KR20190139787A - 미세조류로부터 특정 고분자다당류를 선택적으로 수득하기 위한 방법 - Google Patents

미세조류로부터 특정 고분자다당류를 선택적으로 수득하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류로부터 목적하는 분자량 범위의 고분자 다당류를 선택적으로 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 목적하는 분자량 범위의 고분자 다당류를 선택적으로 생산하기위한 배양조건으로서 광파장, 플라스크 내에서 고분자 다당류의 추출 위치 및 추출용매에서 에탄올의 부피비와 염화나트륨의 농도를 제시한다. 본 발명에서 생산한 고분자 다당류를 분자량에 따라 다른 목적으로 활용될 수 있다.

Description

미세조류로부터 특정 고분자다당류를 선택적으로 수득하기 위한 방법 {The method for selectively obtaining a polysaccharide of specific molecular mass derived from microalgae}
본 발명은 미세조류로부터 목적하는 분자량 범위의 고분자 다당류를 선택적으로 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 기탁번호 KCTC18684P인 Oblongichytrium 균주로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
미세조류는 바다와 민물에 서식하는 단세포 광합성 생물로서, 흔히 식물 플랑크톤이라고 불리는 생물이다.
본 발명의 미세조류는 오블롱키트리움(Oblongichytrium) 균주에 속한다.
Oblongichytrium 균주는 종래 Schizochytrium 균주와 분류학상 학술적 논란이 있었다. 그러나 최근 Oblongichytrium 균주는 18s rRNA gene sequence의 근거로 분명히 구별하여 Thraustochytriidea에서 Oblongichytriidae라는 새로운 과로 구별되고 있다.
Oblongichytrium 균주는 Schizochytrium 균주와 비슷하게 구형의 얇은 벽의 엽상체를 가지고 연속적으로 이분열을 하며, 연한 노란색의 큰 콜로니를 가진다. 지방산과 카로티노이드 프로파일을 비교하였을 때 Oblongichytrium 균주는 높은 n-3 DPA와 적은 n-6 DPA 지방산을 만들고 낮은 ARA를 생산하고 β-carotene와 canthaxanthin을 생산한다. Schizochytrium 균주의 경우는 ARA를 생산하는데 이는 불포화지방산(PUFA)의 최대 20%까지 차지하고 β-carotene을 생산하기 때문에 큰 흐릿한 노랑 콜로니를 보인다. 또한, 두 균주 모두 쌍편모의 부등 편모조류의 zoospore를 가지지만 Oblongichytrium 균주의 경우 타원체에서 길쭉한 형태를 가지고, Schizochytrium 균주의 경우 콩팥모양에서 난형 형태를 가진다.
종래 학술적 논란이 있었으나, 위와 같은 차이를 고려할 때 본 발명의 균주는 Oblongichytrium 균주로 확인되었다.
자연계에는 다양한 당류가 존재하며 그 크기와 단위 당의 수에 따라 아래 표와 같이 구분한다.
구 분 대분류 물질명
Sugars　
(1-2당류)		 Monosaccharides Glucose,　Galactose,　Fructose, Xylose
Disaccharides Sucrose,　Lactose,　Maltose, Trehalose
Polyols Sorbitol,　Mannitol
Oligosaccharides　
(3-9당류)		 Malto-oligosaccharides Maltodextrins
Other oligosaccharides Raffinose,　Stachyose, fructo-oligosaccharides
Polysaccharides　
(>9당류)		 Starch Amylose,　Amylopectin, Modified starches
Non-starch polysaccharides Cellulose,　Hemicellulose
Pectins, Hydrocolloi
독립영양과정의 산물로 생성되는 포도당 등은 대사과정에서 다양한 형태로 변환되며, 에너지원과 중요한 생체물질로서 작용한다.
자연계에 존재하는 다당류는 생화학적, 화학적 공정을 걸쳐 다양한 기능성이 부가되어 의약, 식품, 화장품 등 산업전반에 소재로 사용된다. 상업적 목적으로 생산되는 다당류는 다음 표와 같다.
구분 다당류 유래 용도
음이온계 Carboxymethyl-cellulose(CMC) 펄프, 목재 화장품, 의약품, 식품
Alginic acid 다시마, 미역 등
Pectin 사과, 귤 등 육상과일
Carrageenan 홍조류
Hyaluronic acid 박테리아, 동물세포 화장품, 의약품 식품, 건강기능식품
Chondroitin Hyaluronic acid 유도체
양이온계 Chitosan 갑각류, 키틴질의 유도체 화장품, 의약품, 식품, 산업용소재
Cationic Hydrozyethylcellulose 목재(펄프) 유도체
비이온계 Starch 감자, 옥수수, 곡물 화장품, 의약품, 식품, 산업용소재
Cyclodextrin 덱스트린으로부터 합성
Cellulose ether 목재(펄프) 유도체
조류는 육상식물의 섬유소계와는 달리 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 외에 여러 가지 다당류가 생산된다. 즉 조류에서 생산되는 다당류는 여러 종류의 당들이 복합되어 있는 것이 특징이다. 특수한 산업적 목적으로의 활용을 위해 목적에 맞는 다당류만을 선택적으로 고순도로 생산할 필요성이 높다.
최근 미세조류로부터 생산되는 다양한 기능성 소재들이 화장품에 적용되는 사례가 증가하고 있다. 특히 미세조류에서 생산되는 다당류는 그 분자량에 따라 매우 다른 물성을 가지고 있어, 그 물성에 따라 보습, 필러(충진재), 콜라겐 합성을 통한 주름개선 도움 등 다양한 목적으로 사용될 수 있는바, 화장품 원료로 사용되는 다당류의 분자량 범위는 매우 중요하다. 일례로, 화장품 원료로 빈용되는 hyaluronic acid의 경우 일반적인 화장품(스킨, 로션 등)에 이용하는 분자량 수준은 10,000 Da(Dalton) 이하 수준이며, 300,000~500,000 Da수준은 필러로 이용되고 있으며, 1,000,000 Da 수준의 분자량을 갖는 것은 관절염 치료 목적으로 사용되고 있다.
본 발명의 목적은 분자량에 따라 활용성이 달라지는 고분자 다당류를 미세조류로부터 선택적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 아래 공정을 포함하되, 배양과정 중 광질, 플라스크에서의 다당류 추출 위치, 추출용액의 에탄올 농도 및 염화나트륨의 농도 중 어느 하나 이상을 조정하는 것을 특징으로 한다.
(a) 인공해수를 함유하는 배지에 tryptone을 질소원으로하여 미세조류를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양액을 원심분리하여 1차 균체를 제거하는 단계;
(c) 상기 균체가 제거된 다당류층을 희석하여 원심분리 방법으로 2차 균체를 제거하는 단계;
(d) 균체가 제거된 상등액에 후처리 용매를 가하여 선택적으로 고분자 다당류를 추출하는 단계.
본 발명에서 미세조류는 오블롱키트리움 종(Oblongichytrium sp.)으로, 더 구체적으로는 기탁번호 KCTC18684P의 미세조류일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법에서는 미세조류 배양시 교반 속도는 400 rpm 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법에서는 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하도록 할 수 있다.
(a) 50,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 백색광
(b) 10,000 Da 이하 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 청색광
(c) 640,000 Da 이상 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 암조건
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법에서는 플라스크에서 다당류의 추출 위치 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하도록 할 수 있다.
(a) 1,500,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 상층
(b) 230 Da 이하 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 하층
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법에서는 추출용액에서 에탄올의 농도 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하도록 할 수 있다.
(a) 1,500,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:2
(b) 1,100 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:0.75
(c) 230 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:0.5
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법에서는 추출용액에서 염화나트륨의 농도 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하도록 할 수 있다.
(a) 35만 Da 이상 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 5%
(b) 230 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 10% 이상
본 발명에서는 상기의 방법으로 생산된 고분자 다당류를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 미세조류를 통해 고분자 다당류를 제조하는 방법에 대한 것으로서 원하는 분자량 범위의 고분자 다당류를 고수율로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에서 사용된 미세조류 기탁번호 KCTC18684P의 현미경 사진이다.
도 2는 기탁 균주의 18s rRNA 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 광 종류별로 균주의 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 염분의 농도별로 균주의 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 배지의 조성별로 균주의 배양 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실험예 1 : PB-55 균주의 배양
(1) PB-55 균주의 분리와 규명
켈리포니아 해안에서 채취한 PB-55 균주는 박테리아, 곰팡이 또는 효모와 같은 다른 오염 물질이 없는 무균의 단일 미세조류 확보를 위해 6 well plate 와 agar plate에 penicillin G와 streptomycin 같은 항생제를 처리한 멸균된 바닷물을 넣어 순수 분리하여 동정하였다.
순수 분리된 PB-55 균주는 인공 해수(artificial sea water, ASW)에서 agar plate 또는 Flask에 계대 배양하였다. PB-55균주를 플라스크에서 10일 이상 배양하면 배양액은 젤라틴과 같은 특성을 보였다. 배양액을 수확하여 원심분리하면 cell pellet층, 젤라틴층과 맑은 액층의 3개의 층으로 분리된다. 이 중에서 젤리틴 층만 분리하여 에탄올 처리하여 폴리사카라이드(Polysaccharide)를 분리한다.
Agar plate에 자란 PB-55 균주의 유전자 염기서열(sequence)을 분석하여 균주 기원을 규명(동정)하였다.
이때 사용된 PCR primer sequence는 Honda et al, 1999를 참고하였다.
Forward: 5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3'
Reverse: 5'-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3'.
sequence 분석결과 PB-55 균주는 Oblongichytrium sp. SEK 709의 18s rRNA sequence와 99% 일치함을 보였다.
실험예 2 : PB-55 균주를 이용하여 바이오매스 및 폴리사카라이드 (Polysaccharide) 생산성 향상을 위한 flask 배양 실험
1) Light quality(광질)에 따른 생산성 최적화 실험
PB-55균주를 이용하여 Light quality(광질)에 따른 균주 성장과 폴리사카라이드 생산성을 알아보기 위해 플라스크에 white light, blue, dark등 서로 다른 광질을 주어 실험하였다. 이때 배지로는 ASW(artificial sea water, 염분농도는 12~17g/L NaCL 수준)를 사용하였다.
실험 결과 Optical density(O.D750nm)의 경우 모든 Light quality 조건에서 약 5로 모두 동일하였으며 바이오매스(DCW)또한 약 25mg/ml로 비슷한 결과 값을 보였다.
다만, 분자량별 분포는 광조건에 따라 아래와 같이 다르게 나타났다.
구분 640,000 Da 이상 50,000 Da 수준 10,000 Da 이하
White light 10% 80% 10%
Blue light 35% 50% 15%
dark 40% 50% 10%
2) Salt concentration에 따른 생산성 최적화 실험
PB-55균주를 이용하여 염분 농도에 따른 균주 성장과 폴리사카라이드 생산성을 알아보기 위해 서로 다른 농도의 NaCl을 기존 배지에 넣어 실험하였다. 기본 ASW(artificial sea water)배지에 6g/L, 12g/L, 17g/L, 24g/L의 NaCl을 첨가하여 염분 농도를 조절하였다.
실험 결과 Optical density(O.D750nm)의 경우 최종(최고) O.D가 4.98(5.88)로 17g/L NaCl에서 가장 높았고, 12g/L NaCl에서도 3.56(5.36)으로 높은 성장을 보였다. 또한, NaCl농도가 6g/L에서 17g/L로 증가하면 균주 성장도 함께 증가하였지만 24g/L NaCl을 사용할 경우 17g/L NaCl과 비교하였을 때 균주 성장이 절반 수준으로 떨어짐을 확인하였다. 높은 염분 농도는 균주 성장에 저해를 주는 것을 알 수 있었다. 최종 바이오 메스의 경우 24g/L NaCl에서 15.6mg/ml로 가장 높았다. 하지만 초기 배양부터 6일까지 배양을 비교해 보면 O.D의 결과 값과 비슷한 경향 보였다. 배양액을 원심 분리 해였을 경우에도 사진과 같이 17g/L NaCl 농도에서 배양하였을 경우 폴리사카라이드를 조금 더 생산하는 것을 알 수 있었다.
모든 결과를 비교했을 때 PB-55균주 배양에 있어서 염분 농도는 12-17g/L NaCl이 적합함을 알 수 있었다.
실험예 3 : PB-55 균주를 이용하여 바이오매스 및 폴리사카라이드 (Polysaccharide) 생산성 향상을 위한 5L 배양 최적화 실험
발효기를 이용하여 미세조류를 배양할 경우 배양온도, pH, 교반속도, 용존 산소 농도, 빛의 세기와 같은 환경 변수들은 세포 성장에 영향을 주기 때문에 미세조류 종의 특성에 맞게 배양 온도 또는 교반속도 및 그 밖의 배양 환경을 조정해 주어야 한다.
PB-55 균주를 이용하여 세포 성장 향상에 적합한 조건과 폴리사카라이드(고분자 다당류) 대량 배양 조건을 알아내기 위해 교반 속도, impeller type 변형, 배지 조성 및 질소원 등을 변경하여 배양 최적화 실험을 실행하였다.
1) 배양기 교반 속도에 따른 생산성 최적화 실험
PB-55균주의 경우 점성이 높은 다당류의 생산에 의해 세포들이 서로 뭉쳐서 자라는 특성을 가지고 있다. 이와 같이 서로 뭉쳐 자라는 특성을 가지는 균주는 높은 교반 속도에서 스트레스를 받아 세포 성정에 저해를 받는 경우가 있으므로 균주에 따라 최적 교반속도의 영향에 대한 연구가 필요하다. 또한, 교반속도는 배양 중 산소 전달율(oxygen transfer rate)에 영향을 미칠 뿐만 아니라 배지 내에 미생물이 사용하는 각종 영양원의 교반에도 크게 영향을 미치게 된다.
PB-55 균주를 이용하여 ASW 배지에서 교반속도를 조정하며 발효 배양 실험을 수행하였고, 그 결과는 아래 표와 같다.
RPM 배양시간(H) 초기값 최종값 최고값
O.D750nm DCW(mg.ml) O.D750nm DCW(mg.ml) O.D750nm DCW(mg.ml)
100 358.20 0.303 1.3 4.1 13.0 5.2 13.0
300 358.20 0.334 2.0 4.3 12.6 7.9 13.5
400 358.20 0.312 1.8 5.5 18.0 8.5 45.0
500 358.20 0.304 2.1 6.1 20.0 7.7 23.7
실험 결과, 400 rpm의 교반속도에서 가장 우수한 배양결과를 얻었다.
2) Monosodium glutamate(MSG)의 배지 조성에 따른 생산성 최적화 실험
발효에 있어 통상적인 유기 질소원으로 MSG(Monosodium glutamate)를 사용한다. glutamate는 단백질의 필수 전구체와 뉴클레오티드 합성과 같은 질소 대사 중에서 중요한 역할을 한다. 또한 에너지 대사를 위한 기질로 호기성 해당을 활성화하며, 균주 성장에 큰 영향을 준다.
PB-55 균주를 이용하여 MSG가 균주 성장에 미치는 영향에 대해 실험을 하였다. 이때 배지는 ASW(artificial sea water)를 사용하였고, 한쪽 발효기 배지에는 MSG를 첨가하였고 다른 한쪽 발효기 배지에는 MSG를 첨가하지 않았다. 실험 결과 MSG를 첨가한 것과 첨가 하지 않은 O.D750nm는 각각 10, 9.2로 비슷했지만 DCW 최고값이 각각 19.8mg/ml, 23.8mg/ml로 배지에 MSG를 첨가하지 않은 것이 더 높게 나왔다. MSG를 배지에 첨가하지 않아도 균주 성장에 큰 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.
PB55 배양
시간
(h) 		초기 최종 (최고)
O.D 750nm DCW
(mg/ml) 		cell number
*10 6 		O.D 750nm DCW
(mg/ml) 		cell number
*10 6
ASW
(+MSG)		 365.55 0.253 1 2.68 10
(15.3)		 19.6
(19.8)		 157
(209.5)
ASW(-MSG) 437.50 0.258 0.6 4.20 9.2
(12.6)		 12.2
(23.8)		 60.5
(135)
3) 질소원에 따른 생산성 최적화 실험
일반적으로 미생물 다당류 생합성은 배지에 첨가된 탄소원에 대한 질소, 인산 또는 유황성분 등의 비율 및 환경적 인자들에 의해서 영향을 많이 받는다. 미세조류 세포 성장과 폴리사카라이드 생산을 위한 효소의 생합성에 중요한 인자로 작용하는 질소원의 영향을 보기 위하여 다음과 같은 실험 하였다.
탄소원으로 20g/L glucose를 첨가한 기본 ASW(-MSG)배지에 yeast extract와 tryptone의 최종 농도가 3g/L로 첨가하여 PB-55균주의 다당류 생산 및 균체의 증식에 미치는 영향에 대해 실험하였다. 그 결과는 아래 표와 같다.
PB55 배양
기간
(h) 		초기 최종 (최고)
O.D 750nm DCW
(mg/ml) 		cell number
*10 6 		O.D 750nm DCW
(mg/ml) 		cell number
*10 6
Yeast Extract 334.05 0.46 2.68 3.61 6.26
(8.6)		 46.1
(58.8)		 53.5
(97.5)
Tryptone 306.40 0.339 2.8 3.08 6.95(9.3) 47.9
(49.8)		 47.50
실험 결과 균체의 증식과 폴리사카라이드 생산에는 yeast extract와 tryptone 두 유기 질소원 모두 동일하였다. 하지만 최종 배양액 물성을 확인하였을 때 yeast extract를 질소원으로 사용한 배양액 보다 tryptone을 질소원으로 사용한 배양액이 더 점성이 높음을 확인하였다.
질소원은 미세조류에서 다당류를 생산할 때 필요한 인자이지만 과량을 사용할 경우 균체 외부로의 다당류 분비를 감소시킨다고 보고되었다. 질소원의 최적 농도를 알아보기 위해 trypton의 농도에 따른 배양실험을 수행한 결과는 아래 표와 같다.
Tryptone O.D 750nm (최고 수치) 비고
1g/L 7.8 배양액의 점도가 낮다
3g/L 9.3 배양액의 점도가 높다
5g/L 8.9 배양액의 점도가 높다(3g/L와 유사)
실험 결과 Tryptone의 최적 농도는 3g/L로 확인되었다.
실험예 4: PB55-5L-6th 및 flask polysaccharide 후처리
화장품 원료에 주로 사용되는 분자량 50만 Da 이하를 분획하고자 하였다. 또한 100만 Da 이상의 분자량을 가진 다당류를 제외시키고자 하였다.
1) Ethyl alcohol 희석 비율에 따른 추출 polysaccharide의 분자량 분포 조정
PB55 균주를 12일간 배양하여 생산된 다당류 배양액에서 1차 균체를 제거하기 위하여 10,000rpm으로 10분간 원심분리 한다. 1차 균체 제거 후 나온 상등액을 취하여 온수를 1:1(v/v) 섞어 희석한 후 10,000rpm으로 20분간 원심분리하여 2차 균체를 제거 한다. (현미경 관찰시 균체가 남아 있을 경우 3차 원심분리까지 한다.)
균체가 완전히 제거된 상등액을 취하여 상등액과 99.9% Ethyl alcohol을 1:0.5, 1:0.75, 1:1, 1:2 비율로 희석하여 polysaccharide 추출하였다.
그 결과 Ethyl alcohol의 비중이 높을 수로 polysaccharide 추출 되는 속도가 빨랐으며, Ethyl alcohol과 깨끗하게 분리되어 단단하게 모여 있었다.
분자량 분석 결과 Ethyl alcohol이 많이 들어 갈수록 고분자를 포함하는 polysaccharide 비율이 높아짐을 알 수 있다.
GPC 분자량 분석 결과(분자량에 따른 Area(%))
Sample name Mw
No.		 150만 1,100 230
상층 - EtOH(1:0.5)- washing - F/D sample 1 21.31 30.09 48.6
상층 - EtOH(1:0.75)- washing - F/D sample 2 32.95 37.71 29.34
상층 - EtOH(1:1)- washing - F/D sample 3 32.17 33.11 34.72
상층 - EtOH(1:2)- washing - F/D sample 4 39.97 37.16 22.86
2) 분리 위치에 따른 polysaccharide의 분자량 분포
균체가 완전히 제거된 상등액에 에탄올(99.9%)을 이용하여 polysaccharide 추출 시 에탄올 첨가 비율에 따라 생산된 polysaccharide가 위로 뜨는 부분이 있고, 바닥으로 가라앉는 부분이 있다.
사진과 같이 분리된 polysaccharide를 채취하여 동결건조 후 분자량을 분석한 결과 상층으로 뜨는 polysaccharide의 경우 고분자를 많이 함유하고 있었고, 하층으로 가라앉는 polysaccharide의 경우 저분자를 많이 함유하고 있었다.
이와 같은 방법으로 원하는 분자량을 분리해 낼 수 있다.
이는 물과 에탄올의 혼합비와 이에 따른 용해도의 변화에 따른 것으로 판단된다.
GPC 분자량 분석 결과(분자량에 따른 Area(%))
Sample name Mw
No.		 150만 38
~40만		 1,100 230 170
에탄올-상층 polysaccharide-F/D sample 1 64.46 8.36 8.3 12.15 6.73
에탄올-하층 polysaccharide-F/D sample 2 10.21 0 4.23 53.49 32.06
3) NaCl 농도에 따른 추출 polysaccharide의 분자량 분포 조정
PB55 균주를 12일간 배양하여 생산된 다당류 배양액에서 원심분리를 통해 1차 균체 제거 후 나온 상등액을 취하여 온수와 1:1(v/v) 비율로 섞어 희석한 후 10,000rpm으로 20분간 원심분리하여 2차 균체를 제거한다. 균체가 완전히 제거된 상등액에서 polysaccharide 추출 분리를 향상시키기 위해 포화 NaCl을 5%, 10%, 20%, 30%(v/v)첨가하여 실험하였다.
그 결과 5% 포화 NaCl이 포함된 배양액이 깨끗하게 분리가 되었고, 포화 NaCl이 5%이상에서는 몽글하게 분리가 되었다.
분자량 분석 결과 5% 포화 NaCl 샘플의 경우 고분자에서부터 저분자까지 고르게 분포가 되어 있고, 포화 NaCl을 5% 이상 첨가를 할 경우 저분자만 추출됨을 확인하였다.
GPC 분자량 분석 결과(분자량에 따른 Area(%))
Sample name Mw
No.		 130~160만 35~37만 230
상층:포화 NaCl(1:5%)-EtOH(1:1)-F/D sample 1 14.90 43 42.10
상층:포화 NaCl(1:10%)-EtOH(1:1)-F/D sample 2 0 0 100
상층:포화 NaCl(1:20%)-EtOH(1:1)-F/D sample 3 0 0 100
상층:포화 NaCl(1:30%)-EtOH(1:1)-F/D sample 4 0 0 100
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18684P 20180531

Claims (9)

  1. 미세조류로부터 고분자 다당류를 생산하는 방법에 있어서, 아래 공정을 포함하되, 광파장, 플라스크에서의 다당류 추출 위치, 추출용액의 에탄올 농도 및 염화나트륨의 농도 중 어느 하나 이상을 조정하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
    (a) 인공해수를 함유하는 배지에 tryptone을 질소원으로하여 미세조류를 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양액을 원심분리하여 1차 균체를 제거하는 단계;
    (c) 상기 균체가 제거된 다당류층을 희석하여 원심분리 방법으로 2차 균체를 제거하는 단계;
    (d) 균체가 제거된 상등액에 후처리 용매를 가하여 선택적으로 고분자 다당류를 추출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 오블롱키트리움 종(Oblongichytrium sp.)인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 기탁번호 KCTC18684P인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류 배양시 교반 속도는 400 rpm 인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 광파장의 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
    (a) 50,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 백색광
    (b) 10,000 Da 이하 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 청색광
    (c) 640,000 Da 이상 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 암조건
  6. 제1항에 있어서,
    상기 플라스크에서 다당류의 추출 위치 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
    (a) 1,500,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 상층
    (b) 230 Da 이하 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 하층
  7. 제1항에 있어서,
    상기 추출용액에서 에탄올의 농도 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
    (a) 1,500,000 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:2
    (b) 1,100 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:0.75
    (c) 230 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 균체 제거 후 배양 상등액 : 에탄올 부피비는 1:0.5
  8. 제1항에 있어서,
    상기 추출용액에서 염화나트륨의 농도 선택은 생산하고자 하는 고분자 다당류의 종류에 따라 아래와 같이 선택하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 선택적으로 고분자 다당류를 생산하는 방법.
    (a) 35만 Da 이상 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 5%
    (b) 230 Da 수준의 고분자 다당류 수득을 목적으로 하는 경우 10% 이상
  9. 제1항 내지 제8항의 방법으로 생산된 고분자 다당류를 포함하는 화장료 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20110122424A (ko) * 2010-05-04 2011-11-10 한국생명공학연구원 신규 유지성 미세조류 ｋｒｓ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법
KR101750948B1 (ko) * 2016-01-21 2017-06-26 한국생명공학연구원 트라우스토키트리드계 변이균주 유래의 면역활성 증진 효과가 있는 세포외 다당류 및 이의 용도
KR20180043342A (ko) * 2015-08-28 2018-04-27 앨가힐스 (에이에이치) 리미티드 미세조류로부터 푸코크산틴 및/또는 다당류를 생산하기 위한 개선된 방법

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