KR20110088102A - 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법 - Google Patents

키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110088102A
KR20110088102A KR1020100007846A KR20100007846A KR20110088102A KR 20110088102 A KR20110088102 A KR 20110088102A KR 1020100007846 A KR1020100007846 A KR 1020100007846A KR 20100007846 A KR20100007846 A KR 20100007846A KR 20110088102 A KR20110088102 A KR 20110088102A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chitin
strain
pseudomonas fluorescens
medium
glcnac
Prior art date
Application number
KR1020100007846A
Other languages
English (en)
Inventor
박용일
박제권
김우중
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020100007846A priority Critical patent/KR20110088102A/ko
Publication of KR20110088102A publication Critical patent/KR20110088102A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/39—Pseudomonas fluorescens

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 키틴 분해 능력을 갖는 슈도모나스 플루오레센스 균주 JK-0412 및 이 균주로부터 키틴을 분해하여 키틴을 이루는 단량체로서 다양한 용도로 활용될 수 있는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 또는 이의 올리고당과 같은 물질을 합성할 수 있는 특정 효소를 생산하는 방법을 제안한다. 본 발명의 신규 균주를 이용하여 생물학적인 방법을 통하여 키틴으로부터 암, 당뇨, 면역 활성 등에 주요한 역할을 하는 N-아세틸글루코사민 및 키틴 올리고당을 다양한 기질로부터 생산할 수 있는 효소를 경제적으로 합성할 수 있다.

Description

키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법{Novel Chitinolytic Microorganism Pseudomonas fluorescens JK-0412 and Preparation of N-acetylglucosaminidase Using thereof}
본 발명은 신규 슈도모나스속 미생물 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키틴 분해 능력을 갖는 슈도모나스 플루오레센스 균주 및 이러한 신규의 균주를 응용하는 방법에 관한 것이다.
포도당의 유도체인 N-아세틸글루코사민을 기본 단위로 하여 베타 1-4 글리코시드 결합(β 1,4-glycosidic bond)을 통하여 연결되어 있는 고분자로서의 키틴(chitin)은 지구의 자연 상태에서 가장 풍부하게 존재하는 물질 중의 하나이다. 예를 들어 키틴은 진균류(fungi)의 세포벽, 갑각류 및 곤충과 같은 절지동물의 외골격 및 연체동물의 치설(radula)을 이루는 주요 성분이다.
한편, 키틴을 탈아세틸화하여 만들어지는 키토산이 천연 항균제로서 키토산으로 처리한 필름이 항균, 방취 및 보습효과 등 복합적인 기능을 나타낸다는 것이 알려짐에 따라 키틴 역시 천연 물질로서 다양한 용도로 활용될 수 있다는 점에서 주목을 받고 있다. 최근의 연구 결과에 따르면, 키틴은 식물에서 질병의 방어 메커니즘에서 중요한 역할을 하며 식물의 산출을 증가시키기 위한 비료 성분으로서 농업 분야에서 활용되기도 할 뿐만 아니라 특히 물의 정화라든가 식품이나 의약품 등에서 안정화제로 첨가되거나 염료, 직물 등에서 바인더로서도 기능하며 멤브레인이나 이온 교환 수지의 레진 등과 같은 산업적으로 활용되고 있으며, 수술용 실의 원료로도 사용되는 등 의학적으로도 그 활용 가치가 날로 증가하고 있다.
한편, 키틴의 기본 단위인 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine(NAG), 다른 이름으로 β-1,4-linked 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose, GlcNAc)은 20 여 년 전부터 키틴 및 키토산이 주목을 끌기 시작한 이래로 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. N-아세틸글루코사민은 N-아세틸뮤라믹산(N-acetylmuramic acid, MurNAc)과 함께 미생물의 세포벽을 이루는 생체고분자의 일부분으로서, MurNAc의 젖산 부위에서 올리고펩타이드(oligopeptide)와 cross-link되어 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 형성하고 있다.
특히, GlcNAc는 신경전달과정(neurotransmission)에서 주목을 받고 있는데, 현재까지 N-아세틸글루코사민의 주요한 기능으로는 인간의 면역력 증진을 포함한 다양한 생리활성 등이 밝혀지고 있으며, 생물학적으로는 키틴분해효소를 이용하는 방법으로 이용하여 저분자당의 키틴 올리고당 또는 GlaNAc의 효율적인 생산을 추구하고 있다.
하지만, 실제로 키틴을 제조하는 공정은 간단하지 않으며, 특히 효율적인 효소 반응을 위해 키틴을 강-염산에 녹여 물로 수-세척, 탈수, 중화, 정제 등의 과정을 거쳐 얻을 수 있는 콜로이드 상태의 콜로이달 키틴 제조가 필요하다. 또한 콜로이달 키틴을 이용한 효소학적 분해는 반응 메커니즘에 있어서 여러 가지 제한이 따르기 때문에 특정 크기의 분자량을 갖는 키틴 올리고당 또는 단량체인 GlcNAc의 획득에는 많은 어려움이 존재한다.
특히, 저분자당 키틴 올리고머 또는 단량체의 GlcNAc의 제조를 위하여 분리, 정제된 고가의 효소 사용에 제한적이다. 또한 키틴 분해효소를 이용하는 경우 여러 크기의 올리고당의 생산을 피할 수 없어 특정 크기의 올리고당 생산을 위해 후처리 공정으로 정제과정이 필요하며, 산업적 생산을 위해서는 다소 이용에 문제점들이 지적되고 있다.
한편, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)는 그람-음성의 간상 세균으로서, 16s rDNA 분석에 의하여 슈도모나스속에 속하는 것으로 분류된다. 슈도모나스 플루오레센스는 토양이나 물속에서 서식하며 통상적으로는 호기성 세균이지만 일부 strain의 경우, 산소 대신 질소를 이용하기도 한다. 미국이나 유럽의 경우에, 슈도모나스 플루오레센스를 배양하여 메타실린-저항성 포도상구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)의 감염을 치료하는데 사용되는 항생제인 무피로신(Mupirocin)을 제조하는데 사용되거나, 우유에서 요구르트를 제조하는데 사용되고 있다.
이와 관련해서, 유일한 탄소원으로서 말론산염(malonate)을 배지에 첨가한 상태에서 슈도모나스 플루오레센스를 배양하면 말론산염이 아세테이트를 거쳐 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 변환되어 결국 슈도모나스 플루오레센스가 아세틸-CoA 합성효소(Acetyl-CoA synthetase)를 유도한다는 사실이 알려져 있다(Yu Sam Kim et al., Properties of Acetyl-CoA Synthetase from Pseudomonas fluorescens, J. Biochem. Mol. Biol., 29 (1996), pp. 277-285, 비특허문헌 1).
아울러, 특정 스트레인(strain)의 슈도모나스 플루오레센스의 경우에 특히 열대 지방에서 널리 서식하는 식물에 흰단비병을 야기하는 진균류의 균사체의 성장을 효율적으로 억제할 수 있어서, 이러한 특정 스트레인의 슈도모나스 플루오레센스를 활용하여 기존의 화학 농약을 살포하는 것으로는 제어할 수 없었던 흰단비병을 야기하는 진균류에 대한 생물방제(biocontrol)로서의 활용 가능성이 보고되고 있다(Anand Singh et al., Biocontrol of Collar Rot Disease of Betelvine (Piper betle L.) Caused by Sclerotium rolfsii by Using Rhizosphere-Competent Pseudomonas fluorescens NBRI-N6 and P. fluorescens NBRI-N, Current Microbiology, 47 (2003), pp. 153-168, 비특허문헌 2)
또한, 새우나 게와 같은 갑각류의 외골격에서 얻어진 키틴을 탄소원으로 사용하여 슈도모나스 플루오레센스를 배양하여 항진균제 활성을 갖는 물질을 제조할 수 있으며, 특히 키틴 제조 과정에서 갑각류의 외골격으로부터 생성된 산성 용액 또는 알칼리 용액 성분은 항진균제 물질 생성을 위한 공급 원료(feedstock)로 활용될 수 있으며, 이러한 항진균제 물질은 기본적으로 슈도모나스 플루오레센스에서 발현되는 항진균 단백질로부터 기원한다는 연구 결과도 있다(San-Lang Wang et al., Production of antifungal materials by bioconversion of shellfish chitin wastes fermented by Pseudomonas fluorescens K-188, Enzyme and Microbial Technology, 36 (2005), pp. 49-56, 비특허문헌 3).
이와 같은 연구 결과와 함께 특정한 슈도모나스 플루오레센스 균주의 기능에 대한 특허도 확인할 수 있다. 일례로 대한민국등록특허 제10-0347721호(특허문헌 1)에서는 식물병원성 진균으로서 특히 고추역병의 주요 원인균인 파이토프토라 캡씨씨의 RNA 합성 및 단백질 합성을 저해하는 방법으로 이들 식물 병원균에 대하여 강력한 길항력을 가지는 슈도모나스 플루오레센스 2112 균주가 항진균성 항생물질과 사이드로포어(siderophore)를 생산한다는 점을 밝혀내고 이러한 길항균주를 고추에 처리하여 고추역병의 생육을 억제하는 방법으로 생물학적 방제에 활용될 수 있다고 기술하고 있다.
또한, 대한민국등록특허 제10-0530885호(특허문헌 2)에서는 토양에서 분리, 배양한 슈도모나스 플루오레센스 B16 균주 및 이 균주에 전이인자 Omegon Km을 이용한 Tn 돌연변이 유발을 통해 유도되는 돌연변이 균주인 K2-31를 파종 전에 침지 처리함으로써, 작물의 생장을 촉진하고 특히 세균성 시들음병 방제 방법을 제안하고 있다.
아울러, 대한민국등록특허 제10-0828566호(특허문헌 3)에서는 새로운 슈도모나스 플루오레센스 K4 균주가 특히 고농도 질소산화물 또는 암모니아 성분을 동시에 분해할 수 있어서 탈질 성능이 우수하다는 점을 설명하고 예를 들어 산업폐수를 생물학적으로 탈질 처리하는데 활용할 수 있다고 기술하고 있다.
이처럼, 슈도모나스 플루오레센스는 특히 식물병원성 진균류에 대하여 생물학적 방제 또는 이러한 진균류의 활성을 억제함으로서 결국 특정 식물에 대한 생장을 촉진하는 방법을 중심으로 연구가 진행되었다. 따라서 슈도모나스 플루오레센스가 가지는 새로운 기능을 규명하여 이들을 산업적으로 활용할 필요성이 있다.
1.대한민국등록특허제10-0347721호 2.대한민국등록특허제10-0530885호 3.대한민국등록특허제10-0828566호
1. Yu Sam Kim et al., Properties of Acetyl-CoA Synthetase from Pseudomonas fluorescens, J. Biochem. Mol. Biol., 29 (1996), pp. 277-285. 2. Anand Singh et al., Biocontrol of Collar Rot Disease of Betelvine (Piper betle L.) Caused by Sclerotium rolfsii by Using Rhizosphere-Competent Pseudomanas flurescens NBRI-N6 and P. fluoresecnes NBRI-N, Current Microbiology, 47 (2003), pp. 153-168. 3. San-Lang Wang et al., Production of antifungal materials by bioconversion of shellfish chitin wastes fermented by Pseudomonas fluorescens K-188, Enzyme and Microbial Technology, 36 (2005), pp. 49-56.
본 발명은 상술한 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 신규의 키틴 분해 미생물을 분리, 동정하고 이를 이용한 당생물학 분야 및 암, 당뇨, 면역 활성 등 다양한 생리활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 키틴 올리고당, 특히 1당의 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine, GlcNAc, NAG)을 효율적으로 생산할 수 있는 키틴 가수분해효소인 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)의 생명공학적 생산 방법 및 이용에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제조 과정에서 고가의 효소를 효율적으로 생산할 수 있게 됨으로서 제조 공정의 경제성이 크게 개선된 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)의 생명공학적 생산 방법에 관한 것이다.
결국, 본 발명의 기본적인 목적은 합성화합물이 아닌 천연물로부터 다양한 생리활성을 갖는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 효율적으로 생산할 수 있는 가수분해효소 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)를 생물 특이적인 생명공학적 방법으로 생산하여, 이러한 효소에 의하여 생산될 수 있는 식품, 의약품, 화장품 등에서의 다기능성 생리활성 소재를 제조하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 궁극적인 목적은 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 효율적으로 생산할 수 있는 키틴 가수분해효소인 N엔아세틸 글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)의 생물특이적 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 새로 분리, 동정한 신규의 키틴 분해효소 생산균을 이용하여, 효소의 효율적 생산 및 이를 이용한 GlcNAc 생산에 관한 것이다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 키틴 분해 능력을 갖는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)가 제공된다.
한편, 본 발명의 다른 관점에서는 전술한 JK-0412 균주를 산업적으로 응용할 수 있는 공정을 제안한다.
구체적으로, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)를 배지에서 배양하여 배양액으로부터 N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)를 생산하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생산하는 방법은 탄소원으로서 키틴을 배지에 첨가하고 상기 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주를 상기 배지에 접종 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 키틴을 지속적으로 배지에 첨가하여 JK-0412 균주에 의하여 생성되는 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생물학적인 방법으로 농축시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서 확인된 바에 따르면, 상기 N-아세틸글루코사미니데이즈는 상기 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주가 접종된 배양액의 상층액에 함유되어 있다.
본 발명과 관련해서 탄소원으로 사용되는 상기 키틴은 아세틸화도가 90 ~ 95%인 분말 형태의 키틴 또는 콜로이달 키틴이며, 중량비로 0.1 ~ 10% (w/v)의 비율로 상기 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하며, 상기 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)는 25 ~ 50 ℃의 온도 및 pH 6 ~ 8의 조건에서 배양되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면, (a) 탄소원으로 키틴을 배지에 첨가하고 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)를 상기 배지에 접종시켜 배양시켜 키틴분해효소를 생산하는 단계와; (b) 상기 배지에 상기 키틴분해효소에 의하여 분해되는 키틴 전구체를 첨가하는 단계를 포함하는 키틴 전구체를 가수분해하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 키틴분해효소는 N-아세틸글루코사미니데이즈이며, 가수분해 된 최종 산물은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)인 것을 특징으로 한다. 키틴분해효소의 기질로서는 예를 들어 N-아세틸글루코사민 또는 이의 유도체가 대략 2-10개 정도 연결되어 있는 키틴 올리고당을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 키틴분해 능력을 갖는 신규 슈도모나스 플루오레센스 JK-0412 균주 및 이 균주를 이용하여 키틴분해효소를 생산하는 방법 및 이와 같은 방법을 통하여 생산된 키틴분해효소를 이용하여 키틴을 분해하여 N-아세틸글루코사민 및/또는 이의 올리고머를 얻는 방법을 제안하고 있다.
본 발명에서는 간단한 방법으로 본 발명에서 분리, 동정하여 신규 미생물로 명명한 키틴분해 미생물 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주를 키틴을 에너지원으로 사용하여 배양하여 키틴을 생물효소학적으로 가수분해한 뒤, 불용성 성분을 제거, 농축하는 방법으로 N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)를 생산하고 이 효소를 이용하여 키틴을 분해하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명에 따르면 키틴 분해 미생물 배양에 따른 연속적 생산이 가능하며, 제조 공정이 매우 간단하여 제조 공정의 코스트를 크게 줄일 수 있으면서도 특히 면역 활성 증진, 항바이러스 등의 효과를 갖는 것으로 밝혀진 GlcNAc을 생산할 수 있는 분말 키틴 혹은 콜로이달 키틴을 배양기질로 이용하여 배양액에서 생물학적으로 농축되는 효소를 생산하는 기술로 그 가치가 매우 높다.
본 발명의 생물효소학적 생산 방법에 따라 생산되는 GlcNAc은 거의 모든 세포의 세포벽 구성성분으로서, GlcNAc는 세포-세포 신호전달 또는 당쇄공학의 중요한 소재로 쓰일 가능성이 높아 본 발명에서 생산하는 엑소형(ext type) 효소의 효율적 생산 및 이용, 또한 항바이러스 효능 물질과의 혼합체 합성 등의 물질로 이용될 가능이 높아 향후 기초과학은 물론 인간의 질병 예방 및 치료에 이용가치가 매우 높다.
따라서, 본 발명의 특이적인 생물효소학적 특징을 갖는 신규 키틴 분해 미생물을 이용한 최적의 배양조건에서 배양하는 과정에서 생산, 생물학적으로 축적되는 효소로서, 특히 엑소형 N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)를 생산하는 친환경적, 그리고 부작용이 적을 것으로 예상되는 생체-친화적 바이오 소재의 생물학적-효소학적 생산 방법을 가능하게 하였다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 경기도 가평군 일대의 썩은 나무 그루터기에 분리한 세균에 대한 주사전자현미경 분석 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 경기도 가평군 일대의 썩은 나무그루터기에서 새로 분리, 동정한 세균의 키틴 분해 능력 실험을 위해 유일한 탄소원으로 1.0% 키틴 분말이 포함된 고체 한천 배지위에 배양하여 키틴 분해 능력을 확인한 결과를 도시한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 새로이 분리, 동정된 세균의 16s rDNA 염기서열 결정 및 비교, phylogenetic tree (계통수) 해석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 새로 분리, 동정한 세균의 키틴 분해 능력 실험을 위해 유일한 탄소원으로 1.0% 분말 키틴이 포함된 액체배지에 배양하여, 배양 상층액으로부터 분리, 부분 정제한 한 N-아세틸글루코사미니데이즈 활성을 갖는 효소의 전기영동 젤 결과를 측정한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 부분 분리 정제한 효소 N-아세틸글루코사미니데이즈의 활성을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 부분 분리 정제한 효소 N-아세틸글루코사미니데이즈의 활성 측정을 위하여 이 효소의 기질로 (GlcNAc)1-3을 배지에 첨가한 뒤, 반응 시간별로 생산된 GlcNAc을 HPLC로 측정한 결과이다.
전술한 것처럼, 키틴 올리고당 및 GlcNAc은 생물/생리활성과 더불어 당생물학 분야 및 암, 당뇨, 면역 활성 등 다양한 생리활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나 생물효소학적 생산은 고가의 효소를 사용해야하는 문제점이 있다. 이에, 본 발명에서는 키틴 분해 능력을 갖는 신규한 슈도모나스 플루오레센스 균주를 이용하여 종래의 화학적 방법과 비교하여 훨씬 효율적이고 저렴하게 키틴분해효소를 생산하는 공정 및 이러한 효소를 이용하여 다양한 생리활성 기능이 알려져 있는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 이의 올리고머를 얻는 공정과 같이 신규 미생물 균주에 대한 이용을 제안한다.
즉, 본 발명을 간단히 요약하면, 자연계로부터 신규 키틴 분해 미생물을 분리 및 동정하고, 새롭게 동정된 미생물의 16s rDNA 염기 서열 결정 및 기존의 미생물과의 상동성 비교 결과를 바탕으로 신규 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주라는 점을 규명하였다. 이어서 신규 미생물의 배양을 통하여 에너지원으로 키틴을 배지에 첨가하여 신규 미생물에서 만들어지는 효소를 이용하여 키틴을 생물효소학적으로 가수분해하는 공정과, 이와 같이 생물 효소학적으로 가수분해된 배양액 속의 기질 특이적 효소를 제조하는 공정을 제안한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 응용의 한 예로서, 본 발명은 전술한 방법 및 공정에 따라 효소의 효율적 생산에 따른 GlcNAc 생산에 관한 생물학적 제조방법에 관한 것이다. 특히, GlcNAc은 거의 모든 생물의 세포외막 메트릭스 구조성분 뿐만 아니라, 여러 기능을 갖는 당쇄를 형성, 세포 면역증강, 시알산으로의 변환, 항염증, 항균, 항암작용 등의 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서는 생물계 내에 가장 풍부한 물질인 키틴을 기질로 사용하여 생물 효소학적인 방법을 통하여 GlcNAc 및 이의 올리고머를 효율적으로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
키틴은 생체 내에서 잘 분해되는 않는 성향을 갖고 있으며, 항종양활성, 항균활성, 화상용 피복제 등으로 20세기 후반에 응용연구/이용되기 시작되어 최근 천연유래의 특성을 살린 창상피복제나 서방성제 면역 활성 증진제 등 다양한 용도가 제안되고 있다. 키틴은 사람의 장내소화흡수가 거의 이루어지지 않아 천연소재의 식이섬유인 다당류로 열량을 내거나 신체대사 조절작용이 극미한 것으로 좋은 영양소로서 취급되지 않았다. 하지만, 60년대 이후 식이섬유가 각종 성인병 예방이나 치료에 맹 효과적인 사실이 밝혀지면서 "제 6의 영양소"로 건강기능식품의 주요자원으로 각광을 받기 시작했다.
하지만, 탈아세틸화된 고분자당인 키토산과 달리 키틴은 적절한 용매가 없어 용해하기 어렵다는 점과 이로 인한 기능성을 발견하지 못해 주로 키토산 제조를 위한 중간체로서 이용되어져 왔다. 하지만, 인간의 몸속 세포의 세포벽을 구성하는 주요물질로 키틴을 구성하는 최소단위인 N-acetylglucosamine (GlcNAc)의 존재가 확인되었으며, 생체내 효소인 글리코시데이즈(glycosidase)의 일종인 라이소자임(lysozyme)에 의해 키틴의 일부가 분해되는 것으로 알려져 있으며, 기질 특이성이 매우 낮아 분해성 또한 매우 낮다.
GlcNAc은 거의 모든 생물 세포의 세포외막 구성성분으로 다양한 생리활성을 갖고 있는 것으로 확인 되었으며, 면역응답성, 항종양, 염증억제 작용, 항바이러스 성, 그리고 건강증진 효과 식품이나 여러 생리활성이 보고되고 있어 향후 전망이 밝다. 최근 고순도 키틴올리고당 및 GlcNAc의 제조를 위하여 여러 공정이 도입되고 있으나, 키틴을 원료물질로 하여 산을 이용한 부분가수분해, 중화공정, 여과공정, 탈염공정을 통한 혼합액에서 색소 또는 기타물질 제거를 위해 여러 크로마토그래피를 이용하여 불순물들을 제거하고 건조공정을 거쳐 분발형태의 키틴 올리고당 및 GlcNAc을 제조하는 기술이 대표적이다.
그런데, 일반적으로 분자량이 작은 키틴 올리고당 및 GlcNAc은 수용성으로, 건강기능식품 첨가제로 이용가능하나, 제조비용이 높고 생리활성에 대한 임상연구 결과나 보고 많지 않아 키토산, 키토산 올리고당 등에 비해 큰 시장형성이 기대되지 못하고 있지만, 저비용의 효율적 생산 및 생리활성 효능이 검증된다면 독자적인 시장 확보가 가능하리라 예상되며, 고부가가치 의약품 선도물질로 사용가능성도 높다. 하지만 GlcNAc 또는 올리고당 형태의 키틴의 효율적 생산 및 분리정제가 매우 힘들어 생산이나 이용에 매우 제한적이다.
결국, 키틴올리고당 또는 GlcNAc의 고부가가치 창출을 위한 제품화 기술로서는 단지 이러한 올리고당 생산 기술뿐만 아니라 효율적 생산, 선택적 분리, 정제 방법이 개발되어져야 할 것이며, 각각의 분자량 크기별 효능을 검증하고, 용도 개발에 따른 개별 인정형으로 의료, 의약품 등으로의 이용가능하다. 따라서, 분자량 크기별 순수분리의 효율적 기술 개발이 고부가가치 기술의 핵심이 될 것이다.
뿐만 아니라 GlcNAc와 매우 유사하게 아세틸기를 가지고 있는 단당류로서, 뉴라믹산(neuramic acid)의 이종인 N-아세틸뉴라믹산(N-acetylneuramic acid)을 포함하는 시알산(sialic acid)이 인간 인플루엔자 바이러스의 감염에서 주요한 역할을 한다는 사실이 밝혀짐에 따라, 시알산을 소재로 한 항-바이러스 감염성 저해제 개발에 사용되어지고 있으며, 이러한 저해제, 예를 들어 타미플루, Zanamivir 등 감기바이러스 감염 시의 증상 악화와 감염기간 모두를 감소시키는 활성이 있는 것으로 확인되어 바이러스의 감염 및 세포로부터의 탈출 그리고 다른 세포로의 감염 시 이용되는 neuraminidase 저해활성이 있는 것으로 보고되어, 향후 GlcNAc의 시알산 전이효소 탐색 및 이를 이용한 시알산 대량생산 등 보다 다양한 합성화합물 소재로 이용될 가능성이 확대되고 있으며, 의료, 의약품 등으로의 이용가능하다.
이에, 본 발명자들은 전술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위하여 고-기능성 키틴분해 세균을 선택적으로 분리, 동정하고, 생물효소학적 가수분해방법을 이용하여 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 효율적으로 생산할 수 있는 가수분해효소 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)를 생물 특이적으로 생산하는 방법을 제안한다.
이를 위하여, 본 발명자들은 신규의 키틴 분해 균주는 경기도 가평군내 야산의 썩은 나무에서 분리하였다. 이 균주에 대한 형태학적 결과가 도 1에 도시되어 있으며, 붉은색의 콜로니를 생성하지 않았다. 또한 계통 분석을 위하여 다양한 미생물의 16s rDNA 염기 서열과의 상동성을 검색한 결과 슈도모나스 플루오레센스에 속하는 균주로서, 특히 기존의 슈도모나스 플루오레센스와 99.9%의 높은 상동성을 보여주었으며, 키틴 분해 능력을 가지고 있다는 점을 확인하였다(도 3).
이에, 본 발명자들에 의하여 경기도 가평군 일대의 썩은 나무 그루터기에서 분리, 동정되며 키틴 분해 능력을 갖는 효소를 보유한 균주는 슈도모나스 플루오레센스에 속하는 새로운 균주로서 '슈도모나스 플루오레센스 JK-0412' 균주로 명명하였으며, 2010년 1월 25일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11623BP를 부여받았다.
이어서, 본 발명에 따라 신규 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주로 명명된 미생물을 키틴을 유일한 탄소원으로 사용하여 배양하고 이 배양액으로부터 키틴을 가수분해하는 효소가 효율적으로 얻어질 수 있는지를 확인하였다. 키틴분해효소는 바이러스, 박테리아, 진균류, 고등 식물 및 고등 동물에서도 확인되었다. 특히, 키틴을 분해하는 능력을 갖는 다양한 미생물이 확인되었으나 주로 세라티아속(Serratia sp.), 바실러스속(Bacillus sp.), 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.), 에어로모나스속(Aeromonas sp.)에 속하는 것이 대부분이다. 특히, 본 발명자들은 후술하는 실시예에서 언급하고 있는 것과 같이 본 발명에서 분리 동정한 균주가 매우 강력한 N-아세틸글루코사미니데이즈의 효소 활성을 확인하고, 유명한 생명공학 사이트인 Pub-Med의 문헌 정보 검색 사이트에서 키워드로서 "Pseudomonas fluorescens"와 "N-acetylglucosaaminidase"를 이용하여 검색하였는데, 아무런 것도 검색하지 않았다는 점을 확인하였는바, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에 속하는 균주로서 N-아세틸글루코사미니데이즈를 합성하여 키틴 전구체로부터 GlcNAc를 합성할 수 있다는 점은 매우 이례적이고 예상치 못한 것이다.
키틴을 분해하는 효소는 크게 고분자 형태의 키틴 체인의 내부 위치에서 키틴을 무작위로 절단하는 엔도형 키틴분해효소(endo-chitinase, EC 3.2.1.14)와 키틴의 말단에서 키탄을 절단하는 엑소형 키틴분해효소(exo-chitinase)로 구분된다. 또한 엑소형 키틴분해효소는 키틴 마이크로피브릴(chitin microfibril)의 비환원 말단에서 시작하여 디아세틸키토바이오스(diacetylchitobiose)를 연속적으로 생성하는 키토바이오시데이즈(chitobiosidase, EC 3.2.1.29)와, 전술한 엔도형 키틴분해효소 및 키토바이오시데이즈에 의하여 만들어진 올리고머 형태의 키틴을 절단하여 단량체인 GlcNAc를 합성하는 N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase, EC 3.2.1.30) 으로 구분된다.
이에, 본 발명에서는 특히 키틴을 이루는 기본단위인 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 생산할 수 있는 가수분해효소인 N-아세틸글루코사미니데이즈의 효소 활성을 분석하였다. N-아세틸글루코사미니데이즈의 활성을 측정하는 방법으로는 다음 반응식 1과 같이 키틴 올리고당으로부터 GlcNAc를 합성하는 방법이 널리 이용된다.
반응식 1
Figure pat00001
(pNP-GlcNAc: p-Nitrophenyl N-acetylglucosamine; pN: p-Nitrophenol; n = 1 내지 5)
그런데, 키틴 분해 능력을 갖는 미생물 균주의 경우, 에너지원으로 배지에 첨가된 키틴을 키틴 또는 키틴 올리고당의 내부를 자르는 엔도형의 효소와 키틴의 환원 말단(reducing end)으로부터 단당인 GlcNAc를 생산하는 엑소형으로 구분될 수 있는데, 이와 같이 에너지원(탄소원)으로 배지에 첨가된 키틴으로부터 키틴 올리고당 또는 GlcNAc의 형태로 전환한 뒤에 이를 체내로 흡수하여 탄소원으로 이용하는 것은 키틴 분해 미생물들의 일반적인 키틴 분해 작용 및 이를 통한 이화 작용의 기본이다.
구체적으로, 본 발명에 따르면, 유일한 탄소원으로 키틴(시그마사)을 0.1~10.0%, 바람직하게는 0.1 ~ 5.0%, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 2.0%가 되도록 배양액에 첨가한 후, 본 발명에 따라 분리된 슈도모나스 플루오레센스 JK-0412 균주를 배양하였다. 이어서 시간의 흐름에 따라 본 발명에 따라 분리된 슈도모나스 플루오레센스 JK-0412 균주는 기질에 특이적으로 키틴 분해 과정에서 특히 엑소형 분해효소 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 효율적으로 생산할 수 있는 가수분해효소 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)를 생물 특이적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
이와 관련해서 본 발명의 신규 균주인 JK-0412 균주가 생산한 키틴분해효소인 N-아세틸글루코사미니데이즈의 기질로서는 키틴 올리고당 및 이의 GlcNAc의 유도체로서 GlcNAc 단위체가 1-10개 연결되어 있는 키틴 올리고당 또는 이의 유도체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이때 에너지원으로 이용하는 고분자 키틴의 아세틸화도는 아무런 제한이 없으며, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 90 ~ 99%, 더욱 바람직하게는 90 ~ 95%의 아세틸화도를 갖는 고분자의 키틴이며, 분말 형태의 키틴 또는 콜로이달 키틴(coloidal chitin) 중 어느 형태를 사용하더라도 무방하다.
특히, 분말 키틴을 이용하는 것보다 콜로이달 키틴을 이용하면, 보다 신속하게 미생물이 탄소원/질소원으로 이용할 수 있으므로, 본 발명에 따라 새롭게 분리, 동정된 슈도모나스 플루오레센스 JK-0412 균주에 의하여 키틴분해효소인 N-아세틸글루코사미니데이즈의 생산이 빨라질 수 있으므로 콜로이달 키틴이 바람직할 수 있다. 반면, 본 발명에 따라 분리된 신규 균주에 의하여 생산되는 효소를 산업적인 규모로 생산하고자 하는 경우, 탄소원으로서 사용되는 키틴의 원료로소 콜로이달 키틴을 제조하는 과정에서 강-염산을 사용하게 되므로 환경적인 문제가 유발될 수 있으므로 분말 키틴을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
하지만, 본 발명의 실시예에 따르면, 새롭게 분리, 동정된 미생물 균주는 분말 키틴 또는 콜로이달 키틴을 탄소원으로 사용하는 경우에 거의 유사한 효소 활성을 나타내고 있으므로 분말 키틴을 이용하더라도 아무런 문제가 없기 때문에 본 발명이 특정한 종류의 키틴으로 한정되는 것은 결코 아니다.
오히려 본 발명에서 확인한 바에 따르면, 분말 키틴을 사용하더라도 콜로이달 키틴을 사용하는 것과 거의 유사한 효소 합성 활성을 나타내고 있으므로, 다른 미생물 균주에 비해서도 산업적인 규모로도 활용될 수 있다는 점에서 상당히 바람직한 장점이자 응용이 될 수 있다.
탄소원으로 사용되는 키틴은 중량비로 0.1 ~ 10% (w/v), 바람직하게는 0.1 ~ 5% (w/v)의 비율로 배지에 첨가될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 아울러, 본 발명의 슈도모나스 플루오레센스 균주를 배양하는 과정에서의 온도는 20 ~ 50℃, 바람직하게는 20 ~ 40℃이며, pH 조건은 바람직하게는 pH 6 ~ 8이지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
이때, 탄소원으로서 키틴이 함유된 배양액에서 본 발명의 슈도모나스 플루오레센스 균주 JK-0412 균주가 생산하는 키틴분해효소인 N-아세틸글루코사미니데이즈의 함량을 높일 수 있도록 탄소원인 키틴을 연속적으로 배지에 공급하는 것과 같은 '생물학적 농축' 방법을 생각해 볼 수 있을 것이다. 바람직하게는 본 발명에 따라 확인된 키틴 분해 능력을 갖는 균주가 보유하고 있는 키틴분해효소는 키틴 분해 능력을 갖는 신규한 슈도모나스 플루오레센스 JK-041 균주에 부착된 상태에서 키틴을 GlcNAc로 분해할 수 있다.
결국, 본 발명의 또 다른 관점에서는 본 발명에서 확인된 키틴 분해 균주와 키틴을 접하게 하여 키틴 분해 균주가 보유한 키틴 분해 효소에 의하여 키틴을 분해하여 키틴 올리고당 또는 GlcNAc를 생산하는 방법에 관한 것이다. 키틴 분해 균주와 키틴이 접촉하는 방법과 관련하여 본 발명의 실시예에서는 탄소원으로서의 키틴이 함유된 배지에 본 발명에 따른 키틴 분해 균주인 JK-0412 균주를 배양하는 공정을 채택하였으나, 다른 공정으로서 예컨대 키틴 분해 균주와 키틴을 동일한 시험관 내에 위치시키는 공정을 생각해 볼 수 있을 것이며, 이러한 변형된 공정 역시 본 발명의 권리 범위에서 결코 제외되지 않는다.
본 발명의 균주는 키틴을 함유하는 배지에서 배양하였을 때, 키틴을 분해하는 키틴분해효소를 생산하여 키틴 분해산물을 탄소원으로 이용하여 생장한다. 이와 같이 키틴을 탄소원으로 이용하여 생장할 수 있는 미생물을 이용하여 키틴분해효소를 생산한다.
특히, 키틴 올리고당 또는 키틴의 기본 유닛인 GlcNAc를 높은 수율로 얻고자 하는 경우에는 본 발명에서 확인된 신규 키틴 분해 균주인 JK-0412 균주를 높은 수율로 증식할 필요가 있으며, 이 경우에는 에너지원으로서 탄소원인 키틴 외에도 질소원 및 무기질을 물에 혼합한 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어 질소원으로는 효모추출물, 콩가루 또는 펩톤을 사용할 수 있으며 무기질로는 염화칼륨(KCl), 인산이칼슘(K2HPO4), 황산마그네슘(MgSO4), 황산제1철(FeSO4), 질산나트륨(NaNO3) 등을 사용할 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명의 과정에 대해서 설명한다.
실시예 1 : 신규의 키틴 분해 미생물의 분리 및 동정
(1) 키틴 분해
키틴 분해 미생물의 분리 및 동정에 있어서 특정지역은 제한적이지 않다. 키틴 분해 미생물의 분리를 위해 경기도 가평군내 야산의 썩은 나무 그루터기에서 시료를 채취하여, 이를 미생물 분리용 시료로 이용하였다.
계속해서, 미생물 분리를 위해 채취한 미생물 시료 0.5 g을 순수 정제수 2 ㎖에 현탁시켜 침전물이 가라앉도록 10분 동안 방치한 뒤 상층액을 1/100 로 희석하였다. 사전에 0.1%의 분말 키틴이 포함된 한전 고체 위에 희석한 상층액 0.2 ㎖를 분주하여 도말하고, 30℃도 배양기에 넣어 10일간 배양을 하였다. 10일간의 배양기간 도중 매일 세균의 성장을 확인하였다.
이어서, 최종적으로 키틴을 분해하는 여러 미생물체의 성장을 확인하였다. 총 개체 중 키틴을 분해하는 능력이 가장 큰 것으로 보이는 세균 10 개를 분리하여, 새로운 1.0 분말 키틴 함유 한천 고체배지위에 옮겨 동일한 방법으로 키틴 분해능을 확인하였다. 키틴 분해능을 불용성의 키틴 분말을 가수분해하여 에너지원으로 이용하게 되면 콜로니 주변에 clear-zone 이 형성되어 그 크기를 비교하여 활성이 높은 것으로 판단하였다.
이들 중 가장 키틴 분해능이 우수한 것으로 판단되는 미생물을 분리해낸 날짜를 기준으로 JK-0412로 명명하였으며, 순수 분리 확인을 위하여 일반적으로 이용하는 LB-액체 배지에 균체를 배양하고, 이를 연속적 희석 (serial dilution)으로 고체 한천배지에 100~200 여개의 콜로니가 생기도록 하여 30℃에서 배양하였다. 발생한 콜로니의 모양, 색깔, 전자현미경 관찰 등을 통해 순수분리된 것을 확인하였다. 도 1은 본 실시예에 따라 최종적으로 선별된 콜로니의 주사전자현미경 사진이며, 도 2는 본 실시예에 따라 키틴 분말을 가수 분해하여 에너지원으로 이용한 콜로니 주변에 clear-zone이 형성된, 선별된 콜로니에 대한 사진으로서, 본 실시예에 따라 분리된 균주는 키틴 분해 능력이 있다는 점을 알 수 있다.
(2) 키틴 분해균의 생화학적 특성 조사
위에서 선별된 키틴 분해 균주의 생화학적 특성을 관찰하기 위하여 LB 액체 배지를 이용하여 30℃에서 배양한 후 그람 염색을 실시하는 한편, API20NE kit을 사용하여 이 균주의 생화학적 특성을 조사하였다. 그 결과가 하기 표 1에 나타내었다. 결과를 보면 그람 음성 세균의 호기성 간상 세균이라는 점을 확인하였다.
키틴 분해 균주 JK-0421의 형태적 특성 및 생화학적 특성
시험(API20NE) 반응/효소 결과
세포 형태 - 간상(Rod)
그람 염색 - 그람 음성
산소 관련 - 호기성(aerobic)
NO3 질산염의 아질산염으로의 환원 +
TRP 인돌 생산 -
GLU 산성화 -
ADH 아르기닌 디하이드롤레이즈 -
URE 우레이즈(Urease) +
ESC 가수분해 (β-글루코시데이즈) +
GEL 프로테에이즈(protease) +
PNG β-갈락토시데이즈 +
GLU 글루코오스 동화 +
PAR 아라비노오스 동화 -
MNE 만노오스 동화 +
MAN 만니톨 동화 +
NAG N-아세틸글루코사민 동화 +
MAL 말토오스 동화 +
GNT 글루콘산염 동화 +
CAP 카프론산염 동화 +
ADI 아디프산염 동화 -
MLT 말산염 동화 +
CIT 시트르산염 동화 +
PAC 페닐-아세트산 동화 -
OX 사이토크롬 산화 효소 +
+ : 양성, - : 음성
(3) 키틴 분해 미생물 균주의 동정
이어서, 분리한 세균의 동정을 위해 생리학적 실험 (마이크로 아이디.(주)) 및 16S rDNA 염기서열 결정을 수행하였다. 위에서 확인된 콜로니 중에서 단일 콜로니를 취하고, 멸균수 (시그마) 20 ㎕에 넣어 90℃에서 10분간 가열하여 세포를 파쇄한 뒤, 13,000 rpm에서 원심분리 후 상층액을 취해 DNA sample로 이용하였다.
PCR 증폭을 위해, 박테리아 16s rDNA특이적 primers (1492 R; 5'-TACGGYTACCTTGTTACG-3'(서열번호 2)와 514 F; 5'-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-3' (서열번호 3))을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액에는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 2.5 units Taq DNA 중합효소, 100 pmol의 프라이머와 DNA 주형을 넣어 총 부피를 100 ㎕가 되도록 하였다. 각 시료는 증폭기에서 증폭 사이클을 시작하기 전에 94℃에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 PCR을 수행하였으며, 45 사이클을 종료한 뒤 72℃에서 7분간 연장 반응시킨 다음 PCR 반응을 완전히 종료하였다. 각 사이클은 94℃ 1분, 35℃ 2분, 72℃ 2분으로 하였다.
PCR 분석을 통하여 증폭된, PCR로 증폭된, 본 발명에 따라 분리, 동정된 슈도모나스 플루오레센스 JK-4012 균주의 16s rDNA 서열(970bp, 5'-NNNNNNGATAAAGTGGTAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGTACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATACGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGGCTGGCACGAA-3', 서열번호 1)의 상동성 검사는 Genbank의 database에 등록된 정보를 대상으로 블라스트 프로그램(BLSATIN 2.2.13))으로 수행하였다. 계통분석은 DNAstar의 MegAligh 프로그램을 사용하여 결정하였다. Genbank에 등록된 다른 균주들의 16s rDNA 염기서열 정보와 MegAlign 프로그램을 이용하여 이웃 결합 방법(Saitou et al., Mol. Biol. 4:406-425, 1987)을 이용하여 염기 서열 사이의 계통수(phyogentic tree)를 얻었다.
PCR로 증폭된 16s rDNA를 이용하여 키틴 분해 능력을 갖는 JK-0412의 염기 서열 분석을 위해서 국립생명공학정보 센터(NCBI)의 블라스트 검색을 통해 유사도를 조사한 결과, 본 발명에 따라 분리된 세균은 기존 슈도모나스 플루오레센스( Pseudomonas fluorescens)의 16S rDNA 염기서열과 99.9% 상동성을 보였기에, 이를 바탕으로 본 발명에서 분리한 세균을 Pseudomonas fluorescens JK-0412라 명명하였다. 결정된 염기서열과 유사한 유형의 균주들과의 유연관계를 조사한 계통수가 도 3에 도시되어 있다.
키틴 분해 능력이 우수한, 최종적으로 선별된 플루오레센스 슈도모나스 JK-0412 균주는 2010년 1월 25일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11623BP를 부여받았다.
실시예 2 : N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)의 생산
위 실시예 1에서 본 발명에서 분리, 동정한 신규의 키틴 분해 세균 Pseudomonas fluorescens JK-0412 균주를 이용하여, 키틴 분해 효소액을 만들기 위해 중량 단위로 약 0.5% 정도로 분말 키틴을 기초배지 (M9, 시그마)에 첨가하여, 키틴-한천 고체배지에서 키틴을 분해하는 단일 콜로니를 접종하고, 30℃ 배양기에서 배양을 시작하여 최대 30일간 배양 경과를 확인하였다.
키틴 분해가 진행됨에 따라 시간별 배양액의 극히 일부를 취하여 효소액 생산여부를 확인하였다. 이때 기질로서 PNP-(GlcNAc)n (n=1-2)를 이용하였으며, 이들 물질은 엑소형이나 엔도형 키틴분해효소의 기질로 매우 유용하다. 키틴 분해효소의 활성 및 생산된 단백질의 량을 확인하여, 최대 생산된 지점을 중심으로 3일간 배양을 더 진행시켜 그 변화추이를 확인하였다. 배양 종료 후, 배양상층액을 조효소액으로 하여, 키틴분해효소 활성을 측정하여 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생성하여 기질을 GlcNAc로 변환시키는 것을 확인하였다(결과 미도시).
실시예 3 : N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)의 생산
실시예 2에서와 다르게, 키틴 분말을 이용하지 않고 사전에 준비한 콜로이달 키틴을 기질로 하여 보다 신속히 키틴 분해효소 생산을 추구하였다.
중량비로 0.5%의 콜로이달 키틴을 사용하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 M9 기초배지에 첨가하고, 동일한 방법으로 Pseudomonas fluorescens JK-0412에 의한 콜로이달 키틴 분해 및 효소생산을 확인하였다. 상기 기술한 바와 같이 실시예 2와 동일한 방법으로 키틴 분해효소활성을 측정하고, 이를 조효소로 이용하였다. 키틴분해효소 활성을 측정하여 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생성하여 기질을 GacNAc로 변환시키는 것을 확인하였다(결과 미도시).
실시예 4 : N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)의 생물특이적 생산 방법 및 부분정제
실시예 2의 분말 키틴과 실시예 3의 콜로이달 키틴을 중량비로 1.0%가 되도록 하여 배양액 200 ㎖을 제조한 뒤, 여기에 Pseudomonas fluorescens JK-0412를 접종, 30℃에서 배양을 시작하였다. 상시 실시예와 동일한 방법으로 시간별 키틴 분해양상을 파악하고, 효소의 생산성에 따른 실시예 2와 동일한 방법으로 키틴 분해효소활성을 측정하고, 이를 조효소로 이용하였다. 배양시간 결정은 제한적이지 않다. 따라서 최대 15일간의 배양을 종료 후 배양액으로부터 효소를 분리하기 위해 원심분리 (10,000 x g)하여 불용성 또는 세균체를 분리하였다. 획득한 상층액을 다시 0.25 um 멸균용 filter를 이용하여 여과하고, 배양상층액을 획득하였다. 상층액을 10-kDa 의 분자량을 갖는 물질을 제거할 수 있는 filter (amicon)를 이용하여, 10-kDa 이하의 분자량을 갖는 물질을 제거, 분리, 농축하였다.
도 4는 본 실시예에 따라 1.0% 분말 키틴이 포함된 액체 배지에 배양하여, 배양 상층액으로부터 분리, 부분 정제한 한 N-아세틸글루코사미니데이즈 활성을 갖는 효소의 전기영동 젤 결과를 측정한 사진이다. 배양 상층액으로부터 부분 정제된 정제 효소의 분자량은 비변성 SDS-PAGE (15%)이었다. 도 4에서 레인 1은 콜로이달 키틴을 함유한 기초 배지에 JK-0412 균주를 배양한 상층액을 샘플로 하여 측정한 결과이고, 레인 2는 분말 키틴을 함유한 기초 배지에 JK-0412 균주를 배양한 상층액을 샘플로 하여 측정한 결과이다. 도시된 것처럼 분말 키틴이나 콜로이달 키틴을 탄소원으로 사용하더라도 배양액의 상층에 약 100-KDa의 효소가 정제되었으며, 그 합성 정도는 크게 차이가 없었다.
한편, 도 5는 본 실시예에 따라 분말 키틴을 탄소원으로 사용하여 분리 정제된 배양액에 함유된 효소를 사용하여 N-아세틸글루코사미니데이즈의 활성을 측정한 그래프이다. 도 5에서 흰색 막대는 시그마사에서 구입한 기질 PNP-(GlcNAc)를 사용하여 효소 활성을 측정한 결과이고, 검은색 막대는 시그마사에서 구입한 기질 PNP-(GlcNAc)2를 사용하여 효소 활성을 측정한 결과이다. 도시된 것처럼 본 실시예에 따라 분리, 정제된 배양액은 키틴 유도체 및 키틴 올리고당을 기질로 사용하여 키틴을 분해하는 효소가 함유되어 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 : N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)의 생물특이적 생산 방법 및 부분정제
본 발명의 Pseudomonas fluorescens JK-0412 배양에 따른 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase)의 생물특이적 생산 방법 및 부분정제를 위해 실시예 4 에서 실시한 배양은 분말 키틴 대신 콜로이달 키틴을 유일한 탄소원으로 이용하여 세균을 배양, 배양상층액에 축적되는 키틴분해효소를 획득하기위해 콜로이달 키틴을 중량비 2.0 % (wet g/v)되도록 하여 배양액 200 ㎖을 제조한 뒤, 여기에 Pseudomonas fluorescens JK-0412를 접종, 30℃에서 배양을 시작하였다. 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 키틴분해 활성을 갖는 효소의 활성을 측정, 확인하였다(결과 미도시).
실시예 6 : 배양 조건 규명
최적 배양 온도 및 생산 최적 배양온도를 결정하기위해 실온(25℃), 30℃, 37℃, 그리고 42℃에서 실시예 4, 5와 동일한 조건으로 각각의 온도에서 배양, 키틴분해효소 N-아세틸글루코사미니데이즈 (N-acetylglucosaminidase) 생산 및 활성을 토대로 최적 배양, 효소활성온도를 결정, 각각 30℃와 37℃에서 거의 비슷한 생산성을 보여, 제한적이지 않다. 하지만, 37℃가 가장바람직하다. 아울러, 배지의 pH를 변경시키면서 효소의 최적 생리적 활성을 측정한 결과 pH 6 ~ 8에서 최적의 효율을 보이는 것으로 확인되었다(결과 미도시).
실시예 7 : HPLC 분석
본 실시예에서는 기질 특이성을 확인하기 위해서 천연당 (GlcNAc)3를 이용하여 상기 실시예 4에서 분리 정제된 효소가 엑소형의 키틴분해효소인지 엔도형의 키틴분해효소인지의 여부를 확인하였다. 표준물질은 시그마사로부터 구입하였으며, 효소의 활성 및 활성 모드를 밝히기 위해서 기질로 1 mM (ClcNAc)3를 이용하였고, 실시예 7에서 확인된 최적 pH 및 온도에서 시간별 (0 ~ 120 분 및 24 시간)로 반응(100 ㎕ 기질/효소량 0.5 ㎍)시켜 HPLC를 반응생산물의 크기를 표준물질과 비교하여 측정하였다.
구체적으로, 총 100 ㎕의 부분 정제된 효소 중에서 20 ㎕를 취하여 이온교환 수지에 투입한 뒤, 전기화학 검출기(PED50)가 구비된 'Dionex DX600 chromatography system'(Dionex Corp., Sunnyvale, California, USA)를 사용하여 HPAEC(high performance anion exchange chromatography)로 분석하였다. 크로마토그래피를 위한 칼럼은 CarboPac-PAC (4 ㅧ 250 ㎜)이고, 전개액으로 (a) 0.1M NaOH와 (b) 0.1 M NaOH에 용해된 1 M 아세트산나트륨을 사용하였다. 칼럼에서의 유속은 1 ㎖/min으로 설정하였고, 농도구배는 다음과 같다: 0 ~ 4 분 동안 5% B; 4 ~ 8 분 동안 5~20% B, 8 ~ 15 분 이상 20% B. 도 6은 본 실시예에 따른 분석 결과를 보여주고 있다. 도 6에서 A는 표준물질인 (GlcNAC)1-3이고, B ~ I는 본 발명에 따라 정제된 효소에 의하여 분해되는 물질을 확인한 결과이다.
도 6에 도시된 것과 같이 표준물질로서 GlcNAc는 5.9 ~ 6.0 분 사이에 피크가 형성되고, (GlcNAc)2는 7.6 ~ 7.7 분 사이에 피크가 형성되며, (GlcNAc)3은 7.3 ~ 7.4 분 사이에 피크가 형성된다. 한편, 본 발명에 따라 정제된 효소의 반응을 통하여 합성된 각각의 당은 전기화학 검출기가 반응하는 그에 상응하는 시간대 영역을 참조하여 정량화되었으며, 대응되는 표준물질을 통하여 측정되었다. 도시된 것과 같이, 본 실시예에 따라 확인된 효소의 활성에 따라 최종 분해 산물이 GlcNAc임을 확인할 수 있다.
실시예 8 : 다른 고분자 물질을 탄소원으로 첨가
또 다른 효소활성 존재 여부를 결정하기 위해 여러 고분자 물질을 이용하였다. 여기에는 키토산, 폴리시알산, 베타-글루칸 그리고 히알유론산을 이용하여 키틴 분해효소활성 이외에 다른 특이적 효소생산기능을 탐색한 결과, 특이적으로 엑소형 N-아세틸글루코사미니데이즈는 키틴을 분해하는 과정에서 생산됨을 확인, 기질 특이성을 갖는 효소를 생산하는 세균임을 확인하였다(결과 미도시)
상기에서는 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 전술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 하지만, 그러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통해서 분명해질 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11623 20100125
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel Chitinolytic Microorganism Psedomonas fluorescens JK-0412 and Preparation of N-aceytlglucosaminidase Using thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 970 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <400> 1 nnnnnngata aagtggtagc gccctcccga aggttaagct acctacttct tttgcaaccc 60 actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtagcattc 120 tgatctacga ttactagcga ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgga 180 ctacgacgta ctttatgagg tccgcttgct ctcgcgaggt cgcttctctt tgtatacgcc 240 attgtagcac gtgtgtagcc ctactcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc 300 ttcctccagt ttatcactgg cagtctcctt tgagttcccg gccgaaccgc tggcaacaaa 360 ggataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac 420 agccatgcag cacctgtctc agagttcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttctc 480 tggatgtcaa gagtaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc 540 gcttgtgcgg gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc 600 ggtcgattta acgcgttagc tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaaatcgac 660 atcgtttaca gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac 720 ctgagcgtca gtcttcgtcc agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cagatctcta 780 cgcatttcac cgctacacct ggaattctac ccccctctac gagactctag cttgccagtt 840 tcaaatgcag ttcccaggtt gagcccgggg atttcacatc tgacttaaca aaccgcctgc 900 gtgcgcttta cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgg 960 ctggcacgaa 970 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying bacterial 16s rDNA <400> 2 tacggytacc ttgttacg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying bacterial 16s rDNA <400> 3 cgtgccagca gccgcggt 18

Claims (10)

  1. 키틴 분해 능력을 갖는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP).
  2. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)를 배지에서 배양하여 배양액으로부터 N-아세틸글루코사미니데이즈(N-acetylglucosaminidase)를 생산하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생산하는 방법은 탄소원으로서 키틴을 배지에 첨가하고 상기 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주를 상기 배지에 접종 배양하는 단계를 포함하는 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생산하는 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 N-아세틸글루코사미니데이즈는 상기 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)가 접종된 배양액의 상층액에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생산하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 키틴은 아세틸화도가 90 ~ 95%인 분말 형태의 키틴 또는 콜로이달 키틴이며, 중량비로 0.1 ~ 10% (w/v)의 비율로 상기 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는 키틴분해 효소를 생산하는 방법.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)는 25 ~ 50 ℃의 온도 및 pH 6 ~ 8의 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사미니데이즈를 생산하는 방법.
  7. (a) 탄소원으로 키틴을 배지에 첨가하고 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) JK-0412 균주(기탁번호 KCTC 11623BP)를 상기 배지에 접종시켜 배양시켜 키틴분해효소를 생산하는 단계와;
    (b) 상기 배지에 상기 키틴분해효소에 의하여 분해되는 키틴 전구체를 첨가하는 단계를 포함하는 키틴 전구체를 가수분해하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 탄소원으로서의 키틴은 아세틸화도가 90 ~ 95%인 분말 형태의 키틴 또는 콜로이달 키틴이며, 중량비로 0.1 ~ 10% (w/v)의 비율로 상기 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는 키틴 전구체를 가수분해하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 25 ~ 50 ℃의 온도 및 pH 6 ~ 8의 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 키틴 전구체를 가수분해하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 키틴분해효소는 N-아세틸글루코사미니데이즈이며, 가수분해 된 최종 산물은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)인 것을 특징으로 하는 키틴 전구체를 가수분해하는 방법.
KR1020100007846A 2010-01-28 2010-01-28 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법 KR20110088102A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100007846A KR20110088102A (ko) 2010-01-28 2010-01-28 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100007846A KR20110088102A (ko) 2010-01-28 2010-01-28 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110088102A true KR20110088102A (ko) 2011-08-03

Family

ID=44926767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100007846A KR20110088102A (ko) 2010-01-28 2010-01-28 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20110088102A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
George et al. Extraction, purification and characterization of chitosan from endophytic fungi isolated from medicinal plants
Karunya et al. Optimization and purification of chitinase produced by Bacillus subtilis and its antifungal activity against plant pathogens
Amer et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications
Revathi et al. Production and characterization of chitinase from Vibrio species, a head waste of shrimp Metapenaeus dobsonii (Miers, 1878) and chitin of Sepiella inermis Orbigny, 1848
Shahbaz et al. Cloning, isolation, and characterization of novel chitinase-producing bacterial strain UM01 (Myxococcus fulvus)
Mathur et al. Isolation of Bacillus producing chitinase from soil: production and purification of chito-oligosaccharides from chitin extracted from fresh water crustaceans and antimicrobial activity of chitinase
Wang et al. Production of antifungal materials by bioconversion of shellfish chitin wastes fermented by Pseudomonas fluorescens K-188
KR101348124B1 (ko) 미생물에 의한 ｎ-아세틸-ｄ-글루코사민의 발효 생산방법
JPH0691819B2 (ja) デアセチラーゼの製造方法
KR101229055B1 (ko) 알긴산 분해능을 갖는 메틸로박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용한 알긴산 올리고머 제조방법
KR102090063B1 (ko) 알돈산 생산능을 갖는 신규 미생물 및 이를 이용한 알돈산의 생산 방법
Singh et al. Isolation, purification and optimization of chitosanase production from a common mahabubnagar agricultural field fungi Aspergillus fumigatus of telangana state
KR20110088102A (ko) 키틴분해능을 보유한 신규한 미생물 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주 및 이를 이용한 엔-아세틸글루코사미니데이즈의 생산 방법
KR101780234B1 (ko) 스트렙토마이세스 아눌라투스 cs242 유래의 항진균, 생분해성 키티나아제 및 그의 용도
KR20160137788A (ko) 녹조류 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타 균주 ｋｃｔｃ12651ｂｐ
Singh et al. Production of pullulan from a high yielding strain of Aureobasidium pullulans isolated from Jabalpur region of Madhya Pradesh in Central India
KR100241249B1 (ko) 신규한 BACILLUS sp．균주와 그를 이용한 CHITOSANASE의 생산
KR101170119B1 (ko) 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주가 생산하는 신규의 폴리시알산 분해 효소, 이의 제조 방법 및 이용
KR0140430B1 (ko) 아스퍼질러스 푸미가투스 돌연변이 균주와 생산효고 및 이를 이용한 키토산-올리고당의 제조방법
Anandhi BIOLOGICAL EXTRACTION OF CHITIN AND CHITOSAN FROM MARINE FUNGI, IT’S CHARACTERIZATION, ANTIMICROBIAL ACTIVITY, ANTITEXTILE ACTIVITY AGAINST MDR PATHOGENS AND ANTICANCER ACTIVITY
KR20080011346A (ko) 해양 미생물 슈도모나스 에스피 에치에스 5322 균주를이용한 카라기난 분해효소 및 올리고당의 제조방법
KR20080006931A (ko) 해양 미생물 비브리오 에스피. 에스21 균주를 이용한알긴산 분해효소의 제조방법
KR101853429B1 (ko) 세포외효소 및 세포외 다당체 생성능이 증가된 세리포리아 라세라타 변이균주 및 이의 제조방법
Rameshaiah et al. Enzymatic Depolymerization of Nano Chitin Particles into N-Acetylglucosamine
JPH07284397A (ja) ラミナリトリオースの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application