DK144069B - Fremgangsmaade til fremstilling af et proteinholdigt materiale - Google Patents

Description

f ® o« DANMARK ^

|P (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 1 i+/+06 9 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2323/71 (51) lnt.CI.3 C 12 M 1/1A

(22) Indleveringsdag 13· maj 1971 (24) Løbedag 13· maj 1971 (41) Aim. tilgængelig 15. nov. 1971 (44) Fremlagt 30 . nov. 1 981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) S ta mansøgning nr. -

(30) Prioritet 14. maj 1970, 23452/70, GB 24. jun. 1970, 30584/70, GB

(71) Ansøger RANKS HOVIS MCDOUGALL LIMITED, London S.W.1V 3JL, GB.

(72) Opfinder Gerald Lionel Solomons, GB: Gerald William Scammell, GB.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et protelnholdigt materiale.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et proteinholdigt materiale ved dyrkning af en ikke-toxisk stamme af slægten Fusarium under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og phosphor og ved fraskillelse af den dannede organisme indeholdende et proteinholdigt materiale fra dyrkningsmediet.

En fremgangsmåde af denne art er omtalt i beskrivelsen til USA-patent nr. 3.151.038.

jj Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe et protein- ID holdigt materiale, som har en stor nettoproteinudnyttelsesværdi ved ^ rotteforsøg, nemlig på mindst 70 baseret på a-aminonitrogen.

3" Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et proteinholdigt stof, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en stamme af Fusarium £ 3 2 U4069 graminearum Schwabe, som er deponeret ved Commonwealth Mycological Institute under deponeringsnummeret I.M.I. 145425 eller en af varianterne 1-7j 1-8, 1-9, 1-15 eller I-l6 af denne stamme, som er deponeret under deponeringsnumrene I.M.I. 15209, I.M.I. 154211, I.M.I. 154212, I.M.I. 154213 henholdsvis I.M.I. 154210, og at carbonkilden i form af assimilerbart carbonhydrat anvendes som begrænsende substrat.

Dyrkningsmediet skal som nævnt indeholde en assimilerbar kilde for carbon. Eksempler på en sådan kilde for carbon er stivelse, stivelsesholdige materialer eller hydrolyseprodukter heraf, saccharose, saccharoseholdige materialer eller hydrolyseret saccharose, d.v.s. invertsukker eller blandinger heraf. Substratet kan også omfatte hydrolyseret kartoffelstivelse, melasse, glukose, hydrolyseret bønnestivelse eller cassava. Et substrat af animalsk oprindelse indeholdende valle kan også anvendes.

Den nye stamme Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425 er ikke-patogen overfor hvede. Den har følgende morfologiske egenskaber:

Kartoffelsaccharose- Czapek-Dox (modifi- . ,. agar (PSA) ceret)

Medier _ ___ Agar (oxoid) (CDA) 250 g kartofler vaskedes og blev skåret i skiver for derpå at blive anbragt i en trykkoger under et tryk på 2,05 kg/cm2 i 15 minutter. Udkoget presses dernæst mellem to lag musselin. 2% glukose og 2% agar sættes til det uklare filtrat, og mediet autoklaveres og disper-geres.

Vækstbetingelser. 25°C, adskillige uger.

Væksthastighed: 4,0 cm i 3 dage 3,0 cm i 3 dage Vækstkarakter: Fnuggede udspredende kolonier med hvidt luftmycelium. Underliggende lag på PSA grå-rosa med pletter, som er højrøde til gule. Tendens til at være noget blegere på CDA. Undertiden dannes dybtrødt pigment specielt ved ældning. Efter 1-2 ugers forløb har luft- 144069 3 myceliet tendens til at blive brunt og falde sammen. Kolonien bliver derpå ret slimet, efterhånden som der dannes sporo-dochia, farven bliver lyserød til brun på PSA og lakserød på CDA. Der dannes ikke ekssudat, og pigmentdannelsen har tendens til at følge myceliefarven.

Konidier: Mikrokonidier dannes ikke at denne organis me. Makrokonidier dannes af enkelte laterale phialider eller flergrenede konidiophore med korte phialider. I ældre kulturer aggregerer konodiophorerne til dannelse af sporodochia specielt på CDA. Konidierne varierer fra seglformede til kurvede tenformede og uenssidede. Tværdelingen varierer fra 3 til 5, almindeligvis 5 i yngre kulturer.sporestørrelsen varierer mellem 25-50 μ x 2,5 μ-4,0 μ.

Fodcellen er ofte stilket, specielt i de længere fem tværdelte sporer. Opsvulmede celler forekommer i myceliet og undertiden forekommer der chlamydosporer indskudt enkeltvis eller i kæder.

I det følgende er der givet en beskrivelse i form af et eksempel af fremstillingen af varianterne (eller isolater) af Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425 og disses morfologiske egenskaber.

Isolater fremstillet af en kontinuerlig kultur.

Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 15^209-15^213 udvalgtes fra maltekstrakt agarplader podet med dyrkningsvæske fra et dyrkningsapparat, hvori der dyrkedes Fusarium graminearum Schwabe 145245 på et glukose-salt medium ved 30°C under kontinuerlige dyrkningsbetingelser med carbonbegrænsning og med en fortyndingshastighed på 0,1-0,15 pr. time. Der blev udtaget prøver fra dyrkningsapparatet med ca. 100 timers intervaller for at efterprøve populationen af varianter, og isolaterne I.M.I. 154209 til 154213 blev udtaget fra pladerne fremstillet på basis af prøven, der blev udtaget efter 1100 timers forløb. Under de skitserede betingelser begynder varianterne at forekomme på pladerne fra et tidsrum på 800 timer og fremefter. De dannes kontinuerligt fra dette tidspunkt, og populationen ændres langsomt med hensyn til procentdelen af hver type. Betingelserne i dyrkningsapparatet er følgende: 4 144069

Opløsning 1. Dyrkningsmedium %

Glukose 3,0

Ammoniumsulfat 0,25

Kaliumdihydrogenphosphat 0,30

Magnesiumsulfat , 0,025

Antiskum, polypropylenglykol 2000, steriliseret ved pH

3.0 i 30 minutter og ved et tryk på 2,0 kg/cm2 0,01

Opløsning 2. MnSO^, 4H20 0,0005

FeSOjj, 7H20 0,0005

ZnSOjj, 7H20 0,0005

CoCl2, 6h20 0,0001

CuSOij, 5H20 0,0001

Na2MoO|j, 2H20 0,0001

Steriliseret ved 15 minutter ved et tryk på 2.0 kg/cm2.

Opløsning 3» Biotin 0,10 eller 20 mikrogram/ 1

Cholin 0,1 eller 2 mg/1

Methionin 0 eller 600 mg/1

Steriliseret separat ved filtrering.

Alle opløsninger tilsattes om nødvendigt aseptisk til den beholder, hvori mediet opbevaredes, og førtes dernæst til en 8,5 liters chemostat, hvori der opretholdtes følgende vækstbetingelser:

Temperatur: 30°C, gennemluftning: 1 volumenenhed pr. volumenenhed pr.

minut, omrøring: 800 omdrejninger pr. minut med en enkelt β-bladet skiveturbine, 0,5D i et dyrkningsapparat med skvulpeplader. pH-værdien i dyrkningsapparatet holdtes på 5,0 ved automatisk tilsætning af sterilt ammoniak. Sammensætningen af opløsning 3 ændredes på forskellige tidspunkter for at bestemme ymax med hensyn til de forskellige tilsætninger, såsom biotin alene eller biotin plus cholin. Væksthastighed: 0,1-0,15 pr. time.

De fem isolater havde følgende morfologiske egenskaber: 5 1U069

Medier Kartoffelsaccharose- Czapek Dox agar _ agar____ (Oxoid)_ 250 g kartofler vaskedes og blev skåret i skiver for derefter at blive anbragt i en trykkoger med et tryk på 2,0 kg/cm2 i 15 minutter. Udkoget pressedes dernæst gennem to lag musselin. 2% glukose, og 2% agar sattes til det uklare filtrat, og mediet autoklaveredes og dispergeredes.

Vækstbetingelser: 25°C.

Karakter af væksten:

Isolat 1-7.

Kolonimorfologien svarede til morfologien for I.M.I. 145425, dog med den undtagelse, at kolonidiameteren var mindre, idet den var 1,5 cm i 3 dage ved 30°Cpå CDA. Det fnuggede luftmycelium varierede fra koloni til koloni,men var mindre end for 1-8.Ældre kulturer har en brun misfarvning på myceliet. Bagsiden, gulbrune til grårpsa sektorer med nogen pigmentspredning,

Isolat 1-8.

Meget intenst hvidt fnugget luftmycelium. Kolonidiameteren var igen mindre end for I.M.I. 145425, 2,0 cm i 3 dage ved 30°C på CDA. Bagsiden, lakserøde til grårosa segmenter.

Isolat 1-9.

Makroskopisk udseende, som svarede tæt til udseendet for 1-8, men bagsiden lysere, laksefarvet til glasklar.

Isolat 1-15.

Små begrænsede kuppelformede kolonier. Myceliet kort, filtret og med tendens til sammenrulning. Mange dannede sporodochia-lignende strukturer gav lyserødt udseende ved stregpodningspunkt. Lyserød farvning ved periferien. Kolonidiameterne kun 0,4 cm efter 3 dage ved 30°C på CDA.

Isolat 1-16.

Isolat 1-15 er meget ustabilt og giver kontinuerligt anledning til dannelse af I-l6. Dette isolat har et udseende svarende 6 144069 til udseendet af 1-7, selv om kolonierne har tendens til at have en lidt større diameter, 2,4 cm i 3 dage og har mere ensartet udseende. 1-16 er mere stabilt end 1-15.

Konidier.

Isolat 1-7.

Rigelige mængder makrokonidier dannes på lignende måde som med I.M.I. 145425. Sporodochia dannedes i ældre kulturer. Individuelle makrokonidier svarende til makrokonidier hos I.M.I. 145425 i form og størrelse, 25-50 μ x 3,0-5,0 μ. I ældre kulturer dannes mange sporodochia. Chlamydosporer er også rigelig i mængde i myceliet i dette isolat, indskudte og endestillede. De er kugleformede glatte med en størrelse på 10-12 y. Undertiden danner en enkelt celle af et makro-konidium en chlamydospore.

Isolat 1-8.

Færre makrokonidier end for 1-7, og de tilstedeværende er hovedsagelig mindre og simplere, 1-3 tværdelinger, længde 25“35 y· Der dannes få sporodochia. Antal af chlamydosporer er igen rigeligt, såvel indskudte, endestillede, enkelte og i kæder.

Isolat 1-9.

Svarer meget nær til 1-8 med undtagelse af, at der er flere makrokonidier, næsten det samme antal som for 1-7.

Isolat 1-15.

Meget få makrokonidier, strukturerne af sporodochia-typen er i realiteten dannet af bundter af chlamydosporer. Der er også mange chlamydosporer til stede i myceliet. Makrokonidierne er mindre end i I.M.I. 145425, 30-35 y x 4 y med kun 2 tværdelinger.

Isolat 1-16.

Svarer meget nær til 1-7 med rigelig mængde makrokonidier og chlamydosporer. Makrokonidierne er typiske, 30-45 y x 4 y.

Dyrkningstemperaturen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er almindeligvis mellem 25 og 34°C, fortrinsvis omkring 30°C.

Podningen, som resulterer i igangsætningen af processen, udføres bedst ved et forspiringspodetrin, hvorved der f.eks. anvendes fra 2 til 10% podemateriale, almindeligvis mellem 5 og 10%.

pH-værdien for dyrkningsmediet under dyrkningen holdes 7 1A4Q69 fortrinsvis indenfor et passende område, som fremmer en maksimal vækst, f.eks. mellem 3»5 og 7.

Dyrkningstiden for en batch-kultur under ovennævnte betingelser ligger almindeligvis mellem 20 og 48 timer. Både ved batch-og kontinuerlige processer bør der gennemføres en gennemluffning qg omrøring for at tilvejebringe et tilstrækkeligt højt niveau af opløst oxygen til at overvinde en mangel, som kan være en begrænsende vækstfaktor.

Der opretholdes tilstrækkelige mængder af essentielle vækstnæringsstoffer, såsom nitrogen, svovl, phosphor og andre spor- . grundstoffer i dyrkningsmediet, således at dyrkningen kun begrænses af carbonhydratet, som er tilgængeligt for svampen,

Udover de ovenfor nævnte næringsstoffer kan tilstedevær reisen af en eller flere vitaminer, som f.eks. biotin, være ønskelige for at opretholde en maksimal væksthastighed.

Det er også ønskeligt at sætte et ikke-toksisk antiskum-memiddel til dyrkningsmediet for at regulere skumningen under dyrkningen.

Det materiale, som dannes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan isoleres ved kendte fremgangsmåder. Det dannede mycelium kan således udvindes ved fraskillelse, udvaskning, filtrering og tørring. I den forbindelse har det imidlertid vist sig, at såfremt fugtighedsindholdet i materialet reduceres under en kritisk værdi på ca. 50/5 (vægt/vægt) ved filtrering under tryk, er den efterfølgende tørring ikke underkastet sådanne strenge temperaturbegrænsninger, som er en vigtig faktor ved en økonomisk behandling af materialerne. Tørremetoden må ikke resultere i en nedsættelse af næringsværdien af myceliet og kan være en tørring i en strøm af luft ved 75°C eller en frysetørring.

Svampemyceliet, som dannes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, udviser en god vandbindingskapacitet og kan være anvendelig som et fortyknings- og geldannelsesmiddel. Nærværende patent omfatter ikke fremgangsmådens anvendelse ved tilvirkning af næringsmidler.

Opfindelsen skal herefter beskrives nærmere ved hjælp af eksempler på fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I eksemplerne 1-4 anvendes batch-dyrkninger.

8 1A4069

Eksempel 1 10 liter af følgende dyrkningsmedium fremstilledes og steriliseredes som beskrevet i et med omrører forsynet dyrkningsapparat.

Sukkerrørmelasse til opnåelse af 6# vægt/volumen sukker

Ammoniumsulfat 1,2#

NaH2P0I( 0,25$

Steriliseret i 30 minutter ved et tryk på 2,0 kg/cm^

CaCO^ 0,5# vægt/volumen

Steriliseret i 3 timer ved et tryk på 2,0 kg/cm2.

Mediets bestanddele tilsattes aseptisk, og temperaturen indstilledes på 30°C. Et podemateriale svarende til 5-10# på volumenbasis af kulturmediet og dyrket enten på glukose-majsstøbevæske eller andre passende materialer i rysteflasker tilførtes med en sporesuspension af organismen Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425, og dyrkedes i 18-24 timer ved 30°C i et roterende rysteapparat samt sattes aseptisk til dyrkningsapparatet.

Dyrkningsapparatet holdtes på 30°C, og der foretoges en omrøring med en omrøringshastighed på 800 omdrejninger pr. minut med en 6-bladet pladeturbine (0,5D) i en beholder med skærmplader og under gennemføring af steril luft i en mængde på 1 volumenenhed pr. volumenenhed pr. minut. Efter 35 timers forløb fjernedes det dannede mycelium fra dyrkningsapparatet, centrifugeredes, vaskedes med vand og tørredes i et båndtørreapparat med varm luft med en lufttemperatur på 75°C.

Det tørrede produkt havde følgende sammensætning:

Total nitrogen 8,0#

Aske 5,3#

Lipider 2,7% NPUop. 52 baseret på total nitrogen.

Eksempel 2 10 liter af følgende dyrkningsmedium fremstilledes og steriliseredes som beskrevet i et l4-liters New Brunswick, Microferm-dyrkningsapparat.

4__ 9 144069

Slutværdi, %

Opløsning 1 Glukose pH 3,0 3,0

Opløsning 2 Ammoniumsulfat 0,7

Opløsning 3 Kaliumdihydrogen- phosphat pH 5,0 1,0

Opløsning k FeSO^, 7H20 pH 2,5 0,001

MnSOjj, HH20 0,0005

CuSO^, 5H20 0,0001

MgSOjj, 7H20 0,025

Opløsning 5 Na2MoOi), 2H20 0,0001

CoCl, 6H20 0,0001

CaCl2, 2H20 0,0015

Opløsning 6 NaOH 0,1.

Alle de ovenfor nævnte opløsninger steriliseredes i varme i 15 minutter ved et tryk på 2,5 kg/cm2.

Opløsning 7 Vitaminer og/eller aminosyrer, som beskrevet nedenfor, steriliseredes ved filtrering.

Opløsningerne sattes aseptisk til beholderen.

Der dyrkedes et podemateriale, og dette tilsattes som i eksempel 1 med undtagelse af, at slutkoncentrationen i dyrkningsappa-ratet indstilledes således, at der opnåedes en koncentration på 0,5 g mycelium på tørvægtbasis pr. liter.

Dyrkningsbetingelserne var en temperatur på 30°C og en gennemluftning på 1 volumenenhed pr. volumenenhed pr. minut. Omrører-hastigheden indstilledes således, at der opretholdtes et indhold af opløst oxygen på over 255¾ af mætningsværdien i dyrkningsmediet målt ved hjælp af et New Brunswick Inc. DO prøveapparat. Sterilt antiskum-middel, polypropylenglykol 2000, tilsattes efter behov for at undertrykke skumning, og pH-værdien holdtes mellem 6,0 og 6,3 ved tilsætning af steril kaliumhydroxidopløsning.

Væksthastigheder (pr. time)._ (1) Uden opløsning 7 (minimal me- meget langsom dium) (2) Opløsning 7, således at slut koncentrationen af biotin i dyrkningsmediet var 50 yg/1 0,2 * vr , , 144069 ίο

Vasks thastigheder (pr.time)_ (3) Opløsning 7, således at slut- koncentrationen af biotin i dyrkningsmediet var 50 yg/l, cholinchloridindholdet 30 mg/1 og methioninindholdet 300 mg/1 0,25

Eksempel 3

Det anvendte medium og de anvendte betingelser var som i eksempel 2, men glukosen erstattedes af maltose.

(1) Opløsning 7 som i eksempel 2 (2) 0,l8 (2) Opløsning 7 som eksempel 2 (3) 0,21

Eksempel 4 100 liter af følgende dyrkningsmedium fremstilledes og steriliseredes som beskrevet i et 130 liters dyrkningsapparat af rustfrit stål.

% endelig koncentration

Glukose 4,0

Majsstøbevæske (50% tørstof) 0,8

Ammoniumsulfat 0,2

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2

MgSOjj, 7H20 0,025

ZnSO||, 7H20 0,0005

PeS0||, 7H20 0,0005

MnSOjp 4H20 0,0001

Dyrkningsmediet steriliseredes ved pH 3,0 og et tryk på 2,0 kg/cm^ i 30 minutter, og efter afkøling til 30°C indstilledes pH-værdien på 5,0 ved tilsætning af steril ammoniak.

Biotin steriliseret ved filtrering til opnåelse af en slutkoncentration på 40 yg/1 tilsattes aseptisk.

Beholderens indhold podedes med 10 liter af en kultur dyrket i en besprøjtet beholder i 18 timer ved 30°C på et medium indeholdende: Glukose: 2%, tryptone (oxoid): 0,4%, gærekstrakt (oxoid): 0,1%, ammoniumsulfat: 0,15%, kaliumdihydrogenphosphat: 1%, natriumhydroxid: 0,1%, magnesiumsulfat: 0,025%, ferrosulfat: 0,001%, zinksulfat: 0,001%, mangansulfat: 0,0005%, kobbersulfat: 0,001%, antiskum- 11 144069 middel, polypropylenglykol 2000: 0,05$ og steriliseret i 45 timer ved p 2,0 kg/cm . Mediet var blevet podet med en sporesuspension af organismen Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425·

Dyrkningsbetingelserne var en temperatur på 30°C, en gennemluftning indstillet således, at der opnåedes koncentrationer af opløst oxygen på over 10$ af mætningsværdien for dyrkningsmediet. Sterilt antiskummiddel, polypropylenglykol 2000, tilsattes for at undertrykke en skumning, og pH-værdien holdtes på 5,0 ved tilsætning af steril ammoniak. Prøver af myceliet udtaget under vækstperioden indeholdt på tørstofbasis: Samlet nitrogenindhold 8,0-8,6$, a-aminonitro-gen: 6,4-6,6$. Begyndelsesvæksthastigheden i dette sammensatte medium hidrørende fra både den nævnte portion af dyrkningsmediet og podningsmaterialet var ca. 0,3 pr. time.

Følgende eksempler 5 og 6 er eksempler på kontinuerlig dyrkning.

Eksempel 5

Der fremstilledes et dyrkningsmedium med følgende sammensætning:

Opløsning 1 Slutkoncentration, %

Glukose 3,0

Ammoniumsulfat 0,25

Kaliumdihydrogenphosphat 0,3

Magnesiumsulfat 0,025

Antiskummiddel, polypropylenglykol 2000 0,01

Steriliseret ved pH 3,0 i 30 minutter ved et tryk på 2,0 kg/cm2.

Opløsning 2

MnSO^, 4H20 0,0005

FeSO^, 7H20 0,0005

ZnSO^, 7H20 0,0005

CoCl2, 6η2ο 0,0001

CuSO^, 5H20 0,0001

Na2MoOii, 2H20 0,0001 p

Steriliseret 15 minutter ved et tryk på 2,0 kg/cm .

12 144069

Opløsning 3

Vitaminer og/eller aminosyrer som beskrevet nedenfor steriliseret ved filtrering.

Alle opløsninger tilsattes aseptisk efter behov. Dyrkningsbetingelserne i en 8,5 liters chemostat var følgende:

Temperatur: 30°C, gennemluftning: 1 volumenenhed pr. volumenenhed pr. minut, omrøring: 800 omdrejninger pr. minug med en enkelt β-bladet pladeturbine, 0,5D, i en med skærmplader forsynet beholder. Organismen var Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425· pH-værdien holdtes på 5,0 ved automatisk tilsætning af steril ammoniak.

Mycelium μ Max Udbytte- Total NPU ba- KPU ba- time ~ faktor nitro- nitro- .

p.pn ψ ψ pa to- pa ami- gen,% gen,% tal ni_ nonitro- trogen gen (1) Opløsning 3, 0,17-0,19 0,5 7,2-7,9 6,3-6,8 54 65 således at slutkoncen-trationen af biotin i dyrkningsmediet var 20 yg/1 (2) Opløsning 3, 0,20-0,21 0,5 7,7-8,6 6,1-6,5 59 78 således at slutkoncentrationen af biotin i dyrkningsvar 20 pg/l og koncentrationen af methonin var 600 mg/1 13 144069

Eksempel 6

Der fremstilledes et dyrkningsmedium med følgende sammensætning: % Bønnestivelse (ot-amylasebehandlet) 3,O carbonhydrat

Majsstøbevæske 1,33

Ammoniumsulfat 0,25

Kaliumdihydrogenphosphat 0,15

Magnesiumsulfat 0,025

Antiskummiddel, polypropylenglykol 2000 (volumen/vægt) 0,025

Steriliseret ved en pH-værdi på 4,0 i 30 minutter under et tryk på 2,0 kg/ cm2.

Mediet indførtes i en 8,5 liters chemostat under samme betingelser som i eksempel 1 med den undtagelse, at pH-værdien varie-des mellem 3,5 og 6,0, og væksthastigheden var 0,1 time ^. Følgende resultater opnåedes:

Total nitro- Amino- NPU ba- NPU bagen, % nitrogen, seret seret % på total på ami- nitrogen nonitro- gen

Produkt dyrket ved pH 4,0 7,8 6,6 54 67 " " PH 5,0 8,6 7,1 57 71 " " " PH 6,0 7,7 5,9 61 80

Eksempel 6(b)

Dyrkningsmediet og betingelserne var som i eksempel 6 med den undtagelse, at pH-værdien holdtes på 5,0 under hele forsøget, og temperaturen varieredes mellem 26 og 34°C. Den optimale temperatur viste sig at være fra 30 til 32°C.

I et dobbelt sæt rysteflasker med en kapacitet på 1 li ter indførtes 200 ml af følgende dyrkningsmedium: 144069 14

Eksempel 7

Slutkoncentration, %

Opløsning 1 Glukose (steriliseret separat ved pH 3,0 og et tryk på 1,7 kg/cm2 ± io minutter) 3a0

Opløsning 2 Ammoniumsulfat 0,565

Kaliumdihydrogenphosphat 1,0

MgSOjj, 7H20 0,025

FeS0|j, 6H20 0,0005

MnSO^, 4H20 0,0005

CuSO^, 5H20 0,0001

CoCl2, 6h2o 0,0001

CaCl2, 2H20' 0,0015

NagMoO^, 2H20 0,00001

NaOH 0,2

Saltene steriliseredes ved et tryk på 2,0 kg/cm2 i 15 minutter. Slut-pH-værdien var 6,0.

Opløsning 3 De nedenfor omtalte vitaminer steriliseredes ved filtrering.

Opløsningerne tilsattes aseptisk til opnåelse af et slutvolumen på 200 ml. Derpå podedes flaskerne med vaskede sporer af Fusarium graminearum 1-7 I.M.I. 154209 til opnåelse af en koncentration på 8 x 10^ pr. ml.

Dyrkningsbetingelserne var en temperatur på 30°C og en omdrejningshastighed på 140 omdrejninger pr. minut i et kredsløbsrysteapparat med en slaglængde på 5 cm.

Med intervaller på 1 time blev væksten målt ved at måle den optiske tæthed af en prøve ved 600 mp. På basis af de opnåede resultater bestemtes følgende væksthastigheder.

15 144069 Væksthastighed pr. time (1) Opløsning 3 udeladt (minimalt medium) meget langsom (2) Opløsning 3S således at slut- koncentrationen af biotin i dyrkningsmediet var 50 yg/1 0,22 (3) Opløsning 3, således at slut-koncentrationen af biotin i dyrkningsmediet var 50 yg/l og cholinchloridindholdet 50 kg/1 0,27

Eksempel 8

Fremgangsmåden ifølge eksempel 7 gentoges, men stammen 1-7 erstattedes af stammen Fusarium graminearum Schwabe 1-8. Følgende væksthastigheder opnåedes.

Væksthastighed pr. time (1) Som 7 (1) meget langsom (2) Som 7 (2) 0,22 (3) Som 7 (3) 0,27

Eksempel 9

Fremgangsmåden ifølge eksempel 7 gentoges, men stammen 1-7 erstattedes af stammen Fusarium graminearum Schwabe 1-9. Følgende væksthastigheder opnåedes; Væksthastighed pr. time (1) Som 7 (1) meget langsom (2) Som 7 (2) 0,21 (3) Som 7 (3) 0,27

Eksempel 10

Fremgangsmåden ifølge eksempel 7 gentoges, men stammen 1-7 erstattedes af stammen Fusarium graminearum Schwabe 1-15. Nedenstående væksthastigheder opnåedes: 16 144069 Væksthastighed pr. time (1) Som 7 (1) meget langsom (2) Som 7 (2) 0321 (3) Som 7 (3) 0,27

Eksempel 11

Fremgangsmåden ifølge eksempel 7 gentoges, men stammen 1-7 erstattedes af stammen Fusarium graminearum Sehwabe I-ΐβ. Følgende væksthastigheder opnåedes: Væksthastighed pr. time (1) Som 7 (1) meget langsom (2) Som 7 (2) ' 0,21 (3) Som 7 (3) 0,27

Eksempel 12

Fremgangsmåden ifølge eksempel 7 gentoges, men stammen 1-7 erstattedes af moderstammen Fusarium graminearum Sehwabe I.M.I.

145425..Følgende væksthastigheder konstateredes: Væksthastighed pr. time (1) Som 7 (1) meget langsom (2) Som 7 (2) 0,22 (3) Som 7 (3) 0,27.