JPWO2005083101A1 - 長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含むリン脂質の製造方法、およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明にかかるリン脂質は、LCPUFAを構成要素として含む脂質を生産する脂質生産菌を出発原料として、LCPUFAを構成要素として含むリン脂質(LCPUFA−PL)であり、本発明にかかるリン脂質の製造方法(以下、単に製造方法と略す場合がある)は、当該LCPUFA−PLを製造する方法であるが、特に、本発明では、脂質生産菌菌体からトリグリセリド(TG)を含む油脂を抽出した後の脱脂菌体から、リン脂質(PL)を抽出するPL抽出工程を少なくとも含んでいる。
本発明において出発原料となる脂質生産菌は、LCPUFA−PLを生産し得る微生物であれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば、モルティエレラ(Mortierella)属、コニディオボラス(Conidiobolus)属、フィチウム(Pythium)属、フィトフトラ(Phytophthora)属、ペニシリューム(Penicillium)属、クラドスポリューム(Cladosporium)属、ムコール(Mucor)属、フザリューム(Fusarium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、エントモフトラ(Entomophthora)属、エキノスポランジウム(Echinosporangium)属、サプロレグニア(Saprolegnia)属等を挙げることができる。
本発明では、上述したLCPUFA−PLを生産し得る微生物(脂質生産菌)を培養し、十分な量の菌体を取得すればよい。したがって、本発明にかかる製造方法には、脂質生産菌を培養する脂質生産菌培養工程が含まれていてもよい。
本発明では、上記脂質生産菌培養工程により集菌された菌体に対して、先に油脂抽出工程を行ってからPL抽出工程を行う。この油脂抽出工程は、集菌された菌体から脱脂菌体(微生物菌体残渣)を製造するための工程であって、当該菌体からトリグリセリド等の油脂を抽出して除去する。この工程では、LCPUFA−PLのほとんどを残存させたまま、PL以外の脂質の全部または一部を除去することになる。換言すれば、油脂抽出工程は、PL抽出工程の前処理となる。ただし、このとき抽出されるトリグリセリド等の油脂には、構成要素としてLCPUFAが含有されているので、当該油脂は、LCPUFAを含有する油脂として高い商品価値を有する。
本発明にかかる製造方法では、脱脂菌体からPLを抽出するPL抽出工程を必須の工程として有する。このPL抽出工程において、脱脂菌体からPLを抽出する方法は特に限定されるものではないが、上記油脂抽出工程と同様に抽出媒による抽出を用いることが好ましい。
本発明にかかる製造方法では、上述したように、少なくともPL抽出工程を含んでいればよく、好ましくは油脂抽出工程を含んでいるが、これら以外の工程を含んでいてもよい。その他の工程としては、具体的には、例えば、前述したような集菌工程や菌体加工工程等を挙げることができる。他にも、後述する実施例にも示すように、PL抽出工程で得られたPLを精製するPL精製工程等を挙げることができる。
本発明にかかるリン脂質(PL)は、上述した製造方法により製造されるリン脂質である。換言すれば、本発明にかかるリン脂質は、脂質生産菌菌体からTGを含む油脂を抽出した後の脱脂菌体から抽出されてなるリン脂質であり、LCPUFAを構成要素として含むものである。
本発明にかかる脂質組成物は、本発明にかかるリン脂質を含むものであればよく、その組成や状態等は特に限定されるものではないが、一つの好ましい組成として、溶媒である液状脂質に対して、溶質として少なくともLCPUFA−PLを溶解しており、上記液状脂質として、LCPUFAを構成要素として含む脂質(LCPUFA脂質)が用いられる組成を挙げることができる。すなわち、本発明にかかる脂質組成物の一例としては、LCPUFA−PLを液状のLCPUFA脂質に溶解させた「リン脂質溶液」となっている構成を挙げることができる。
リン脂質は、高度に精製すると粉末状であり、一般的に、きわめて吸湿性が高く、また分解しやすい(生化学実験講座3 脂質の科学 p22−23 東京化学同人(1974)参照)。そのため、取扱性を向上させるために、少量の液状脂質を溶媒として、これにリン脂質を溶解させて用いる(リン脂質溶液として用いる)ことが多い。このとき溶媒として用いられる液状脂質としては、トリグリセリド(TG)等が好ましく用いられる。
上記リン脂質溶液の溶媒として用いる液状のLCPUFA脂質としては、特に限定されるものではないが、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪酸、脂肪酸アルコールエステル等を挙げることができる。また、LCPUFA脂質の構成要素として含まれるLCPUFAとしては、前記<本発明にかかるリン脂質>の項で説明した各LCPUFAを挙げることができる。なお、上記のように、LCPUFA脂質としては、脂肪酸そのものを用いることができるので、液状のLCPUFAそのものをLCPUFA脂質として用いることができる。
上記脂質組成物の製造方法は特に限定されるものではなく、本発明にかかるリン脂質の製造方法で得られたリン脂質を液状のLCPUFA脂質に溶解し、必要に応じてその他の成分を添加して溶解または分散させればよい。換言すれば、本発明にかかる脂質組成物の製造方法は、上記PL抽出工程を少なくとも含み、さらに、当該PL抽出工程で得られたLCPUFA−PLを含むPLを、LCPUFA脂質に溶解させてリン脂質溶液を調製する溶液調製工程を含んでいればよい。
本発明の利用方法は特に限定されるものではないが、代表的なものとしては、本発明にかかるリン脂質または脂質組成物を、LCPUFA−PLを補給するための栄養組成物として用いる用途が挙げられる。栄養組成物の使用対象となる生物は特に限定されるものではなく、どのような生物であってもよいが、代表的にはヒトであり、それ以外には、家畜動物や実験動物等を挙げることができる。栄養組成物はどのような形でも摂取することができるが、経口摂取する方法が最も好ましい。したがって、本発明には、上記リン脂質または脂質組成物を含有する食品も含まれる。
乾燥菌体および脱脂菌体の製造例1で用いた種培地Aは、その組成は酵母エキス1%、グルコース2%、残部水であり、pH6.3とした。同じく種培地Bは、その組成は酵母エキス1%、グルコース2%、大豆油0.1%、残部水であり、pH6.3とした。
脂質生産菌として、アラキドン酸含有リン脂質生産菌としてモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)CBS754.68を用いた。このCBS754.68の保存菌株を、種培地Aに接種し、往復振盪100rpm、温度28℃の条件にて種培養(第一段階)を開始し、3日間培養した。次に、30Lの種培地Bを50L容通気攪拌培養槽内で調製し、これに種培養液(第一段階)を接種して、攪拌回転数200rpm、温度28℃、槽内圧150kPaの条件にて、種培養(第二段階)を開始し、2日間培養した。
容積10Lの通気攪拌培養槽に5Lの本培地Dを仕込んで滅菌し、脂質生産菌としてアラキドン酸を生産する糸状菌モルティエレラ・ポリセファラ(Mortierella polycephala)IFO6335を植菌し、温度26℃、通気量1vvm、攪拌回転数300rpmで、9日間培養した。グルコース消費に応じて適宜1%相当のグルコースを流下した。得られた培養菌体を実施例1と同様にして滅菌し、培地を除去した後に実施例1同様にして乾燥させ、乾燥菌体を得た。
脂質生産菌として、ジホモ−γ−リノレン酸(DGLA)を生産する糸状菌モルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elongata)SAM1860(ブダペスト条約に基づく国際寄託番号FERMBP−3589)を植菌した以外は実施例2と同様にして脱脂菌体Cを得た。
脂質生産菌として、ミード酸を生産する糸状菌モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)SAM2086(ブダペスト条約に基づく国際寄託番号FERMBP−15766)を植菌した以外は実施例2と同様にして脱脂菌体Dを得た。
脂質生産菌として、アラキドン酸を生産する糸状菌エキノスポランジウム・トランスバーサリス(Echinosporangium transversalis)ATCC16960を植菌した以外は実施例2と同様にして脱脂菌体Eを得た。
培養時間を6日間とした以外は製造例2と同様にして、モルティエレラ・ポリセファラ(M.polycephala)IFO6335の乾燥菌体を得た。また、乾燥菌体を20g、加えるヘキサンの量を何れも60mLとした以外は、製造例2と同様にして、モルティエレラ・ポリセファラ(M.polycephala)IFO6335の脱脂菌体Fを得た。
培養時間を6日間とした以外は製造例5と同様にして、エキノスポランジウム・トランスバーサリス(E.transversalis)ATCC16960の乾燥菌体を得た。また、乾燥菌体を20g、加えるヘキサンの量を何れも60mLとした以外は、製造例2と同様にして、エキノスポランジウム・トランスバーサリス(E.transversalis)ATCC16960の脱脂菌体Gを得た。
乾燥菌体および脱脂菌体の製造例1で得られた1gの脱脂菌体A−2に対して、抽出媒として種々の有機溶媒25mLを加え60℃で1時間緩やかに攪拌した。抽出媒としては、ヘキサン、ヘキサン/エタノール混合溶媒a〜e、エタノール、クロロホルム/メタノール混合溶媒を用いた。これら抽出媒の組成(混合体積比)を表1に示す。
乾燥菌体および脱脂菌体の製造例1で得られた200gの脱脂菌体A−1〜A−4それぞれに対して、1:1の体積混合比のヘキサン/エタノール混合溶媒1Lを加え、60℃で90分間緩やかに攪拌した。溶媒層を濾過した後、再び同じ操作をさらに2回繰り返した。その後、溶媒層を全て回収し、溶媒を留去することにより、粗リン脂質画分を得た。得られた粗リン脂質画分は、実施例1と同様に、シリカゲルTLCにて、TGおよびPLに分画し、脂肪酸の定性および定量を行った。定性および定量の結果を表3に示す。なお、表3中の重量は全て脱脂菌体1g当たりの量を示す。
乾燥菌体および脱脂菌体の製造例2〜5で得られた5gの脱脂菌体B〜Eそれぞれに対して、1:1の体積混合比のヘキサン/エタノール混合溶媒25mLを加え、60℃で90分間緩やかに攪拌した。溶媒層を濾過した後、再び同じ操作をさらに2回繰り返した。その後、溶媒層を全て回収し、溶媒を留去することにより、粗リン脂質画分を得た。得られた粗リン脂質画分は、実施例1と同様に、シリカゲルTLCにて、TGおよびPLに分画し、脂肪酸の定性および定量を行った。定性および定量の結果を表5に示す。なお、表5中の重量は全て脱脂菌体1g当たりの量を示す。
乾燥菌体および脱脂菌体の製造例6・7で得られた10gの脱脂菌体F・Gそれぞれに対して、1:1の体積混合比のヘキサン/エタノール混合溶媒50mLを加え、60℃で90分間緩やかに攪拌した。溶媒層を濾過した後、再び同じ操作をさらに2回繰り返した。その後、溶媒層を全て回収し、溶媒を留去することにより、粗リン脂質画分を得た。
ゼラチン(新田ゼラチン社製)と食品添加用グリセリン(花王社製)とを重量比100:35となるように混合して水を加え、50〜60℃の温度範囲で溶解させ、粘度2000cpのゼラチン被膜を調製した。
実施例2で脱脂菌体A−2から得られた粗リン脂質画分を、60℃で5〜30分間、混合分散装置(エムテクニック社製,商品名:クレアミックス)を用いて水中で攪拌することにより、水中に均一に分散してリポソーム分散液を得た。当該リポソーム分散液中のリン脂質の濃度は0.1〜20%で自由に制御可能であった。
〔特許文献1〕
特開2003−48831号公報(2003年(平成15)2月21日公開)
〔特許文献2〕
特開平11−35587号公報(1999年(平成11)2月9日公開)
〔特許文献3〕
特開平8−59678号公報(1996年(平成8)3月5日公開)
〔非特許文献1〕
G. Toffano et al., Nature Vol.260 p331-333(1976)
〔非特許文献2〕
G. Toffano et al. Clinical Trial Journal Vol.24 p18-24(1987)
〔非特許文献3〕
今泉勝巳、臨床栄養、第67巻、p119(1985)
〔非特許文献4〕
矢澤一良ら、油科学、第44巻、p787-793(1995)
〔非特許文献5〕
S. Jareonkitmongkol et al., Apple Environ Microbiol Vol.59 p4300-4304(1993)
〔非特許文献6〕
油脂・油糧ハンドブック p178-184 幸書房(1988)
Claims (36)
- 長鎖高度不飽和脂肪酸(LCPUFA)を構成要素として含む脂質を生産する脂質生産菌を出発原料として、LCPUFAを構成要素として含むリン脂質(LCPUFA−PL)を製造するリン脂質の製造方法であって、
上記脂質生産菌菌体からトリグリセリド(TG)を含む油脂を抽出した後の脱脂菌体から、リン脂質(PL)を抽出するPL抽出工程を含むことを特徴とするリン脂質の製造方法。 - さらに、上記PL抽出工程の前段で実施され、上記脂質生産菌菌体からTGを含む油脂を抽出するとともに脱脂菌体を得る油脂抽出工程を含むことを特徴とする請求の範囲1に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記脂質生産菌として、モルティエレラ(Mortierella)属、コニディオボラス(Conidiobolus)属、フィチウム(Pythium)属、フィトフトラ(Phytophthora)属、ペニシリューム(Penicillium)属、クラドスポリューム(Cladosporium)属、ムコール(Mucor)属、フザリューム(Fusarium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、エントモフトラ(Entomophthora)属、エキノスポランジウム(Echinosporangium)属、およびサプロレグニア(Saprolegnia)属から選択される少なくとも1種が用いられることを特徴とする請求の範囲1または2に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記脂質生産菌としてモルティエレラ属が用いられる場合、当該モルティエレラ属の菌がモルティエレラ亜属であることを特徴とする請求の範囲3に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記モルティエレラ亜属の菌がモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)であることを特徴とする請求の範囲4に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記PL抽出工程では、上記脱脂菌体からPLを抽出するための抽出媒として、脂肪族系有機溶媒および水の少なくとも何れかの抽出液、または、超臨界炭酸ガスを用いることを特徴する請求の範囲1ないし5の何れか1項に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記脂肪族系有機溶媒として、飽和炭化水素、アルコール、飽和炭化水素とアルコールとの混合溶媒、または、ハロゲン化炭化水素とアルコールとの混合溶媒が用いられることを特徴とする請求の範囲6に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記抽出液として、ヘキサン、エタノール、メタノール、含水エタノール、イソプロピルアルコール、アセトンの少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲6または7に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記抽出液として、ヘキサンおよびエタノールの混合溶媒が用いられることを特徴とする請求の範囲8に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記ヘキサンおよびエタノールの混合溶媒においては、ヘキサン:エタノールの混合比が、体積比で、4:1〜0:6の範囲内にあることを特徴とする請求の範囲9に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記油脂抽出工程では、加圧による圧搾抽出、レンダリングによる抽出、および抽出媒による抽出の少なくとも何れかにより、上記脂質生産菌菌体から油脂を抽出することを特徴とする請求の範囲1ないし10の何れか1項に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記抽出媒として、脂肪族系有機溶媒および水の少なくとも何れかの抽出液、または、超臨界炭酸ガスを用いることを特徴する請求の範囲11に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記脂肪族系有機溶媒として、ヘキサンが用いられることを特徴とする請求の範囲12に記載のリン脂質の製造方法。
- 上記油脂抽出工程で用いられる脂質生産菌菌体が乾燥菌体であることを特徴とする請求の範囲2ないし13の何れか1項に記載のリン脂質の製造方法。
- 請求の範囲1ないし14の何れか1項に記載のリン脂質の製造方法により製造されるリン脂質。
- 構成要素として含まれるLCPUFAが、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、ドコサトリエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサジエン酸、テトラコサトリエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、およびテトラコサヘキサエン酸から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求の範囲15に記載のリン脂質。
- 上記LCPUFAの分子中に含まれる炭素−炭素二重結合のうち、少なくとも1つが共役二重結合となっていることを特徴とする請求の範囲16に記載のリン脂質。
- 上記LCPUFAには、アラキドン酸および/またはドコサヘキサエン酸が含まれることを特徴とする請求の範囲16または17に記載のリン脂質。
- 全てのLCPUFA−PLの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるアラキドン酸の含有率が20重量%以上であることを特徴とする請求の範囲18に記載のリン脂質。
- 上記LCPUFA−PLとして、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、およびカルジオリピンから選択される少なくとも1種のグリセロリン脂質を含むことを特徴とする請求の範囲16ないし19の何れか1項に記載のリン脂質。
- LCPUFA−PLとして少なくともホスファチジルコリンが含まれているとともに、全てのホスファチジルコリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるアラキドン酸の含有率が15重量%以上であることを特徴とする請求の範囲20に記載のリン脂質。
- LCPUFA−PLとして少なくともホスファチジルセリンが含まれているとともに、全てのホスファチジルセリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるアラキドン酸の含有率が5重量%以上であることを特徴とする請求の範囲20に記載のリン脂質。
- 長鎖高度不飽和脂肪酸(LCPUFA)を構成要素として含むリン脂質(LCPUFA−PL)であって、
当該LCPUFA−PLとして少なくともホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンが含まれており、かつ、LCPUFAとして少なくともアラキドン酸が含まれているとともに、
全てのホスファチジルコリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるアラキドン酸の含有率が40重量%以上であり、かつ、全てのホスファチジルセリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるアラキドン酸の含有率が20重量%以上であることを特徴とするリン脂質。 - さらに、上記LCPUFA−PLとして、少なくともジホモ−γ−リノレン酸がLCPUFAとして含まれているホスファチジルコリンが含まれているとともに、
全てのホスファチジルコリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるジホモ−γ−リノレン酸の含有率が3重量%以上であることを特徴と請求の範囲23に記載のリン脂質。 - さらに、上記LCPUFA−PLとして、少なくともジホモ−γ−リノレン酸がLCPUFAとして含まれているホスファチジルセリンが含まれているとともに、
全てのホスファチジルセリンの構成要素として含まれる総脂肪酸中におけるジホモ−γ−リノレン酸の含有率が1重量%以上であることを特徴とする請求の範囲23または24に記載のリン脂質。 - 請求の範囲1ないし14の何れか1項に記載のリン脂質の製造方法におけるPL抽出工程を少なくとも含むとともに、
当該PL抽出工程で得られたLCPUFA−PLを含むPLを、LCPUFAを構成要素として含む液状脂質に溶解させてリン脂質溶液を調製する溶液調製工程を含むことを特徴とする脂質組成物の製造方法。 - さらに、上記油脂抽出工程を含むとともに、当該油脂抽出工程で得られた油脂を上記液状脂質として用いることを特徴とする請求の範囲26に記載の脂質組成物の製造方法。
- 油脂抽出工程における油脂の抽出量を抑制することにより、PL抽出工程にて、LCPUFA−PLを上記液状脂質に溶解させた脂質組成物として抽出することを特徴とする請求の範囲27に記載の脂質組成物の製造方法。
- 請求の範囲26、27または28に記載の脂質組成物の製造方法により製造され、少なくともLCPUFA−PLおよびLCPUFAを構成要素として含む液状脂質とを含むことを特徴とする脂質組成物。
- 上記液状脂質における総脂肪酸中に占めるLCPUFAの割合が11重量%以上であることを特徴とする請求の範囲29に記載の脂質組成物。
- 請求の範囲15ないし25の何れか1項に記載のリン脂質を含む脂質組成物。
- 栄養組成物として用いられることを特徴とする請求の範囲29、30または31に記載の脂質組成物。
- カプセル状または錠剤状に加工されていることを特徴とする請求の範囲29ないし32の何れか1項に記載の脂質組成物。
- 請求の範囲29ないし33の何れか1項に記載の脂質組成物を含有する食品。
- リン脂質によりリポソーム化された水中油滴型の分散液を含むことを特徴とする請求の範囲34に記載の食品。
- 栄養補助食品であることを特徴とする請求の範囲34または35に記載の食品。
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