本发明的药用组合物的药用有效剂量到一生物体的上皮细胞。此唾液酸酶活性可从自然发生的唾液酸酶蛋白上分离的蛋白或者与自然发生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重组蛋白。一优选的药用组合物包括与粘性放线菌唾液酸酶(SEQID NO:12)基本同源的唾液酸酶。此被治疗的生物体可为动物或者人类。
在另一方面,此方法包括:用本发明的药用组合物预防或者治疗生物体的过敏或者发炎反应,其包括具唾液酸催化域的基于蛋白的化合物。在一些优选实施方案中,此方法包括应用本发明的药用组合物的治疗有效剂量到生物体的上皮细胞。此唾液酸酶催化域优选地包括与粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)的第274-666个氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。此被治疗的生物体可为动物或者人类。
此过敏或者发炎反应可为急性或者慢性疾患,且可包括,作为非限制性例子,哮喘,其它的导致呼吸困难、过敏性鼻炎、湿疹、牛皮藓、对植物或者动物毒素的过敏反应或者自体免疫疾患。
在一些优选的实施方案中,本发明的化合物可以吸入剂或者鼻喷雾剂的形式传递已组织或者治疗呼吸道的发炎,包括但不受限于,哮喘和过敏性鼻炎。含唾液酸酶活性(包括唾液酸酶催化域蛋白和唾液酸酶融合蛋白)的本发明的化合物也可用作滴眼液、滴耳液、喷雾剂、药膏、洗剂或用于皮肤的凝胶。在另一方面,此方法包括静脉内或者局部注射的包括唾液酸酶活性的本发明治疗具有炎性疾病的患者。
剂量
所属领域的技术人员显而易见,体内有用的用药剂量和用药的特殊方式会根据年龄、体重、接受治疗的病人的类型、施用的特殊的药用组合物和施用此药用组合物的特殊用途来决定。有效剂量水平的确定,其为达到想要的结果的需要的药剂水平,可为所属领域的技术人员用上述的程序方法完成。在不用人的动物研究中,药用组合物的施用以一个高的剂量水平开始,随着剂量降低,直到不再达到想要效果或者相反的副作用减少或者消失。根据想要的药效、治疗指征、用药程序、纯度和此化合物的活性,本发明的化合物的剂量可在大范围内变动。典型说来,产品在人类临床上的应用以低剂量水平开始,并逐渐增加剂量水平直到想要的效果达到了。另一选择是,可接受的体外研究可用于建立受试化合物的有用剂量和用药程序。典型说来,剂量可在约1ng/kg到约10mg/kg之内,优选地在在约10ng/kg到约1mg/kg之内,且更优选地在约100ng/kg到约100mg/kg之内。
专人医师可根据病人的情况选择确切的药剂、程序和剂量(见,Fingle等The Pharmacological Basis of Therapeutics(1975))。需要注意的是,由于不恰当的用药也有导致毒性、器官功能紊乱或者其他相反的效果的可能性,此参与医师应该知道如何和什么时候来终止、打断或者调节用药。相反地,此参与医师也应知道当临床反应不足够时应调整到高剂量水平。处理需关注的系统紊乱的最高用药量随被治疗者的情况的严重性和用药程序变化。情况的严重性可能部分地,举例来说,用标准的预后评估方法评估。再者,此剂量和多半剂量的频率,也会随年龄、体重和此个别的病人的反应而变化,也包括兽医用药。
在一些优选的治疗方案中,合适的剂量以吸入剂、鼻喷雾剂或者局部应用用于每一个病人。但是可以理解的是,此特殊的剂量水平和用药水平对于每一个特定的病人来说可能会变化,且依赖于包括此特殊的盐或其他施用形式的物质的活性、代谢稳定性和此化合物的活动长度、年龄、体重、健康程度、性别、饮食、用药的方式和时间、排泄速率、药物组成、此特别疾患的严重性和寄主正在实施的治疗。
VI 通过重组病毒载体增强基因传递的方法
本发明也包括通过重组病毒载体增强基因传递的方法。该方法一方面包括:给药包括有唾液酸酶活性的蛋白的本发明的化合物的有效剂量至至少一个细胞,其在给药至少一个重组病毒载体之前或者伴随其。本发明的组合物可与至少一个重组病毒载体的方式制备在相同的药剂中或者别的药剂中。
在一些优选的实施方案中,此方法包括应用本发明的化合物的有效的治疗剂量和重组病毒载体至一生物体的细胞。此需治疗的生物体可为动物或者人类。在一特殊的优选实施方案中,重组病毒载体用于为基因治疗转导生物体的上皮靶细胞。例如,重组病毒载体可用于转导生物体的具囊性纤维性变的气管上皮细胞。在此情况下,本发明的化合物可通过使用吸入剂而用药。包括治疗基因的重组病毒可同时地或者单独地给药。
在一些实施方案中,细胞可用本发明的化合物和体内或者“体外”(指在转导后从一生物体的移出的细胞将被移植到一生物体)重组病毒载体处理。
此唾液酸酶活性可为一种分离的自然发生的唾液酸酶蛋白,或者一种与自然发生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重组蛋白,其包括唾液酸催化域。一优选的药用组合物包括与粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)基本同源的唾液酸酶。
本发明的化合物可在使用此重组病毒的一天前或者两小时后用到靶细胞上。优选地,本发明的化合物在使用此重组病毒前的四小时到十分钟前用到靶细胞。给药可为
重组病毒优选地为一可用于转移基因到哺乳动物细胞的重组病毒,例如,优选的,人类细胞。举例来说,重组蛋白可为逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或者单纯疱疹病毒类型1。此重组病毒包括至少一个将转移到靶细胞的外源基因。此基因优选地为治疗基因,但是不需要为此情形。举例来说,此基因可为用于标记细胞或者赋予抗药性的基因。
在一优选的实施方案中,本发明包括提高基因治疗载体的功效的方法。此方法包括用本发明的具唾液酸酶活性的化合物并且在相同的或者另一药剂中用重组病毒处理病人。本发明的具有唾液酸酶活性的此化合物可在使用重组病毒之前、同时或者之后用于病人。在一实施方案中,此唾液酸酶与粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID NO:12)或其部分基本是同源的。在一优选的实施方案中,此唾液酸酶包括此粘性放线菌唾液酸酶的催化域。在另一实施方案中,此重组病毒为AAV。在另一实施方案中,此疾病为囊肿性纤维化。在另一实施方案中,此重组病毒包括此囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因。
剂量
所属领域的技术人员显而易见,体内有用的用药剂量和用药的特殊方式会根据年龄、体重、接受治疗的病人的类型、施用的特殊的药用组合物和施用此药用组合物的特殊用途来决定。有效剂量水平的确定,其为达到想要的结果的需要的药剂水平,可为所属领域的技术人员用上述的程序方法完成。在不用人的动物研究中,药用组合物的施用以一个高的剂量水平开始,随着剂量降低,直到不再达到想要效果或者相反的副作用减少或者消失。根据想要的药效、治疗指征、用药程序、纯度和此化合物的活性,本发明的化合物的剂量可在大范围内变动。典型说来,产品在人类临床上的应用以低剂量水平开始,并逐渐增加剂量水平直到想要的效果达到了。另一选择是,可接受的体外研究可用于建立受试化合物的有用剂量和用药程序。典型说来,剂量可在约1ng/kg到约10mg/kg之内,优选地在在约10ng/kg到约1mg/kg之内,且更优选地在约100ng/kg到约100mg/kg之内。
专人医师可根据病人的情况选择确切的药剂、程序和剂量(见,Fingle等The Pharmacological Basis of Therapeutics(1975))。需要注意的是,由于不恰当的用药也有导致毒性、器官功能紊乱或者其他相反的效果的可能性,此参与医师应该知道如何和什么时候来终止、打断或者调节用药。相反地,此参与医师也应知道当临床反应不足够时应调整到高剂量水平。处理需关注的系统紊乱的最高用药量随被治疗者的情况的严重性和用药程序变化。情况的严重性可能部分地,举例来说,用标准的预后评估方法评估。再者,此剂量和多半剂量的频率,也会随年龄、体重和此个别的病人的反应而变化,也包括兽医用药。
在一些优选的治疗方案中,合适的剂量以吸入剂、鼻喷雾剂或者局部应用用于每一个病人。但是可以理解的是,此特殊的剂量水平和用药水平对于每一个特定的病人来说可能会变化,且依赖于包括此特殊的盐或其他施用形式的物质的活性、代谢稳定性和此化合物的活动长度、年龄、体重、健康程度、性别、饮食、用药的方式和时间、排泄速率、药物组成、此特别疾患的严重性和寄主正在实施的治疗。
实施例
实施例1:抑肽酶基因的合成、纯化和抑肽酶融合蛋白的检测
介绍
流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的流感包膜蛋白,它在病毒感染过程中起重要作用。HA的重要性为它是寄主免疫反应产生的保护性中和抗体的主要作用目标所证实(Hayden,FG(1996)Antiviral drug resistance(D.D.Richman编),59-77页.Chichester,UK:John Wiley & Sons Ltd.)。现已清楚HA在病毒感染过程中具有两种作用:首先,HA负责病毒向唾液酸细胞受体的吸附;第二,HA通过促使病毒包膜和细胞膜的融合而介导病毒进入靶细胞。
HA合成过程中其前体蛋白首先被合成,即HA0,它以三聚分子复合物的形式通过高尔基体被转运到细胞表面,其后被切割,C末端形成HA1(HA0的328残基),N末端形成HA2。一般认为切割过程发生于细胞表面或被释放的病毒上。HAO被切割为HA1/HA2不是HA结合到唾液酸受体所必需,但却为病毒感染性所必需(Klenk,HD和Rott,R.(1988)Adv Vir Res.34:247-281;Kido,H,Niwa,Y,Beppu,Y和Towatari,T,(1996)Advan EnzymeRegul36:325-347;Skehel,JJ和Wiley,DC.(2000)Annu Rev Biochem69:531-569)。
HA0对寄主蛋白酶的敏感性由HA0分子的外环上的蛋白裂解位点决定。蛋白裂解位点可能包含一个Arg或Lys残基(一元切割位点),或包含数个Lys和/或Arg残基(多元切割位点),这些残基位于R-X-K/R-R基序内。只有流感A病毒亚型H5和H7含带有多元切割位点的HA蛋白。流感A的其他亚型以及流感B和C病毒含有一元切割位点。含多元切割位点的流感A病毒具有较强的感染力,能引起寄主全身感染,而含有一元HA位点的病毒只能引起哺乳动物的呼吸道感染或鸟类的呼吸道和肠道感染(Klenk,HD和Garten W.1994Trend Micro 2:39-43综述)。幸运的是迄今为止人类中只出现了少数被携带有多元切割位点的高感染力鸟流感病毒A亚型H5和H7感染的病例,这些病例大多发现于香港。绝大多数流感是由含只能在一元切割位点进行切割的HA蛋白的病毒引起的。
含有多元切割位点的流感病毒HA亚型5和7是由费林蛋白酶激活的,费林蛋白酶是类枯草杆菌蛋白内切酶或前蛋白转换酶家族成员。费林蛋白酶是在细胞内切割病毒的,这一过程普遍存在于许多类型的细胞中,使得这种病毒引起的致命性全身感染能被观察到(Klenk,HD和Garten W.1994.Trend Micro 2:39-43;Nakayama,K.1997.Biochem 327:625-635)。其它所有含一元切割位点HA的流感病毒由分泌型胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶激活。流感病毒的激活涉及到的酶包括:血纤维蛋白溶酶(Lazarowitz SG,Goldberg AR和Choppin PW.1973.Virology 56:172-180),小血纤维蛋白溶酶(Murakami M,Towatari T,Ohuchi M,Shiota M,Akao M,Okumura Y,Parry MA和Kido H.(2001)Eur J Biochem 268:2847-2855),类胰蛋白酶Clara(Kido,Chen Y和Murakami M.(1999)In B.Dunn(编),Proteases ofinfectious agents.205-217页,Academic Press,New York,H.Y),激肽释放酶,尿激酶,凝血酶(Scheiblauer H,Reinacher M,Tashiro M和Rott R.(1992)JInfec Dis166:783-791),凝血因子Xa(Gotoh B,Ogasawara,Toyoda T,Inocencio N,Hamaguchi M和Nagai Y.(1990)EMBO J 9:4189-4195),精子头粒蛋白(Garten W,Bosch FX,Linder D,Rott和Klenk HD.(1981)Virology115:361-374.),来自人呼吸灌洗的蛋白酶(Barbey-Mprel CL,Oeltmann TN,Edwards KN和Wright PF.(1987)JInfectDis 155:667-672),来自金黄色葡萄球菌(Tashiro M,Ciborowski P,Reinacher M,Pulverer G,Klenk HD和RottR.(1987)Virology 157:421-430)和铜绿假单胞菌(Callan RJ,Hartmann FA,West SE和Hinshaw VS.(1997)J Virol 71:7579-7585)的细菌蛋白酶。一般认为流感病毒被寄主丝氨酸蛋白酶的激活发生于细胞外,在质膜上或病毒从细胞中释放出以后。
抑肽酶又称特斯乐(Trasylol)或牛胰抑肽酶(BPTI),是一种含58个氨基酸的多肽。它属于Kunitz型抑制剂,能够竞争性地、广谱性地抑制丝氨酸蛋白酶,包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶。长期以来抑肽酶被人们用作药物,如用于治疗胰腺炎、各种时期的休克综合征、纤溶出血和心肌梗死。它也用于心内直视手术,包括体外循环手术,以减少失血(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。
人体内抑肽酶对人体的安全性已为多年的治疗实践所证实。此外,抑肽酶显然是它的特异抗体的弱免疫原,此类免疫原迄今还未在人血清中观察到(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch 33:479-494)。抑肽酶作为候选药物的另一特征是它的超稳定性,它可在室温中保存至少18个月而活性丝毫不下降(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。
为使抑肽酶达到显著的抑制病毒的效果,在动物试验中使用了高剂量。例如对小鼠进行6天的腹膜内注射,每天使用280到840毫克剂量(Zhirnov OP,Ovcharenko AV和Bukrinskaya AG.(1984)J Gen Virol65:191-196);进行雾化吸入须使用较低剂量,但每只小鼠每天仍需63-126毫克服用6天(Ovcharenko AV和Zhirnov OP.(1994)Antiviral Res23:107-118)。根据从小鼠中得到的数据推断,人体需要使用非常高剂量的抑肽酶。因此,为在人体中获得更好的药效,需显著提高抑肽酶分子的效价。
抑肽酶是通过竞争性抑制位于寄主呼吸上皮细胞表面的丝氨酸蛋白酶发挥作用的。因此,抑肽酶在接近寄主蛋白酶处具有局部高浓度是决定其竞争优势的关键因素。我们利用两种方法协同作用以提高抑肽酶在呼吸上皮表面的竞争优势。
首先,使抑肽酶形成多价融合蛋白使之亲合力(功能型亲和力)得到提高,多价融合蛋白由两个、三个或更多抑肽酶蛋白通过连接子的连接而形成。这种分子能够以多价形式与膜蛋白酶结合,与抑肽酶单体相比具明显的反应动力学优势。单体抑肽酶与牛胰蛋白酶结合较紧密,其解离常数(Ki)为6.0×10-14mol/l。然而它的结合力与其它蛋白酶相比是非常低的,如被认为与流感病毒的激活有关的胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和激肽释放酶的Ki值为10-8到10-9mol/l(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch 33:479-494)。多聚化可使抑肽酶与这些蛋白酶的结合力呈指数性提高。
第二,我们将抑肽酶与锚定于呼吸表皮的结构域融合。锚定域使抑肽酶停留于接近寄主膜结合蛋白酶的区域,使之在在表皮表面保持较高的局部浓度。锚定域也增加了药物在呼吸表皮的停滞时间。
克隆
抑肽酶是一单链多肽,具有58个氨基酸残基和3个链内二硫键(SEQID NO:1)。图1所示为抑肽酶的氨基酸序列。在利用PCR合成编码抑肽酶和其融合蛋白的基因时,利用了对密码子进行优化过的重叠寡核苷酸为模板,以利于在大肠杆菌中的表达。将PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。测序后将基因亚克隆到表达载体pQE(Qiagen)中。该载体含有纯化标签Hisx6,便于纯化重组蛋白。将该构建体转化到大肠杆菌中。转化细胞在加有氨苄青霉素的LB培养基中培养至对数生长中期,利用标准实验方法使用IPTG诱导。将细胞离心沉淀后在磷酸盐缓冲液(PBS)中利用超声波将之裂解。利用镍柱(Qiagen)纯化带His6纯化标签的酶。
制作了以下几种抑肽酶融合蛋白:
1.二价和三价抑肽酶。两个或三个抑肽酶通过柔性连接子连接为以下结构:抑肽酶—(GGGGS(SEQ ID NO:10))n(n=3,4或5)—抑肽酶;
抑肽酶—(GGGGS(SEQ ID NO:10))n(n=3,4或5)—抑肽酶—(GGGGS(SEQID NO:10))n(n=3,4或5)—抑肽酶
连接肽序列的长度可能会决定多价抑肽酶分子的三维柔性,从而影响它的功能性亲和力。因此构建了具有多种长度的连接肽的构建体。
具有全功能的重组单价抑肽酶已在大肠杆菌中产生(Auerswald EA,Horlein D,Reinhardt G,Schroder W和Schnabel E.(1988).Biol ChemHopper-Seyler Vol 369,Suppl.,第27-35页)。因此我们期望大肠杆菌细胞中的多价抑肽酶蛋白能够正确折叠。除在各种常见的大肠杆菌菌株如BL21、JM83等之中表达外,也在OrigamiTM细胞(Novagen,Bad Soden,Germany)中表达了多价抑肽酶蛋白。OrigamiTM细胞系不含硫氧还蛋白和谷胱甘肽还原酶,因此具有氧化性细胞质。该细胞系已被成功用于表达许多含二硫键的蛋白(Bessette PH,Aslund F,Beckwith J和Georgiou G.(1999)Pro NatlAcad Sci USA96:13703-13708;Venturi M,Seifert C和Hunte C.(2001)J MolBiol 315:1-8.)。
2.表皮细胞锚定抑肽酶。将表皮细胞锚定序列与抑肽酶融合。任何与表皮细胞表面具有亲和力的肽或多肽序列都可能作为表皮锚定序列。我们已选出三个人类GAG结合序列:PF4(aa47-70;SEQ ID NO:2),IL-8(aa46-72;SEQ ID NO:3),和AT III(aa 118-151;SEQ ID NO:4)(图2)。这些序列与硫酸肝素和硫酸乙酰肝素具有纳摩尔(nanomolar)级的高亲和力(表1)。硫酸肝素/硫酸乙酰肝素普遍存在于呼吸表皮中。在不同构建体中,GAG结合序列通过通用连接肽序列GGGGS与抑肽酶基因的N末端和C末端融合为以下结构:
(GAG结构域—GGGGS(SEQ ID NO:10)—抑肽酶);和
(抑肽酶—GGGGS(SEQ ID NO:10))—GAG结构域)
表1 对肝素的亲和力
 
蛋白质 KdnM(ref)
PF4 27(44)
IL-8 <5(43)
ATIII 11(42)
ApoE 62(45)
胰蛋白酶抑制光度测定
利用光度测定法检测抑肽酶和其融合蛋白的胰蛋白酶抑制活性,具体方法如前人所述(Fritz H和Wunderer G.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。简言之,在该检测中抑肽酶抑制胰蛋白酶催化的Na-苯甲酰-L-精氨酸-对硝酰基苯胺(BzArgpNA或L-BAPA)(Sigma)的水解,这种物质可在405nm波长下进行光度测定。一个胰蛋白酶单位(UBAPA)相当于每分钟水解一毫克底物。一个抑制单位(IUBAPA)将两单位胰蛋白酶活性减少50%在数量上相当于抑制1UBAPA胰蛋白酶。抑肽酶的精确活性用IUBAPA/mg多肽表示。
表面等离子共振检测
以人血纤维蛋白溶酶为作用目标,利用表面等离子共振或BIAcore分析(BIAcore,Piscatawa,NJ)技术对含有多种连接肽的双价和三价抑肽酶与单价抑肽酶进行亲和力比较。与此类似,以肝素为作用目标,利用BIAcore技术检测GAG结合的抑肽酶融合蛋白与肝素的亲和力。
当使用血纤维蛋白溶酶为作用目标时,按照产品介绍(BIAcore,Piscataway,NJ)将纯化的人血纤维蛋白溶酶(Sigma)固定于CM5型芯片上。当使用肝素为作用目标时,按照文献所述方法(Xiang和Moss B.(2003)J Virol77:2623-2630)将生物素化的白蛋白和白蛋白-肝素(Sigma)捕获到链霉亲和素包被的BIAcore SA芯片上。
实施例2:建立改进的用于研究流感病毒感染的组织培养模型
流感病毒株
流感病毒株从ATCC和St.Jude儿童医院的库获得。所有涉及流感病毒的试验均遵守生物研究安全等级II的规定。
按照文献所述方法将病毒注射进九日龄的鸡胚尿囊腔以进行扩繁(Zhirnov OP,Ovcharenko AV和Bukrinskaya AG.(1985)J Gen Virol66:1633-1638)。或将Madin-Darby犬肾细胞系(MDCK)中的病毒株置于加有0.3%牛血清白蛋白和0.5毫克每毫升胰蛋白酶的低限基本培养基(MEM)中培养。孵育48到72小时后,低速离心对培养基进行澄清,利用超速离心和25%蔗糖缓冲沉淀并纯化病毒颗粒。将纯化的病毒重悬于50%甘油-0.1M Tris缓冲液(pH7.3),保存于-20℃。
空斑分析
病毒株的传染力和滴度测定使用了两种空斑分析方法,一种为传统方法,另一种为改进型的(Tobita,K,Sugiura,A,Enomoto,C和Furuyama,M.(1975)Med Microbiol Immunuol 162:9-14;Zhirnov OP,Ovcharenko AV和Bukrinskaya AG.(1982)Arch Virol 71:177-183)。传统的空斑分析法通常用作病毒滴度的检测。它需要在病毒感染单层MDCK细胞后立即加入琼脂中的外源胰蛋白酶形成重叠层(Tobita,K,Sugiura,A,Enomoto,C和Furuyama,M.(1975)Med Microbiol Immuol 162:9-14)。这个方法通过激活所有含未切割HA的病毒颗粒而人为地提高了毒株的传染力。
Zhirnov等设计了一个改进的空斑分析方法,琼脂重叠层由双层组成,胰蛋白酶包含于第二层,且该层在感染24小时后加入(Zhirnov OP,Ovcharenko AV和Bukrinskaya AG.(1982)Arch Virol 71:177-183)。感染3天后用10%甲醛溶液固定细胞,移去琼脂糖层,用苏木素-伊红对固定的细胞染色,对空斑计数。改进的空斑分析法能够对含切割和未切割HA的毒株的感染力进行精确测定。结合传统的和改进的空斑分析方法的结果,就可区分含切割和未切割HA的病毒,从而将毒株的感染力与HA切割状态联系起来。
人细胞培养模型
1.原代人表皮细胞的短期培养。传统的流感病毒体外感染大多是在MDCK细胞培养基中加入外源胰蛋白酶。这与实际生理状况相差甚远且不适用于本研究,因为胰蛋白酶在体内不是激活流感病毒的蛋白酶。迄今为止,能够在不加外源蛋白酶的条件下使流感病毒生长的体外组织培养模型只有下列组织细胞的很有限的报道,即肾组织的原代细胞、胚化鸡蛋的尿囊腔和羊膜腔的内衬细胞、胎儿气管环组织细胞和原代人淋巴组织上皮细胞(EndoY,Carrill KN,Ikizler MR和Wright PF.(1996)J Virol 70:2055-2058)。上述报道中,最近所做的利用原代人淋巴组织上皮细胞进行的工作是最接近人体环境条件的。在该研究中,Endo等(EndoY,Carrill KN,Ikizler MR和Wright PF.(1996)JVirol 70:2055-2058)从人淋巴组织的外科手术样品中分离得到上皮细胞,培养于Transwell小室(Costar,Canbrige,Mass)胶原基质中(Vitrgen 100,Celtrix Laboratories,Palo Alto,California)。细胞在加有生长因子和微量元素的50%Ham’S F12和50%Eagles低限基本培养基中继代。培养的细胞在10到14天内到达融合,主要为单层的,但有不连续的纤毛化的细胞斑,这些细胞在达到融合后保持有规律的纤毛活性1-3周。在该体系中,流感病毒A可生长至滴度为106pFU/ml,感染增殖率为0.001(Endo Y,Carrill KN,Ikizler MR和Wright PF.(1996)J Virol70:2055-2058)。感染过程中也出现了进行性的致细胞病变效应。这个体系最大的缺点是它需要新鲜人淋巴组织。
为解决这个问题,将原代人淋巴组织上皮细胞替换为可商用的(Cambrex)原代人气道上皮组织细胞,相同条件下后者可以生长。利用原代人气道上皮组织细胞进行短期培养的体系能够相对较快地建立,可用作大多数体外感染和抗病毒试验的一线试验模型。
2.高分化的人气道上皮组织(WD-HAE)。为最好地模拟体内人体气道条件,利用了高分化的人气道上皮组织(WD-HAE)模型。WD-HAE是成层的上皮组织,具有正常人气道上皮组织分化的所有细胞,包括功能性纤毛化细胞和黏液分泌细胞。因此,在这个模型系统中流感病毒更可能被和生理机能相关的寄主蛋白酶激活。虽然WD-HAE已被广泛用于研究呼吸道病毒感染,如呼吸道合胞病毒(RSV)(Zhang L,Peeples ME,Boucher RC,CollinsPL和Pickles RJ.(2002)J Virol 76:5654-5666)、麻疹病毒(Sinn PL,WilliamsG,Vongpunsawad S,Cattaneo R和McCray PB.(2002)JVirol 752403-2409)和人鼻病毒,它还未被用于研究流感病毒。
已有关于WD-HAE实验方法的详细描述(Krunkosky TM,Fischer BM,Martin LD,Jones N,Akley NJ和Adler KB.(2000)Am J Respir Cell Mol Biol22:685-692)。简言之,将商用的原代人支气管上皮组织细胞(Cambrex)培养于I型鼠尾胶原蛋白薄膜包被的Transwell澄清培养小室(Costar)中。开始的5到7天,用支气管上皮组织细胞生长培养基(BEGM)(Cambrex)和加有高浓度葡萄糖的DMEM按1:1比例混合,再加生长因子的混合培养基进行浸没培养(Krunkosky TM,Fischer BM,Martin LD,JonesN,AkleyNJ和Adler KB.(2000)Am J Respir Cell Mol Biol 22:685-692)。当培养至70%融合时(第5至7天),移去顶层培养基,使细胞基部表面只暴露于培养基,以此产生气-液交界层。细胞在气-液交界层继续培养14天,前后共经过21天培养后可供试验用。分化的上皮细胞可在体外保存数周。
上皮组织的形态和分化程度的研究方法已有常规组织学的文献记载(EndoY,Carroll KN,Ikizler MR和Wright PF.(1996)J Virol70:2055-2058)。简而言之,用10%缓冲甲醛溶液固定后,用石蜡包被上皮组织细胞,切片,用苏木素-伊红染色,对黏液分泌细胞用过碘酸雪夫氏反应(PAS)染色。
在上述两个模型体系中,将0.001至1MOI病毒加入到分化的细胞中以进行流感感染。在接下来的3至7天内检测上层病毒的滴度和传染力。使用传统和改进的斑点分析方法估计流感病毒的繁殖速度和传染力水平。
实施例3:体外比较抑肽酶融合蛋白的功能
抑肽酶融合蛋白的抗病毒效果
1.感染前处理。将各种浓度的抑肽酶融合蛋白加入原代人细胞培养物中,孵育一小时。用新鲜培养基洗涤细胞,立即加0.01至1 MOI的流感病毒共孵育。一小时后再次洗涤细胞,培养3至5天。在各个时间点利用两种斑点分析方法检测上清病毒的滴度和传染力。用结晶紫对活细胞染色以估计病毒感染的致细胞病变效应,试验结束时于570nm波长测量细胞的光吸收以对病变效应进行定量。抑肽酶融合蛋白保护的细胞的百分比以100×{(抑肽酶处理样品-未处理受感染样品)/(未感染对照-未处理受感染样品)}计算。药物对细胞保护的效价表示为该药品能够保护50%细胞(EC50)时的有效浓度。因为HA激活只出现于新释放的病毒颗粒,第一轮病毒感染将正常出现,病毒的滴度将在感染后头24小时内升高。然而,从第二轮开始,由于抑肽酶的处理,病毒传染力将下降,病毒滴度逐渐减少。本实验得到的结果能够通过一次预防性治疗以效价为指标区分各种类型的不同的抑肽酶融合蛋白。
另一可选方法是,将起始病毒孵育的计时从抑肽酶处理后立即开始改为处理后2-24小时。感染后3-5天,用上文所述方法检测病毒滴度、传染力和细胞病变效应。从这类实验取得的结果能够通过一次预防性治疗以有效时间窗的长度为指标区分各种抑肽酶融合蛋白。
2.感染后处理。对于多次治疗处理,首先将0.001-0.1MOI病毒接种到细胞进行感染,之后立即加入各种浓度的抑肽酶融合蛋白,感染开始后48小时内每8小时处理一次。将细胞培养至感染后第7天。对培养基内的病毒滴度和传染力进行全过程检测。实验结束时进行细胞病变效应的评估。
对于单次治疗处理,首先将0.001-0.1MOI病毒接种到细胞进行感染,感染开始后48小时内于不同时间点加入各种浓度的抑肽酶,但每个细胞样品在全实验中只能处理一次。将细胞培养至感染后第7天。对培养基内的病毒滴度和传染力进行全过程检测。实验结束时进行细胞病变效应的评估。从这类实验取得的结果能够以效价为指标区分各种不同类型的抑肽酶融合蛋白。
抑肽酶融合蛋白对HA切割的抑制
为证明抑肽酶融合蛋白通过抑制流感HA蛋白的切割抑制流感病毒感染,用1MOI的流感病毒感染人原代上皮组织细胞培养物。抑肽酶融合蛋白在病毒接种之前或病毒感染之后立即加入培养物。感染后6.5小时时,将培养物在不含冷蛋氨酸、含100microCi/ml(脉冲)浓度的35S标记的蛋氨酸(Amersham)MEM培养基中孵育1小时。之后用含10倍浓度冷蛋氨酸的MEM培养基洗涤两次,用MEM继续孵育3小时(进行脉冲追踪)。标记后,将细胞溶解于放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液中,利用抗(用于感染实验的)病毒株的抗血清沉淀HA(抗病毒血清可从ATCC和疾病控制和预防中心(Center of Disease Control and Prevention)获得),用G蛋白琼脂糖凝胶(Amersham)纯化免疫复合物。用SDS-PAGE胶分离样品后进行放射自显影。对于未用抑肽酶融合蛋白处理的样品,预期HA1和HA2数量占优势;对于抑肽酶处理的样品,预期HA0是主要存在的HA类型。
实施例4:五个唾液酸酶基因的合成,唾液酸酶蛋白的表达和纯化
介绍
流感病毒属于RNA病毒正粘病毒科家族。A型和B型病毒均含8段负链RNA基因组,它们包被在源于寄主细胞的脂质包膜中。病毒包膜由刺突覆盖,刺突由三种蛋白组成:红血球凝聚素(HA),它负责病毒向寄主细胞受体的附着,介导病毒与细胞膜的融合;唾液酸苷酶(NA),负责新产生的病毒从宿主细胞的释放;少数作为离子通道的M2蛋白。对流感病毒A而言,其HA和NA均经过了抗原性漂流和抗原性转移,病毒亚型以HA和NA蛋白的血清学差异区分。共存在15种HA(H1-H15)和9种NA(N1-N9),但迄今为止在人流感病毒A中仅发现三种HA(H1-H3)和两种NA(N1-N2)蛋白(Granoff,A.& Webster,R.G.,编Encyclopedia ofVirology,2nd Edition,Vol 2)。与流感病毒A相反,流感病毒B中未发现不同的抗原亚型。
流感病毒B仅在人类中传播,而流感病毒A可从全部种类的动物寄主中分离到,例如猪、马、鸡、鸭和其它鸟类,这造成了流感病毒A的基因重组,导致了抗原性转移。野生水禽被认为是一切鸟类和哺乳动物的流感病毒的原始贮存库。有广泛证据证明流感病毒在水禽和包括猪和马在内的其它物种间传播,以及通过猪向人的间接传播。从猪或鸡向人的直接传播也有证据(Ito,T.(2000)Microbiol Immunol 44(6):423-430)。
细胞表面的唾液酸是流感病毒的寄主细胞受体。唾液酸是含九碳骨架的α酮酸,通常发现于与糖蛋白和糖脂附着的寡糖链的最外位置。唾液酸的主要类型之一是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),它是大多数其它类型唾液酸的生物合成前体。在自然界中发现两种Neu5Ac与醣侧链上第二末位半乳糖残基的连接方式,即Neu5Ac α(2,3)-Gal与Neu5Ac α(2,6)-Gal。Neu5Acα(2,3)-Gal与Neu5Ac α(2,6)-Gal分子均能被流感病毒A识别作为受体(Schauer,R.(1982)Adv.Carbohydrate Chem & Biochem 40:131-235),但人携带的病毒倾向于Neu5Ac α(2,6)-Gal分子,鸟类与马类携带的病毒优先识别Neu5Ac α(2,3)-Gal分子(Ito,T.(2000)Microbiol Immunol 44(6):423-430)。
流感病毒A型和B型的感染一般起始于上呼吸道粘膜的表面。病毒复制起初限于上呼吸道,但可扩展到较低位置的呼吸道,导致可致命的支气管肺炎。死亡几率为万分之一,但对高危人群而言则危险性显著提高,如在大范围流行时的患心肺疾病者和免疫功能低下者。
含唾液酸酶的治疗化合物可有效地降解两种唾液酸,即Neu5Acα(2,6)-Gal和Neu5Ac α(2,3)-Gal,从而对机体提供针对动物病毒在内的多种流感病毒的保护。即使在毒株每年都发生变化的条件下它仍然保持有效。因为唾液酸酶作用于寄主细胞而非病毒,形成病毒生命周期的“堵塞点”,从而使抗性病毒不能继代。结合蛋白的唾液酸在细胞表面均匀增殖的半衰期为33小时(Kreisel,W,Volk,BA,Buchsel,R和Reutter,W.(1980)ProNatl Acad Sci USA 77:1828-1831)。因此,我们估计一日一次或两次服用唾液酸酶就可针对流感提供有效保护。
唾液酸酶被发现存在于高等真核生物中,也存在于一些高致病性微生物中,包括病毒、细菌和原生生物。病毒和细菌唾液酸酶的特性已研究得很清楚,一些此类唾液酸酶的三维结构也已确定(Crennell,SJ,Garman,E,Laver,G,Vimr,E和Taylor,G.(1994)Structure 2:535-544;Janakiraman,MN,White,CL,Laver,WG,Air,GM和Luo,M.(1994)Biochemistry 33:8172-8179;Pshezhetsky,A,Richard,C,Michaud,L,Igdoura,S,Wang,S,Elsliger,M,Qu,J,Leclerc,D,Gravel,R,Dallaire,L和Potier,M.(1997)NatureGenet 15:316-320)。近些年已克隆了数个人唾液酸酶基因(Milner,CM,Smith,SV,Carrillo MB,Taylor,GL,Hollinshead,M和Campbell,RD.(1997)JBiol Chem 272:4549-4558;Monti,E,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A和Borani G.1999.Glycobiol 9:1313-1321;Wada,T,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,M,Akita,H和Miyagi,T.(1999)Biochem Biophy Res Communi261:21-27;Monti,E,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,M,Manzoni,M,Veneranobo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G和Borsani,G.(2000)Bichem J 349:343-351)。所有已了解的唾液酸酶在其氨基末端位置都有含四个氨基酸的基序,其后为随蛋白不同重复3-5次的Asp box基序(Monti,E,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,M,manzoni,M,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G和Borsani,G.(2000)Bichem J 349:343-351;Copley,RR,Russell,RB和Ponting,CP,(2001)ProteinSci 10:285-292)。虽然唾液酸酶超家族全部氨基酸一致性相对较低,只有大约20-30%,但其分子折叠结构非常相似,尤其是负责催化的氨基酸(Wada,T,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,M,Akita,H和Miyagi,T.(1999)Biochem BiophyRes Communi 261:21-27;Monti,E,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,M,Manzoni,M,Veneranobo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G和Borsani,G.(2000)Bichem J 349:343-351;Copley,RR,Russell,RB和Ponting,CP,(2001)Protein Sci 10:285-292)。
一般将唾液酸酶分为两个家族:“小”唾液酸酶,分子量大约为42kDa,达到最高活性时不需要二价金属离子;“大”唾液酸酶,分子量大约为65kDa以上,需要有二价金属离子才具有活性(Wada,T,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,M,Akita,H和Miyagi,T.(1999)Biochem Biophy Res Communi261:21-27;Monti,E,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,M,Manzoni,M,Veneranobo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G和Borsani,G.(2000)Bichem J 349:343-351;Copley,RR,Russell,RB和Ponting,CP,(2001)Protein Sci 10:285-292)。
已有超过15种唾液酸酶被纯化,它们在底物特异性和酶动力学方面彼此差异很大。为获得广谱抗流感病毒特性,唾液酸酶应能够对α(2,6)-Gal和α(2,3)-Gal交连位置的唾液酸都有效地降解,而且这种作用应能够在糖蛋白和一些糖脂环境下进行。来源于流感A病毒(influenza A virus)、鸡瘟病毒(fowl plague virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)等的病毒唾液酸酶一般特异降解Neu5Ac α(2,3)-Gal,而对Neu5Ac α(2,6)-Gal的降解效率很低。小细菌唾液酸酶在糖蛋白和糖脂环境下与唾液酸的反应强度一般较低。与此相反,大病毒唾液酸酶在大多数天然底物环境下都能够高效率地切割唾液酸α(2,6)和α(2,3)连接位置(图4;Vimr,DR.(1994)TrendsMicrobiol 2:271-277;Drzeniek,R.(1973)Histochem J:271-290;Roggentin,P,Kleineidam,RG和Schauer R.(1995)Biol Chem Hoppe-Seyler 376:569-575;Roggentin,P,Schauer,R,Hoyer,LL和Vimr,ER.(1993)Mol Microb 9:915-921)。因为大细菌唾液酸酶具有底物广泛的特性,它们是较好的药物候选对象。
在图4所示的已知特异底物的大细菌唾液酸酶中,霍乱弧菌(vibriocholerae)唾液酸酶须有Ca2+才具有活性,因此不受推荐。较优选的唾液酸酶包括来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的71kDa唾液酸酶、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)的113kDa唾液酸酶和arthrobacterureafaciens的唾液酸酶。可作为候选对象的第三种唾液酸酶是来自生绿小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)的68kDa酶,已知它可破坏流感病毒受体(Air,GM和WG.(1995)Virology211:278-284)。
这些酶具有高特异活性(产气荚膜梭菌为600U/mg蛋白(Corfield,AP,Veh,RW,Wember,M,Michalski,JC和Schauer,R.(1981)Bichem J197:293-299),粘性放线菌为680U/mg蛋白(Teufel,M,Roggentin,P,andSchauer,R.(1989)BiolChem Hopper Seyler 370:435-443)),不存在二价金属离子时具完全活性,已被克隆,可从大肠杆菌中以重组蛋白形式纯化出来(Roggentin,P,Kleineidam,RG和Schauer,R.(1995)Biol Chem Hopper-Seyler376:569-575,Teufel,M,Roggentin,P,and Schauer,R.(1989)BiolChem HopperSeyler 370:435-443,Sakurada,K,Ohta,T和Hasegawa,M,(1992)J Bacteriol174:6896-6903)。另外,产气荚膜梭菌在溶液状态下可于2-8℃稳定存在数周,而在白蛋白存在时4℃下可稳定存在超过两年(Wang,FZ,Akula,SM,Pramod,NP,Zeng,L和Chandran,B.(2000)JVirol75:7517-27)。粘性放线菌在反复冻融条件下不稳定,但4℃下于0.1M醋酸盐缓冲液(pH=5)中可保持稳定(Teufel,M,Roggentin,P,andSchauer,R.(1989)Biol Chem Hopper Seyler 370:435-443)。
由于细菌唾液酸酶只在上呼吸道局部使用且不被全身吸收,使用这类唾液酸酶引起免疫反应的几率很低,但为了人体长期使用,更期望找到来自人的唾液酸酶。
迄今为止已从人体中克隆了四个唾液酸酶基因:NEU1/G9/溶酶体唾液酸酶(Pshezhetsky,A,Richara,C,Michaud,L,Igdoura,S,Wang,S,Elsliger,M,Qu,J,Leclerc,D,Gravel,R,Dallaire,L和Potier,M.(1997)Nature Genet15:316-320.,Milner,CM,Smith,SV,Carrillo MB,Taylor,GL,Hollinshead,M和Campbell,RD.(1997).JBio Chem 272:4549-4558)、从人脑分离的膜结合唾液酸酶NEU3(Wada,T,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,M,Akita,H和Miyagi,T.(1999)Biochem Biophy ResCommuni 261:21-27,Monti,E,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,M,Manzoni,M,Veneranobo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G和Borsani,G.(2000)Bichem J349:343-351)、在人骨骼肌以极低水平表达的42kDa唾液酸酶NEU2(Monti,E,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A和Borsani G.(1999)Glycobiol 9:1313-1321)和在所有供试人体组织中表达的含497个氨基酸的NEU4蛋白(GenebankMN080741)(Monti,E,Preti,A,Venerando,B和Borsani,G.(2002)NeurochemRes 27:646-663)。
氨基酸序列比对分析显示NEU2(SEQ ID NO:8)和NEU4(SEQ IDNO:9)都是胞浆唾液酸酶。NEU2和NEU4中,形成鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)唾液酸酶催化位点的12个氨基酸残基中有9个保守(Monti,E,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A和Borani G.1999.Glycobiol 9:1313-1321,图3)。另外,NEU4中一大约80个氨基酸残基的区段(氨基酸294-373)是所有已知哺乳动物唾液酸酶共有的(Monti,E,Preti,A,Venerando,B和Borsani,G.(2002)Neurochem Res 27:646-663)。与已选的大细菌唾液酸酶不同,NEU2和NEU4的底物特异性仍是未知的,需要测试NEU2和NEU4能否有效降解流感病毒受体。
唾液酸酶检测
NEU2、NEU4和生绿小单孢菌唾液酸酶贮存于PBS、50%甘油和-20℃。产气荚膜梭菌和粘性放线菌唾液酸酶于4℃下贮存于10mM醋酸盐缓冲液(pH5)。用HPLC和SDS-PAGE电泳检测制备的蛋白。酶的特异活性和稳定性由唾液酸酶检测得到。
唾液酸酶的活性检测利用以2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸(4Mu-NANA)(Sigma)为底物的荧光测定法。重复两次反应。在加有400毫克牛血清白蛋白和0.2mM4MU-NANA,终体积为100毫升的0.1M柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液(pH=5.6)中进行反应。37℃孵育5-10分钟后,加1ml0.2M氨基乙酸/NaOH(pH=10.2)停止反应。利用荧光计在365nm激发波长和445nm发射波长下检测荧光发射强度,利用4-甲基伞形酮(4-MU)获得标准曲线。
实施例5:体外比较唾液酸酶的功能,选择一种做进一步研究
1.流感病毒毒株
流感病毒毒株从ATCC和St.Jude儿童医院储藏库获得。或将Madin-Darby犬肾细胞系(MDCK)中的病毒株置于加有0.3%牛血清白蛋白和0.5毫克每毫升胰蛋白酶的低限基本培养基(MEM)中培养。孵育48到72小时后,低速离心对培养基进行澄清,利用超速离心和25%蔗糖垫沉淀并纯化病毒颗粒。将纯化的病毒重悬于50%甘油-0.1M Tris缓冲液(pH7.3),保存于-20℃。病毒滴度由空斑分析(Tobita,K,Sugiura,A,Enomoto,C和Furuyama,M.(1975)Med MicrobiolImmunuol 162:9-14)或TCID50(即感染50%MDCK细胞所需的病毒剂量)确定。
选择对Neu5Ac α(2,6)-Gal或Neu5Ac α(2,3)-Gal具有特异性的人和动物流感A毒株,在其中进一步选择对受体具有高亲和力(具有高血凝活性)的毒株做体外试验:
1.识别受体Neu5Ac α(2,6)-Gal的毒株包括人分离株A/aichi/2/68,A/Udorn/307/72,A/Prot Chaimers/1/73和A/Victoria/3/75等(Connor,RJ,Kawaoka,Y,Webster,RG和PaulsonJC.(1994)Virology205:17-23)。
2.对Neu5Ac α(2,3)-Gal具有特异性的毒株包括动物分离株(A/duckUkraine/1/63,A/duckMemphis/928/74,A/duckhokk/5/77,A/Eq/Miani/1/63,A/Eq/Ur/1/63,A/Eq/Tokyo/71、A/Eq/Prague/71)等(Connor,RJ,Kawaoka,Y,Webster,RG和Paulson JC.(1994)Virology205:17-23)。
2.血凝检测
该方法用来快速检测每种酶破坏受体Neu5Acα(2,6)-Gal和Neu5Acα(2,3)-Gal的效率。
具体步骤为,将6ml鸡红细胞(SPAFAS Inc.,Norwich,CT)用两倍体积PBS稀释,于500x g离心5分钟,用PBS重悬到原体积。将唾液酸酶以各种浓度加到鸡红血球细胞中,室温下孵育30分钟。洗涤细胞三次移去唾液酸酶蛋白,用PBS重悬至6ml。对照细胞与BSA孵育并洗涤。将以上所列的可识别Neu5Acα(2,6)-Gal或Neu5Acα(2,3)-Gal作为受体的各种流感病毒株于微板上用PBS(100微升)将原始贮存株连续稀释。将唾液酸酶处理的或对照鸡红细胞悬液(100微升的以上制备的0.5%溶液)于4℃加到每孔内。2h后对板进行读数。使血细胞凝结的最低病毒浓度定为一血凝单位。我们将寻找能够有效阻止所有病毒株造成的血凝的酶。
3.病毒抑制分析
用各种浓度的唾液酸酶处理融合的单层MDCK细胞1h,缓冲液洗涤两次后用各种流感病毒株感染。孵育1小时后再次洗涤以移去游离病毒。为估算细胞表面病毒结合点的减少情况,将细胞覆盖一层琼脂后于37℃孵育。将唾液酸酶处理的细胞的空斑数与对照细胞相比。另一可选方法是于37℃常规培养基培养细胞,在培养的各时间点以TCID50为指标检测病毒的滴度。
为证明唾液酸酶处理可抑制已存在的感染,将MDCK单层细胞先用低滴度病毒感染,洗去游离病毒后,加唾液酸酶后对细胞进行培养。每24h加一次新鲜唾液酸酶。72小时内检测培养基中的病毒滴度。
4.细胞毒性检测
购买原代人支气管上皮细胞(Clonetics),按照厂家说明书培养于低限补充培养基。将各种浓度的唾液酸酶加入培养基。7-10天内检测细胞生长情况,也对细胞显微病变效应进行定期观察。
实施例6:唾液酸酶蛋白的构建和检测
1.选择一GAG结合序列作为锚定域
选取一种在抗病毒活性、毒性、稳定性和易于生产等方面都具最好表现的唾液酸酶。利用分子遗传学方法,我们将之与GAG结合序列相连,将融合基因亚克隆至pQE载体,在大肠杆菌中表达并从中纯化融合蛋白。
我们选了六个可能的人GAG结合序列:PF4(氨基酸47-70)(SEQ IDNO:2),IL-8(氨基酸46-72)(SEQ ID NO:3),AT III(氨基酸118-151)(SEQ IDNO:4),ApoE(氨基酸132-165)(SEQ ID NO:5),双调蛋白(氨基酸25-45)(SEQID NO:6)和人脉管关联迁移细胞蛋白(AAMP)(氨基酸14-25)(SEQ ID NO:7)(图2)。这些序列一般与肝素之间存在纳摩尔级的亲和力,然而,这些亲和力彼此之间可能存在数量级的差异(表1)。因为不清楚哪个锚定域能使唾液酸酶获得最佳功能,所以将所有四种GAG结合序列与唾液酸酶的N末端或C末端通过一通用连接肽序列GGGGS融合为以下结构:
(GAG结合域—GGGGS(SEQ ID NO:10)—唾液酸酶);或
(唾液酸酶—GGGGS(SEQ ID NO:10))—GAG结合域)
通过一个改进的病毒抑制分析方法比较不同的融合蛋白。具体步骤为,用等量的每种融合蛋白处理融合单层MDCK细胞,限定一处理时间,如30分钟。用缓冲液洗涤细胞两次以移去游离唾液酸酶融合蛋白,培养基中继续孵育一小时后,将流感病毒毒株加入细胞,一小时后再次洗涤细胞移去游离病毒。在72小时的培养过程中,以TCID50为指标对培养基中的病毒滴度进行监测。本试验以未融合唾液酸酶蛋白与融合蛋白进行比较。如果结果太接近以致不能对所有融合蛋白进行分级,则通过缩短融合蛋白处理窗、降低蛋白浓度和提高病毒感染强度等措施提高分析的严格性。
2.优化融合蛋白构建体
通过之前的实验选出最好的融合蛋白后,通过比较不同长度连接肽的优劣进一步优化构建体。为达到此目的,做了以下构建体:
(唾液酸酶-(GGGGS(SEQ ID NO:10))n(n=0,1,2,3或4)-GAG结合域)
将蛋白表达和纯化后,用上述的改进的病毒保护分析进行比较。
另外,如果前面的数据暗示融合蛋白与硫酸乙酰肝素之间具有较高亲和力能够导致较高效价的话,我们则也计划检测提高GAG结合域的亲和力是否能进一步提高效价。如下所示,在融合蛋白构建体上产生一个多价GAG结合结构就可达到这个目的:
(唾液酸酶-(GGGGS(SEQ ID NO:10))n-HS结合域-GAG结合域)
(GAG结合域-(GGGGS(SEQ ID NO:10))n-唾液酸酶-(GGGGS(SEQID NO:10))n-GAG结合域)
将纯化的融合蛋白以上述改进的病毒保护分析结果为基础而对活性分级。
3.细胞毒性检测
为观察融合蛋白对正常细胞的生长和形态的影响,将原代人支气管上皮细胞与各种浓度的融合蛋白共培养,其后实时检测细胞生长曲线并观察任何可能的细胞显微病变效应。
实施例7:融合蛋白对其它传染性微生物的抗性
融合蛋白含一个功能域和一个锚定域,这也被设计用于其它许多方面的用途。例如,在此介绍的唾液酸酶融合蛋白也可做流感病毒之外的别的病毒和细菌的防治剂,因为许多别的传染性微生物,如副粘病毒(Wassilewa,L.(1977)ArchViro l54:299-305)、冠病毒(Vlasak,R.,Luytjes,W.,Spaan,W和Palese,P.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:4526-4529)、轮状病毒(Fukudome,K.,Yoshie,O.和Konno,T.(1989)Viroloy 172:196-205)和铜绿假单胞菌(Ramphal,R.和Pyle,M.(1983)Infect Immun 41:339-44)等,也已知是利用唾液酸作为细胞受体的。例如,抑肽酶与肝素结合域融合的蛋白除用于防治流感外,也可用于防治其它需要寄主蛋白酶激活的病毒,如副流感病毒。
实施例8:唾液酸酶催化域融合蛋白的克隆
根据已发表的关于大细菌唾液酸酶的文献,来自产尿素节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的51kDa唾液酸酶、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的71kDa唾液酸酶和粘性放线菌(Actinomyces viscosus)的113kDa唾液酸似乎具有相似的特异活性和对各种唾液酸偶联物的广泛的底物特异性(Biology ofthe Sialic Acids(1995),270-273;Corfield等,Biochem.J.,(1981)197(2),293-299;Roggentin等,Biol.Chem.Hoppe Seyler,(1995)376(9),569-575;Teufel等,Biol.Chem.Hopper Seyler,(1989)370(5),435-443)。已知的第三种可破坏流感病毒受体的唾液酸酶是来自生绿小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)的68kDa酶(Air和Laver.Virology(1995)211:278-284)。
粘性放线菌(A.viscosus)是人口腔和胃肠道正常菌群的一部分(Sutter,Rev.Infect.Dis.,(1984)6Suppl 1,S62-S66)。因为粘性放线菌的唾液酸酶一般由寄生于人粘膜表面的细菌分泌,人粘膜免疫系统应对它有耐受性。所以,如向人气道表面局部施加粘性放线菌唾液酸酶,可能将不会产生免疫原性。我们认为粘性放线菌唾液酸酶的这一特征使之成为很好的候选治疗药物。
我们确信粘性放线菌唾液酸酶的一个片断,即从第274到第667氨基酸,应包含其催化域(称之为AvCD)且本身具有完全活性。之后我们克隆了AvCD片断,证明该片断和其它至少包含第290-666氨基酸的粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12),如从第274到第681氨基酸、从第274到第666氨基酸、从第290到第666氨基酸和从第290到第681氨基酸,都具有唾液酸酶活性。
粘性放线菌唾液酸酶蛋白和基因的全序列从GenBank(A49227和L06898)获得。在和已知3D结构的唾液酸酶(M.viridifaciens和鼠伤寒沙门氏菌)的做同源性比较的基础上,我们确定其催化域(CD)序列位于第274和第667氨基酸(SEQ ID NO:16)之间。为克隆粘性放线菌唾液酸酶催化域(AvCD),对该区域粘性放线菌唾液酸酶基因密码子进行了优化改造,以在大肠杆菌中表达(SEQ ID NO:15)。密码子已优化的编码粘性放线菌唾液酸酶(SEQ ID No:15)的第274至667氨基酸的AvCD核苷酸序列,由重叠寡核苷酸化学合成产生,将其退火、PCR扩增后克隆到表达载体pTrc99a(Amersham,New Jersy,USA)中。
使用标准分子克隆方法构建唾液酸酶融合构建体。通过融合六个组氨酸(His6)和AvCD序列N末端残基构建His6-AR构建体。His6-AvCD构建体核苷酸序列为SEQ ID NO:17,翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。这些序列示于图7。
为构建AR-AvCD构建体,将锚定结合域直接融合于AvCD序列的N末端残基。称为AR的锚定域源于人双调蛋白前体的GAG结合序列(GenBank#AAH 09799)。人双调蛋白前体编码第125至145氨基酸的核苷酸序列(图2,SEQ ID NO:7)以两个重叠寡核苷酸的形式化学合成。AR-AvCD构建体核酸序列为SEQ ID NO:19,翻译的氨基酸序列为SEQ IDNO:20。
为构建另一构建体AR-G4S-AvCD,将在AR-AvCD构建体中所用的AR编码序列与一个已与AvCD序列融合的编码五个氨基酸的连接肽(GGGGS;SEQ ID NO:10)融合,这样将连接肽融合于粘性放线菌唾液酸酶催化域N末端。这个构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO:34)和翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)示于图9。将所有构建体克隆到pTrc99a表达载体。
另外构建了四个构建体,在其中将粘性放线菌唾液酸酶融合于AR序列(人双调蛋白GAG结合结构域;SEQ ID NO:7)N末端。在4号构建体(SEQ ID NO:27)中,由SEQ ID NO:12第274至第666氨基酸组成的粘性放线菌唾液酸酶催化域与双调蛋白GAG结合域(SEQ ID NO:7)融合。在5号构建体(SEQ ID NO:29)中,由SEQ ID NO:12第274至第681氨基酸组成的粘性放线菌唾液酸酶催化域与双调蛋白GAG结合域(SEQ ID NO:7)融合。在6号构建体(SEQ ID NO:31)中,由SEQ ID NO:12第290至第666氨基酸组成的粘性放线菌唾液酸酶催化域与双调蛋白GAG结合域(SEQID NO:7)融合。在7号构建体(SEQ ID NO:33)中,由SEQ ID NO:12第290至第681氨基酸组成的粘性放线菌唾液酸酶催化域与双调蛋白GAG结合域(SEQ ID NO:7)融合。所有这些构建体的唾液酸酶活性在分析中都具有可比性。
实施例9:生产唾液酸酶催化域融合蛋白
为了生产出此唾液酸酶融合蛋白,此表达构建体转化到大肠杆菌BL21中。接种一个菌落到2.5ml的LB培养基中,并在37℃下振荡培养过夜。早上将2ml的过夜培养物接种到在一个2升的振荡瓶中的500ml的TB培养基中,此培养物于37℃振荡生长至OD600=400(需2-4小时)。瓶内加入IPTG直到最终浓度为1mM以诱导蛋白质表达,并持续振荡培养3个小时。在5,000×g下离心10分钟后收集细胞。洗涤细胞一次(重新悬浮在PBS中并再度离心)并且再次悬浮在15ml的Lysis缓冲液中。
在蛋白质表达和提纯时用到的培养基和缓冲液的组成
蛋白质表达的TB培养基
溶液1
胰化蛋白胨-12g
酵母提取物-24g
加H2O至800ml
溶液2
KH2PO4(无水的)-2.3g
K2HPO4(无水的)-12.5g
加H2O至100ml
溶液1和2分别经高压灭菌,冷却、混合并加下列物质:
60ml的20%的甘油(过无菌滤膜)
20ml的20%的葡萄糖(过无菌滤膜)
Lysis缓冲液
50mM的磷酸盐,pH8.0
10%的甘油
300mM NaCl
在Lysis缓冲液中悬浮的细菌细胞用超声波降解法降解,且通过离心去除细胞碎片。澄清的溶菌液透过SP-琼脂糖凝胶柱(床体积15ml,流速120cm/小时)。用1体积的PBS调整此柱到较低的pH和盐量以保证在清除内毒素时保留流感酶。通过用5体积的含1%的Triton X-100、0.5%的脱氧胆酸钠和0.1%SDS的PBS清洗柱子清除内毒素。此清洁剂用3体积的PBS和3体积的Lysis缓冲液洗净。用含0.8M NaCl的Lysis缓冲液从柱子中洗提蛋白质。从SP-琼脂糖凝胶上洗提的部分用1.9M(NH4)2SO4校准(大部分蛋白质污染物在这一步被盐析出来)并且离心使其变澄清。上清液加到Butyl-琼脂糖凝胶柱上(流速120cm/小时)。此柱用2体积的1.3M(NH4)2SO4清洗并且用0.65M(NH4)2SO4洗提融合物。最后的一步是,用PBS缓冲液平衡以25cm/小时的流速在SephacrylS-200上进行体积排阻色谱分析。用后面的段落中描述方法对4-MU-NANA的唾液酸酶活性进行测定。蛋白质的浓度用Bio-Rad’sBradford试剂盒测定。蛋白质的纯度用SDS-PAGE法测定,估计应为>98%。此酶的特异活性为大约937U/mg。在最后的制品中内毒素用LAL测试法(Cambrex)测定,估计应<0.5EU/ml。
为了纯化含His6的融合蛋白,用在Ni-NTA上的金属螯合亲和膜色谱取代SP-琼脂糖胶进行阳离子交换。所有的缓冲液为相同的,除了从Ni-NTA上的洗提是在Lysis缓冲液中用0.25M的咪唑进行。
实施例10:检测唾液酸酶以测定唾液酸酶催化域融合蛋白的活性
检测了由构建体#2编码的AR-AvCD蛋白的唾液酸酶活性,并将其与从产气荚膜梭菌(Sigma St.Louis,Mo)和产尿素节杆菌(Prozyme,SanLeandro,CA)中提纯的天然唾液酸酶相比。此外,在一个构建体中双调蛋白GAG序列(SEQ ID NO:7)融合到Neu2人唾液酸酶(SEQ ID NO:8),我们也检测了此构建体产生的融合蛋白的唾液酸酶活性。
以单位数每毫克唾液酸酶表示的唾液酸酶活性是用人工合成的荧光底物4-MU-NANA(Sigma)检测唾液酸酶来测量的。一个单位的唾液酸酶被定义为在0.2ml体积中含20nmol的4-MU-NANA在37℃于10分钟内从4-MU-NANA中释放的10nmol的MU的酶量(50mMCH3COOH-NaOH缓冲液,pH5.5)。通过加入1ml的0.2M的氨基乙酸/NaOH pH 10.2终止反应。用365nm的激发光和445nm的发射光在荧光计上测量荧光发射量,并用4-甲基伞形酮(4-MU)获得校正曲线(Potier等,Anal.Biochem.,(1979)94(2),287-296)。
表2.唾液酸酶的活性比较(单位/毫克)
唾液酸酶         特异活性
AR-NEU2             8
AR-AvCD             937
产气荚膜梭菌        333
产尿素节杆菌        82
我们的结果显示,AvCD融合蛋白(AR-AvCD)在所有供试的唾液酸酶中具有最高活性(表2)。AR-AvCD的特异活性是人唾液酸酶融合蛋白(AR-NEU2)的100多倍,是产气荚膜梭菌唾液酸酶两倍多。比较唾液酸酶稳定性的实验结果显示AR-AvCD稳定性非常高:溶液置25℃或4℃20周后未测出活性下降。与此相比,AR-NEU2溶液如储存于25℃和37℃,半衰期分别为五周和两周。
实施例11:唾液酸酶催化域融合蛋白N末端的优化
特定条件下AR-AvCD融合蛋白N末端会被部分切割,导致纯化的AR-AvCD制备物中存在低程度的蛋白异质性。为解决此问题,我们设计了一个方法来优化唾液酸酶融合构建体的N末端。构建了含有随机N末端氨基酸的AR-AvCD库。利用一对引物PCR扩增AR-AvCD,其中与该基因5’端退火的引物在对应于第2个和第3个氨基酸的位置含随机序列。引物的核苷酸序列和编码的氨基酸序列如下所示。
ttttcgtctcccatgvnnvnnaagcgcaaaaaaaaaggcggca(SED ID NO:21)
              MetXxxXxxLysArgLysLysLysGlyGly(SED ID NO:22)
在SEQ ID NO:21中,“n”代表任意核苷酸(a,c,g或t),“v”代表核苷酸a,g或c。这样设计序列(不允许核苷酸t存在于第一位密码子)可避免引入中止密码子、芳香氨基酸(Phe,Tyr,Trp)和Cys。引入了Esp3I限制性核酸内切酶位点(用粗体示)以产生兼容NcoI的末端。与基因的3’端退火的引物在中止密码子之后带有HindIII位点。PCR产物用Esp3I-HindIII酶切后连入用NcoI-HindIII酶切后的表达载体pTrc99a。将连接混合物转化到大肠杆菌后在含氨苄青霉素的液体培养基中对转化细胞进行过夜培养。
次日用新鲜培养基稀释培养物,培养至OD600=0.8,用IPTG诱导2h。对细胞进行收获、均质化后用液相色谱两步法纯化融合蛋白。将澄清的裂解物上样到用裂解缓冲液(50mM HEPES,pH8.0,0.3M NaCl,10%甘油)平衡的SP-Sepharose柱中。用0.45M NaCl洗涤柱子,0.9M NaCl洗脱融合蛋白。用10%甘油稀释洗出液,使NaCl浓度降为0.2M后,上样至Heparin-Sepharose柱中。该柱含有线性梯度的NaCl。含唾液酸酶活性的部分在SDS-PAGE上解析,电印记法杂交到PVDF膜上,对43kDa的条带进行氨基末端测序。
分离的唾液酸酶融合蛋白N-末端残基主要为Val或Gly,其后为AR标签的N-末端残基。我们之后合成了新的唾液酸酶融合构建体,构建体#2和#3,通过在此AR序列前引入一个Val使得构建体#2和#3编码的前6个氨基酸为(Met-Val-Lys-Arg-Lys-Lys(SEQ ID NO:23))。由这些新的融合构建体产生的蛋白质的N-末端测序表明具有100%的同源性,其初始Met被完全去除(这是作为治疗用蛋白质所期望的)并且Val为此AR标签序列后的第一个N-末端残基。这些数据与早期的结果一致,其报道了N-末端加工和蛋白质N-末端的氨基酸残基的功能为稳定蛋白质是普遍的规律的(Hirel等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1989)86(21),8247-8251;Varshavsky Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1996)93(22),12142-12149)。
新的融合构建体#2(具优化的N-末端的AR-AvCD)(SEQ ID NO:24)的核苷酸序列和其氨基酸序列的翻译(SEQ ID NO:25)在图10中描述。新的融合构建体#3(具优化的N-末端的AR-G4S-AvCD)(SEQ ID NO:36)的核苷酸序列和其氨基酸序列的翻译(SEQ ID NO:37)示于图11中。用构建体#2感染的大肠杆菌中分离出的被处理蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:38,用构建体#3感染的大肠杆菌中分离出的被处理蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:39。
实施例12:对比具或者不具锚定域的唾液酸酶构建体的活性
为了估计AR序列是否可提高唾液酸酶融合蛋白的细胞表面活性,我们将经构建体#2(SEQ ID NO:24,示于图7)或者构建体#1(His6-AvCD;SEQ ID NO:17,示于图5)转化的大肠杆菌中提纯的蛋白质与原代人支气管上皮细胞温育,并在彻底清洗后测定细胞结合的唾液酸酶活性。与构建体#2蛋白(SEQ ID NO:25)温育的细胞具有多达10%的细胞结合唾液酸酶活性,此细胞结合唾液酸酶活性随着构建体#2蛋白质的处理浓度以一个依赖于剂量的方式增加。然而,构建体#1蛋白质(SEQ ID NO:18)温育的细胞仅显示唾液酸酶活性的背景水平。此外,我们用或者构建体#2或者构建体#1蛋白质处理MDCK细胞并且测定在细胞表面残余的α(2,6)-连接的唾液酸的水平(图8)。在每孔低于100mU的酶活性的同等水平下,构建体#2蛋白质比构建体#1蛋白质明显具更高的潜力。这些结果表示AR域确实提高唾液酸酶的功能。
实施例13:唾液酸酶融合蛋白的体外活性
流感病毒株
从ATCC和St.Jude儿童研究医院储藏室获得流感病毒株。所有的包括流感病毒的试验在生物安全等级II标准下进行。
在培养于加有0.3%的牛血清蛋白和0.5mg/ml的胰岛素的低限基本培养基(MEM)中的Madin-Darby犬肾细胞系(MDCK)上繁殖病毒。温育48到72小时后,培养基经低速离心澄清。病毒微粒经20%的蔗糖垫超速离心沉淀。纯化的病毒悬浮在50%的甘油-0.1M Tris缓冲液(pH7.3)并在-20℃储存。
细胞保护检验
为了测定构建体#2AR-AvCD蛋白质的保护细胞不受流感病毒感染的能力,我们首先用从构建体#2生产出的AR-AvCD或从产尿素节杆菌分离出的广谱细菌唾液酸酶处理MDCK细胞,并且用多种人流感病毒(IFV)处理细胞,所选流感病毒包括H1、H2及H3亚型的人类IFV A和人类IFV B,也包括鸟IFV毒株。如图9所示,由构建体#2产生的融合蛋白表现出保护80到100%的细胞的能力,其与产尿素节杆菌唾液酸酶的效果相似。
为了进行检验,用10mU的AR-AvCD蛋白质(用构建体#2制成)或者粘性放线菌的分离的唾液酸酶于37℃处理MDCK细胞2小时。之后将这些细胞用流感病毒于MOI 0.1处理1小时。洗涤这些细胞并将它们温育在加有0.2%ITS(GIBCO)和0.6μg/ml乙酰胰岛素(Sigma)的新鲜的DMDM:F12中。这些细胞用0.5%的结晶紫和20%的甲醇浸染5分钟并用自来水冲洗。在每个孔的活细胞用70%的乙醇提取结晶紫并在570nm下比色定量。细胞保护用100×{(唾液酸酶处理的样品-仅病毒)/(未感染的样品-仅病毒)}测定。
IFV抑制检验
我们用基于细胞的ELISA方法测定AR-AvCD蛋白质(用构建体#2制成)和AR-G4S-AvCD蛋白质(用构建体#3制成)对IFV扩增的抑制(Belshe等,J Virol.,(1988)62(5),1508-1512)。
为了进行试验,用16mU的用构建体#2制成的AR-AvCD或构建体#3制成的AR-G4S-AvCD唾液酸酶在EDB/BSA缓冲液中(10mM醋酸钠、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.5%BSA)于37℃处理96孔板上的MDCK单层细胞2个小时。用0.1MOI的病毒感染所有的用唾液酸酶处理或未处理的对照细胞(仅用EDB/BSA缓冲液处理)。1小时后,用PBS洗涤这些细胞两次,并将其温育在加有0.2%ITS(Gibco)和0.6μg/ml乙酰胰岛素(Sigma)的DMEM:F12中。感染后40-48小时,用基于细胞的ELISA检验法测定细胞结合病毒的水平。具体步骤为,细胞在PBS中用0.05%戊二醛固定,并用50μl稀释1000倍的抗流感A NP抗血清或者是抗流感B(Fitzgerald Inc.)在0.5%BSA和PBS于37℃温育1小时。洗涤以后,每一个孔用HRP-蛋白G在0.5%的BSA和PBS中温育1小时。在最后的清洗后,细胞在室温下与含0.02%的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐(Sigma)和0.01%的过氧化氢的50μl的25mM柠檬酸钠(pH4.5)反应5分钟。此反应通过加入50μl的1mM的H2SO4终止,并且通过在450nM下测定其光密度定量。病毒复制的抑制百分比以100%×{(仅含病毒样品-唾液酸酶处理样品)/(仅含病毒样品-未感染样品)}计算。
对各种人类流感A和流感B病毒的复制抑制效果数据、细胞保护的EC50值以及有关来自构建体#2的AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白、来自构建体#3的AR-G4S-AvCD唾液酸酶融合蛋白的选择指数示于图12。
如图10所示,唾液酸酶融合蛋白强烈抑制多种所选的流感病毒的繁殖。值得注意的是,虽然唾液酸酶处理最多移去细胞表面70-80%的唾液酸(图8),却达到了80-100%的病毒抑制(图10)和细胞保护(图9)效果。这一发现证明,利用本发明推出的唾液酸酶融合蛋白为实现期望的疗效并不需要彻底消除细胞表面唾液酸。残留的20-30%表面唾液酸虽然是唾液酸酶融合蛋白难于结合的,很可能也是流感病毒难于结合的。
唾液酸酶融合蛋白的细胞毒性
为估测AR-AvCD或AR-G4S-AvCD蛋白(来自构建体#2和#3)的细胞毒性,将低密度的MDCK细胞接种到96孔板上,在含10%FBS和每孔不超过20U的AR-AvCD蛋白或AR-G4S-AvCD蛋白的DMEM培养基中培养5天(每种唾液酸酶在实验全过程内都保持全部活性)。通过每天对细胞进行结晶紫染色和在570nM测光吸收确定AR-AvCD或AR-G4S-AvCD处理孔和对照孔中的细胞密度。培养过程中未观察到细胞抑制现象的存在,甚至在AR-AvCD或AR-G4S-AvCD(100U/ml)浓度最高的情况下也未发现。所以,AR-AvCD或AR-G4S-AvCD的IC50,即抑制细胞50%生长的药物浓度,应高于100U/ml。
实施例14:唾液酸酶催化域融合蛋白的体内活性
雪貂可感染未被人适应的流感病毒并产生和人类相似的病症,并可用抗病毒化合物治疗,例如扎那米伟(乐感清)。(Mendel等,AntimicrobAgents Chemother,(1998)42(3),640-646;Smith和Sweet,Rev.Infect.Dis.,(1988)10(1),56-75;Reuman等,J.Virol.Methods,(1989)24(1-2),27-34)。为了估计我们的化合物的体内效果,我们以雪貂为模式动物测试了AR-AvCD蛋白(由构建体#2构成)。具体步骤如下:研究中共使用经测试血清中不含抗红血球凝聚素抗体的24只幼年雌雪貂(0.5-0.8kg)(Marshall Farms,Norht Rose,NY)。实验前将两只动物放在一只笼子中适应3天。这些动物随机地分为三组:8只用药物稀释缓冲液和病毒处理,12只用病毒和AR-AvCD处理,而4只仅用用AR-AvCD处理。研究中应用的是含5000U/ml唾液酸酶活性和0.7mg/ml的蛋白质浓度的溶在磷酸盐缓冲液(PBS)中的AR-AvCD。在药物治疗组中的动物每一剂药用量为1ml AR-AvCD,相当于约1mg/kg的剂量水平。
麻醉雪貂,并用AR-AvCD或者PBS进行两次(上午8点和下午6点)鼻内接种(每个鼻孔0.5ml),并且每天进行共计7天(在病毒处理前2天和病毒接种后5天)。观察这些雪貂在用药后的不耐受表现。在第三天的上午10-11点接种病毒。用人类A/Bayern/7/95(H1N1)-相似病毒以105TCID50(≥104雪貂ID50)的剂量完成病毒处理。在用AR-AvCD处理后的第2天开始收集所有的动物的鼻部洗出物并持续到第7天。为了收集鼻部洗出物,鼻内加入1ml的消过毒的PBS,收集打出的喷嚏并且记录其体积。此鼻洗出物被离心。重新悬浮成团的细胞并在显微镜下用血球计计数。收集悬浮液,整分成部分并储藏在-80℃。根据制造商的说明书(Bio-Rad,Hercules,CA)用Bio-Rad蛋白质试剂测定在无细胞的鼻部洗出液中的蛋白质的浓度。为了获得鼻部洗出液的病毒滴度,接种的MDCK细胞在CO2培养箱中于36℃温育三天。检查单层的细胞病理效应(CPE)并且用具豚鼠红细胞的标准血球计测试每个孔的细胞培养悬浮液中的被分成小份的病毒。用Spearman Karber方法(1996)测定病毒滴度量。
在鼻内施加AR-AvCD的未受感染的动物中(n=4),未观察到鼻部洗出液的发炎细胞数目和蛋白质浓度明显变化(图15A和B)。收集7天这些动物的鼻部洗出液并且其全部无病毒散发。在此研究中的用该药物剂量的这些动物中,没有发现药物相关毒性的表现。在空白处理的组中,病毒在所有的8只雪貂的鼻上皮细胞上繁殖。在感染后的第一或者第二天病毒达到4.4到5.9log10TCID50(指滴定峰值为4.9),随着时间减少并在第五天前变为阴性的(图13)。与此形成对比的是,在感染后第一天(图13)12只AR-AvCD处理的雪貂中只有3只病毒排放为阳性,并且它们的鼻病毒滴度比那些对照处理的动物的低约100倍(平均值2.4±0.3对比4.4±0.4log10TCID50)(图13)。在第一天后,对AR-AyCD处理的反应充分地变化。三只动物完全受保护不受感染,无疾病症状和发炎反应(图13,雪貂标签#803、805、806)。此保护效应也因在攻击感染后第14天无血清转化而被确认。一只雪貂(标签号780)在感染后的前三天不排毒,但它在感染后的第四天因一不相关的伤害死了。剩余的8只雪貂排毒随着感染的过程而变化,从雪貂#812排毒仅一天到#791排毒五天。
排毒至少一天的雪貂的感染被确认,因在感染后的抗HA抗体滴定量(血清转化)有16倍的升高。AR-AvCD处理对攻毒后的血清中的抗HA滴度没有明显影响(320-1280对160-1280,分别为对照和药物处理组)。
虽然用AR-AvCD处理(n=8)的雪貂有排毒现象,但其发炎发应减少,并且与未处理雪貂表现为总是嗜睡和发烧相比,它们表现为更为机警和活跃。对受感染的、用AR-AvCD处理了的8只雪貂组而言,计算出的鼻内蛋白质浓度平均的AUC(曲线下方的面积)值与那些用媒介物处理相比减少了大约40%(2.68对比4.48,任意单位)(图11B)。在空白对照处理的感染动物中,攻毒感染后第二天鼻部洗出液中的发炎细胞的数量比那些未感染的动物的药高约100倍。在另外的4天一直维持在此水平。AR-AvCD处理的动物的鼻部洗出液中的发炎细胞的数量表现出明显的下降。特别地,与对照处理的受感染的动物相比,在AR-AvCD处理的动物中细胞计数的AUC值减少了大约3倍(1965对比674,任意单位,图11A)。观察到的发炎反应的减少意味着在感染的早期阻止病毒很重要。
实施例15.唾液酸酶融合蛋白抑制细菌细胞的吸附
细菌
肺炎链球菌:不同血清型的10个包装好的菌株选自保存在ATCC的临床分离株。细菌保存在冷库并且转移到含3%绵羊血的胰蛋白酶的大豆琼脂板上(Difco&Micropure Medical Inc.)在5%CO2中于37℃中温育18小时。为用放射性同位素标记肺炎双球菌,从1到2天的培养板上取一个菌株,加到赖氨酸缺乏的每毫升含70μCi[3H]的胰蛋白酶大豆肉汤中,并于37℃温育在5%的CO2中。控制每一培养物于595nm的吸收光下生长。在对数阶段,收集细菌,离心洗涤两次(3分钟13,000rpm),并且重新悬浮于加有0.1%BSA的L-15培养基(无酚红)中(Cundell和Tuomanen,Microb.Pathog.,(1994)17(6),361-374)(Barthelson等,Infect.Immun.,(1998)66(4),1439-1444)。
流感嗜血杆菌:从储存在ATCC的临床分离株中获得了5个b型(Hib)菌株和10个不标准的菌株(NTHi)。所有的菌株都在包含血晶素(ICN)和NAD(Sigma)的脑心汤(BHI,Difco)中库存,并保持在冰冻状态直到其运用。接着它们在具血晶素和NAD的BHI琼脂中培养,并于37℃在5%的CO2中温育14小时。(Kavakami等,Microbiol.Immunol.,(1998)42(10),697-702)。为用[3H]标记细菌,流感嗜血菌细胞在含血晶素、NAD和每毫升250μCi[3H]的亮氨酸的BHI肉汤中温育,并且一直生长直到晚对数期,然后收获、洗涤并重新悬浮在L-15-BSA中(Barthelson等,Infect.Immun.,(1998)66(4),1439-1444)。
细胞吸附分析
在洗涤后,所有的[3H]标记细菌悬浮在L-15-BSA中,通过用Petroff-Hausser计数板肉眼计数测定细菌的浓度,用闪烁计数法测定放射活性,并且计算[3H]标记的细胞的特殊活性。用带有7cpm/1000细胞或者更多的细菌制品。细菌稀释到5×108个细胞/每毫升。BEAS-2B细胞单层在含5×107个细菌的[3H]-标记的细菌悬浮液中于37℃中在5%的CO2中温育。30分钟后,用L-15-BSA冲洗5遍洗去未结合的细菌。吸附到WD-HAE组织样品的细菌用闪烁计数法计数。
唾液酸酶融合蛋白对BEAS-2B细胞的脱唾液酸化作用(desialylation)和肺炎链球菌及流感嗜血杆菌对细胞吸附的影响。
BEAS-2B细胞在1-50mU的AR-AvCD中温育2小时。用上面所述的肺炎链球菌及流感嗜血杆菌毒株完成细胞吸附检验分析。用mock处理的细胞作为阳性对照。AR-AvCD的功效用EC50的量来表示,即达到50%抑制细菌粘附效果的酶量。
实施例16用唾液酸酶融合蛋白提高AAV载体的转导效率
体外试验
以与出版的方法步骤相似的方法进行了证实AR-AvCD的效果的实验(Bals等,J Viroo.,(1999)73(7),6085-6088)。完全分化的气管上皮(WDAE)细胞单层在迁移孔上继续生长(Karp等,Methods Mol.Biol.,(2002)188,115-137;Wang等,J Virol.,(1998)72(12),9818-9826)。为了去除细胞表面的唾液酸,培养基换成无血清的溶有0.5-10单位的AR-AvCD的培养基。处理细胞30分钟到6小时。清洗此细胞单层,用AAV转导,并用标准的程序估计转导效率。许多迁移孔仅用培养基(无AR-AcVD)处理以用作对照(基础转导效率)。其他的对照可能包括仅用AR-AvCD处理的转移孔以估计脱唾液酸酶化作用的细胞毒素效果。使用报告子病毒以便容易检测转导细胞。报告子AAV及对其使用的例子包括AAV-CMV-eGFP、AAV2LacZ(Bals等,J Virol.,(1999)73(7),6085-6088;Wang等,Hum.Gene Ther.,(2004)15(4),405-413)和碱性磷酸酯酶(Halbert等,Nat.Biotechnol.,(2002)20(7),697-701),在许多文献中已有描述。用光学显微镜观察固定的并用合适的底物处理的细胞(如果用了含病毒的lacZ或AP)或者荧光显微镜观察活细胞(如果用了GFP)估计其效果。根据在NexBio用NHBE原代上皮细胞(Cambrex,Walkersville,MD)做的试验,当每一转移孔内用10个单位的AR-AvCD时,不到1小时就达到去除最大数量的唾液酸的效果。在用很少的AR-AvCD时(1小时0.1U),其他的用到的细胞系(例如MDCK)就被去唾液酸酶化。因此我们估计用10U的AR-AvCD的处理WDAE两个小时足以去除能够去除的唾液酸并且用AAV可以显著地提高WDAE细胞的转导效率。在模式动物中测试AR-AvCD处理对AAV转导的效果
为了验证AR-AvCD处理在模式动物上的效果,进行了与前面描述的实验相似的一个实验(Flotte等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1993)90(22),10613-10617;Halbert等,Nat.Biotechnol.,(2002)20(7),697-701)。在用AAV之前的几个小时(1-6),根据以前出版的方法,通过鼻内吸入雾状的或者冻干的AR-AvCD粉末将AR-AvCD传递到小鼠肺部(Flotte等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1993)90(22),10613-10617)。通过鼻内吸入将携带报告基因的AAV(碱性磷酸酯酶)传递,4周后将小鼠无痛处死并且如以前所描述的那样在固定的肺中检测受转导的细胞(Halbert等,JVirol.,(1998)72(12),9795-9805)。
实施例17唾液酸酶处理抑制气管肥大细胞的功能和平滑肌收缩
用前面所述的实验方法(Cocchiara等,J Neuroimmunol.,(1997)75(1-2),9-18),能证实用本发明的化合物处理防止肥大细胞的磷物质(SP)导致的组胺释放。用另一组试验(Stenton等,J Pharmacol.Exp.Ther.,(2002)302(2),466-474),用本发明的化合物可以抑制由两个PAR-激活肽促进的肥大细胞的β-氨基己糖苷酶的释放(PAR代表蛋白酶激活的受体)。
本发明的化合物可在豚鼠气管内用药并且此气管的反应可在前面所述的动物中估计出来(Jarreau等,Am.Rev.Respir.Dis.,(1992)145(4Pt1),906-910;Stenton等,J Pharmacol.Exp.Ther.,(2002)302(2),466-474)。根据对多种诱导物的反应判断,唾液酸酶处理不会导致非特异的气道过敏反应。此外,唾液酸酶处理不会导致磷物质(SP)诱导的支气管收缩。类似地,本发明的化合物可用于处理分离的豚鼠和老鼠的气管及肺(Kai等,Eur.J.Pharmacol.,(1992)220(2-3),181-185;Stenton等,J Pharmacol.Exp.Ther.,(2002)302(2),466-474)。同样重组的唾液酸酶处理也对由乙酰胆碱、组胺和5-羟色胺导致的平滑肌收缩没有影响。此外,它还抑制由抗原(卵白蛋白)或者48/80复合物导致的气管收缩。
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所有的出版物,包括在本发明中引用的包括专利文件、具核苷酸和氨基酸序列及相关信息的Genbank序列数据库记录和科学论文,参考书目,附录,都通过引用的方式完整地合并在本文中,就像每一个单独的出版物都在单独的包含在参考文献中的程度。
所有的标题都是为了便于读者,且不应用于限制标题下面的内容,除非是非常特殊化的。
序列表
<110>房芳
     迈克尔.马拉科夫
<120>一类新颖的以蛋白质为基础的治疗用分子
<130>NB-00101.P.1.1-US
<150>US 60/428,535
<151>2002-11-22
<150>US 10/718,986
<151>2003-11-21
<150>US 60/580,084
<151>2004-06-16
<150>US 60/561,749
<151>2004-04-13
<150>US 60/464,217
<151>2003-04-19
<160>39
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>58
<212>PRT
<213>普通牛
<400>1
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<213>人类
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<213>人类
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<213>粘性放线菌
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<213>粘性放线菌
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<213>粘性放线菌
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Figure A200580037226D01222
Figure A200580037226D01231
Figure A200580037226D01241
Figure A200580037226D01251
<210>20
<211>1248
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>20
Figure A200580037226D01252
Figure A200580037226D01261
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<211>415
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>21
Figure A200580037226D01262
Figure A200580037226D01271
Figure A200580037226D01281
Figure A200580037226D01291
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<220>
<223>人工构建体
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<220>
<223>人工构建体
<400>24
Figure A200580037226D01331
Figure A200580037226D01341
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<220>
<223>人工构建体
<400>25
Figure A200580037226D01342
Figure A200580037226D01351
Figure A200580037226D01361
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<223>人工构建体
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Figure A200580037226D01371
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<220>
<223>人工构建体
<400>27
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<212>DNA
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<220>
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<220>
<223>人工构建体
<400>29
Figure A200580037226D01412
Figure A200580037226D01431
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<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>30
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Figure A200580037226D01451
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<212>PRT
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<220>
<223>人工构建体
<400>31
Figure A200580037226D01452
Figure A200580037226D01461
Figure A200580037226D01471
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<222>(17)..(18)
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<222>(20)..(21)
<223>n代表a、c、g或t
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<222>(2)..(3)
<223>Xaa可为任何自然氨基酸
<400>33
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<212>PRT
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<223>人工构建体
<400>35
Figure A200580037226D01501
Figure A200580037226D01511
Figure A200580037226D01521
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<223>人工构建体
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Figure A200580037226D01522
Figure A200580037226D01531
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Figure A200580037226D01551
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<211>416
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<223>人工构建体
<400>38
Figure A200580037226D01562
Figure A200580037226D01571
Figure A200580037226D01581
<210>39
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<223>人工构建体
<400>39
Figure A200580037226D01591
Figure A200580037226D01611

Claims (129)

1.一种唾液酸酶催化域蛋白,其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列,其从所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第270到290氨基酸的任一氨基酸开始到所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第665到901氨基酸的任一氨基酸结束;其中,所述唾液酸酶催化域蛋白缺少从第1个到第269氨基酸的序列组成的粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列,并且其中所述唾液酸酶催化域蛋白具唾液酸酶活性。
2.一种核酸分子,其包括编码权利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸分子,其在表达载体内。
4.如权利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白,其包括SEQ ID NO:14。
5.一种核酸分子,其包括编码权利要求4所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的核酸分子,其在表达载体中。
7.如权利要求1所述的唾液酸酶催化域蛋白,其中所述唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列,其从所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQID NO:12)第270到290氨基酸的任一氨基酸开始到所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)第665到681氨基酸的任一氨基酸残基结束。
8.一种核酸分子,其包括编码权利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的核酸分子,其在表达载体中。
10.如权利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白,其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括SEQ ID NO:16。
11.一种核酸分子,其包括编码权利要求10所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的核酸分子,其在表达载体中。
13.如权利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白,其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列,其从所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第274氨基酸开始到所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第681氨基酸残基结束。
14.一种核酸分子,其包括编码权利要求13所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
15.如权利要求14所述的核酸分子,其在表达载体中。
16.如权利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白,其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列,其从所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第290氨基酸开始到所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第666氨基酸残基结束。
17.一种核酸分子,其包括编码权利要求16所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的核酸分子,其在表达载体中。
19.如权利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白,其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列,其从所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第290氨基酸开始到所述粘性放线菌唾液酸酶蛋白序列(SEQ ID NO:12)的第681氨基酸残基结束。
20.一种核酸分子,其包括编码权利要求19所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。
21.如权利要求20所述的核酸分子,其在表达载体中。
22.一种融合蛋白,其包括:
至少一个唾液酸酶的催化域;和
纯化域、蛋白质标签、蛋白质稳定域、溶解度域、蛋白质大小增加域、蛋白质折叠域、蛋白质定位域、锚定域、N-末端结构域、C-末端结构域、催化活性域、结合域或催化活性增强域。
23.如权利要求22所述的融合蛋白,其还包括至少一个肽连接子。
24.如权利要求22所述的融合蛋白,其中所述的催化域是与产气荚膜梭菌唾液酸酶的催化域基本同源的,与粘性放线菌唾液酸酶基本同源的、与产尿素节杆菌唾液酸酶基本同源的、与生绿小单孢菌唾液酸酶基本同源的、与人Neu2唾液酸酶基本同源的或者与人Neu4唾液酸酶基本同源的。
25.如权利要求24所述的融合蛋白,其中所述的催化域是与粘性放线菌唾液酸酶的催化域基本同源的。
26.如权利要求25所述的融合蛋白,其中所述的催化域包括SEQ IDNO:16。
27.如权利要求26所述的融合蛋白,其包括至少一个蛋白质纯化域。
28.如权利要求27所述的融合蛋白,其中所述的至少一个蛋白质纯化域为组氨酸标签、钙调蛋白结合域、麦芽糖结合蛋白质结构域、链霉亲和素结构域、链霉亲和素结合域、内含肽结构域或者几丁质结合域。
29.如权利要求28所述的融合蛋白,其中所述的蛋白质纯化域为组氨酸标签。
30.如权利要求29所述的融合蛋白,其中所述的融合蛋白包括SEQ IDNO:18。
31.一种核酸分子,其编码权利要求30所述的融合蛋白。
32.如权利要求31所述的核酸分子,其在表达载体中。
33.如权利要求31所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:17。
34.如权利要求33所述的核酸分子,其在表达载体中。
35.如权利要求25所述的融合蛋白,其包括至少一个锚定域。
36.如权利要求35所述的融合蛋白,其中所述的锚定域为GAG结合域。
37.如权利要求36所述的融合蛋白,其中所述的锚定域是与人血小板因子4(SEQ ID NO:2)的GAG结合域基本同源的,与人白细胞介素8(SEQID NO:3)的GAG结合域基本同源的,与人抗凝血酶III(SEQ ID NO:4)的GAG结合域基本同源的,与人载脂蛋白E(SEQ ID NO:5)的GAG结合域基本同源的,与人脉管关联迁移蛋白(SEQ ID NO:6)的GAG结合域基本同源的,或与人双调蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG结合域基本同源的。
38.如权利要求37所述的融合蛋白,其中所述的锚定域是与人双调蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG结合域基本同源的。
39.如权利要求38所述的融合蛋白,其中所述的锚定域包括人双调蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG结合域。
40.如权利要求39所述的融合蛋白,其中所述的唾液酸酶的催化域包括SEQ ID NO:16。
41.如权利要求40所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:20。
42.一种核酸分子,其编码权利要求41所述的融合蛋白。
43.如权利要求42所述的核酸分子,其在表达载体中。
44.如权利要求42所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:19。
45.如权利要求44所述的核酸分子,其在表达载体中。
46.如权利要求40所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:25。
47.一种核酸分子,其编码权利要求46所述的融合蛋白。
48.如权利要求47所述核酸分子,其在表达载体中。
49.如权利要求47所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:24。
50.如权利要求49所述的核酸分子,其在表达载体中。
51.如权利要求40所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:38。
52.如权利要求40所述的融合蛋白,其还包括连接所述人双调蛋白GAG结合域到所述唾液酸酶的催化域的肽连接子。
53.如权利要求52所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:35。
54.一种核酸分子,其编码权利要求53所述的融合蛋白。
55.如权利要求54所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:34。
56.一种表达载体,其包括权利要求55所述的核酸分子。
57.如权利要求52所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:37。
58.一种核酸分子,其编码权利要求57所述的融合蛋白。
59.如权利要求58所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:36。
60.一种表达载体,其包括权利要求59所述的核酸分子。
61.如权利要求52所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:39。
62.如权利要求39所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:27。
63.一种核酸分子,其编码权利要求62所述的融合蛋白。
64.一种表达载体,其包括权利要求63所述的核酸分子。
65.如权利要求63所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:26。
66.一种表达载体,其包括权利要求65所述的核酸分子。
67.如权利要求39所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:29。
68.一种核酸分子,其编码权利要求67所述的融合蛋白。
69.一种表达载体,其包括权利要求68所述的核酸分子。
70.如权利要求68所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:28。
71.一种表达载体,其包括权利要求70所述的核酸分子。
72.如权利要求39所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:31。
73.一种核酸分子,其编码权利要求72所述的融合蛋白。
74.一种表达载体,其包括权利要求73所述的核酸分子。
75.如权利要求73所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:30。
77.一种表达载体,其包括权利要求75所述的核酸分子。
78.如权利要求39所述的融合蛋白,其包括SEQ ID NO:33。
79.一种核酸分子,其编码权利要求78所述的融合蛋白。
80.一种表达载体,其包括权利要求79所述的核酸分子。
81.如权利要求79所述的核酸分子,其包括SEQ ID NO:32。
82.一种表达载体,其包括权利要求81所述的核酸分子。
83.一种药物制剂,其包括唾液酸酶。
84.如权利要求83所述的药物制剂,其中所述的唾液酸酶是与产气荚膜梭菌唾液酸酶至少一部分基本同源的,与粘性放线菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的,与产尿素节杆菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的,与生绿小单孢菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的,与人Neu2唾液酸酶的至少一部分基本同源的,与人Neu4唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
85.如权利要求84所述的药物制剂,其中所述唾液酸酶是与粘性放线菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的。
86.如权利要求85所述的药物制剂,其中所述的唾液酸酶包括SEQ IDNO:12.
87.一种药物制剂,其包括权利要求1所述的组分。
88.一种药物制剂,其包括权利要求7所述的组分。
89.一种药物制剂,其包括权利要求22所述的组分。
90.一种药物制剂,其包括权利要求26所述的组分。
91.一种药物制剂,其包括权利要求46所述的组分。
92.一种药物制剂,其包括权利要求62所述的组分。
93.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成喷雾剂。
94.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成吸入剂。
95.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成注射用溶液。
96.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成滴眼液。
97.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成霜、药膏、凝胶或软膏。
98.如权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的药物制剂,其配制成可口服给药的药丸、药片、锭剂、悬浮液或溶液。
99.一种治疗或者预防由流感、副流感病毒或者呼吸道合胞病毒引起的病毒感染的方法,其包括:
将权利要求83、85、87、88、89、90、91或92中任一项所述的组合物的治疗有效量应用于受治疗者的上皮细胞。
100.如权利要求99所述的方法,其中所述的应用是通过用鼻喷雾剂。
如权利要求99所述的方法,其中所述的应用是通过用吸入剂。
如权利要求99所述的方法,其中所述的应用是以一天一到四次。
一种治疗或者预防细菌病原体感染的方法,其包括:将权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的组合物的治疗有效量给药于受治疗者。
如权利要求103所述的方法,其中所述的病原体为肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌或幽门螺杆菌。
如权利要求103所述的方法,其中所述的给药是通过用鼻喷雾剂。
如权利要求103所述的方法,其中所述的给药是通过用吸入剂。
如权利要求103所述的方法,其中所述的给药是通过用局部给药。
如权利要求103所述的方法,其中所述的给药是通过用口服给药。
如权利要求103所述的方法,其中所述的给药是以一天一到四次。
110.一种治疗和预防过敏或发炎的方法,其包括:用权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的组合物的治疗有效量向受治疗者给药。
111.如权利要求110所述的方法,其中所述的发炎与哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、牛皮藓、接触植物或动物毒素或者自体免疫疾患有关。
112.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是通过用鼻喷雾剂。
113.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是通过用吸入剂。
114.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是通过用滴眼液。
115.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是通过用局部使用。
116.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是局部使用或者静脉内注射。
117.如权利要求110所述的方法,其中所述的给药是以一天一到四次。
118.一种由重组病毒载体增强基因递送的方法,其包括:在给药所述的重组病毒载体之前或者同时将权利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述组合物的治疗有效量给药到受治疗者的上皮细胞。
119.如权利要求118所述的方法,其中所述的重组病毒载体为逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体或者腺相关病毒载体。
120.如权利要求119所述的方法,其中所述的重组病毒载体为重组的腺相关病毒载体。
121.如权利要求120所述的方法,其中所述重组腺相关病毒载体包括编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的基因。
122.如权利要求119所述的方法,其中所述的给药是通过用吸入剂。
123.如权利要求119所述的方法,其中所述的给药是以一天一到四次。
124.一种药物制剂,其包括权利要求62所述的组合物。
125.如权利要求124所述的药物制剂,其配制成喷雾剂。
126.如权利要求124所述的药物制剂,其配制成吸入剂。
127.一种治疗或者预防流感感染的方法,其包括:将权利要求124所述的组合物的治疗有效量应用到受治疗者的上皮细胞。
128.如权利要求127所述的方法,其中所述的应用是通过用鼻喷雾剂。
129.如权利要求127所述的方法,其中所述的应用是通过用吸入剂。
130.如权利要求127所述的方法,其中所述的应用是以一天一到四次。
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