DK166686B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af en spiselig, proteinholdig substans til brug i dyrefoder - Google Patents

Description

i DK 166686 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde.til fremstilling af en spiselig, proteinholdig substans til brug i dyrefoder.

GB-patentskrift nr. 1210356 angår en fremgangsmåde til fremstilling af en spiselig, proteinholdig substans, hvilken fremgangsmåde omfatter 5 inkubering og proliferation under aerobe betingelser af en organisme, der er en ikke-toksisk stamme af en mikrofungus af Fungi imperfecti klassen, i et dyrkningsmedium indeholdende essentielle vækstfremmende næringsstoffer, af hvilke carbon i form af assimilerbart carbohydrat udgør det begrænsende substrat ved proliferation, og adskillelse af den 10 prolifererede organisme, som udgør den spiselige, proteinholdige substans, fra det for assimilerbart carbohydrat udtømte medium.

GB-patentskrift nr. 1331471 omhandler en spiselig, proteinholdig substans omfattende fungusmycelium, der besidder en høj nettoproteinud-nyttelsesværdi ved rottetests på mindst 70, baseret på Q!-aminonitrogen.

15 GB-patentskrift nr. 1346062 beskriver en fremgangsmåde til frem stilling af en spiselig, proteinholdig substans, der omfatter inkubering og proliferation under aerobe betingelser af en ikke-toksisk stamme af slægten Fusarium eller en variant eller mutant heraf i et dyrkningsmedium indeholdende essentielle vækstfremmende næringsstoffer, af hvilke 20 carbon i form af et assimilerbart carbohydrat udgør det begrænsende substrat ved proliferation, og fraskillelse af den prolifererede organisme, der indeholder den spiselige, proteinholdige substans.

Selv om kontrol af processen til fremstilling af et spiseligt protein giver et højere udbytte med hensyn til carbon, når carbon er det 25 begrænsende næringsstof, har det vist sig, at de fysiske egenskaber og spisekvaliteten af den spiselige, proteinholdige substans nu kan forbedres. Disse produktfordele opvejer udbyttetabet i forhold til begrænsning ved hjælp af carbon.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer den foreliggende op-30 findelse en fremgangsmåde til fremstilling af en spiselig, proteinholdig substans, indeholdende lange hyfer med ringe eller ingen forgrening, til brug i dyrefoder, hvilken fremgangsmåde omfatter inokulering og gennemførelse af en kontinuert fermentering under anvendelse af Fusarium gra-minearum Schwabe IMI 145425 i et dyrkningsmedium indeholdende alle nød-35 vendige vækstfremmende næringsstoffer og er ejendommelig ved, at fermenteringen luftes ved en strømningshastighed på 0,32 til 1,2 1‘min"* pr. 1 fermenteringsbeholdervolumen, således at oxygen udgør det begrænsende næringsstof, men opretholder cellekoncentration i kulturen, uden at der DK 166686 B1 2 forekommer anaerob vækst, at alle næringsstoffer for Fusarium graminea-rum bortset fra oxygen er til stede i overskud, og at fermenteringen udføres ved et tryk på 101 kN/m2 til 505 kN/m2.

Den fraskilte, prolifererede organisme, der indeholder den spisel i -5 ge, proteinholdige substans, kan inkorporeres i et næringsmiddel til dyr. Fremgangsmåden er en videreudvikling af den, som er beskrevet i GB-patentskrift nr. 1346062. Erfaringen fra anvendelsen af denne fremgangsmåde og produkterne deraf til inkorporering i forskellige næringsmidler såsom produkter svarende til fjerkræ, fisk og kød viser, at der opstår 10 et problem, og at carbonbegrænsning giver et produkt opbygget af forgrenede hyfetråde med en medianlængde på 0,25 til 0,3 mm. Til sådanne produkter har det imidlertid vist sig, at spiselige, proteinholdige substanser med større fiberlængde kan tekstureres til dannelse af et produkt, der bedre svarer til strukturen af det originale næringsmiddel.

15 Ved anvendelse af en fermentering, hvor oxygen er det begrænsende næringsstof, forbedres produktkvaliteten. Oxygenbegrænset fermentering tilvejebringer almindeligvis hyfer med en medianlængde, der er større end 0,3 mm, almindeligvis 0,3 mm til 0,5 mm, og med ringe eller ingen forgrening.

20 Efter dyrkning af den spiselige, proteinholdige substans kan den underkastes varmechokbehandling for at reducere mængden af ribonuklein-syre (RNA) i produktet. En fremgangsmåde til RNA-reduktion er beskrevet i GB-patentskrift nr. 1440642. Lange hyfetråde (længde 0,3 til 0,5 mm) med ringe eller ingen forgrening er ønskværdige for den efterfølgende 25 teksturering, som beskrevet i GB-patentskrift nr. 1502455, af høstet spiselig, proteinholdig substans med reduceret RNA-indhold, idet de muliggør en større grad af orientering af hyferne og en større opfattet fibrøshed af slutproduktet. Ydermere frembringer oxygenbegrænsning et høstet materiale med reduceret RNA-indhold, der er svagt brungult i far-30 ve og i det væsentlige mildt i lugt og smag. Forudsat at niveauet af oxygen lige netop opretholder cellekoncentrationen i kulturen, optræder der ikke nogen i det væsentlige anaerob metabolisme, og en mild lugt af det høstede materiale kan bibeholdes.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres der en kontinuert 35 fermentering. Oxygenbegrænsning muliggør frembringelse af hyfer med karakteristika, der er ønskværdige til mange forskellige slutprodukter, og med god produktivitet i fermenteringsbeholderen. Forudsat at alle andre næringsstoffer er til stede i overskud, kan produktiviteter på 3,0 DK 166686 Bl 3 g/l/time eller derover opretholdes.

Oxygen eller oxygenberiget luft ledes ind i fermenteringsbeholderen ved atmosfæretryk eller derover ved tryk på 101 kN/m2 til 505 kN/mz.

Systemer med tryk på 101 kN/m2 til 330 kN/m2 i fermenteringsbeholde-5 ren er blevet undersøgt ved forskellige omrørerhastigheder og forskellige strømningshastigheder for tilført oxygen.

Det antages, at organismens oxygenoptagelse er diffusionskontrolleret og således afhængig af flere træk: 10 (a) tilførselshastigheden for oxygen eller oxygenberiget luft, (b) kraften af omrøreren til tilvejebringelse af den drivende kraft til opløsning af oxygen i dyrkningssubstratet, (c) overtrykket og temperaturen (fastholdt på 30°C), der bestemmer mætningskoncentrationen for oxygen, 15 (d) omsætningstiden i beholderen, der står i relation til om- rørerens effektivitet til blanding af dyrkningssubstratet, og (e) viskositeten og strukturen af dyrkningssubstratet, som bestemmer de begrænsende diffusionshastigheder.

20 Substratet, der anvendes ved fermenteringen, kan være af vegetabilsk oprindelse, for eksempel stivelse, stivelsesholdige materialer eller hydrolyseprodukter deraf, for eksempel glycose. Saccharose, saccha-roseholdige materialer eller hydrolyseret saccharose, d.v.s. invertsuk-ker eller blandinger heraf. Substratet kan således omfatte hydrolyseret 25 kartoffel, melasse, glucose, maltose, hydrolyseret bønnestivelse eller kassava. Alternativt kan substrater af animalsk oprindelse, for eksempel mælkevalle, anvendes.

Den ikke-toksiske stamme af Fusarium er en stamme af Fusarium gra-minearum, nærmere bestemt vores stamme af Fusarium graminearum Schwabe 30 (FGS), der sammen med varianter og mutanter deraf er beskrevet i og genstand for krav i GB-patentskrift nr. 1346061 og deponeret ved Commonwealth Mycological Institute, Kew, under nummeret IMI 145425.

GB-patentskrift nr. 1346061 beskriver og omhandler specifikt fem varianter af vores stamme af Fusarium graminearum Schwabe IMI 145425, 35 nemlig 1-7, 1-8, 1-9, 1-15 og 1-16, der er deponeret ved Commonwealth Mycological Institute og henholdsvis tildelt numrene IMI 154209, IMI 154211, IMI 154212, IMI 154213 og IMI 154210.

Inkubationstemperaturen ligger almindeligvis mellem 25 og 34eC, DK 166686 B1 4 fortrinsvis omkring 30eC.

Fremgangsmåden indledes med inokulering af næringssubstratet i fermenteringsbeholderen med en aktivt voksende kultur af organismen FGS i vegetativ vækst.

5 Substratmediets pH under inkubationen holdes fortrinsvis inden for et egnet område, der støtter maksimal vækst, for eksempel mellem 3,5 og 7, fortrinsvis omkring 6.

Vækstperioden i batchkultur under de ovennævnte betingelser er afhængig af størrelsen af inokulet og volumenet af fermenteringsbeholdereri 10 og ligger typisk i området fra 20 til 48 timer for en 1300 liters beholder.

Som det let vil kunne forstås af fagfolk, opretholdes der tilstrækkelige mængder af substratcarbon som assimilerbart carbohydrat sammen med essentielle vækstnæringsstoffer såsom nitrogen, svovl, phosphor og 15 andre sporelementer i substratmediet, således at organismens vækst kun begrænses af den oxygenmængde, der er tilgængelig for fungus.

Ud over de næringsmidler, der er nævnt ovenfor, kan tilstedeværelsen af ét eller flere vitaminer, som for eksempel biotin, være ønskværdig for at opretholde maksimal væksthastighed.

20 Substansen, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan isoleres på enhver egnet måde kendt inden for faget. Således kan det resulterende mycelium udvindes ved adskillelse fra næringssubstratet, for eksempel ved filtrering. Substansen, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan tekstureres på en måde i overensstemmelse 25 med GB-patentskrift nr. 1502445 efter blanding med passende tilladte farve- og smagsstoffer. Det teksturerede materiale kan herefter formuleres til produkter, der opbevares enten nedfrosset eller nedkølet.

Fungusmyceliet kan på grund af dets filamentagtige struktur anvend-> es som en analog til forskellige kødprodukter, især ved tilsætningen af 30 smags- og farvemidler.

Den foreliggende opfindelse vil blive yderligere beskrevet i de efterfølgende eksempler.

Eksempler 35 De følgende eksempler illustrerer strømningshastigheder af nærings mediet og fermenteringsprocesbetingelser for kontinuert dyrkning af Fusan um graminearum Schwabe IM 145425 ved forskellige begrænsende næringsstoffer.

DK 166686 B1 5

Eksempel 1 til 8 viser begrænsning med hensyn til oxygen, mens eksempel 9, som sammenligning, viser begrænsning med hensyn til carbon.

I alle eksempler tilsættes mediumkomponenter aseptisk. Glucosesi-rup, magesiumsulfat, kaliumsulfat, monoammoniumphosphat, ferrichlorid 5 eller ferrosulfat, zinksulfat, mangansulfat og kobbersulfat blandes sammen i et enkelt næringsmedium, som steriliseres ved 138°C, typisk i 5 til 7 minutter ved 377 kN/m2 tryk, afkøles til omgivelsestemperatur og sættes kontinuert til en 1300 liters beholder af rustfrit stål indeholdende dyrkningssubstratet ved den angivne strømningshastighed. I alle ek-10 sempler holdes fermenteringsbeholderen ved 30°C og omrøres ved den angivne hastighed af en dobbeltomrører omfattende en 18 bladet skiveturbine (diameter (D) = 0,508 m) og en trebladet klinge (D = 0,7 m) i en beholder, der er fuldstændigt udstyret med afbøjningsplader.

Angivne niveauer af steril luft ledes gennem beholderen, og kultu-15 rens pH holdes på 6 ved direkte tilsætning af ammoniak til luften, der fødes til beholderen.

Den producerede biomasse forlader fermenteringsbeholderen i en jævn strøm, og ribonukleinsyreindholdet (RNA) reduceres ved den i GB-patent-skrift nr. 1440642 beskrevne fremgangsmåde. De tabel lerede biomassedata 20 henviser til materialer, der er behandlet for at reducere RNA-indholdet ved denne fremgangsmåde.

Biomassen høstes ved hjælp af et filter. Den følgende tabel viser, at organismernes medianhyfelængde og farven, teksturen og lugten af den høstede biomasse påvirkes af det begrænsende næringsstof i fermente-25 ringsprocessen.

Biomasse AAN er et mål for aminosyrenitrogen, der giver et indeks for mængden af protein til stede i det producerede materiale.

Biomassemedianlængden er medianlængden af hyfetrådene, der er til stede.

30 Teksturen er vurderet og kvalitetsbestemt af et smagspanel.

Udbyttefaktoren med hensyn til carbon er beregnet som vægten af dannet organisme/vægten af anvendt carbonsubstrat.

Produktiviteten er vægten af den producerede biomasse pr. volumenenhed pr. tidsenhed og udregnes som vægten af biomasse pr. liter x for-35 tyndingsforholdet. Fortyndingsforholdet er strømningshastigheden for næringsstofferne til fermenteringsbeholderen divideret med beholderens volumen og udtrykkes i enheden h~*. Overtryk er det positive tryk i fermenteringsbeholderen i forhold til atmosfærisk tryk, udtrykt i enheden DK 166686 B1 6 kN/m2. Det absolutte tryk i fermenteringsbeholderen er således lig atmosfærisk tryk + overtryk.

Eksempel 1 til 8 illustrerer forskellige fermenteringsbetingelser, ved hvilke materiale med middel til god spisekvalitet kan produceres 5 under oxygenbegrænsning.

Eksempel 1 og 8 illustrerer stort overtryk i fermenteringsbeholderen. Eksempel 2, 4, 5 og 6 illustrerer lille overtryk, og eksempel 7 illustrerer et overtryk derimellem.

Eksempel 1, 3 og 8 illustrerer stor lufttilstrømning. Eksempel 6 10 illustrerer lille lufttilstrømning.

Eksempel 1, 7 og 8 illustrerer høj produktivitet. Eksempel 2, 4 og 6 illustrerer lav produktivitet.

Mens de mest ønskværdige produktiviteter opnås ved fortyndingsforhold i området 0,17 til 0,19"*, er det muligt at tillade organismen at 15 vokse ved oxygenbegrænsning ved fortyndingsforhold over 0,25. Eksempel 6 illustrerer vækst ved fortyndingsforhold på 0,25 h“*.

20 25 30 35 DK 166686 61 7

Eksempel nr. 1 2 3 _4 5

, - - => - -Begrænsning O OOOO

5 Næringsstoffer

Glucose (majssirup) 39,5 41,5 27,22 34,83 23,3

Monoammoniumphosphat 2,1 2,1 1,30 2,26 1,30

Kaliumsulfat 2,1 2,1 2,1 3,65 2,1

Magnesiumsulfat 0,87 0,87 0,87 1,51 0,87 10 Biotin 0,0134 0,009 0,004 0,009 0,004

Cholin 87,0 87,0 87,0 113,9 87,0

FeSO4, 7H20 - - 1,26 7,57 3,79

FeCl3, 6H20 3,64 5,94

ZnSO4, 7H20 19,30 26,09 8,7 15,13 8,7 15 MnSO4, 4H20 15,46 17,39 8,7 15,13 8,7

CuSO4, 5H20 1,85 3,48 0,87 3,03 0,90

Betingelser

Strømningshastighed 218 265 255 265 264 20 Beholdervolumen 1252 1340 1280 1342 1245

Fortyndingsforhold 0,174 0,20 0,20 0,20 0,21

Biomassecellekonc. 17,9 9,2 11,1 10,2 10,7

Omrøringshastighed 180 180 180 185 180

Luftstrøm 1500 1211 1316 1239 1216 25 Overtryk 207 34,5 55 34,5 34,5

Glucoseoverskud 5,5 17,7 6,2 13,2 3,9

Resultater

Biomasse AAN 75,5 66,0 68,1 63,5 68,5 30 Biomassemedianlængde 0,38 0,40 0,39 0,43 0,41

Farve Svagt Svagt Gulbrun Gulbrun Gulbrun gulbrun gulbrun

Tekstur God Middel God God Over

Udbyttefaktor 0,53 0,39 0,53 0,47 0,47 35 m.h.t. carbon

Produktivitet 3,11 1,84 2,22 2,04 2,25 DK 166686 B1 8

Eksempel nr. 6 7 8 _9 Enhed _ _ .

Begrænsning 00 0 C

5 Næringsstoffer

Glucose (majssirup) 22,45 46,25 48,00 15,73 g/1

Monoammoniumphosphat 1,30 1,65 1,39 1,34 g/1

Kaliumsulfat 2,1 2,1 2,1 2,1 g/1

Magnesiumsulfat 0,87 0,87 0,87 0,87 g/1 10 Biotin 0,004 0,004 0,004 0,004 mg/1

Cholin 87,0 670,0 456,5 87,0 mg/1

FeSO4, 7H20 4,34 4,34 4,34 4,34 mg/1

FeCl , 6H 0 - - - - mg/1

ZnSO4, 7H20 8,7 8,7 8,7 8,7 mg/1 15 MnSO4, 4H20 8,7 8,7 8,7 8,7 mg/1

CuSO4, 5H20 0,87 0,87 0,87 0,87 mg/1

Betingelser

Strømningshastighed 326 254 228 265 1/h 20 Beholdervolumen 1305 1350 1321 1230 1

Fortyndingsforhold 0,25 0,188 0,172 0,22 h"1

Biomassecellekonc. 8,7 20,7 21,4 9,8 g/1

Omrøringshastighed 179 200 200 180 opm

Luftstrøm 412 1072 1112 1458 1/min 25 Overtryk 34,5 117 207 34,5 kN/m2

Glucoseoverskud 5,0 10,8 7,4 <0,1 g/1

Resultater

Biomasse AAN 68,2 67,5 64,1 49,8 mg/g 30 Biomassemedianlængde 0,44 0,36 0,32 0,28* mm

Farve Gulbrun Mørk Mørk Lyserød gulbrun gulbrun

Tekstur Over Middel Middel Under middel middel 35 Udbyttefaktor m.h.t. 0,50 0,58 0,53 0,62 carbon

Produktivitet 2,1 3,89 3,68 2,16 g/l/h *(forgrenet)

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en spiselig, proteinholdig substans, indeholdende lange hyfer med ringe eller ingen forgrening, til 5 brug i dyrefoder, hvilken fremgangsmåde omfatter inokfflering og gennemførelse af en kontinuert fermentering under anvendelse af Fusarium gra-minearum Schwabe IMI 145425 i et dyrkningsmedium indeholdende alle nødvendige vækstfremmende næringsstoffer, KENDETEGNET ved, at fermenteringen luftes ved en strømningshastighed på 0,32 til 1,2 l'min”1 pr. 1 fer-10 menteringsbeholdervolumen, således at oxygen udgør det begrænsende næringsstof, men opretholder cellekoncentration i kulturen, uden at der forekommer anaerob vækst, at alle næringsstoffer for Fusarium graminea-rum bortset fra oxygen er til stede i overskud, og at fermenteringen udføres ved et tryk på 101 kN/m2 til 505 kN/m2. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at fermenteringen udføres ved et tryk på 101 kN/m2 til 303 kN/m2.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at hy-20 ferne har en medianlængde på 0,3 mm til 0,5 mm. 25 2 30