FI79859B - Foerfarande foer framstaellning av ett aetligt, proteinhaltigt aemne. - Google Patents

Description

79859

MENETELMÄ SYÖTÄVÄKSI KELPAAVAN, PROTEIINEJA SISÄLTÄVÄN AINEEN VALMISTAMISEKSI

Kyseessä oleva keksintö koskee syötäväksi kelpaavia proteiineja sisältävien aineiden valmistusmenetelmää, ja se koskee erityisesti mikrobitoiminnan avulla tapahtuvaa sieni-proteiinin valmistusta.

Englantilainen patentti no 1210356 koskee syötäväksi kel-paavaa proteiinia sisältävän aineen valmistusmenetelmää, jossa menetelmässä Fungi Imperfect! -luokan mikrosienen myrkytöntä kantaa inkuboidaan ja annetaan sen lisääntyä aerobisissa olosuhteissa, elatusaineessa, joka sisältää välttämättömiä, kasvua edistäviä ravintoaineita, joista hiili assimiloituvan hiilihydraatin muodossa muodostaa lisääntymistä rajoittavan substraatin, ja jakaantunut organismi erotetaan elatusaineesta, josta assimiloituva hiilihydraatti on käytetty loppuun ja jossa on syötäväksi kelpaava proteiini.

Englantilaisen patentin no 1331^71 vaatimukset kohdistuvat syötäväksi kelpaavaan proteiinia sisältävään aineeseen, joka koostuu s 1 eniproteiinista, jolla on rotilla suoritettujen kokeiden perusteella korkea proteiinin hyväksikäytön netto-arvo, ainakin 70, o<-aminotypen perusteella laskettuna.

Englantilaisessa patentissa no 13^6062 kuvataan menetelmää syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävän aineen valmistamiseksi, jossa menetelmässä Fusarlum-suvun myrkytöntä kantaa tai sen muunnosta tai mutanttia inkuboidaan ja annetaan sen lisääntyä elatusaineessa, joka sisältää välttämättömiä, kasvua edistäviä ravintoaineita, joista assimiloituvan hiilihydraatin muodossa oleva hiili muodostaa solunjakaantumista rajoittavan substraatin, josta elatusaineesta jakaantunut organismi erotetaan ja Jossa on syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävä aine.

Vaikka syötäväksi kelpaavan proteiinin valmistusmenetelmän säätely antaa korkeimman saannon hiilellä, kun hiili on 2 79859 rajoittava ravintoaine, on havaittu, että syötäväksi kelpaa-vaa proteiinia sisältävän aineen fysikaalisia ominaisuuksia ja nautittavuutta voidaan parantaa. Nämä tuotteen edut ovat arvokkaampia kuin hiilen määrää rajoittamalla aiheutettu tappio saannossa.

Niinpä kyseessä oleva keksintö tarjoaa syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävän aineen valmistusmenetelmän, jossa jatkuva käyminen käynnistetään siirrostamalla Fusarium graminearumin avulla elatusaine, joka sisältää kaikki välttämättömät, kasvua edistävät ravintoaineet, ja käyminen ilmastetaan siten, että happi muodostaa rajoittavan ravinteen.

Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön myös Fusarium graminearumin myrkyttömän sienihuovaston, jota voidaan käyttää ihmisten ravintoaineena ja jonka huovaston keskipituus on suurempi kuin 0,3 mm, ja jota valmistetaan Fusarium graminearumin sekä kaikkia välttämättömiä, kasvua edistäviä ravintoaineita ja happea rajoittavana ravinteena sisältävän : elatusaineen jatkuvan käymisen avulla.

:Erotettu, lisääntynyt organismi, joka käsittää syötäväksi :· kelpaavaa proteiinia sisältävän aineen, saatetaan liittää ihmisten tai eläinten käyttöön tarkoitettuun ravintoaineeseen. Menetelmä on englantilaisessa patentissa no 1346062 kuvatun menetelmän kehitystulos. Kokemuksemme tämän menetelmän käytöstä seka tuotteiden sisällyttämisestä erilaisiin ravintoaineisiin kuten esimerkiksi siipikarjan, kalan ja lihan analogeihin sekä makeisiin ja suolaisiin välipala-tuotteisiin on osoittanut, että ongelmia muodostuu ja hiilen rajoittaminen antaa käyttöön tuotteen, joka koostuu haaroit-tuneista hyyfisäikeistä, joiden keskimääräinen pituus on 0,25-0,3 mm. Kuitenkin on sellaisten tuotteiden suhteen ** · havaittu, että syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävää .'·' ainetta, jonka säie on pitempi, voidaan käsitellä tuotteen . i valmistamiseksi, joka paremmin vetää vertoja alkuperäiselle li 3 79859 ruoka-aineelle. Käyttämällä hyväksi käymistä, jossa happi on rajoittava ravinne, paranee tuotteen laatu. Hapen avulla rajoitettu käyminen antaa yleensä käyttöön hyyfin, jonka keskimääräinen pituus on suurempi kuin 0,3 mm, tavallisesti 0,3-0,5 mm ja Joka on vähän haaroittunut tai ei ollenkaan.

Syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävän aineen kasvatuksen Jälkeen sitä saatetaan käsitellä lämpösokkikäsittelyllä, jotta vähennetään tuotteen ribonukleilnihapon (RNA) määrää. Menetelmää RNA:n vähentämiseksi kuvataan englantilaisessa patentissa no 1^40642. Pitkät hyyfi-säikeet (pituus 0,3-0,5 mm), joissa on vähän haaroja tai jotka eivät haaraudu ollenkaan, ovat haluttuja syötäväksi kelpaavaa proteiinia sisältävän aineen seuraavaa englantilaisessa patentissa no 1502455 kuvatulla tavalla suoritettavaa teksturointia varten sen jälkeen, kun RNA:ta on vähennetty ja aine on kerätty talteen, koska tällöin hyyfien suuntaaminen on suuremmassa määrin mahdollista ja lopullisessa tuotteessa on suurempi, näkyvä säikeisyys. Lisäksi hapen määrän rajoittaminen tuottaa koottua, RNA:ta vähän sisältävää materiaalia, Joka :I on väriltään vaalean nahanväristä sekä oleellisesti mietoa : : hajultaan sekä maultaan. Edellyttäen, että hapen taso vain ylläpitää viljelmän solukonsentraatiota, mitään oleellisesti anaerobista metaboliaa ei tapahdu ja kootun materiaalin mieto haju voidaan säilyttää.

Kyseessä oleva keksintö soveltuu jatkuvaan käymiseen. Hapen rajoittaminen tekee käymisastiassa mahdolliseksi hyvän tuottavuuden hyyfeille, joilla on laajalla lopputuotteiden alueella toivottuja ominaisuuksia. Edellyttäen, että kaikkia ravinteita on läsnä ylimäärin, voidaan pitää yllä tuottavuuksia, jotka ovat 3,0 g 1“* h-1 tai sitä suurempia.

Happea tai hapella rikastettua ilmaa johdetaan käymisastiaan ilmakehän tai sitä suuremmassa paineessa, esim. 101 kN/m^ - 505 kN/m^. On tutkittu järjestelmiä, joissa käymisastian 4 79859 paine on 101-330 kN/m2, erilaisin siipirattaan ja hapen sisäänvirtausnopeuksin.

Vaikka toivotaan, ettei keksinnön mukainen teoria rajoita, uskotaan diffuusion kontrolloivan organismin hapenottoa, joten se riippuu useista seikoista: (a) Hapen tai hapella rikastetun ilman virtausnopeudesta; (b) Siipirattaan voimasta, joka tarjoaa käyttövoiman hapen liuottamiseksi elatusaineeseen; (c) Hapen ylipaineesta ja lämpötilasta (pidetty 30 °C:ssa), joka määrää hapen kyllästyskonsentraation; (d) Vaihtumisajasta astiassa, joka riippuu siipirattaan tehokkuudesta elatusaineen sekoituksessa; ja (e) Elatusaineen viskositeetista Ja rakenteesta, joka määrää (f) rajadiffuusion nopeudet.

Käymisessä käytetty substraatti saattaa olla kasvialkuperää, esim. tärkkelystä, tärkkelystä sisältäviä aineita tai niiden :: hydrolyysituotteita, esim. glukoosia, sakkaroosia, sakkaroo sia sisältäviä materiaaleja tai hydrolysoitua sakkaroosia, ·.: so. inverttisokeria tai niiden seoksia. Täten substraatti saattaa käsittää hydrolysoitua perunaa, melassia, glukoosia, maltoosia, hydrolysoitua paputärkkelystä tai maniokkia. Saatetaan käyttää vaihtoehtoisia substraatteja, jotka ovat eläinalkuperää, esim. maitoheraa.

Fusariumln myrkytön kanta saattaa olla Fusarlum gramlnearumin kanta.

Edullinen, myrkytön kanta on Fusarlum graminearum Schwabe (FSG) kantamme, Jota kuvataan Ja Jota koskevat patenttivaatimukset yhdessä sen muunnosten ja mutanttien kanssa esitetään englantilaisessa patentissa no 13M6061 ja joka on jätetty 5 79859 säilytettäväksi Commonwealth Mycological Institute:een, Kew, ja joka on merkitty numerolla IMI 145 425. ja on vapaasti saatavissa talletuslaitoksen viljelmäkokoelmasta·

Englantilainen patentti 546061 kuvaa ja kohdistuu spesifisesti Fusarium graminearum Schwabe IMI 145425 kantamme seuraavaan viiteen varianttiin nimittäin: 1-7» 1-8, 1-9, 1-15 sekä 1-16, jotka on jätetty säilytettäväksi Commonwealth Mycological Institute:een sekä merkitty vastaavasti numeroin IMI 154209, IMI 154211, IMI 154212, IMI 154215 sekä IMI 154210.

Inkubaatio-lämpötila on yleensä 25-54 °C, mieluummin noin 50 OC.

Valmistus aloitetaan ymppäämällä ravinneliemi käymis-astiassa, vegetatiivisessa kasvuvaiheessa olevan organismin FSG aktiivisesti kasvavalla viljelmällä. Substraatti-elatus-aineen pH pidetään inkuboinnin aikana sopivissa rajoissa, | jotka ylläpitävät maksimikasvua, esim. 5,5-7, mieluummin noin pH 6.

Viljelyerän kasvujakso yllämainituissa olosuhteissa riippuu ympin koosta ja käymisastian tilavuudesta, ja se on tyypillisesti 20-48 tuntia 1500 litran vetoisessa astiassa.

Kuten asiaan perehtyneelle on selvää, substraatti-elatus-aineessa pidetään yllä riittäviä määriä substraatti-hiiltä, kuten assimiloitavaa hiilihydraattia sekä välttämättömiä kasvuravinteita kuten esimerkiksi typpeä, rikkiä, fosforia sekä muita hivenalkuaineita, niin että organismin kasvua rajoittaa ainoastaan happi, joka on sienen saatavilla.

Yllä esitettyjen ravinteiden lisäksi yhden tai useamman vitamiinin, kuten esimerkiksi biotiinin läsnäolo saattaa olla toivottavaan maksimikasvunopeuden ylläpitämiseksi.

6 79859

Kyseessä olevan keksinnön mukaan valmistettu aine saatetaan eristää sopivalla, tunnetulla tavalla. Täten syntyvä huovasto saatetaan koota ravinneliemestä esim. suodattamalla. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu aine voidaan koostaa englantilaisessa patentissa no 1502445 esitetyllä tavalla sen jälkeen, kun sitä on käsitelty sopivilla väriä sekä makua antavilla aineilla. Koostettu aine voidaan sitten formuloida tuotteiksi, jotka varastoidaan jäädytettyinä tai jäähdytettyinä.

Sienihuovastoa voidaan sen säikeisen rakenteen vuoksi käyttää erilaisten lihatuotteiden analogina, erityisesti lisäämällä makua sekä väriä antavia aineita.

Kyseessä olevaa keksintöä kuvataan edelleen viittaamalla mukana seuraaviin esimerkkeihin.

ESIMERKIT

Seuraavat esimerkit valaisevat ravinne-elatusaineen virtausnopeuksia sekä fermentterissä tapahtuvan valmistuksen olosuhteita Fusarlum gramlnearum Schwabe IM l45425:n jatkuvassa kasvatuksessa erilaisia rajoittavia ravinteita käytettäessä.

Vertailun vuoksi esimerkeissä 1-8 rajoitetaan hapen saantia ja esimerkissä 9 hiili on rajoittava ravinne.

Kaikissa esimerkeissä elatusaineen komponentit lisätään aseptisesti. Glukoosisiirapista, magnesiumsulfaatista, kaliumsulfaatista, monoammoniumfosfaatista, ferrikloridista tai ferrosulfaatisa, sinkkisulfaatista, mangaani(2)-sulfaatista sekä kuparisulfaatista valmistetaan yhdessä yksinkertainen ravintoelatusaine, joka steriloidaan 138 °C:ssa, tyypillisesti 5-7 minuuttia 377 kN/m^rn paineessa, Jäähdytetään ympäristön lämpötilaan ja lisätään jatkuvasti 1300 litran vetoiseen teräsastiaan, joka sisältää elatusaineen, esite-

II

7 79859 tyllä nopeudella käyttäen kaksoissiipiratasta, joka koostuu 18-teräisestä levyturbiinista (läpimitta (D) = 0,508 m) sekä kolmilevyisestä sapelista (D = 0,7 m) täysin suuntaansa muuttavassa astiassa.

Steriilin ilman esitetyt määrät läpäisevät astian, ja viljelmän pH pidetään 6:ssa johtamalla ammoniakkia suoraan astian ilmasyöttöön.

Valmistettu biomassa lähtee astiasta vakiovirtauksella, ja ribonukleiinihapon (RNA) määrää vähennetään menetelmällä, jota kuvataan englantilaisessa patentissa no 1440642. Taulukoidut biomassaa koskevat tiedot tarkoittavat materiaalia, jota on käsitelty tällä menetelmällä RNA:n poistamiseksi.

Biomassa kootaan suodattimen avulla. Seuraava taulukko ilmaisee organismin keskimääräisen hyyfin pituuden sekä värin, rakenteen ja kootun biomassan hajun, joihin käymisproses-sissa rajoittava ravinne vaikuttaa.

Biomassa-AAN on aminohappotypen mittaus, Joka antaa valmistetussa materiaalissa läsnäolevan proteiinimäärän indeksin.

Biomassan keskimääräinen pituus on läsnäolevien hyyf1-säikei-den keskimääräinen pituus.

Rakenteen määrää Ja luokittelee maistamisen suorittava henkilöryhmä.

Hiileen perustuva saantotekijä lasketaan muodostuneen organismin painon Ja käytetyn hiilisubstraatin painon suhteena.

Tuottavuus on valmistetun biomassan painoyksikkö tilavuu dessa aikayksikössä, ja se lasketaan biomassan painona lit rassa x laimennusnopeus. Laimennusnopeus on ravinteiden vir-

__ - I

s 79859 tausnopeus käymi sastiaan jaettuna astian tilavuudella sekä ilmaistaan yksiköinä h~1. Ylipaine on käymisastian positiivinen paine yli ilmakehän paineen ilmaistuna yksiköinä kN/m2. Täten käymisastiassa vallitseva absoluuttinen paine on ilmakehän paine plus ylipaine.

Esimerkit 1-8 valaisevat erilaisia käymisolosuhteita, joiden avulla hapen ollessa kasvua rajoittana tekijänä, voidaan valmistaa laadullisesti nautittavuudeltaan keskimäärin hyvää materiaalia.

Esimerkit 1 ja 8 valaisevat korkean ylipaineen käyttöä fermentterissä. Esimerkit 2, 4, 5, 6 valaisevat alhaisen ylipaineen ja esimerkki 7 valaisee keskimääräisen ylipaineen käyttöä.

Esimerkit 1, 3 ja 8 valaisevat korkean ilmavirtauksen käyttöä. Esimerkki 6 valaisee alhaisen ilmavirtauksen käyttöä.

Esimerkit 1, 7 sekä 8 ovat esimerkkinä suuresta tuottavuudesta. Esimerkit 2, 4 sekä 6 valaisevat alhaista tuottavuutta.

Vaikka eniten toivotut tuottavuudet saadaan laimennusnopeuk-silla, jotka ovat alueella 0,17-0,19“^, on mahdollista antaa organismin kasvaa, hapen ollessa rajoittavana tekijänä, lai-mennusnopeuksien ollessa enemmän kuin 0,25· Esimerkki 6 on esimerkkinä kasvatuksesta laimennusnopeudella 0,25 h~1.

ESIMERKKI NO 12 3 15 Yksik- kö 9 79859

Rajoitus C>2 O2 O2 O2 O2

Ravinteet

Glukoosi (malsslsiirappi) 39,5 41,5 27,22 34,83 23,3 g/i

Monoammoniumfosfaatti 2,1 2,1 1,30 2,26 1,30 g/i

Kallumsulfaatti 2,1 2,1 2,1 3,65 2,1 g/l

Magnesiumsulfaatti 0,87 0,87 0,87 1,51 0,87 g/l

Biotiini G,0134 0,009 0,004 0,009 0,004 mg/1

Kollini 87,0 87,0 87,0 113,9 87,0 mg/i

Fe S0i| 7H20 - - 1,26 7,57 3,79 mg/1

Fe Cl3 6H20 3,64 5,94 - mg/i

Zn SOi, 7H20 19,30 26,09 8,7 15,13 8,7 mg/1

Mn SOn 4H20 15,46 17,39 8,7 15,13 8,7 mg/1

Cu S0i| 5H2O 1,85 3,48 0,87 3,03 0,90 mg/1

Olosuhteet ;

Virtausnopeus 218 265 255 265 264 l/hr

Fermentterin tilavuus 1252 1340 1280 1342 1245 1

Laimennusnopeus 0,174 0,2 0,20 0,20 0,21 hr

Solublomassan kons. 17,9 9,2 11,1 10,2 10,7 g/l

Sekoltusnopeus l80 l80 180 185 180 kr/min

Ilman virtaus 1500 1211 1316 1239 1216 1/min

Ylipaine 207 34,5 55 34,5 34,5 kN/m2

Glukoosin ylimäärä 5,5 17,7 6,2 13,2 3,9 g/l

Tulokset

Biomassan AAN 76,5 66,0 68,1 63,5 68,5 mg/g

Biomassan kesklm. pituus 0,38 0,40 0,39 0,43 0,41 mm Väri vaalea vaalea nahan nahan nahan nah.värl nah.väri väri väri väri

Koostumus hyvä kesklm. hyvä hyvä kesklm.

hyvä hyvä

Saantotekijä hiilen perusteella 0,53 0,39 0,53 0,47 0,47

Tuottavuus 3,11 1,84 2,22 2,04 2,25 g/l/h 10 79859 ESIMERKKI NO 6789 Yksikkö

Rajoitus O2 O2 O2 C

Ravinteet

Glukoosi (maissisiirappi) 22,45 46,25 48,00 15,73 g/1

Monoammoniumfosfaatti 1,30 1,65 1,39 1,34 g/1

Kaliumsulfaatti 2,1 2,1 2,1 2,1 g/1

Magnesiumsulfaatti 0,87 0,87 0,87 0,87 g/1

Biotiini 0,004 0,004 0,004 0,004 mg/1

Koliini 87,0 670,0 456,5 87,0 mg/1

Pe SO4 7H2O 4,34 4,34 4,34 4,34 mg/1

Pe CI3 6H2O - mg/1

Zn SO4 7H2O 8,7 8,7 8,7 8,7 mg/1

Mn SO4 4H20 8,7 8,7 8,7 8,7 mg/1

Cu SO/j 5H2O 0,87 0,87 0,87 0,87 mg/1

Olosuhteet

Virtausnopeus 326 254 228 265 1/hr

Permentterin tilavuus 1305 1350 1321 1230 1

Laimennusnopeus 0,25 0,188 0,172 0,22 hr

Solubiomassan kons. 8,7 20,7 21,4 9,8 g/1

Sekoitusnopeus 179 200 200 180 kr/mln

Ilman virtaus 412 1072 1112 1458 1/min

Ylipaine 34,5 117 207 3,45 kN/m2

Glukoosin ylimäärä 5,0 10,8 7,4 <0,1 g/1

Tulokset

Biomassan AAN 68,2 67,5 64,1 49,8 mg/g

Biomassan keskim. pituus 0,44 0,36 0,32 0,28* mm Väri nahan tumma tumma vaal.pun.- nahan nahan nahan värinen värinen värinen Koostumus keskim. keskim. keskim.

hyvä hyvä huono

Saantotekijä hiilen perusteella 0,50 0,58 0,53 0,62

Tuottavuus 2,1 3,89 3,68 2,16 g/1/h *(haarautunut)

Claims (3)

11 79859

1. Menetelmä syötäväksi kelpaavan, proteiinia sisältävän aineen valmistamiseksi, jossa on lineaariset hyyfit, jotka ovat haaroittuneet vähän tai ei ollenkaan, jossa menetelmässä siirrostetaan ja toteutetaan jatkuva käyminen fermentorissa lämpötilassa välillä 25-34°C fermentorin ollessa paineessa 101-505 kN/m2 ja käymisen tapahtuessa pH-arvossa 3,5-7 käyttäen Fusarium Graminearum Schwabe IMI 145425;ttä (talletettu Commonwealth Mycological Instituteen) elatusaineessa, joka sisältää hiilihydraattia, Mg-, K-, PO4--, Fe-, Zn-, Mn- ja Cu-ioneja kasvua edistävinä aineina, kaikkia ylimäärin, tunnettu siitä, että käymistä ilmastetaan virtausnopeudella 0,32-1,2 litraa minuutissa fermentorin litratila-vuutta kohden, siten että happi on rajoittava ravinne, mutta ylläpitää solukonsentraatiota viljelmässä ilman, että esiintyy anaerobista kasvua, jolloin syntyy pitempiä hyyfejä, jotka ovat haaroittuneet vähän tai ei ollenkaan.

1. Förfarande för framställning av ett ätligt, proteinhaltigt ämne innehallande lineära hyfer, som är litet eller ej alls förgrenade, vilket förfarande omfattar ympning och drift av en kontinuerlig fermentering i en fermentor vid en temperatur mellan 25-34°C, varvid fermentorn är under 101-505 kN/m2 tryck och fermenteringen sker vid ett pH-värde av 3,5-7 genom användning av Fusarium Graminearum Schwabe IMI 145425 (depo-nerat hos Commonwealth Mycological Institute) i ett kultur-medium innehallande kolhydrat. Mg-, K-, P04~-,Fe-, Zn-, Mn-och Cu-joner säsom tillväxtbefrämjande ämnen, alla i över-skott, kännetecknat därav, att fermenteringen luftas i en strömningshastighet av 0,32-1,2 liter per minut per fermentorns litervolym, sä att syret är det begränsande näringsämnet, men upprätthaller cellkonsentrationen i odlingen utan att anaerob tillväxt förekommer, varvid produ-ceras längre hyfer, som är litet eller ej alls förgrenade.