Uprawniony z patentu: Ranks Hovis McDougall Limited, Londyn (Wiel¬ ka Brytania) Sposób wytwarzania jadalnych substancji zawierajacych bialko Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania jadalnych substancji zawierajacych bialko, a zwla¬ szcza bialko grzybowe, poprzez dzialanie drobno¬ ustrojów.Znany jest sposób wytwarzania jadalnych: sub¬ stancji zawierajacych bialko, polegajacy na inkubo- waniu i rozmnazaniu Imperfecti i na wydzielaniu z przyswajalnej, wyjalowionej pozywki weglowoda¬ nowej rozmnozonego organizmu, stanowiacego ja¬ dalna substancje zawierajaca bialko. Wegiel sub¬ stancji odzywczych w postaci przyswajalnego we¬ glowodanu stanowi podloze ograniczajace rozmna¬ zanie.Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia grzybni posiadajacej wysoka wartosc biologi¬ czna wykorzystania bialka netto (NPU), która to wartosc w próbach prowadzonych na szczurach wynosi co najmniej 70 w przeliczeniu na azot za¬ warty w grupach a-aminowych.Sposób wytwarzania jadalnej substancji zawiera¬ jacej bialko polega wedlug wynalazku na inkubo- waniu i rozmnazaniu wegetatywnym w warunkach aerobowych na pozywce, zawierajacej zasadnicze skladniki pokarmowe podtrzymujace wzrost, nie¬ toksycznego szczepu z rodzaju Fasarium, jego wa¬ riantów lub mutantów i wydzieleniu rozmnozonego organizmu stanowiacego jadalna substancje zawie¬ rajaca bialko.Wegiel substancji wzrostowych w postaci ptrzyswa- 10 15 20 25 30 jalnego weglowodanu jest podlozem ograniczajacym rozmnazanie.Wydzielony rozmnozony organizm, stanowiacy ja¬ dalna substancje zawierajaca bialko, mozna doda¬ wac do srodków zywnosciowych spozywanych przez ludzi i zwierzeta.Podloze stosowane w etapie i inkubacji moze byc pochodzenia roslinnego i skladac sie na przyklad ze skrobi i substancji zawierajacych skrobie lub produktów ich hydrolizy, z sacharozy, z substancji zawierajacych sacharoze lub ze zhydrolizowanej sa¬ charozy, takiej jak cukier inwertowany lub z mie¬ szaniny tych substancji. Podloze moze stanowic na przyklad zhydrolizowana skrobia ziemniaczana, melasa, glukoza, zhydrolizowana skrobia z fasoli lub z manioku. Mozna tez stosowac podloze pocho¬ dzenia zwierzecego zawierajace serwatke. Jako nie¬ toksyczny szczep Fusarium mozna stosowac szczep Fusarium graminearum, a korzystnie szczep Fusa¬ rium giraminearum Schwabe, zdeponowany w Com- monwealth Mycological Institute pod numerem I.M.I. 145425 oraz jego warianty i mutanty.Mozna stosowac równiez ponizsze nowe warianty szczepu, zdeponowane we wspomnianym Instytucie: 1-7 zdeponowany pod numerem I.M.I. 154209, 1-8 zdeponowany pod numerem I.M.I. 154211, 1-9 zde¬ ponowany pod numerem I.M.I. 154212, 1-15 zdepo¬ nowany pod numerem IJM.I. 154213 i 1-16 zdepono¬ wany pod numerem I.M.I. 154210.Nowy szczep Fusarium graminearum Schwabe 7719477194 I.M.I. 145425 nie jest patogenny dla pszenicy. Posia¬ da on nastepujace cechy morfologiczne: Pozywka: Agar ziemniaczano-sacharozowy Zmodyfikowany agar Czapka-Do- W autoklawie umieszcza sie na xa (produkt fir- okres 15 minut pod cisnieniem my Oxoid) 1,05 kG/cm2 250 g umytych, po¬ krajanych w kostke ziemniaków.Wywar cedzi sie przez 2 godziny.Do metnego przesaczu dodaje sie 2% glukozy i 2% agaru, pozywke ogrzewa sie w autoklawie i ro¬ zlewa.Warunki wzrostu: 25°C, kilka tygodni.Tempo wzrostu: 4 cm w ciagu 3 dni, 3 cm w ciagu 3 dni.Typ wzrostu: Klaczkowate kolonie rozprzestrzenio¬ ne na powierzchni pozywki z biala grzybnia po¬ wietrzna.Podloze na agarze ziemniaczano-sacharozowym sza¬ raworózowe z platnikami od purpurowych do zól¬ tych, z tendencja do nieco jasniejszego zabarwienia na agarze Czapka-Doxa. Niekiedy, zwlaszcza pod¬ czas starzenia, grzybnia wytwarza ciemnoczerwony pigment. Po tygodniu lub dwóch grzybnia powie¬ trzna ma tendencje do brazowienia i opadania.Wówczas kolonia staje sie raczej sluzowata, ponie¬ waz powstaje sporodochia, a zabarwienie przecho¬ dzi od rózowego do brazowego na podlozu z agaru ziemniaczano-sacharozowego i lososiowo-rózowego na podlozu z agaru Czapka-Doxa. Nie powstaja zadne wydzieliny, a wytwarzane pigmenty maja tendencje do przyjmowania barwy grzybni.Konidia: Organizm ten nie wytwarza mikrokoni- diów. Makrokonidia wytwarzane sa przez pojedyn¬ cze boczne sterygmy lub przez wielokrotnie rozga¬ lezione konidiofory z krótkimi sterygmami. W star¬ szych kulturach konidiofory skupiaja sie tworzac sporodochium, zwlaszcza na agarze Czapka-Doxa.Konidia maja ksztalt od sierpowatego do ksztaltu grzbietobrzusznie wypuklego wrzeciona i posiadaja od 3 do 5 komórek, w mlodszych hodowlach zazwy¬ czaj 5. Wymiany zarodników wahaja sie od 25—50 \i X2,5—4,0 ia. Komórka dolna ma czesto trzonek, zwlaszcza w dluzszych zarodnikach 5-komórko- wych. W grzybni trafiaja sie komórki nabrzmiale, a niekiedy wystepuja interkalarnie chlamidospory pojedynczo lub w lancuchach.Ponizej opisano przykladowo sposoby otrzymy¬ wania wariantów lub wyizolowanych szczepów Fu- sarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425 oraz ich cechy morfologiczne.Wyizolowane szczepy otrzymane z hodowli ciaglych.Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154209 do 154213 wyselekcjonowano z szalek z agarem brzecz- kowych, zaszczepionych plynna hodowla Fusarium graminearum Schwabe 145245, rosnaca na pozywce glukozowej w temperaturze 30°C w warunkach cia¬ glej hodowli, ograniczanej zawartoscia wegla w po¬ zywce, przy szybkosci jego zuzywania wynoszacej 0,1—0,15/godzine. Z kadzi fermentacyjnej co okolo 100 godzin pobierano próbki w celu badania popu- 10 25 30 35 lacji wariantów, a wyizolowane szczepy I.M.I. 154209 do 154213 pobrano z szalek zawierajacych próbki otrzymane po 1100 godzinach fermentacji.Szczepy te sa charakterystyczne dla wiekszosci ty¬ pów wariantów morfologicznych powstalych pod¬ czas fermentacji.W warunkach podanych w tym przykladzie wa¬ rianty szczepu zaczely pojawiac sie na szalkach po 800 godzinach. Sa one wytwarzane dalej z poste¬ pem czasu z tym, ze populacja powoli zmienia sie, jesli chodzi o udzial procentowy kazdego z typów.Fermentacje prowadzi sie w nastepujacych wa¬ runkach: 15 Roztwór 1 20 Roztwór 2 Pozywka % Glukoza 3,0 Siarczan amonu 0,25 Dwuwodorofosforan potasu 0,30 Siarczan magnezu 0,025 Srodek przeciwpieniacy glikol polipropylenowy o cie¬ zarze czasteczkowym 2000 sterylizowany orzy wartosci pH 3 w ciagu 30 minut pod cisnieniem 2,05 kG/cm2. 0,01 MnS04 • 4H2O 0,0005 FeSG4 • 7H2O 0,0005 ZnS04 • 7HaO 0,0005 C0CI2 • 6H2O 0,0001 CnS04 • 5H2O 0,0001 NaMoQ4 • 2H2O 0,0001 Sterylizowany w ciagu 2,05 kG/cm2 Roztwór 3 Biotyna Cholina Metionina 15 minut pod cisnieniem 0,10 lub 0,20 ^g/litr 0,10 lub 2 mg/litr 0 lub 600 mg/litr 40 Sterylizowany oddzielnie przez filtracje.Wszystkie roztwory dodawano, w miare potrzeby aseptycznie, do zbiornika z pozywka, a nastepnie umieszczono w chemositacie o pojemnosci 8,5 litra, 45 w którym panowaly nastepujace warunki wzrostu: temperatura 30^C, napowietrzenie w ilosci 1 oboje- tosc powietrza na jednostke objetosci w ciagu 1 minuty, mieszanie z szybkoscia 800 obrotów na mi¬ nute za pomoca turbiny o tarczy z 6 lopatkami, 50 0,5D, naczynie fermentacyjne wyposazone w prze¬ grody. W zbiorniku fermentacyjnym utrzymuje sie stala wartosc pH 5 za pomoca automatycznego do¬ dawania sterylnego amoniaku. Sklad roztworu 3 zmieniano przy róznych czasach w celu okreslenia 55 u max (maksymalne tempo wzrostu) z róznymi dodatkami, takimi jak sama biotyna lub biotyna wspólnie z cholina. Tempo wzrostu wynosilo 0,1— —0,15/godzine-1.Piec wyizolowanych szczepów posiada nastepuja¬ ce cechy morfologiczne: Pozywka: Agar ziemniaczanó-sacharozo- Agar Czapka- wy. W autoklawie umieszcza sie -Doxa (produk- 65 pod cisnieniem 1,05 kG/cm2 na cji firmy Oxoid)77194 5 okres 15 min. 250 g umytych, pokrajanych w kostke ziemnia¬ ków. Wywar cedzi sie przez 2 warstwy gazy. Do metnego prze¬ saczu dodaje sie 2% glukozy i 2% agaru, pozywke ogrzewa sie w autoklawie i dysperguje.Warunki wzrostu: temperatura 25°C.Typ wzrostu: Wyizolowany szczep 1-7 Kolonia jest morfologicznie podobna do kolonii ro¬ dzicielskiej A 3/5 z ta róznica, ze jej srednica jest mniejsza i po 3 dniach wzrostu w temperaturze 30°C ma pozywce Czapka-Doxa wynosi 1,5 cm. Sto¬ pien klaczkowatosci grzybni powietrznej jest rózny w róznych koloniach, ale mniejszy niz w wyizolowa¬ nym szczepie 1-8. Grzybnie starszych hodowli po¬ siadaja splowiala barwe brazowa. Powracaja sek¬ tory o zabarwieniu od zóltobrazowego do szarawo- -rózowego z pewnym przechodzeniem pigmentu do pozywki.Wyizolowany szczep 1-8.Bardzo silne biale klaczki grzybni powietrznej. Sre¬ dnica kolonii równiez mniejsza niz kolonii rodzi¬ cielskiej A 3/5 i po 3 dniach wzrostu nia pozywce Czapka-Doxa w temperaturze 30°C wynosi 2 cm.Powracaja segmenty o zabarwieniu od lososiowo- -rózowego do szaraworózowego.Wyizolowany szczep 1-9.Makroskopowo zblizony do wyizolowanego szczepu 1-8, lecz tracac barwe lososiowa staje sie szklisty.Wyizolowany szczep 1-15.Male, zbite, kopulaste kolonie. Grzybnia krótka, poplatana, z tendencja do falistosci. Powstaja licz¬ ne struktury, sporadochiopodobne, które w punkcie szczepienia rozmazem robia wrazenie rózowych.Rózowe zabarwienie na krancach. Srednica kolonii po 3 dniach wzrostu na pozywce Czapka-Doxa w temperaturze 30°C wynosi tylko 0,4 cm.Wyizolowany szczep 1-16.Wyizolowany szczep 1-16 jest bardzo niestaly i nie¬ ustannie w jego hodowli pojawia sie szczep 1-16.Szczep ten ma wyglad podobny do wyizolowanego szczepu 1-7, chociaz jego kolonie maja tendencje wyrastania do nieco wiekszych srednic. Po 3 dniach wzrostu wystepuja srednice 2,4 cm, a nawet wie¬ ksze.Konidia. Wyizolowany szczep 1-7.Powstaja liczne makrokonidia, podobnie jak w szczepie rodzicielskim A 3/5. W starszych koloniach powstaja sporodachia. Pojedyncze makrokonidia ma¬ ja ksztalt i wymiary podobne do szczepu rodziciel¬ skiego A 3/5, a mianowicie 25—50/^X3—5^. W star¬ szych hodowlach twarzy sie wiele sporodochiów.W grzybni tego szczepu wystepuja równiez liczne chlamidospory, interkalarne i teminalne. Maja one ksztalt gladkich kulek o wymiarach 10—12//. Nie¬ kiedy pojedyncza chlamidospora powstaje z poje- 5 dynczej komórki makrokonidium.Wyizolowany szczep 1-8.Makrokonidia mniej liczne niz w wyizolowanym 10 szczepie 1-7, a te, które istnieja, przewaznie mniej¬ sze i prostsze, 1—3-komórkowe o dlugosci 25—35 fi tworza nieliczne sporodochia, natomiast liczne chla¬ midospory, interkalarne, terminalne, pojedyncze i w lancuchach. 15 20 30 Wyizolowany szczep 1-9.Bardzo podobny do wyizolowanego szczepu 1-8 z ta róznica, ze posiada wiecej makrokonidiów, nie¬ mal w takiej ilosci jak w wyizolowanym szczepie 1-7.Wyizolowany szczep 1-15.Bardzo nieliczne makrokonidia o strukturach typu 25 sporodochium, sa w rzeczywistosci utworzone ze zgrupowan chlamidospor. Liczne chlamidospory wystepuja takze w grzybni. Makrokonidia mniejsze niz w szczepie rodzicielskim, tylko 2-komórkowe o wymiarach 30—35^X4/*.Wyizolowany szczep 1-16.Bardzo podobny do wyizolowanego szczepu 1-7, z licznymi makrokonidiami i chlamidosporami. Ma- 35 krokonidia typowe, o wymiarach 30—45^X4/*.W sposobie wedlug wynalazku temperature inku¬ bacji utrzymuje sie zazwyczaj w granicach 25— —34°C, korzystnie okolo 30°C. Szczepienie inicjujace proces najlepiej prowadzic poprzez etap wstepnego 40 skielkowania zarodników, wykorzystujac na przy¬ klad 2—10% inokulum, zazwyczaj 5—10%. Pod¬ czas inkubacji wartosci pH pozywki korzystnie utrzymuje sie w odpowiednim przedziale, zapew^ niajacym maksymalny wzrost, na przyklad 3,5—7. 45 W tych warunkach czas wzrostu w hodowli okre¬ sowej wynosi zazwyczaj 20—48 godzin.Zarówno w procesach hodowli ciaglej, jak i okre¬ sowej, nalezy prowadzic napowietrzanie i mieszanie w celu zapewnienia w brzeczce odpowiedniej ilosci 50 rozpuszczonego tlenu, którego brak moze stanowic czynnik ograniczajacy wzrost. Jest rzecza oczywi¬ sta, ze w pozywce podloza znajduja sie takie pod¬ stawowe skladniki odzywcze jak azot, siarka, fosfor i inne sladowe pierwiastki, tak, ze wzrost w zasa- 55 dzie jest ograniczony tylko przez weglowodan przy¬ swajalny dla grzyba. Ponadto, oprócz wyzej wymie¬ nionych skladników pokarmowych, dla utrzymania maksymalnego tempa wzrostu pozadana jest obe¬ cnosc w pozywce jednej lub wiecej witamin, takich 6o jak na przyklad biotyna. W celu regulacji wydzie¬ lania piany podczas fermentacji korzystnie jest do¬ dawac do pozywki podloza nietoksyczny srodek przeciwpieniacy.Substancje wytwarzana sposobem wedlug wyna- 65 lazku wydziela sie w dowolny znany sposób. Tak77194 na przyklad powstala grzybnie mozna odzyskac po¬ przez oddzielenie, przemycie, filtracje i wysuszenie.Stwierdzono jednak, ze jesli przy stosowaniu filtra¬ cji pod cisnieniem wilgotnosc otrzymywanej sub¬ stancji obnizy sie ponizej krytycznego poziomu wy¬ noszacego okolo 50% wagowych, to dalej mozna prowadzic suszenie w nieco wyzszej temperaturze, co jest bardzo wazne z punktu widzenia ekonomi¬ ki procesu otrzymywania tych substancji. Suszenie nie powinno niszczyc wartosci odzywczych grzybni, która suszy sie w strumieniu powietrza o tempe¬ raturze 75°C lub przez wynirazanie.Grzybnia wytwarzana sposobem wedlug wynalaz¬ ku przejawia bardzo dobra zdolnosc wiazania wody i moze sluzyc jako srodek zageszczajacy i zelujacy.Po obróbce zachowuje ona witaminy jak równiez inne przyswajalne substancje odzywcze, takie jak lipidy i nieco weglowodanów. Grzybnia ta ma za¬ dowalajace wlasciwosci wypiekowe, co ma duze znaczenie w przypadkach chlebów wzbogaconych bialkiem, spozywanych jako pozywienie. Ponadto, dzieki wlóknistej strukturze, grzybnie otrzymana sposobem wedlug wynalazku mozna wypiekac, smazyc lub gotowac na parze i podawac ludziom jako pozywienie porównywalne pod wzgledem wy¬ gladu i przyswajalnosci z pozywieniem tradycyj¬ nym, do którego nawykli.Sposób wedlug wynalazku wyjasniono w naste¬ pujacych przykladach. Przyklad 1—4 odnosza sie do hodowli okresowej.Przyklad I. W naczyniu fermentacyjnym wy¬ posazonym w mieszadlo przygotowuje sie i wyjala¬ wia 10 litrów pozywki o nastepujacym skladzie, przy czym procenty oznaczaja liczbe gramów na 100 ml pozywki: Melasa z trzciny cukrowej dostarczajaca 6% cukru Siarczan amonu 1,2% NaH2PCU 0,25% Wyjalawiac w ciagu 30 minut pod cisnieniem 2,05 kG/cm2.OaCOs 0,5% Wyjalawiac 3 godziny pod cisnieniem 2,05 kG/cm2.Skladniki pozywki dodaje sie w warunkach ase- ptycznych i ochladza do temperatury 30°C. Inoku- lum w ilosci równej 5—10% objetosci pozywki, wy¬ hodowane na wstrzasarce na pozywce z glukozy i wyciagu namokowego kukurydzy lub na innych odpowiednich pozywkach, szczepi sie zawiesina za¬ rodników szczepu Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145425, hoduje w ciagu 18—24 godzin w tem¬ peraturze 30°C na wstrzasarce obrotowej i dodaje w warunkach aseptycznych do kadzi fermentacyj¬ nej.Brzeczke inkubowana w temperaturze 30°C mie¬ sza sie w naczyniu wyposazonym w przegrody za pomoca 6-lopatkowej turbiny tarczowej (0,5 D) z szybkoscia 800. obrotów/minute, przepuszczajac przez nia wysterylizowane powietrze w ilosci i ob¬ jetosci powietrza na jednostke objetosci pozywki w ciagu 1 minuty. Po 35 godzinach dojrzala grzyb¬ nie usuwa sie z brzeczki, odwirowuje, przemywa woda i suszy w strumieniu powietrza o tempera- b turze 75°C w suszarce tasmowej. Suchy produkt ma nastepujacy sklad: Azot calkowity 8% Popiól 5,3% Lipidy 2,7% NPU optymalne 52% 10 30 40 45 50 55 60 w przeliczeniu na azot calkowity Przyklad II. W 14-litrowej kadzi fermentacyj- 15 nej typu Microferm, New Brunswick, przygotowano 10 litrów pozywki o nastepujacym skladzie: roztwór 1 Glukoza pH 3,0 3,0 20 roztwór 2 Siarczan amonu 0,7 roztwór 3 Dwuwodorofosforan po¬ tasu pH 5,0 1,0 roztwór 4 FeSCU • 7H20 pH 2,5 0,001 25 MnS04 • 4H20 0.0005 CuS04 • 5H20 0,0001 MgSG4 • 7*1*0 0,025 roztwór 5 NagMoCU • 2H20 0,0001 CoCl2 • 6H20 0,0001 CaCl2 • 2H20 roztwór 6 NaOH 0,0015 0,1 Kazdy z wymienionych roztworów wyjalowiano przez ogrzewanie w ciagu 15 minut pod cisnieniem 2,05 kG/cm2.Roztwór 7. Opisane nizej witaminy i (lub amino¬ kwasy) wyjalowiane przez filtracje.Przygotowane roztwory dodawano do naczynia w warunkach aseptycznych. Inokulum hodowano jak w przykladzie I z ta róznica, ze jego stezenie koncowe bylo tak dobrane, aby w kadzi fermenta¬ cyjnej zapewnic zawartosc suchej grzybni w ilosci 0,5 g/litr. Hodowle prowadzono w nastepujacych warunkach: temperatura 30°C, napowietrzanie i ob¬ jetosc powietrza na jedna objetosc pozywki w cia¬ gu 1 minuty, szybkosc mieszania taka, aby ilosc tlenu rozpuszczonego w pozywce przekraczala 25% wartosci nasycenia, mierzonej metoda New Brun¬ swick Inc., DO. W celu tlumienia piany dodaje sie jako srodek przeciwpieniacy odpowiednia ilosc ste¬ rylnego glikolu polipropylenowego o ciezarze cza¬ steczkowym 2000. Przy pomocy dodawanego ste¬ rylnego roztworu wodorotlenku potasowego utrzy¬ muje sie wartosc pH pozywki w granicach 6—6,3.Bez roztworu 7 (pozywka mini¬ malna) Roztwór 7 dodany w takiej ilos¬ ci, ze koncowe stezenie biotyny w pozywce wynosilo 50 ^ug/litr Tempo wzrostu na 1 godzine bardzo wolno 0,277194 10 Hoztwór T dodany w takiej ilos¬ ci, ze koncowe stezenie biotyny w pozywce wynosilo 50 jUg/litr chlorku choliny 30 mg/litr, a rmetióniny 300 mg/litr. 0,25 Przyklad III. Zachowano pozywke i warunki jak w przykladzie II z ta róznica, ze glukoze za¬ stapiono maltoza.Roztwór 7 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 /^g/litr.Boztwór 7 dodany w takiej ilos¬ ci, ze koncowe stezenie biotyny w pozywce wynosilo 50 //g/litr, -chlorku choliny 30 mg/litr, a metioniny 300 mg/litr.Tempo wzrostu na 1 godzine 0,18 0,21 Przyklad IV. W kadzi fermentacyjnej, wyko¬ nanej z nierdzewnej stali, o pojemnosci 130 litrów, przygotowano 100 litrów pozywki o nastepujacym skladzie koncowym: Clukoza Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) Siarczan amonu Dwuwodorofosforan potasu MgS04 • 7H20 ZnS04 • 7H2O FeS04 • 7H20 MnS04 • 4H20 Stezenie koncowe % 4 0,8 0,2 0,2 0,025 0,0005 0,0005 0,0001 Pozywke wyjalawia sie przy wartosci pH 3 w ciagu 30 minut pod cisnieniem 205 kG/cm2 i po ochlodzeniu do temperatury 30°C doprowadza sie wartosc pH pozywki do 5 dodajac wyjalowiony amoniak. Nastepnie w warunkach aseptycznych do pozywki dodano biotyne wyjalowiona przez filtra¬ cje w takiej ilosci, aby jej ostateczne stezenie wy¬ nosilo 40 wg/litr. Zawartosc kadzi fermentacyjnej zaszczepiono 10 litrami kultury wyhodowanej w zraszanym naczyniu w ciagu 18 godzin w tempera¬ turze 30°C na pozywce zawierajacej 2% glukozy, 0,4% tryptonu (produkcji firmy Oxoid), 0,1% ek¬ straktu drozdzowego (produkcji firmy Oxoid), O—15% siarczanu amonowego, 1% dwuwodorofos- foranu potasowego, 0,1% wodorotlenku sodowego, 0,025% siarczanu magnezowego, 0,001% siarczanu zelazowego, 0,001% siarczanu cynku, 0,0005% siar¬ czanu magnezowego i 0,001% siarczanu miedzio¬ wego, do której to pozywki jako srodka tlumiace¬ go piane dodawano 0,05% glikolu polipropyleno¬ wego o ciezarze czasteczkowym 2000. Pozywke te wyjalowiano w ciagu 45 minut przy cisnieniu 2,05 kG/cm2 i zaszczepiano zawiesina zarodników 10 15 20 25 40 45 50 55 60 naszego szczepu Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145 425. Zapewniono nastepujace warunki wzrostu: temperatura 30°C, napowietrzanie brzecz¬ ki zabezpieczajace ilosc rozpuszczonego tlenu prze¬ kraczajace 10% wartosci nasycenia. W celu tlumie¬ nia piany, jako srodek przeciwpieniacy stosowano sterylny glikol polipropylenowy o ciezarze czastecz¬ kowym 2000. Za pomoca dodawanego wyjalowione¬ go amoniaku utrzymuje sie wartosc pH pozywki równa 5. Próbki grzybni pobrane po okresie wzro¬ stu, po wysuszeniu zawieraja: azotu calkowitego 8—8,6%, azotu w grupach anaminowych 6,4—6,6%.Poczatkowe tempo wzrostu na zastosowanej kom¬ pleksowej pozywce zarówno w przypadku pozywki hodowli okresowej jak i inekulum wynosilo okolo 0,3/godzine.Nastepne przyklady V, VI, VII odnosza sie do hodowli ciaglych.Przyklad V. Sporzadzono pozywke o nastepu¬ jacym skladzie: Roztwór 1.Glukoza Siarczan amonu Dwuwodorofosforan potasu Siarczan magnezu Srodek przeciwpieniacy — < glikol propylenowy o ciezarze czastecz¬ kowym 2000.Stezenie koncowe % 3 0,25 0,3 0,025 04 35 Roztwór sterylizuje sie przy wartosci pH 3 w ciagu 30 minut pod cisnieniem 2,05 kG/cm2.Roztwór 2 MnS04 • 4H20 FeS04 • 7H20 ZnSC4 • 7H2O C0CI2 • 6HaO CuS04 • 5HsO NaMoQ4 • 2H2O 0,0005 0,0005 0,0005 0,0001 0,0001 0,0001 Roztwór sterylizuje sie w ciagu 15 minut pod cis¬ nieniem 2,05 kG/cma. * ¦ Roztwór 3. Witaminy i/lub aminokwasy, jak poda¬ no nizej, sterylizowane przez filtracje.Wszystkie roztwory dodawano, w miare potrzeby, w warunkach aseptycznych. W chemostacie o poje¬ mnosci 8,5 litrów zapewniono nastepujace warunki wzrostu: temperatura 30°C, napowietrzenie w ilosci 1 objetosci powietrza na jedna objetosc pozywki w ciagu 1 minuty, mieszanie przy pomocy poje¬ dynczej turbiny z 6 lopatkami na tarczy, 0,5 D — naczynie fermentacyjne wyposazone w przegrody.Wzrastajacy organizm stanowi szczep Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145 425. Za pomoca automatycznego dodawania amoniaku utrzymywa¬ no wairtosc pH równa 5. Wyniki podano w ta¬ blicy 1. )11 77 194 Tablica 1 12 Roztwór Roztwór 3 dodany w ta¬ kiej ilosci, ze koncowe stezenie biotyny w po¬ zywce wynosi 20 jig/litr.Roztwór 3 dodany w ta¬ kiej ilosci, ze koncowe stezenie biotyny w po¬ zywce wynosi 20 g/litr, a metioniny 600 ^g/litr. fx max 1 godz. 0,17— —0,19 0,20— —0,21 Wspólczyn¬ nik wydaj¬ nosci 0,5 0,5 Grzybnia Azot calko¬ wity % 7,2—7,9 7,7—8,6 Azot w gru¬ pach a-ami- nowych % 6,3—6,8 6,1—6,5 NPU w przeli¬ czeniu na azot calkowity 54 59 NPU w przeli¬ czeniu na azot] w grupach -amonowych 1 65 78 Przyklad Via. Przygotowano pozywke o na¬ stepujacym skladzie: % Skrobia fasolowa (zadana a-amylaza)-weglo¬ wodanu 3 wyciag namokowy kukurydzy 1,33 siarczan amonu 0,25 dwuwodorofosforan potasu 0,15 20 glikol polipropylenowy o ciezarze czastecz¬ kowym 2000 jako srodek przeciwpieniacy 0,025 Pozywke sterylizowano przy wartosci pH 4 w ciagu 30 minut pod cisnieniem 2,05 kG/cm* 25 i umieszczano w chemostacie o pojemnosci 8,5 litra, zapewniajac takie same warunki wzrostu jak w przykladzie V z ta róznica, ze wartosc pH zmie¬ nila sie od 3,5 do 6, a tempo wzrostu przez caly czas wynosilo 0,l/godzine. siarczan magnezu 0,025 30 Otrzymano wyniki podane w tablicy 2.Produkt produkt hodowany przy wartosci pH 4 produkt hodowany przy wairtosci pH 5 produkt hodowany przy wartosci pH 6 Tablica 2 Azot calkowity % 7,8 8,6 7,7 Azot zwiazany w grupach a-ami- nowych % 6,6 7,1 5,9 NPU w przelicze¬ niu na azot cal¬ kowity 54 57 61 NPU w przelicze¬ niu na azot w grupach a-amino- wych 67 71 80 Przyklad VIb. Pozywke i warunki wzrostu stosowano jak w przykladzie Via z tym, ze przez caly czas utrzymywano wartosc pH brzeczki równa 5, natomiast temperature procesu zmieniono od 26 do 34°C. Stwierdzono, ze optymalna jest temperatu¬ ra od 30 do 32°C.Przyklady VII-IX opisuja fermentacje 5 wa¬ riantów lub szczepów wyizolowanych ze szczepu Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145 425.Przyklad VII. W dwóch kolbach do hodowli na wstrzasarce o pojemnosci po 1 litr umieszczono po 200 ml. pozywki skladajacej sie z nastepujacych roztworów: « Roztwór 2. 50 55 Siarczan amonu Dwuwodorofosforan potasu MgS04 . 7H20 FeS04 • (NH4)2S04 • 6H20 MnS04 • 4HsjO CuS04 • 5Hj£ CoCl2 . 6H20 CaCl2 • 2H20 Na2Mo04 • 2H20 NaOH 0,565 1,00 0,025 0,0005 0,0005 0,0001 0,0001 0,0015 0,00001 0,2 Roztwór 1.Stezenie koncowe % Glukoza (sterylizowana oddzielnie przy wartosci pH 3 w ciagu 10 minut pod cisnieniem 0,7 kG/cm2} 65 Sole sterylizowano w ciagu 15 minut pod cisnie¬ niem 2,05 kG/cm2. Koncowa wartosc pH roztworu wynosi 6.Roztwór 3. Opisane nizej witaminy sterylizowane- przez filtracje.77194 13 14 Roztwory dodawano do kolb w warunkach asc¬ etycznych do otrzymania koncowej objetosci 200 ¦.ml. Nastepnie zawartosc kolb szczepiono przemyty¬ mi zarodnikami naszego szczepu Fusarium grami- .Jieamim 1-7 I.M.I. 154 209 do osiagniecia stezenia 8X103/ml. Zapewniono nastepujace warunki wzro¬ stu: temperatura 30°C, wstrzasanie na wstrzasarce obrotowej o 140 obr./mdnute i skoku 5,08 mm. Co godzine mierzono tempo wzrostu za pomoca pomia¬ ru gestosci optycznej próbki przy 600 m\i..Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono nastepujace tempo wzrostu: Tempo wzro¬ stu/godzine Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malina) Roztwór 3 dodano w takiej ilos¬ ci, ze koncowe stezenie biotyny w pozywce wynosilo 50 //g/litr 0,22 Roztwór 3 dodano w takiej ilos¬ ci, ze koncowe stezenie biotyny w pozywce wynosilo 50 ^g/litr, a chlorku choliny 50 mg/litr. 0,27 Przyklad VIII. Postepowano jak w przykla¬ dzie VII z ta róznica, ze szczep 1-7 zastapiono szczepem Fusarium graminearum Schwabe 1-8.Stwierdzono nastepujace szybkosci wzrostu.Tempo wzro¬ stu/godzine Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malna) Roztwór 3 dodawano w takiej Ilosci, ze koncowe stezenie bioty¬ ny w pozywce wynosilo 50 \i g/litr 0,22 Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 yt, g/litr, a chlorku choliny 50 mg/litr. 0,27 Przyklad IX. Postepuje sie jak w przykladzie Tli z ta róznica, ze szczep 1-7 zastapiono naszym szczepem Fusarium graminearum Schwabe 1-9. tStwierdzono nastepujace tempo wzrostu.Tempo wzro¬ stu/godzine Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malna) Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bioty¬ ny w pozywce wynosilo 50 p g/litr 0,21 Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 u g/Mtr, a chlorku choliny 50 mg/litr. 0,27 Przyklad X. Postepuje isie jak w przykladzie "VII z ta róznica, ze szczep 1-7 zastapiono naszym szczepem Fusatrium graminearum Schwabe 1-15 Stwierdzono nastepujace tempo wzrostu: Tempo wzro- 5 stu/godzine Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malna) Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bioty- 10 ny w pozywce wynosilo 50 p g/litr 0,21 Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 u 15 g/Mtr, a chlorku choliny 50 mg/litr. 0,27 Przyklad XI. Postepuje sie jak w przykladzie VII z ta róznica, ze szczep 1-7 zastepuje sie naszym 20 szczepem Fusarium graminearum Schwabe 1-16.Stwierdzono nastepujace tempo wzrostu: Tempo wzro¬ stu/godzine 25 Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malna) Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bioty¬ ny w pozywce wynosilo 50 /ll 30 g/litr 0,21 Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 fi g/litr, a chlorku choliny 50 35 mg/litr. 0,27 Przyklad XII. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie VII z ta róznica, ze szczep 1-7 zastepuje sie rodzicielskim szczepem Fusarium graminearum 40 Schwabe I.M.I. 145 425. Stwierdzono nastepujace tempo wzrostu: Tempo wzro¬ stu/godzine 45 Bez roztworu 3 (pozywka mini- bardzo wolne malna) Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bioty¬ ny w pozywce wynosilo 50 [i 50 g/litr 0,22 Roztwór 3 dodawano w takiej ilosci, ze koncowe stezenie bio¬ tyny w pozywce wynosilo 50 \i g/litr, a chlorku choliny 50 55 mg/litr. 0,27 Przyklady XIII i XIV opisuja fermentacje prze¬ prowadzona przez inne szczepy Fusarium niz Fu¬ sarium graminearum. 60 Przyklad XIII. Brzeczka posiewowa w ilosci 80 litrów zawierajaca glukoze i wyciag namokowy kukurydzy zaszczepiono zawiesina zarodników szczepu Fusarium solani. Po wyrosnieciu, gdy ste¬ zenie brzeczki posiewowej osiagnie 10—20 g/litr 65 dzieli sie ja na dwie porcje po 40 litrów kazda,77194 15 umieszczajac je w 400-litrowych naczyniach. Po¬ siew szczepi sie na pozywce o nastepujacym skla¬ dzie: 0/ /o 16 Skrobia KHtP04 (NH^jSCU Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 6 0,20 0,25 0,50 Wzrost odbywa sie w nastepujacych warunkach: wartosc pH utrzymuje sie na poziomie 5,5 dodajac sterylny amoniak: temperatura wynosi 30°C, cis¬ nienie 4,1 kG/cm2. Szybkosc przeplywu powietrza 1, objetosc powietrza na jedna objetosc pozywki w ciagu minuty. Obroty mieszadla zwieksza sie stop¬ niowo z 92 do 184 obr./minute w celu utrzymania odpowiedniej ilosci rozpuszczonego w brzeczce tle¬ nu. Mieszadlo sklada sie -z 2 turbin 0,4 D. Po zu¬ zyciu weglowodanu zawartego w pozywce wyros¬ nieta grzybnie usuwa sie, saczy, przemywa woda, odwirowuje i suszy w cieplym powietrzu o tempe¬ raturze 75°C w suszami tasmowej.Suchy produkt ma nastepujacy sklad: azot calkowity popiól 9,1% 8,3% azot calkowity popiól NPU optymalne 9,9% 10,8% 47,0 w przeliczeniu na azot calkowity.Zawartosc calkowitego azotu okreslono automatycz¬ nym analizatorem Kjeldahla (Technicon) patrz A.Ferrari, Amn, N.Y.Sci. 87, 792 (1969).Azot zwiazany w grupach aminowych oznaczano zmodyfikowana metoda TNBS, patrz M.A. Pinine- gar, Technicon Symposium 1965, str. 80. PL PL PL PL PL